TEKNIK KULTUR ENDOTHELIAL PROGENITOR CELL

(EPC) UNTUK TERAPI PENYAKIT DEGENERATIF

Disusun Oleh :
Asma Omar (0202506013)
Yuni Lestari (0202507014)

Jurusan Biologi
Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Al Azhar Indonesia
Jakarta
2009

1
A. Pendahuluan
Perkembangan dunia kedokteran telah mampu mendorong lahirnya pengobatan
regeneratif, cabang baru ilmu kedokteran ini dapat memberi janji nyata untuk
memperbaharui jaringan atau organ yang rusak dan memperbaiki disfungsi organ.
Teknologi ini berpotensi menyembuhkan penyakit-penyakit yang semula tak dapat
disembuhkan, seperti diabetes, penyakit jantung, gagal ginjal, osteoporosis, Alzheimer,
dan cedera pada sumsum tulang belakang, lebih jauh lagi berbagai penyakit yang timbul
karena malfungsi, kerusakan, atau kegagalan jaringan dapat diobati melalui terapi
pengobatan regeneratif (M. Aris Widodo, 2009). Adapun metode pendekatan yang
dilakukan dalam pengobatan regeneratif ini adalah:
- Penerapan terapi yang mendorong tubuh untuk memperbaiki jaringan yang
rusak sendiri
- Implantasi jaringan yang telah direkayasa untuk mendorong regenerasi
jaringan yang rusak
- Transplantasi langsung jaringan yang sehat ke bagian tubuh yang cedera/
rusak
Penyakit degeneratif seperti stroke, iskemia, dan
penyakit jantung dapat disembuhkan melalui aplikasi
pengobatan regeneratif dengan EPC (Endothelial
Progenitor Cell). Dimana EPC dapat memperbaiki kondisi-
kondisi penyakit yang diawali dengan kerusakan sel-sel
endotel, baik secara anatomis/stuktural maupun fungsional,
melalui mekanisme neovaskularisasi (Saut H. H. Nababan,
dkk, 2007). EPC dapat diisolasi dari berbagai sumber,
antara lain darah tali pusar, darah tepi, sumsum tulang, dan
juga pada jaringan tubuh lainnya, seperti jaringan lemak,
hati, jantung, limpa, dan saluran pencernaan. Namun,
jumlah EPC yang snagat terbatas ini menjadi kendala
tersendiri. Oleh karena itu, sangat penting dilakukan upaya Sumber : Progenitor cellUnresolved
questions, changing definitions, and novel
perbanyakan EPC dengan mengkultur secara in vitro paradigms for defining

2
 (ekspansi) untuk memenuhi jumlah kebutuhan dalam terapi (Frisca, Caroline T. Sardjono,
Ferry Sandra, 2008).

B. Progenitor Stem Cell (EPC)

Progenitor sel adalah sel yang bersifat unipoten atau multipoten. Dibandingkan
dengan stem sel, progenitor sel lebih terdiferensiasi. Kondisi progenitor sel antara stem
sel dan sel yang telah terdeferensiasi penuh. Sebagian besar sel progenitor berada dalam
keadaan dorman, atau melakukan aktivitas terbatas pada jaringan tempat sel ini berasal.
Tetapi ketika terjadi luka pada jaringan, atau kerusakan dan kematian sel, sel progenitor
akan teraktivasi. Growth Factor dan sitokinase adalah dua substansi yang mempercepat
mobilisasi sel progenitor ke jaringan yang luka. Beberapa jenis progenitor sel antara lain
sel satelit pada otot, intermediate progenitor cells (IPC) pada otak, sel stroma sumsum
tulang, pada periosteum terdapat sel progenitor yang akan berkembang menjadi
osteoblast, dan angioblast atau EPC (Ensiklopedia Wikipedia).
Stem Sel Progenitor Sel
Perbanyakan diri in vivo Tidak terbatas Terbatas
Perbanyakan diri in vitro Tidak terbatas Terbatas
Unipotent atau
Potensi Multipotent
multipotent
Pengaturan perbanyakan diri Iya Tidak
Mencapai jumlah sel maksimal Tidak mencapai populasi
Population
sebelum diferensiasi maksimum
(sumber : Progenitor Cell, Encyclopedia Wikipedia)
EPC memiliki peran penting dalam pembentukan pembuluh darah dan
remodelisasi sel endotelial pada pembuluh darah yang mengalami kerusakan. EPC

