P. 1
Prinsip PCR Adalah Penggunaan Polimerase

Prinsip PCR Adalah Penggunaan Polimerase

|Views: 675|Likes:
Published by Muttaqin Barokah

More info:

Published by: Muttaqin Barokah on Jul 17, 2012
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOC, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

04/21/2014

pdf

text

original

Prinsip PCR adalah penggunaan polimerase termostabil (Taq polymerase) selama beberapa siklus.

Dimana ada 3 langkah utama yang dilakukan pada setiap siklus tersebut. Adapun langkah tersebut adalah sebagai berikut : 1. Denaturasi Dengan terjadinya denaturasi yang dilakukan pada temperatur 94°C selama 30-60 detik dari untaian ganda DNA ( double – stranded DNA) sehingga sequence target akan muncul. 1. Annealing Pendinginan yang dilakukan pada temperatur 45-60°C selama 60-120 detik pada setiap siklus memungkinkan primer untuk melekat pada target. 1. Extension Sintesis DNA komplementer baru oleh enzim polimerase dilakukan pada temperatur 72°C selama 60-120 detik sehingga terbentuk kembali DNA rantai ganda . Dimana setiap siklus tersebut memperbanyak dua kali jumlah DNA dan siklus tersebut diulang 20-35 kali. Sehingga pada akhir PCR akan diperoleh amplifikasi sebanyak 106 –109 kali dari jumlah DNA target awal. Kemudian produk amplifikasi tersebut dibaca pada gel elektroferesis. Reaksi amplifikasi ini demikian sensitif sehingga kurang dari 10 molekul DNA target dapat memberi sinyal positif. Untuk mencegah kontaminasi aerosol dari hasil amplifikasi spesimen lain yang dapat menyebabkan hasil positif palsu maka di dalam disertakan enzim Uracil N-Glycosylate (UNG) yang mengenali dan mengkatalisa destruksi DNA yang mengandung urasil tidak terdapat dalam DNA kuman tetapi ada dalam amplikon karena reagen PCR menggunakan urasil. Amplikon yang mugkin terbawa akan dihancurkan terlebih dahulu oleh UNG sehingga tidak ikut proses amplifikasi, dengan demikian mengurangi salah satu kemungkinan hasil positif palsu. Adanya kontrol negatif pada pemeriksaan mengurangi kemungkinan kontaminasi, maka semua peralatan dan perlengkapan laboratorium harus dibersihkan secara teratur dan menggunakan perlengkapan habis pakai. Pada hasil biakan negatif, PCR dapat memberikan hasil positif. Hal ini kemungkinan karena kuman specimen terlalu sedikit untuk dapat tumbuh dalam biakan atau respon imun penderita yang menyebabkan kuman tak dapat tumbuh. Sedangkan hasil negatif palsu dapat diakibatkan karena specimen tidak mengandung DNA kuman M. tuberkulosis. walaupun berasal dari penderita TB atau kemungkinan dapat disebabkan karena kesalahan teknis. Untuk menghindari kemungkinan ini, maka pada setiap pemeriksaan disertakan kontrol positif yang mengandung DNA kuman M. tuberkulosis. Upaya lain adalah menghilangkan inhibitor yang berpotensi dapat menurunkan sensitivitas PCR. Pemeriksaan PCR telah dilakukan di beberapa laboratorium dengan target IS 6110. Dimana waktu yang diperlukan antara 24-36 jam. Sensitivitas PCR di dalam penegakan diagnosis efusi pleura tuberkulosis sekitar 20-81%. PCR positif 100% pada kultur positif efusi pleura tuberkulosis dan sekitar 30-60% PCR positif pada kultur negatif cairan pleura. Pada sampel apusan BTA sputum positif dijumpai sensitivitas PCR berkisar 73,6–100%. Sedangkan sampel apusan BTA sputum negatif dijumpai sensitivitas PCR

70% dan spesitifitasnya 98,6 %. Selain itu pada apusan BTA positif dengan pemeriksaan PCR dapat dijumpai hasil yang negatif. Yang mana hal ini dapat terjadi karena adanya infeksi M. atipikal dan inhibitor dalam proses amplifikasi.

