PRAKATA Mikrobiologi merupakan suatu sains praktik.

Oleh itu, selain mempelajari dan mengumpul fakta serta konsep adalah penting bagi pelajar dan pengamal mikrobiologi mahir dan cekap dalam mengendalikan kaedah-kaedah makmal mikrobiologi.Sungguhpun kaedah yang digunakan dalam mikrobiologi banyak dan berbagai-bagai, terdapat beberapa kaedah seperti pewarnaan bakteria yang boleh dianggap sebagai teknik asas dalam amalan sains ini. Teknik asas ini biasanya diajarkan kepada pelajar mikrobiologi dalam sesi amali yang terancang. Daripada pengalaman kami dalam mengendalikan sesi amali mikrobiologi terdapat beberapa kesilapan serta amalan yang tidak sewajarnya diulangi oleh setiap kumpulan pelajar baru. Sering juga terdapat soalan serta kemusykilan yang sama yang diajukan oleh mereka. Oleh yang demikian, sebuah buku yang menyentuh tentang teknik-teknik dasar makmal dan tradisional mikrobiologi amat diperlukan. Menyedari hakikat di atas, kami menulis buku ini yang bukan sahaja memaparkan kaedah serta pelaksanaan yang sempurna, tetapi juga merangkumi pengenalan ringkas dan tepat mengenai teknik-teknik tersebut. Ini dilakukan supaya pelajar dapat memahami teori serta penggunaan teknik-teknik di atas dengan lebih mendalam kerana buku ini menyertakan beberapa petunjuk dan petua bagi mencapai hasil yang baik dan diharapkan. Buku ini mengandungi 81 teknik dan maklumat teknikal. Penggunaan setiap teknik ini sengaja diolah berdasarkan konsep yang dimaksudkan di atas. Kami menaruh harapan agar buku ini berguna dalam mempertingkatkan lagi kemahiran pelajar mahupun pengamal mikrobiologi, di samping menambahkan sebuah lagi judul teks ke dalam senarai buku-buku teknikal dalam Bahasa Melayu yang tercinta. Yap Kok Leong Abdul Hamid Abdul Aziz Mohd Salleh Mohd Yasin

Jabatan Sains Bioperubatan Fakulti Sains Kesihatan Bersekutu UKM

9 1. AMALAN DAN PERATURAN DALAM MAKMAL MIKROBIOLOGI 1.1. PROSEDUR UMUM DI DALAM MAKMAL MIKROBIOLOGI Mikroorganisma boleh menyebabkan penyakit pada manusia. Oleh itu adalah penting bagi kita menyedari dan mengawasi prosedur dan perilaku dengan betul serta penuh tanggungjawab semasa bekerja dengannya. Mikrobiologi adalah mengenai mikroorganisma atau jasad renik yang mempunyai saiz kecil seperti fungus (kulat), bakteria dan virus. Tumpuan khusus perlu diberikan kepada aspek-aspek keselamatan dan ketelitian di dalam makmal mikrobiologi demi kepentingan diri sendiri mahupun pekerja-pekerja lain. Untuk mencapai matlamat ini sentiasalah mengingati dan mematuhi peraturan-peraturan umum makmal berikut: 1. Pakai kot makmal dan kasut pada setiap waktu anda bekerja di dalam makmal. Kot makmal janganlah dipakai di luar makmal. 2. Basuh tangan dengan sabun dan air atau dengan disinfektan kulit sebelum anda memulakan sebarang pekerjaan di makmal. 3. Jangan membawa bahan-bahan makmal yang rosak, pecah atau tercemar kepada instruktor. Panggillah instruktor dengan segera jika berlaku sebarang KEMALANGAN terutama yang

