Prinsip PCR adalah penggunaan polimerase termostabil (Taq polymerase) selama beberapa siklus.

Dimana ada 3 langkah utama yang dilakukan pada setiap siklus tersebut. Adapun langkah tersebut adalah sebagai berikut : 1. Denaturasi Dengan terjadinya denaturasi yang dilakukan pada temperatur 94°C selama 30-60 detik dari untaian ganda DNA ( double – stranded DNA) sehingga sequence target akan muncul. 1. Annealing Pendinginan yang dilakukan pada temperatur 45-60°C selama 60-120 detik pada setiap siklus memungkinkan primer untuk melekat pada target. 1. Extension Sintesis DNA komplementer baru oleh enzim polimerase dilakukan pada temperatur 72°C selama 60-120 detik sehingga terbentuk kembali DNA rantai ganda . Dimana setiap siklus tersebut memperbanyak dua kali jumlah DNA dan siklus tersebut diulang 20-35 kali. Sehingga pada akhir PCR akan diperoleh amplifikasi sebanyak 106 –109 kali dari jumlah DNA target awal. Kemudian produk amplifikasi tersebut dibaca pada gel elektroferesis. Reaksi amplifikasi ini demikian sensitif sehingga kurang dari 10 molekul DNA target dapat memberi sinyal positif. Untuk mencegah kontaminasi aerosol dari hasil amplifikasi spesimen lain yang dapat menyebabkan hasil positif palsu maka di dalam disertakan enzim Uracil N-Glycosylate (UNG) yang mengenali dan mengkatalisa destruksi DNA yang mengandung urasil tidak terdapat dalam DNA kuman tetapi ada dalam amplikon karena reagen PCR menggunakan urasil. Amplikon yang mugkin terbawa akan dihancurkan terlebih dahulu oleh UNG sehingga tidak ikut proses amplifikasi, dengan demikian mengurangi salah satu kemungkinan hasil positif palsu. Adanya kontrol negatif pada pemeriksaan mengurangi kemungkinan kontaminasi, maka semua peralatan dan perlengkapan laboratorium harus dibersihkan secara teratur dan menggunakan perlengkapan habis pakai. Pada hasil biakan negatif, PCR dapat memberikan hasil positif. Hal ini kemungkinan karena kuman specimen terlalu sedikit untuk dapat tumbuh dalam biakan atau respon imun penderita yang menyebabkan kuman tak dapat tumbuh. Sedangkan hasil negatif palsu dapat diakibatkan karena specimen tidak mengandung DNA kuman M. tuberkulosis. walaupun berasal dari penderita TB atau kemungkinan dapat disebabkan karena kesalahan teknis. Untuk menghindari kemungkinan ini, maka pada setiap pemeriksaan disertakan kontrol positif yang mengandung DNA kuman M. tuberkulosis. Upaya lain adalah menghilangkan inhibitor yang berpotensi dapat menurunkan sensitivitas PCR. Pemeriksaan PCR telah dilakukan di beberapa laboratorium dengan target IS 6110. Dimana waktu yang diperlukan antara 24-36 jam. Sensitivitas PCR di dalam penegakan diagnosis efusi pleura tuberkulosis sekitar 20-81%. PCR positif 100% pada kultur positif efusi pleura tuberkulosis dan sekitar 30-60% PCR positif pada kultur negatif cairan pleura. Pada sampel apusan BTA sputum positif dijumpai sensitivitas PCR berkisar 73,6–100%. Sedangkan sampel apusan BTA sputum negatif dijumpai sensitivitas PCR

70% dan spesitifitasnya 98,6 %. Selain itu pada apusan BTA positif dengan pemeriksaan PCR dapat dijumpai hasil yang negatif. Yang mana hal ini dapat terjadi karena adanya infeksi M. atipikal dan inhibitor dalam proses amplifikasi.