PCR (Era Uji Diagnoistik Molekuler Terkini) UJI DIAGNOSTIK MOLEKULER

maka pengembangan uji-uji diagnostik mulai diarahkan kepada teknologi tersebut yang menggunakan materi genetik sebagai dasar pengujiannya. uji-uji diagnostik merupakan salah satu metode untuk menangani kasus penyakit. untuk DNA adalah Cytocine [C] dan Thymine [T] dan untuk RNA kedudukan Thymine digantikan oleh Uracil [U] Kedua unsur basa tersebut (purin dan pirimidin) akan berpasangan membentuk kode-kode genetik pada DNA maupun RNA melalui ikatan hidrogen (A akan berpasangan dengan T [pada DNA] atau A dengan U [pada RNA]. uji-uji diagnostik dikembangkan melalui teknik-teknik molekuler seperti hibridisasi dengan probe asam nukleat. Struktur DNA lebih stabil bila dibandingkan dengan RNA. Dengan berkembangnya teknologi dalam bidang biologi molekuler. Unsur gula dan fosfat akan membentuk struktur DNA dan RNA. . dan 3) fosfat. PCR dapat mengamplifikasi DNA dan jumlah yang sedikit menjadi jumlah yang dapat dideteksi/banyak. DNA polymerase adalah enzim yang dapat mensintesis rantai DNA yang baru dan DNA yang sudah ada. Reaksi Rantai Polimerase atau Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu teknik sintesis untuk mengamplifikasi atau melipatgandakan fragmen DNA target secara invitro dengan eksponensial yang menggunakan primer atau pemula DNA yang tepat.Dalam bidang kedokteran (manusia maupun hewan). telah membuat PCR dapat digunakan untuk uji-uji diagnostik secara praktis. DNA memiliki struktur rantai ganda sedangkan RNA memiliki rantai tunggal. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA in vivo. baik yang didasarkan pada teknik kultur agen penyakit. yaitu: 1) basa (purin dan pirimidin). polymerase chain reaction (PCR). Berbagai uji diagnostik telah dikembangkan. karena tahap awal proses PCR dilakukan dengan cara pemanasan rantai DNA yang sudah ada pada temperatur 90°C. Materi genetik yang berupa asam nukleat baik DNA (Deoxy-ribose Nucleic Acid) maupun RNA (Ribo Nucleic Acid) mengandung tiga komponen. 2) gula (deoksiribosa untuk DNA dan ribosa untuk RNA). yaitu Adenine [A] dan Guanine [G] sedangkan basa pirimidin berbeda. Basa purin yang terdapat pada DNA maupun RNA adalah sama. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Salah satu perkembangan teknik biologi molekuler yang sangat membantu dalam pengembangan uji-uji diagnostik adalah PCR. reraksi kimia/biokimia maupun reaksi imunologik. Berbeda dengan proses replikasi yang berlangsung secara diskrit untuk sepanjang rantai DNA. Penemuan enzim yang tahan panas sangat membantu untuk mensintesis DNA baru. restriction fragment length polymorphism (RFLP) dan sekuensing asam nukleat. dan G dengan C). Adanya penemuan DNA polymerase (Taq polymerase) yang stabil pada temperatur tinggi dan pengembangan alat yang mengatur temperatur proses PCR secara otornatis. Berdasarkan materi genetik tersebut.