berkaitan dengan kultur mikroorganisma. 4. Jangan menyentuh kawasan muka atau mulut anda semasa bekerja. 5. Jangan makan, minum atau merokok di dalam makmal pada setiap waktu. 6. Jangan memasukkan pensil, jari atau sebarang objek ke dalam mulut atau membasahkan pelekat dengan menggunakan lidah. 7. Jangan menyedut sebarang cairan ke dalam pipet dengan mulut. Gunakan penyedut getah atau alat penyedut khas untuk tujuan ini. 8. Jangan membawa keluar dari makmal sebarang kultur atau bahan-bahan dalam kelas amali. 9. Simpan buku dan catatan berjauhan daripada tempat bekerja anda di dalam makmal untuk menghindari daripada tercemar. 10. Buangkan semua bahan dan kultur yang tercemar ke dalam bekas khusus yang disediakan, misalnya bikar yang berisi disinfektan atau bekas yang disediakan khas. 11. Jangan nyalakan mancis semasa bekerja dengan/atau berdekatan dengan reagen meruap seperti alkohol dan eter. 12. Tutup gas dan paip air dengan rapat dan bersihkan meja setelah anda selesai bekerja dan bersiap sedia untuk meninggalkan makmal. 13. Periksa penunu Bunsen dari semasa ke semasa untuk memastikan tidak berlaku kebocoran gas. Gantikan tiubnya jika perlu. 14. Basuh tangan anda semula dengan sabun dan air atau dengan disinfektan kulit sebelum meninggalkan makmal. 1.2. BANTUAN PEMULA KECEMASAN DI DALAM MAKMAL

Oleh kerana kemalangan boleh berlaku di dalam makmal, pekerja makmal haruslah mempunyai sedikit sebanyak pengetahuan mengenai bantuan pemula dan tindakan yang perlu diambil serta sedar akan keperluan ini, khususnya dalam kes-kes kecederaan ringan. Bekalan Bantuan Pemula Kecemasan 1. Antiseptik ringan untuk luka dan luka terbakar 2. Kain kasa (gauz) atau pembalut steril 3. Larutan asid asetik 2% 4. Natrium bikarbonat 5. Jeli petroleum/vaselin 10 Tatacara Rawatan Bantuan Pemula 1. Luka bakar asid. Segera simbah dengan sabun dan air dan sapukan dengan natrium bikarbonat. 2. Luka bakar alkali. Elak daripada menggunakan air kerana boleh menyebarkan alkali berkenaan. Bilas bersungguh-sungguh dengan asid asetik 2%. 3. Luka bakar api. Untuk luka bakar kulit yang ringan (kulit kemerahan tetapi tidak sampai mengelupas), sapukan lapisan tipis jeli petroleum di kawasan berkenaan. Bagi luka bakar yang lebih serius, jangan berikan sebarang rawatan tetapi bawalah mangsa ke hospital. 4. Luka. Untuk luka ringan dan cakaran, cuci luka dan teliti sama ada terdapat bendasing (kaca) di dalam luka. Bilas dengan alkohol 70% atau dengan antiseptik. Balut dengan kain pembalut berperekat atau dengan balutan longgar. Jika luka kelihatan parah, jangan

menggunakan antiseptik. Segera berjumpa doktor. Jika formalin atau mana-mana cairan tersimbah ke dalam mata, pastikan mata dicuci dengan air yang banyak dengan air paip. Jika keradangan pada mata tersebut masih berterusan, jumpalah doktor. 1.3. DISINFEKTAN UNTUK KEGUNAAN MAKMAL Pekerja di makmal mikrobiologi sentiasa berhadapan dengan bahan-bahan berbahaya terutamanya yang mengandungi mikrob patogenik. Di samping ini, objek di dalam makmal seperti tempat kerja, pipet dan slaid mikroskop juga sering tercemar. Umumnya, objek seperti spesimen klinikal dan pipet dikumpulkan di dalam bekas yang sesuai sebelum disterilkan dan dibuang. Untuk mengelakkan penyebaran patogen, spesimen dan bahan terpakai terlebih dahulu disimpan buat sementara di dalam bahan kimia tertentu sehingga pekerjaan di makmal tersebut selesai. Disinfektan adalah bahan kimia yang dimaksudkan di atas yang digunakan untuk memusnahkan mikrob patogenik pada sesuatu objek tak bernyawa (inanimate). Namun demikian, tahap pemusnahan di peringkat ini tidaklah perlu mencapai tahap pensterilan, iaitu pemusnahan semua bentuk hidupan. Sebatian kimia halogen dan fenol adalah di antara agen yang penting sebagai disinfektan. Disinfektan Jenis Fenolik Jernih 1. Digunakan untuk kebanyakan bahan organik, bahan tuberkulosis dan bahan bakteriologi umum; tidak digunakan untuk darah dan virus. 2. Aktiviti antimikrobnya tidak banyak dikurangkan oleh bahan organik dan tidak bertindak