PCR (Era Uji Diagnoistik Molekuler Terkini) UJI DIAGNOSTIK MOLEKULER

uji-uji diagnostik merupakan salah satu metode untuk menangani kasus penyakit. restriction fragment length polymorphism (RFLP) dan sekuensing asam nukleat. Basa purin yang terdapat pada DNA maupun RNA adalah sama. dan 3) fosfat. maka pengembangan uji-uji diagnostik mulai diarahkan kepada teknologi tersebut yang menggunakan materi genetik sebagai dasar pengujiannya. telah membuat PCR dapat digunakan untuk uji-uji diagnostik secara praktis. DNA memiliki struktur rantai ganda sedangkan RNA memiliki rantai tunggal. karena tahap awal proses PCR dilakukan dengan cara pemanasan rantai DNA yang sudah ada pada temperatur 90°C. 2) gula (deoksiribosa untuk DNA dan ribosa untuk RNA). yaitu Adenine [A] dan Guanine [G] sedangkan basa pirimidin berbeda. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA in vivo. untuk DNA adalah Cytocine [C] dan Thymine [T] dan untuk RNA kedudukan Thymine digantikan oleh Uracil [U] Kedua unsur basa tersebut (purin dan pirimidin) akan berpasangan membentuk kode-kode genetik pada DNA maupun RNA melalui ikatan hidrogen (A akan berpasangan dengan T [pada DNA] atau A dengan U [pada RNA]. Berbeda dengan proses replikasi yang berlangsung secara diskrit untuk sepanjang rantai DNA. Berbagai uji diagnostik telah dikembangkan. uji-uji diagnostik dikembangkan melalui teknik-teknik molekuler seperti hibridisasi dengan probe asam nukleat. Penemuan enzim yang tahan panas sangat membantu untuk mensintesis DNA baru. yaitu: 1) basa (purin dan pirimidin). Berdasarkan materi genetik tersebut. PCR dapat mengamplifikasi DNA dan jumlah yang sedikit menjadi jumlah yang dapat dideteksi/banyak. dan G dengan C). Struktur DNA lebih stabil bila dibandingkan dengan RNA. Adanya penemuan DNA polymerase (Taq polymerase) yang stabil pada temperatur tinggi dan pengembangan alat yang mengatur temperatur proses PCR secara otornatis. Dengan berkembangnya teknologi dalam bidang biologi molekuler. Unsur gula dan fosfat akan membentuk struktur DNA dan RNA.Dalam bidang kedokteran (manusia maupun hewan). Materi genetik yang berupa asam nukleat baik DNA (Deoxy-ribose Nucleic Acid) maupun RNA (Ribo Nucleic Acid) mengandung tiga komponen. baik yang didasarkan pada teknik kultur agen penyakit. reraksi kimia/biokimia maupun reaksi imunologik. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Salah satu perkembangan teknik biologi molekuler yang sangat membantu dalam pengembangan uji-uji diagnostik adalah PCR. polymerase chain reaction (PCR). Reaksi Rantai Polimerase atau Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu teknik sintesis untuk mengamplifikasi atau melipatgandakan fragmen DNA target secara invitro dengan eksponensial yang menggunakan primer atau pemula DNA yang tepat. . DNA polymerase adalah enzim yang dapat mensintesis rantai DNA yang baru dan DNA yang sudah ada.

Pada perkembangan penggunaan PCR dilakukan pemurnian terhadap sampel yang akan di tes. malam Jumat. tetapi hanya untuk satu segmen tertentu saja dari suatu DNA.coli DNA Polymerase I untuk memicu perpanjangan potongan DNA yang spesifik. saat membawa kendaraannya keluar kota pada bulan purnama menuju ke Negara bagian utara California dimana Mullis mendapatkan inpirasi yang bermakna dengan menemukan cara baru untuk mendeteksi urutan basa yang spesifik dari DNA. karena hasilnya yang memberikan sensitifitas yang rendah dan memperlihatkan hasil yang heterogen. sehingga PCR sekarang telah dapat dikerjakan dengan mesin. Satu siklus terdiri dari 3 tahap. kemudian divisualisasikan melalui elektroforesis dan proses hibridisasi. yang memberiny peluang pada tahun 1993 mendapatkan hadiah Nobel dalam kimia atas penemuan PCR. Klenow enzim dapat bekerja baik pada potongan DNA yang pendek (<200bp). Impian Mullis dimulai ketika di bulan April. tahap hibridisasi primer pada temperatur 37° sampai 56°C dan tahap polimerisasi pada temperatur 72°C. Hal ini disebabkan karena tahapan annealing yang rendah dan perubahan temperatur (37’C) yang harus disesuaikan untuk mengaktifkan enzim Klenow. Untuk mengamplifikasi DNA dilakukan 30-40 kali siklus proses PCR. GuSCN dan diatom menghilangkan hambatan secara efisien terhadap berbagai macam sampel dari rumah sakit. Setelah beberapa tahun berikutnya didapatkan enzim thermostable DNA Polymerase yaitu Taq DNA Polymerase. Dengan merancang komplementer potongan DNA yang spesifik dari mikroorganisme tersebut. Mullis pada tahun 1985. Untuk mendeteksi potongan DNA yang spesifik dengan PCR diperlukan informasi dari tiap mikroorganisme yang memiliki potongan DNA yang spesifik untuk golongannya. Semula Mullis menggunakan enzim Klenow fragmen E. 1983. Untuk mendukung amplifikasi tersebut diperlukan berbagai zat lainnya. Situasi yang sangat memperihatinkan pada awal dimulainya PCR ini ialah bahwa teknik ini dilakukan secara manual dari satu waterbath ke waterbath lainnya sesuai tahapan dari PCR. maka dapat dihasilkan pemula DNA atau disebut juga primer. Penemuan yang mempesonakan itu dipublikasi pada American Scientific.maka pada proses PCR reaksi ini berjalan kontinu. sehingga mengharuskan penambahan enzim yang baru lagi pada setiap siklus PCR. dan inilah yang dilipatgandakan atau diamplifikasi sampai jutaan dalam waktu sekitar 4 jam pada mesin PCR. Keseluruhan proses PCR membutuhkan waktu hanya 2 hari. enzim ini tidak dapat bertahan pada saat tahapan denaturasi dari PCR. GuSCN berfungsi untuk lisis dan menginaktifkan asam nukleat. B. Teknik PCR ditemukan pertama kali oleh Kary. Penemuan enzim ini juga memberi peluang untuk dilakukannya setiap tahapan PCR secara automatis. . khususnya pada teknik yang diharapkan berlangsung secara automatis. Kondisi ini merupakan suatu hambatan yang kritis. PCR menjadi sangat populer dalam penelitian. tetapi tetapi tidak bis bekerja pada potongan DNA yang lebih besar. Potongan DNA yang spesifik ini akan berikatan dengan pasangan yang komplementer dengannya. Metode ini menggunakan Chaotropic agent guanidium thiocyanate (GuSCN) dan diatom. sedangkan partikel silica ataupun diatom berfungsi mengikat asam nukleat. yaitu tahap denaturasi pada temperatur 95°C. Namun. Permunian sampel DNA dilakukan dengan memakai metode Boom (1990). 1990.