tahap hibridisasi primer pada temperatur 37° sampai 56°C dan tahap polimerisasi pada temperatur 72°C. tetapi hanya untuk satu segmen tertentu saja dari suatu DNA. Pada perkembangan penggunaan PCR dilakukan pemurnian terhadap sampel yang akan di tes. tetapi tetapi tidak bis bekerja pada potongan DNA yang lebih besar. Impian Mullis dimulai ketika di bulan April. Penemuan yang mempesonakan itu dipublikasi pada American Scientific. Namun. Dengan merancang komplementer potongan DNA yang spesifik dari mikroorganisme tersebut. sehingga mengharuskan penambahan enzim yang baru lagi pada setiap siklus PCR. Satu siklus terdiri dari 3 tahap. . GuSCN dan diatom menghilangkan hambatan secara efisien terhadap berbagai macam sampel dari rumah sakit.maka pada proses PCR reaksi ini berjalan kontinu. sedangkan partikel silica ataupun diatom berfungsi mengikat asam nukleat. Teknik PCR ditemukan pertama kali oleh Kary. Penemuan enzim ini juga memberi peluang untuk dilakukannya setiap tahapan PCR secara automatis. sehingga PCR sekarang telah dapat dikerjakan dengan mesin. Metode ini menggunakan Chaotropic agent guanidium thiocyanate (GuSCN) dan diatom. dan inilah yang dilipatgandakan atau diamplifikasi sampai jutaan dalam waktu sekitar 4 jam pada mesin PCR. Semula Mullis menggunakan enzim Klenow fragmen E. malam Jumat. Hal ini disebabkan karena tahapan annealing yang rendah dan perubahan temperatur (37’C) yang harus disesuaikan untuk mengaktifkan enzim Klenow. Mullis pada tahun 1985. kemudian divisualisasikan melalui elektroforesis dan proses hibridisasi. PCR menjadi sangat populer dalam penelitian. saat membawa kendaraannya keluar kota pada bulan purnama menuju ke Negara bagian utara California dimana Mullis mendapatkan inpirasi yang bermakna dengan menemukan cara baru untuk mendeteksi urutan basa yang spesifik dari DNA. B. Klenow enzim dapat bekerja baik pada potongan DNA yang pendek (<200bp). GuSCN berfungsi untuk lisis dan menginaktifkan asam nukleat. Kondisi ini merupakan suatu hambatan yang kritis. Setelah beberapa tahun berikutnya didapatkan enzim thermostable DNA Polymerase yaitu Taq DNA Polymerase. Untuk mengamplifikasi DNA dilakukan 30-40 kali siklus proses PCR. Permunian sampel DNA dilakukan dengan memakai metode Boom (1990). maka dapat dihasilkan pemula DNA atau disebut juga primer. yaitu tahap denaturasi pada temperatur 95°C. Keseluruhan proses PCR membutuhkan waktu hanya 2 hari. Situasi yang sangat memperihatinkan pada awal dimulainya PCR ini ialah bahwa teknik ini dilakukan secara manual dari satu waterbath ke waterbath lainnya sesuai tahapan dari PCR. Untuk mendukung amplifikasi tersebut diperlukan berbagai zat lainnya. karena hasilnya yang memberikan sensitifitas yang rendah dan memperlihatkan hasil yang heterogen. Untuk mendeteksi potongan DNA yang spesifik dengan PCR diperlukan informasi dari tiap mikroorganisme yang memiliki potongan DNA yang spesifik untuk golongannya. 1990. Potongan DNA yang spesifik ini akan berikatan dengan pasangan yang komplementer dengannya. khususnya pada teknik yang diharapkan berlangsung secara automatis. 1983. yang memberiny peluang pada tahun 1993 mendapatkan hadiah Nobel dalam kimia atas penemuan PCR. enzim ini tidak dapat bertahan pada saat tahapan denaturasi dari PCR.coli DNA Polymerase I untuk memicu perpanjangan potongan DNA yang spesifik.