terhadap logam. 3. Sesuai untuk kerja mikrobiologi umum, balang buangan sisa makmal. 4. Digunakan pada pencairan seperti yang ditetapkan oleh pengeluar disinfektan. 5. Contoh: Clearsol, Sudol. Disinfektan Jenis Hipoklorit 1. Aktiviti antimikrobnya dikurangkan oleh bahan organik. Bahan antimikrob ini menyerang logam. 2. Gunakan hipoklorit untuk bahan yang mengandungi hanya sedikit bahan organik atau sedikit darah; sesuai untuk menginaktivasi virus, tetapi tidak digunakan untuk bahan tuberkulosis atau yang diperbuat daripada logam. 3. Boleh digunakan dalam bidang virologi, hematologi dan patologi kimia di dalam balang buangan sisa makmal, balang pipet terpakai dan untuk mendisinfeksi permukaan. 4. Hipoklorit sesuai digunakan dengan detergen anionik dan bukan ionik tetapi tidak sesuai 11 dengan detergen kationik. 5. Penggunaan umum: 1000 ppm klorin bebas. 6. Balang pipet: 2500 ppm klorin bebas. 7. Contoh: Chloros, Presept. 1.4. TATACARA ASEPTIK Teknik aseptik bukan sahaja bertujuan untuk menjamin kesterilan bahan yang anda sedang kendalikan (iaitu tanpa berlakunya sebarang pencemaran ke atas bahan berkenaan) tetapi juga

merangkumi tindakan menghindari daripada berlakunya pencemaran mikroorganisma yang sedang dikaji ke atas diri anda sendiri (tangan, pakaian mahupun tempat anda bekerja di makmal) dan juga ke atas pekerja-pekerja lain. Pensterilan Gelung Dawai dengan Api Gelung dawai adalah sejenis dawai yang umumnya terdiri daripada nichrome atau platinum dengan garis pusat berukuran 0.5 mm yang dibentuk melingkar seperti gelung pada salah satu penghujungnya. Penghujung lainnya dicantumkan kepada sebatang pemegang dawai. Gelung dawai ini merupakan alat utama di makmal bakteriologi yang digunakan untuk memindahkan bakteria daripada suatu kultur ke tempat-tempat lain. Sebelum digunakan, gelung dawai ini terlebih dahulu dibakar supaya semua mikrooganisma yang terdapat pada permukaannya musnah dan terhapus serta tidak akan tercampur atau mencemari kultur bakteria murni yang akan diambil dengannya nanti. Dengan perkataan lain, gelung dawai ini disterilkan. Adalah penting juga dalam mengamalkan teknik aseptik, gelung dawai ini disterilkan setiap kali selepas digunakan. Tatacara Pensterilan Gelung Dawai dengan Api BAHAN 1. Gelung dawai 2. Rak gelung dawai 3. Penunu Bunsen

TATACARA 1. Nyalakan penunu Bunsen dan buka sepenuhnya liang kemasukan udaranya. 2. Masukkan gelung dawai ke dalam api penunu Bunsen seperti yang ditunjukkan pada Rajah 1.1. 3. Lakukan pembakaran sehingga peringkat keseluruhan dawai menjadi merah membara. Keluarkan dawai. 4. Biarkan ia supaya dingin semula (sama ada dengan memegang atau meletakkannya di atas rak khas) sebelum digunakan. PERHATIAN 1. Gelung dawai haruslah sentiasa disterilkan melalui pembakaran merah membara seperti di atas sebelum dan sesudah digunakan. 2. Pastikan gelung dawai yang steril ini tidak tersentuh sebarang objek sebelum digunakan. Elakkan daripada meletakkannya langsung di atas meja. Letakkan ia di atas rak khas atau pegang sahaja sementara menunggu dingin. 12 Pensterilan Alat dengan Alkohol yang Membakar Suatu tatacara cepat untuk mensterilkan objek kecil atau sebahagian daripada sesuatu objek, seperti bahagian memotong gunting ialah dengan mencelupkan objek atau bahagian daripada objek berkenaan ke dalam alkohol dan kemudian membakar objek beralkohol tersebut. Dalam tempoh alkohol pada permukaan objek tersebut terbakar, mikroorganisma yang terdapat pada permukaan