karena panas dapat merusak ikatan hidroksi antara basa-basa yang komplementar. digunakan pada tahap awal proses PCR. maka rantai DNA target yang terdapat di antara primer akan diperbanyak menjadi dua rantai dengan panjang yang sama seperti DNA target. Perkembangan selanjutnya terhadap pemanfaatan mesin PCR. 3. termasuk M. Prinsip dasar suatu PCR adalah : pasangan primer menghibridisasi sekuens komplemen terget pada rantai DNA yang sebelumnya telah terdenaturasi. Annealing ( penempatan / pemasangan primer ) Primer dipasangakan pada tempat yang sesuai ( berkomplementer dengan rantai tunggal DNA ) melalui proses pembentukan iktan hidroksi.Secara umum. juga untuk tes resistensi terhadap OAT. terkecuali pada kandungan PCR-miks. dengan bantuan enzim DNA polymerase sehingga terbentuk suatu fragmen rantai ganda DNA yang spesifik. kemudian primer ditambahkan pada DNA target dan temperatur diturunkan agan terjadi proses hibridisasi. Bila digunakan hanya satu pasang primer disebut PCR unipleks. Dengan adanya pengulangan tahap-tahap denaturasi. atau dengan analisis restriction fragment length polymorphism (RFLP) dan elektroforesis pada gel agarose atau dengan cara sekuensing. waktu tahapan dan jumlah sikling temperatur. annealing dan elongation. Enzim yang stabil pada temperatur tinggi ini akan membantu proses penempaan nukleotida yang dibutuhkan sampai terbentuknya suatu rantai ganda DNA. Bila enzim reverse transcriptase yang mensintesis DNA dan template RNA. PCR dapat digunakan dalam uji-uji diagnostik untuk mengamplifikasi asam nukleat dan agen-agen penyakit yang ada dalam jumlah sedikit sehingga sensitifitas uji dapat ditingkatkan. tuberkulosis dan mikobakterium lain. DNA yang akan diamplifikasi diapit oleh sepasang primer sintetik yang merupakan potongan pendek dari DNA yang spesifik/komplementer yang berfungsi sebagai template dari DNA yang akan diamplifikasi. Bila tahap polimerisasi dimulai. DNA yang telah diamplifikasi selanjutnya diidentifikasi dengan teknik hibridisasi yang rnenggunakan probe asam nukleat yang spesifik. hibridisasi dan polimerisasi beberapa kali. Sintesis DNA kemudian berlangsung dengan bantuan enzim polimerase di sepanjang daerah diantara primer. dalam suatu siklus PCR. . dimulailah proses pemanjangan rantai baru DNA yang berkomplementar. DNA target yang akan diamplifikasi didenaturasi terlebih dahulu dengan pemanasan. yaitu tahap : 1. PCR dilaksanakan dengan cara menginkubasi sample pada temperatur yang berbeda pada tahap. Extension ( Perpanjangan) Setelah primer ditempatkan pada posisi yang tepat. 2. PCR Unipleks dapat dipakai untuk diagnosis terhadap penyebab penyakit infeksi.Untuk proses pemasangan primer ini dibutuhkan temperature yang berbeda dari setiap primer. Denaturasi Dengan pemanasan 95 oC rantai DNA akan berpisah. maka RNA ribosom dan genomik dan virus RNAjuga dapat diamplifikasi. sedangkan PCR multipleks selain digunakan untuk diagnosis. temperatur optimal yang dibutuhkan untuk proses ini adalah 72o C. dibedakan antara PCR unipleks dan PCR multipleks. sedangkan PCR yang menggunakan lebih dari satu pasang disebut PCR multipleks tak ada perbedaan pada tahapan denaturasi. maka DNA target akan diperbanyak secana efektif.