Sumber : Progenitor cellUnresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining
didefinisikan sebagai bagian dari sel berinti tunggal (mononuclear cell/ MNC) yang

3
 memiliki molekul penanda sel punca hematopoietik, yaitu CD34, suatu glikoprotein yang
memediasi pelekatan sel punca pada matriks ekstraseluler sumsum tulang dan CD133,
suatu glikoprotein yang dilaporkan merupakan molekul penanda untuk sel punca yang
lebih primitif dibandingkan CD34, sampai saat ini fungsi molekul CD133 belum
diketahui dengan pasti (Frisca, Caroline T. Sardjono, Ferry Sandra, 2008).
EPC diproduksi di sumsum tulang belakang, selain itu diproduksi di dinding
pembuluh darah yang kemudian bersirkulasi di dalam darah tepi (circulating endothelial
cell (CEC)), serta kelompok sel yang disebut endothelial outgrowth cell (EOC). CEC dan
EOC diperoleh dari hasil kultur sel-sel mononuklear darah tepi di dalam medium yang
sesuai. Hemangioblast, pada masa embriogenesis selain mampu berdiferensiasi menjadi
sel induk hematopoetik (HSC) juga dapat menjadi EPC. Kemungkinan sumber EPC lain
adalah sel-sel monosit yang berfungsi pada proses neovaskularisasi. Secara morfologi
EPC dari monosit ini berbentuk spindle, menyerupai sel-sel fibroblast, sedang EPC yang
berasal dari sumsum tulang belakang berbentuk seperti cobblestone. EPC juga diketahui
terdapat pada darah tali pusat (Saut H. H. Nababan, dkk, 2007).

C. Teknik Kultur Sel pada EPC

Kadar EPC yang dapat diisolasi dari sumber-sumbernya sangatlah terbatas untuk
digunakan dalam terapi manusia dewasa. Pada sum-sum tulang kadar EPC kurang dari
1% dan kurang dari 0,01% jika diisolasi dari peredaran darah perifer. Agar dapat
dilakukannya terapi penyakit degeneratif, maka dibutuhkan 3 x 108 hingga 3 x 108 sel
atau setara dengan 8,5-120 liter darah.
Teknik ekspansi atau yang sering disebut juga dengan perbanyakan EPC secara
invitro dapat dibagi ke dalam 3 tahap, yaitu :
1. Isolasi Endothelial Progenitor Sel

Metode isolasi sel dapat dikelompokkan berdasarkan karakteristik inti selnya

dan molekul reseptor yang berada di permukaan selnya.

a. Berdasarkan karakteristik inti sel dengan metode sentrifugasi.

Prinsip : pemisahan fraksi sel berinti tunggal (MNC/Mononuclear Cell) dan sel-
sel lainnya di dalam darah berdasarkan perbedaan densitas. Sel-sel

4
 darah merah dan granulosit yang memiliki densitas yang tinggi akan
terpisah dengan sel-sel MNC (sel punca, progenitor, limfosit, dan
monosit) yang memiliki densitas yang lebih rendah. Reagen yang
digunakan dalam metode ini adalah reagen Ficoll.

b. Berdasarkan Reseptor Permukaan Sel/Metode Separasi Immunomagnetik

Tujuan : untuk memperoleh hasil isolasi sel yang lebih spesifik

dibandingkan dengan metode sentrifugasi dan memperoleh
fraksi sel yang memiliki molekul penanda tertentu.