objek tersebut juga turut terbakar dan akhirnya dihapuskan. Sungguhpun ini merupakan suatu kaedah pensterilan yang boleh digunakan dalam keadaan-keadaan tertentu, ia kurang meyakinkan dibandingkan dengan pensterilan yang diperolehi dengan menggunakan autoklaf, misalnya. Tatacara Pensterilan Alat dengan Alkohol yang Membakar BAHAN 1. Balang alkohol (mengandungi etanol 70%) 2. Penunu Bunsen TATACARA 1. Pegang objek kecil seperti slaid mikroskop atau penutup slaid dengan forseps dan objek yang lebih besar pada pemegangnya. 2. Celup objek atau bahagian yang akan disterilkan ke dalam balang alkohol. 3. Singkirkan alkohol yang berlebihan. 4. Sentuhkan objek beralkohol kepada api penunu Bunsen supaya alkohol terbakar. RAJAH 1.1 Cara membakar gelung dawai Mulakan dengan memasukkan gelung dawai langsung ke dalam api (biru) di bahagian gas tak terbakar. Naikkan gelung perlahan-lahan sehingga bahagian gelung keluar dari kemuncak api biru dan biarkan terbakar sehingga merah

membara. Seterusnya bakar keseluruhan dawai sehingga menjadi merah sebelum dikeluar dan didinginkan di udara. 13 5. Jauhkan objek daripada api penunu Bunsen dan biarkan sehingga api pembakaran alkohol tersebut padam dengan sendirinya. PERHATIAN 1. Kaedah ini hanya boleh digunakan untuk objek kaca dan logam sahaja. 2. Letakkan balang berisi alkohol berjauhan daripada api penunu Bunsen untuk mengelak daripada disambar api tersebut. NOTA 1. Sentiasalah memegang objek supaya parasnya lebih rendah daripada paras tangan untuk mengelak daripada alkohol yang sedang terbakar mengalir ke tangan dan mengakibatkan kebakaran pada diri sendiri. 2. Mata gunting mestilah dalam keadaan terbuka semasa proses pensterilan supaya bahagian tajamnya terdedah kepada alkohol dan pembakaran. 3. Bahan kaca seperti slaid atau penutupnya akan pecah sekiranya dibiarkan dalam api pembakar terlalu lama. Tatacara Mengeluarkan dan Memasukkan Bahan daripada Botol yang Tertutup 1. Peganglah botol/tabung di bahagian dasarnya (iaitu agak berjauhan daripada mulut botol/

tabung) dengan tangan kiri. 2. Longgarkan dahulu penutup botol/tabung yang ketat dengan tangan kanan. 3. Tanggalkan penutup botol/tabung tersebut dengan jari kelengkeng kanan dan pegang terus penutup ini dengan jari berkenaan, tanpa meletakkannya (lakukan prosedur ini berdekatan dengan api penunu Bunsen). 4. Dengan tangan kiri, segera lalukan mulut botol/tabung ke dalam api beberapa kali dan kemudian masukkan sesuatu yang diambil dengan gelung dawai atau pipet steril dengan tangan kanan. ATA U dengan peralatan yang sama keluarkan sesuatu bahan (misalnya kultur) daripada botol/tabung berkenaan. 5. Lalukan semula mulut botol/tabung ke dalam api beberapa kali sebelum botol/tabung tersebut ditutup. PERINGATAN Amalkan prosedur ini setiap kali anda melakukan penginokulasian supaya pencemaran khususnya dari udara di sekitar kita dapat dihindari. NOTA 1. Teknik ini membolehkan anda melakukan dua perkara secara serentak dengan kedua-dua tangan, iaitu mensterilkan mulut botol/tabung sambil menghindari daripada berlakunya pencemaran udara dan mengambil inokulum daripada sejenis media kultur ataupun memasukkan inokulum ke dalam media.