PCR dilaksanakan dengan cara menginkubasi sample pada temperatur yang berbeda pada tahap. Extension ( Perpanjangan) Setelah primer ditempatkan pada posisi yang tepat. Bila tahap polimerisasi dimulai. . 2. termasuk M. maka RNA ribosom dan genomik dan virus RNAjuga dapat diamplifikasi. Denaturasi Dengan pemanasan 95 oC rantai DNA akan berpisah. annealing dan elongation. sedangkan PCR multipleks selain digunakan untuk diagnosis. atau dengan analisis restriction fragment length polymorphism (RFLP) dan elektroforesis pada gel agarose atau dengan cara sekuensing. karena panas dapat merusak ikatan hidroksi antara basa-basa yang komplementar. DNA yang telah diamplifikasi selanjutnya diidentifikasi dengan teknik hibridisasi yang rnenggunakan probe asam nukleat yang spesifik. Enzim yang stabil pada temperatur tinggi ini akan membantu proses penempaan nukleotida yang dibutuhkan sampai terbentuknya suatu rantai ganda DNA. Prinsip dasar suatu PCR adalah : pasangan primer menghibridisasi sekuens komplemen terget pada rantai DNA yang sebelumnya telah terdenaturasi. kemudian primer ditambahkan pada DNA target dan temperatur diturunkan agan terjadi proses hibridisasi. dimulailah proses pemanjangan rantai baru DNA yang berkomplementar. terkecuali pada kandungan PCR-miks. PCR Unipleks dapat dipakai untuk diagnosis terhadap penyebab penyakit infeksi. dibedakan antara PCR unipleks dan PCR multipleks. hibridisasi dan polimerisasi beberapa kali. waktu tahapan dan jumlah sikling temperatur. Perkembangan selanjutnya terhadap pemanfaatan mesin PCR. juga untuk tes resistensi terhadap OAT. PCR dapat digunakan dalam uji-uji diagnostik untuk mengamplifikasi asam nukleat dan agen-agen penyakit yang ada dalam jumlah sedikit sehingga sensitifitas uji dapat ditingkatkan. Dengan adanya pengulangan tahap-tahap denaturasi.Secara umum. 3. tuberkulosis dan mikobakterium lain. sedangkan PCR yang menggunakan lebih dari satu pasang disebut PCR multipleks tak ada perbedaan pada tahapan denaturasi. DNA target yang akan diamplifikasi didenaturasi terlebih dahulu dengan pemanasan. temperatur optimal yang dibutuhkan untuk proses ini adalah 72o C. DNA yang akan diamplifikasi diapit oleh sepasang primer sintetik yang merupakan potongan pendek dari DNA yang spesifik/komplementer yang berfungsi sebagai template dari DNA yang akan diamplifikasi. dalam suatu siklus PCR. Bila digunakan hanya satu pasang primer disebut PCR unipleks. maka DNA target akan diperbanyak secana efektif. digunakan pada tahap awal proses PCR. maka rantai DNA target yang terdapat di antara primer akan diperbanyak menjadi dua rantai dengan panjang yang sama seperti DNA target. dengan bantuan enzim DNA polymerase sehingga terbentuk suatu fragmen rantai ganda DNA yang spesifik. Annealing ( penempatan / pemasangan primer ) Primer dipasangakan pada tempat yang sesuai ( berkomplementer dengan rantai tunggal DNA ) melalui proses pembentukan iktan hidroksi. Bila enzim reverse transcriptase yang mensintesis DNA dan template RNA.Untuk proses pemasangan primer ini dibutuhkan temperature yang berbeda dari setiap primer. Sintesis DNA kemudian berlangsung dengan bantuan enzim polimerase di sepanjang daerah diantara primer. yaitu tahap : 1.