Prinsip : pemisahan berdasarkan reaksi kompleks antara antigen dan

antibodi. Antigen yang digunakan dalam metode ini adalah
molekul penanda permukaan sel yang akan diisolasi.
Sedangkan antibodi spesifik yang akan digunakan terikat
dengan magnetic microbeads.

Instrumen : magnetic microbeads, kolom, dan separator

Teknik Kerja : Kolom disisipkan pada separator (medan magnet kuat),

sehingga antigen yang telah terikat dengan antibodi pada
microbeads akan tertahan di kolom dan dapat dipisahkan.

Aplikasi : menghasilkan fraksi sel dengan molekul penanda CD14,

CD34, CD133, CD146

2. Kultur EPCs

a. Media Pertumbuhan

Media yang digunakan adalah media basal dan beberapa komponen tambahan
lainnya untuk meningkatkan poliferasi sel dan diferensiasi menjadi EPC.
Umumnya media mengandung serum untuk mendukung pertumbuhan dan
antibiotic untuk mencegah terjadinya kontaminasi. Selain itu ditambahkan pula
suplemen (bovine pituitary extract, bovine brain extract) dan faktor
pertmbuhan (Vascular Endothelial Growth Factor/VEGF, basic Fibroblast

5
 Growth Factor/b-FGF, Epidermal Growth Factor/EGF, Insulin like Growth
Factor-1/IGF-1). Contoh media yang sering digunakan yaitu Endothelial Basal
Medium-2 (EBM-2) dan Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM).

b. Inkubasi

Kondisi inkubasi juga menjadi faktor penentu keberhasilan kultur yang

dilakukan terhadap endothelial progenitor sel. Suhu yang digunakan dalam
inkubasi adalah 370C. Hal ini disesuaikan dengan suhu tubuh manusia yang
merupakan kondisi optimum bagi poliferasi dan diferensiasi sel endothelial
progenitor sel. Proses inkubasi dilakukan selama 6 hingga 7 hari ditambah
dengan CO2 5% yang berfungsi untuk membuat kondisi inkubasi menjadi
lembab.

3. Pemurnian EPC

Setelah dilakukannya inkubasi selama 6 hingga 7 hari, maka dilakukan seleksi

terhadap sel-sel yang tumbuh dalam media. Sel yang bukan merupakan EPC
dipisahkan dari media kultur dengan membuang media kultur yang tidak
mengandung sel-sel progenitor. Endothelial progenitor sel akan menghasilkan
integrin, fibronectin and vWF. Sisa sel tersebut dikulturkan kembali dalam
media kultur padat serta masa ekspansi diperpanjang hingga 12 atau 14 hari.
Setelah 18 sampai 21 hari akan diproduksi EPC murni. Tingkat kemurnian
EPC yang dihasilkan dapat diukur dengan menggunaan pewarnaan
immunohistokimia atau menggunakan flouresence.

4. Penghitungan EPC

Endothelial progenitor Cell yang telah dikultur secara invitro dilakukan

penghitungan berdasarkan 3 hal, yaitu :

a. Berdasarkan Morfologi

Penghitungan didasarkan pada bentuk sel EPC yang membentuk koloni

bulat/cobblestone.

6
 b. Berdasarkan Fenotipe

Penghitungan EPC pada metode ini menggunakan flowcytometry dengan

mengidentifikasi sel-sel yang memiliki molekul penanda sel matopoietik
dan sel endothel (CD34, CD133, KDR).

c. Berdasarkan Karakteristik Fungsional

Karakterisasi EPC secara fungsional dapat dilakukan melalui pengikatan

dengan lektin, kemampuan endositesis senyawa lipoprotein, atau
kemampuan membentuk struktur menyerupai pembuluh darah secara in
vitro.

Dengan menggunakan teknik penghitungan yang berbeda-beda, maka kan

dihasilkan jumlah sel endothelial progenitor sel yang berbeda pula dari
penghitungan tersebut. Jumlah EPC berdasarkan morfologinya pada 1 mL darah
manusia dewasa segar adalah 1,6 x 105 hingga 3 x 105 sel. Sedangkan berdasarkan
fenotipenya, jumlah EPC yang terdapat pada darah tepi manusia normal adalah
0,002% dari total sel mono nucleus atau setara dengan 66 sel/17 mL.