2. Pada prinsipnya, api penunu Bunsen menghasilkan arus perolakan, iaitu arus udara yang bergerak ke atas disebabkan haba dari api tersebut. Jadi udara di persekitaran api akan terbawa arus ini ke atas dan akan mencegah partikel kecil seperti debu dan sebagainya daripada mendap di kawasan persekitaran ini. Dengan demikian, ia dapat mengelak daripada berlakunya pencemaran dari udara disebabkan partikel-partikel yang kecil apatah lagi spora fungus dan bakteria yang biasanya terapung atau berterbangan akan bergerak ke atas menurut arus dan tidak akan terjatuh ke dalam mana-mana media yang terdedah di bawahnya berdekatan dengan api. Berdasarkan konsep ini, dipercayai bahawa bekerja berdekatan dengan sesuatu sumber api umumnya boleh mengurangkan kadar pencemaran dari udara. Oleh itu, untuk melaksanakan pengambilan inokulum dari spesimen tertentu atau penginokulasian sesuatu media, bekerja berdekatan dengan api ini amat digalakkan dan seharusnyalah menjadi amalan di bidang mikrobiologi. 14 2. MIKROSKOP CAHAYA DALAM MIKROBIOLOGI Antara teknik asas makmal yang seharusnya diketahui oleh seseorang penuntut mikrobiologi ialah pengamatan ke atas mikrooganisma serta sel-sel yang terinfeksi mikroorganisma dengan menggunakan mikroskop. Sungguhpun kini terdapat pelbagai jenis mikroskop, yang lazim dan paling sering digunakan ialah mikroskop cahaya jenis kompaun iaitu mempunyai dua set kanta (Rajah 2.1). Mikroskop makmal

yang biasa mempunyai sekurang-kurangnya tiga kanta objektif: objektif kuasa rendah (pembesaran 10X), kuasa sederhana (40-45X) dan kuasa tinggi (100X) atau rendaman minyak (kuasa yang paling tinggi). Kanta okular (mata) biasanya mempunyai kuasa pembesaran 10X. Jumlah kuasa pembesaran adalah kuasa pembesaran objektif darab kuasa pembesaran kanta okula. Spesimen dihubungkan secara fizikal dengan kanta rendaman minyak melalui minyak rendaman. Keadaan ini memberikan imej yang lebih terang kerana cahaya yang melalui slaid mikroskop dan terkena pada spesimen yang sedang diamati tidak dibiaskan dan oleh yang demikian disalurkan ke dalam kanta rendaman minyak sebab indeks refraktif kaca dan minyak rendaman adalah hampir sama. Cahaya menjadi tertumpu dengan intensiti yang meningkat dan akan memberikan resolusi yang tinggi. Sebaliknya, jika ruang antara spesimen dan kanta adalah udara, sebahagian besar daripada cahaya akan dibiaskan disebabkan perbezaan indeks refraktif yang besar antara kaca dan udara. Oleh yang demikian, cahaya yang dibiaskan pasti tidak akan masuk ke dalam kanta. Dengan menggunakan cahaya biasa untuk memancarkan imej objek, peringkat yang paling halus sekali

yang boleh kita lihat (kuasa resolusi) adalah 0.2 mikron (m) atau 200 nm kerana ini adalah had yang ditentukan oleh gelombang cahaya yang dapat dilihat. Walau bagaimanapun, kuasa resolusi 200 nm ini adalah dalam keadaan optimum dan sungguhpun objek boleh diamati, struktur dan saiznya amat sukar dipastikan. Sebenarnya, resolusi mikroskop cahaya biasa ialah 300 nm. 2.1. TATACARA MIKROSKOP CAHAYA Tatacara Menggunakan Mikroskop Cahaya Biasa BAHAN 1. Mikroskop cahaya 2. Slaid apusan bakteria yang telah diwarnai 3. Minyak rendaman 4. Kertas/tisu kanta TATACARA 1. Letakkan slaid di atas pentas/dataran mikroskop dengan apusan di sebelah atas. 2. Putarkan objektif (40X) supaya berada tepat di atas apusan. 3. Turunkan objektif dengan memutarkan tombol pengatur fokus kasar sehingga jarak objektif berada kira-kira 1 mm di atas slaid. 4. Amatilah apusan melalui kanta okular (mata). 5. Pusingkan tombol pengatur fokus kasar perlahan-lahan supaya objektif bergerak ke atas sehingga