2. ELISA kompetitif langsung Konfigurasi ELISA langsung merupakan konfigurasi paling sederhana. ELISA kompetitif tak langsung Pada metoda ini menunjukan bahwa warna yang ditimbulkan tidak langsung disebabkan oleh antigen dan antibodi yang bereaksi. Ciri utama metoda ini adalah menggunakan suatu indikator enzim untuk reaksi immunologi (Burgess. Teknik pengujian dengan metoda ELISA dapat dilakukan dengan beberapa konfigurasi. Kemudian antigen sampel dan antigen yang berlabel enzim dimasukan kedalam immunosorbent sehingga terjadi kompetisi antara antigen sampel dengan antigen berlabel enzim untuk berikatan dengan antibodi dan terbentuk kompleks antibodi-antigen. yaitu: 1. serta tingkat sensitifitas dan spesifitas yang dikehendaki. 1995). Antibodi spesifik dilapiskan pada mikroplat yang kemudian diinkubasi selama waktu tertentu. Dengan memiliki satu dari komponen tersebut (antigen atau antibodi) yang dilabel dengan enzim dan diikatkan dengan pendukung immunosorbent. Analat yang akan dideteksi bersama dengan enzim-hapten konjugat ditambahkan pada mikroplat yang telah dilapisi dengan antibodi. Beberapa konfigurasi tersebut adalah: A. antibodi dilapiskan pada immunosorbent (substrat padat). Antigen dalam hal ini hapten protein konjugat dilekatkan pada permukaan mikroplat dan kemudian diinkubasi selama waktu tertentu. Analat dan enzim-hapten konjugat akan saling berkompetisi untuk mengikat antibodi yang dilekatkan pada permukaan mikroplat. sehingga akan lebih sedikit enzim-hapten konjugat yang mengikat antibodi. akan dihasilkan reaksi yang menghasilkan warna. Dibutuhkan suatu antibodi antispesies yang dilabel dengan enzim. Akibatnya intensitas warna yang terbentuk berkurang karena enzim yang bereaksi dengan substrat juga lebih sedikit. Dengan tambahan substrat yang spesifik terhadap kerja enzim. Banyaknya enzim-hapten konjugat yang dapat mengikat antibodi dapat ditentukan dengan penambahan substrat senyawa pembentuk warna. Hasil warna tersebut dapat dilihat secara visual atau diukur dengan menggunakan kolorimeter atau spektrofotometer. Analit bersama dengan antibodi ditambahkan kedalam mikroplat. Antigen . Pada metoda ELISA dengan antigen kompetitif. Warna yang terbentuk akan berbanding terbalik dengan jumlah analat yang terdeteksi dalam contoh. Semakin banyak analat dalam contoh maka analat mempunyai kesempatan yang lebih besar untuk mengikat antibodi. pemilihan konfigurasi tergantung dari besar molekul yang akan dideteksi. ELISA Kompetitif ELISA Kompetitif dapat dibedakan menjadi dua. maka akan terbentuk antigen-antibodi kompleks.ELISA adalah suatu metoda immunokimia yang berdasarkan reaksi spesifik antara antigen dengan antibodi yang memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi dengan menggunakan enzim sebagai indikatornya.

ELISA on-kompetitive sandwich Antibodi dilekatkan pada permukaan sumur-sumur mikroplat.dan analat akan berkompetisi untuk mengikat antibodi yang ada. akibatnya intensitas warna yang ditimbulkan juga semakin rendah. B. toksin serta senyawa dengan berat molekul kecil. Kompetitif ELISA merupakan konfigurasi yang banyak digunakan untuk pengujian cemaran. Kemudian ditambahkan antibodi kedua yang diberi label enzim. Sehingga antibodi kedua yang berlabel enzim (antibodi antispesies) yang ditambahkan jumlahnya akan semakin sedikit. Intensitas warna yang ditimbulkan setelah penambahan substrat berbanding lurus dengan antigen yang terdeteksi. Makin banyak analat dalam contoh yang diuji maka semakin sedikit antigen yang dapat mengikat antibodi. Konfigurasi ini digunakan untuk mendeteksi makromolekul atau senyawa dengan molekul besar seperti protein dan mikroorganisme. kemudian antigen dan contoh uji ditambahkan dan diinkubasi selama waktu tertentu. Akan tetapi kurang sensitif untuk mendeteksi senyawa dengan berat molekul kecil seperti toksin dan cemar .

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->