Melakukan ekspansi EPC merupakan hal yang cukup sulit dilakukan karena
adanya beberapa hambatan dan tantangan yang harus dihadapi dalam proses
prolierasi dan diferensiasi sel-sel progenitor tersebut. Beberapa tantangn tersebut
diantaranya : menemukan komponen pengganti hewan dalam media kultur dalam
proses ekspansi EPC. Komponen hewan tersebut belum teridentifikasi secara jelas
sehingga dikhawatirkan akan membawa mikroorganisme patogen, menimbulkan
reaksi penolakan imun pada resipien dan dapat menyebabkan variasi hasil kultur
EPC yang diperoleh. Solusi yang dilakukan untuk menghindari masalah tersebut
adalah dengan tidak menggunakan komponen dari spesies yang berbeda dalam
kultur EPC.

Tantangan lainnya yang harus dihadapi dalam penggunaan EPC sebagai

metode terapi untuk menghambat dan mencegah penyakit degeneratif yaitu
ekspansi harus dapat memproduksi EPC dalam jumlah yang besar. Oleh karena itu

7
 perlu dilakukannya teknik rekayasa genetika pada endothelial progenitor sel dengan
mengunakan gen human telomerase reverse transcriptase (hTERT) dan
penambahan gen penyandi proangiogenesis, contohnya : VEGF.

DAFTAR PUSTAKA

A. Ingram, David, et. al, 2005, Progenitor cellUnresolved questions, changing

definitions, and novel paradigms for defining, [online], (http://bloodjournal.
hematologylibrary.org/cgi/reprint/106/5/1525.pdf, diakses tanggal 27 Desember
2009)

Anonim, ______, Epithelial Progenitor Cell, [online], (http://en.wikipedia.org/wiki

/Progenitor_cell, diakses tanggal 25 Desember 2009)

Anonim, ______, Progenitor Cell, [online], (http://en.wikipedia.org/wiki/Progenitor_cell

diakses tanggal 25 Desember 2009)

Asahara, Takayuki, dan Masuda, Haruchika, ______, Method for ampification of

endothelial progenetic cell in vitro description/claims, [online],
(http://www.freshpatents.com/Method-for-amplification-of-endothelialprogenitor-
cell-in-vitro -dt20080710ptan20080166327.php, diakses 26 Desember 2009)

8
Dawson, Rob, 2007, Sel Saraf Progenitor Berperan Sebagai Tempat Penyimpanan HIV,
[online], (http://spiritia.or.id/news/bacanews.php?nwno=0538&gg=1, diakses
tanggal 26 Desember 2009)

Frisca, dkk, 2008, Ekspansi Endhotelial Progenitor Cell, Stem Cell and Cancer Institue,
Kalbe Pharmeceautical Company : Jakarta

H. H. Saud, Nababan, dkk, 2007, Peranan Endhotelial Progenitor Cell dalam

Neovaskularisasi, Stem Cell and Cancer Institue, Kalbe Pharmeceautical
Company : Jakarta

K. Wary, Kishore, et.al, ______, Selected endothelial progenitor cells an method for use,
[online],(http://www.faqs.org/patents/app/20080206200#ixzz0aWJahBXo,diakses
tanggal 26 Desember 2009)

Urbich, Carmen, dan Dimmeler, Stefanie, 2004, Endothelial Progenitor Cells

Characterization and Role in Vascular Biology, [online],
(http://circres.ahajournals.org/cgi/content/abstract/95/4/343, diakses tanggal 26
Desember 2009)

Widodo, M. Aris, 2009, Endhotelial Progenitor Cell Modulation Its Role In Promoting
Regenerative Medicine, Dibacakan pada seminar ASPI, Jakarta 30 Mei 2009