anda dapat melihat dan memfokus sesuatu pada slaid. 6. Putarkan pula tombol pengatur fokus halus untuk mendapatkan imej objek yang tajam dan terang. 7. Tukarkan kepada kanta objektif (100X) dan turunkannya sehingga hampir-hampir menyentuh permukaan slaid. 8. Amatilah apusan melalui kanta okular. 9. Pusingkan tombol pengatur fokus halus perlahan-lahan supaya objektif bergerak ke atas sehingga dapat memfokus sesuatu objek pada slaid. 10. Ulangi prosedur di atas dengan kanta objektif rendaman minyak (100X). Sebelum memulakannya terlebih dahulu naikkan kanta objektif (100X) sehingga ke had maksimum. Kemudian, letakkan satu titis minyak rendaman di dalam lingkaran apusan pada slaid. 15 11. Turunkan objektif semula sehingga terendam di dalam minyak rendaman dan hampir-hampir menyentuh slaid. 12. Sambil mengamati melalui kanta okular, putarkan tombol fokus halus perlahan-lahan supaya objektif bergerak ke atas sehingga anda dapat memfokus dan meneliti morfologi sel bakteria dengan jelas. 13. Setelah selesai pengamatan, gerakkan objektif ke atas menjauhi slaid. 14. Lapkan minyak rendaman daripada objektif dengan kertas kanta kering atau dibasahi dengan sedikit

xilena diikuti dengan kertas kanta kering yang bersih lainnya sejurus selepas setiap kali anda selesai melakukan pengamatan minyak rendaman. NOTA 1. Adalah suatu amalan yang baik jika dalam melaksanakan pemfokusan ke atas sesuatu objek, yang digerakkan adalah objektif mikroskop daripada permukaan slaid ke arah atas dan bukan sebaliknya. Ini kerana dalam sesetengah jenis/jenama mikroskop, objektif dapat diturunkan sehingga boleh melampaui paras pentas mikroskop dan apabila ini berlaku semasa pemfokusan besar kemungkinan penghujung objektif akan menekan ke atas slaid dan boleh menyebabkan slaid pecah. 2. Sebelum melakukan pengamatan, pastikan terlebih dahulu apusan pada permukaan slaid berada di sebelah atas atau slaid tidak diletakkan dalam keadaan terbalik. 3. Jika spesimen masih tidak kelihatan dengan kanta rendaman minyak ada kemungkinan spesimen tidak dapat difokus kerana tombol pengatur objektif mikroskop diputarkan terlalu cepat, atau minyak rendaman yang diletakkan di atas apusan tidak mencukupi, atau slaid melekat kepada kanta objektif dan turut bergerak ke atas semasa kanta digerakkan (masalah ini boleh diatasi dengan menekan slaid dengan satu jari semasa objektif digerakkan), atau mungkin juga slaid dalam keadaan terbalik

dan apusan berada di sebelah bawah. RAJAH 2.1 Komponen-komponen mikroskop cahaya Tiub binokular Bahagian mata ( eye piece ) Bahagian mercu yang berputar Objektif Pentas Kondenser Pentas mikroskop Lampu Tombol pengatur fokus 16 4. Penggunaan kertas tisu lain seperti kertas tisu muka, atau tisu tandas atau sapu tangan untuk membersihkan permukaan kanta hanya akan mengakibatkan calar ke atas kanta dan ini akan mempersulitkan pengamatan seterusnya. 5. Jika minyak rendaman pada kanta rendaman minyak tidak dilap dengan baik, lambat-laun debu akan melekat dan menutupi kanta tersebut dan akan menyebabkan pengamatan kabur serta