Warna yang terbentuk akan berbanding terbalik dengan jumlah analat yang terdeteksi dalam contoh. Analat dan enzim-hapten konjugat akan saling berkompetisi untuk mengikat antibodi yang dilekatkan pada permukaan mikroplat. Antigen dalam hal ini hapten protein konjugat dilekatkan pada permukaan mikroplat dan kemudian diinkubasi selama waktu tertentu. Hasil warna tersebut dapat dilihat secara visual atau diukur dengan menggunakan kolorimeter atau spektrofotometer. ELISA kompetitif langsung Konfigurasi ELISA langsung merupakan konfigurasi paling sederhana. Antibodi spesifik dilapiskan pada mikroplat yang kemudian diinkubasi selama waktu tertentu. Dibutuhkan suatu antibodi antispesies yang dilabel dengan enzim. Analit bersama dengan antibodi ditambahkan kedalam mikroplat. sehingga akan lebih sedikit enzim-hapten konjugat yang mengikat antibodi. Analat yang akan dideteksi bersama dengan enzim-hapten konjugat ditambahkan pada mikroplat yang telah dilapisi dengan antibodi. Antigen . Beberapa konfigurasi tersebut adalah: A. akan dihasilkan reaksi yang menghasilkan warna. Banyaknya enzim-hapten konjugat yang dapat mengikat antibodi dapat ditentukan dengan penambahan substrat senyawa pembentuk warna. antibodi dilapiskan pada immunosorbent (substrat padat). Ciri utama metoda ini adalah menggunakan suatu indikator enzim untuk reaksi immunologi (Burgess. Kemudian antigen sampel dan antigen yang berlabel enzim dimasukan kedalam immunosorbent sehingga terjadi kompetisi antara antigen sampel dengan antigen berlabel enzim untuk berikatan dengan antibodi dan terbentuk kompleks antibodi-antigen. 2. serta tingkat sensitifitas dan spesifitas yang dikehendaki. yaitu: 1. ELISA kompetitif tak langsung Pada metoda ini menunjukan bahwa warna yang ditimbulkan tidak langsung disebabkan oleh antigen dan antibodi yang bereaksi. maka akan terbentuk antigen-antibodi kompleks. Akibatnya intensitas warna yang terbentuk berkurang karena enzim yang bereaksi dengan substrat juga lebih sedikit. pemilihan konfigurasi tergantung dari besar molekul yang akan dideteksi. ELISA Kompetitif ELISA Kompetitif dapat dibedakan menjadi dua. 1995). Pada metoda ELISA dengan antigen kompetitif. Teknik pengujian dengan metoda ELISA dapat dilakukan dengan beberapa konfigurasi.ELISA adalah suatu metoda immunokimia yang berdasarkan reaksi spesifik antara antigen dengan antibodi yang memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi dengan menggunakan enzim sebagai indikatornya. Dengan memiliki satu dari komponen tersebut (antigen atau antibodi) yang dilabel dengan enzim dan diikatkan dengan pendukung immunosorbent. Semakin banyak analat dalam contoh maka analat mempunyai kesempatan yang lebih besar untuk mengikat antibodi. Dengan tambahan substrat yang spesifik terhadap kerja enzim.

kemudian antigen dan contoh uji ditambahkan dan diinkubasi selama waktu tertentu. Kompetitif ELISA merupakan konfigurasi yang banyak digunakan untuk pengujian cemaran. Sehingga antibodi kedua yang berlabel enzim (antibodi antispesies) yang ditambahkan jumlahnya akan semakin sedikit. B. Intensitas warna yang ditimbulkan setelah penambahan substrat berbanding lurus dengan antigen yang terdeteksi.dan analat akan berkompetisi untuk mengikat antibodi yang ada. Kemudian ditambahkan antibodi kedua yang diberi label enzim. Akan tetapi kurang sensitif untuk mendeteksi senyawa dengan berat molekul kecil seperti toksin dan cemar . akibatnya intensitas warna yang ditimbulkan juga semakin rendah. ELISA on-kompetitive sandwich Antibodi dilekatkan pada permukaan sumur-sumur mikroplat. Konfigurasi ini digunakan untuk mendeteksi makromolekul atau senyawa dengan molekul besar seperti protein dan mikroorganisme. Makin banyak analat dalam contoh yang diuji maka semakin sedikit antigen yang dapat mengikat antibodi. toksin serta senyawa dengan berat molekul kecil.