menimbulkan kesulitan. Tatacara Penjagaan Mikroskop Cahaya Iklim di Malaysia adalah lembap dan keadaan ini menggalakkan pertumbuhan fungus pada permukaan kanta mikroskop. Terdapat jenama mikroskop yang kantanya dilapisi dengan bahan kimia untuk mencegah masalah ini, tetapi perlindungan ini, dipercayai tidak berkekalan. Ia perlu dirawat secara berterusan khususnya dengan menyalutkan semula bahan kimia berkenaan pada waktu tertentu. Cara yang mudah dan baik untuk mengatasi hal ini adalah dengan menyimpan mikroskop di dalam bilik atau ruangan tertutup yang dilengkapi dengan alat penyahlembap (dehumidifier) yang akan mempastikan suasana udara di dalam bilik atau ruangan tersebut sentiasa kering. 17 3. PENGAMATAN MIKROB 3.1. PENGAMATAN BAKTERIA 3.1.1. PENGAMATAN PERGERAKAN BAKTERIA DI DALAM SUSPENSI CAIRAN Bakteria dalam keadaan semulajadi susah untuk diamati dengan mikroskop cahaya kerana bersifat transparen atau tidak mempunyai warna. Walau bagaimanapun, pengamatan dalam keadaan seperti ini terpaksa dilakukan juga, misalnya untuk menentukan pergerakannya (motiliti). Dalam hal ini terdapat dua tatacara yang boleh digunakan, iaitu pelekapan basah

dan titisan tergantung. Pengamatan motiliti bakteria di dalam suspensi cairan digunakan khusus untuk bakteria yang dikulturkan dalam media broth kerana tidak dapat tumbuh dengan baik pada media padat (agar). Tatacara Pelekapan Basah Bakteria BAHAN 1. Kultur bakteria (dalam botol media broth atau plat kultur) 2. Slaid mikroskop 3. Penutup slaid 4. Botol larutan salin (steril) TATACARA 1. Sterilkan gelung dawai melalui kaedah pembakaran dan biarkannya sehingga sejuk. 2. Letakkan setitis kecil salin steril di atas sekeping slaid mikroskop bersih. 3. Sentuhkan gelung dawai steril kepada 1 koloni bakteria pada plat kultar. 4. Buatkan suspensi bakteria dari gelung dawai di dalam titisan salin di atas. 5. Letakkan sekeping penutup slaid di atas suspensi bakteria seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3.1. 6. Amati pergerakan bakteria dengan kanta objektif 40X. Sekiranya menggunakan kultur broth tukarkan langkah 4 kepada berikut: 4a. Sterilkan gelung dawai melalui kaedah pembakaran dan biarkannya sehingga sejuk. 4b. Letakkan 1 gelung penuh kultur cecair bakteria (yang agak keruh atau tebal) ke atas slaid mikroskop.

Tatacara Pelekapan Titisan Tergantung BAHAN 1. Kultur bakteria (dalam botol media broth atau plat kultur) 2. Slaid mikroskop 3. Penutup slaid 4. Plastisin 5. Botol larutan salin (steril) TATACARA 1. Sediakan 1 titis suspensi bakteria di tengah-tengah sebuah penutup slaid mengikut tatacara pelekapan basah. 2. Buatkan 1 lingkaran/cincin plastisin berukuran tidak melebihi luas penutup slaid. 3. Letakkan lingkaran tersebut di atas penutup slaid supaya titisan suspensi berada tepat di tengah-tengah lingkaran plastisin dan tekan sedikit supaya lingkaran ini melekat kepada penutup slaid. 18 4. Letakkan sebuah slaid mikroskop yang bersih di atas lingkaran plastisin dan tekan sedikit supaya ia melekat kepada plastisin. 5. Angkat dan terbalikkan slaid mikroskop dengan cepat supaya penutup slaid berada di atas dan suspensi bakteria menjadi tergantung. 6. Amati pergerakan bakteria dengan kanta objektif 40X. NOTA

1. Intensiti cahaya perlu dikurangkan dengan menurunkan kondenser dan mengecilkan diafragma untuk memberikan kontras yang secukupnya. Ini membolehkan sel bakteria kelihatan lebih jelas dan pergerakannya dapat diamati dengan mudah. 2. Semasa melakukan pengamatan jangan letakkan tangan di atas meja ataupun menekan meja di mana mikroskop berada. Ini adalah untuk mengelak daripada suspensi bakteria mengalami gegaran goncangan yang akan menyulitkan pengamatan. 3. Dalam pergerakan Brown, partikel (termasuk bakteria) bergerak perlahan-lahan secara bolak-balik (to and fro) tanpa arah tertentu. Kadangkala kesemua partikel bergerak ke satu arah menurut aliran cecair, atau disebabkan mikroskop tergoncang, atau berlakunya RAJAH 3.1 Tatacara melakukan pelekapan basah Letakkan setitis larutan salin di atas slaid mikroskop bersih dan sentuh 1 koloni bakteria dengan gelung dawai dan buatkan suspensi. Letakkan sebuah penutup slaid mikroskop dan dengan berhati-hati lekapkan di atas suspensi bakteria (usahakan supaya tidak terbentuk gelembung udara). Amatilah pelekapan basah ini di bawah kanta objektif pembesaran 40X. Rajah muka surat 18 19 penyejatan dari sisi kaca penutup. Motiliti sebenarnya ditunjukkan dengan gerakan yang

aktif bercorak putaran, atau partikel individu bergerak dengan pantas menuju ke sesuatu arah tertentu. 4. Kebanyakan spesies yang diambil daripada kultur padat sering memberikan hasil yang negatif untuk motiliti (memperlihatkan tidak motil). Oleh yang demikian, untuk melakukan ujian motiliti, disarankan agar kultur cecair digunakan. Pengeraman optimum yang biasanya digunakan, dalam hal ini, adalah kira-kira 2 jam dan bagi kebanyakan bakteria, suhu pengeramannya adalah di bawah 37C, yakni 22C atau 25C. 5. Kelebihan tatacara ini daripada tatacara pelekapan basah adalah perubahan rupa bentuk (distortion) bakteria dikurangkan kerana tidak ditindih oleh penutup kaca. RAJAH 3.2 Tatacara melakukan pelekapan titisan tergantung Letakkan kaca penutup slaid di atas permukaan yang bersih dan titiskan, atau buatkan suspensi bakteria di atasnya. Dengan hati-hati letakkan cincin plastisin melingkari suspensi tanpa menyentuhnya. Kemudian letakkan sebuah slaid mikroskop yang bersih di atas plastisin dan tekan sedikit supaya melekat kepada plastisin. Dengan berhati-hati sekali angkat dan terbalikkan slaid mikroskop dengan cepat. Dengan demikian suatu suspensi bakteria yang tergantung akan dihasilkan.

20 3.1.2. PENYEDIAAN UNTUK PEWARNAAN BAKTERIA Tatacara Membersihkan dan Menyimpan Slaid Mikroskop BAHAN 1. Slaid mikroskop 2. Etanol 70% 3. Metanol 95% 4. Asid hidroklorik pekat PERSEDIAAN REAGEN Alkohol asid 0.5%. Campurkan 5 ml asid hidroklorik pekat kepada 1 liter etanol 70%. Lakukan di dalam kabinet asap. TATACARA 1. Rendam slaid kaca di dalam alkohol asid semalaman. 2. Cuci dengan air suling. 3. Simpan di dalam balang tertutup yang mengandungi metanol 95%. PERHATIAN Pastikan balang slaid tidak diletak berhampiran penunu Bunsen atau sebarang sumber api kerana alkohol mudah terbakar. Tatacara Membuat Apusan Bakteria BAHAN

1. Slaid mikroskop yang disimpan di dalam metanol 95% di dalam bekas yang tertutup 2. Forseps 3. Kertas turas 4. Penunu Bunsen 5. Gelung dawai 6. Pensil gris/pena tanda (marker) kalis air 7. Kultur bakteria 8. Larutan salin 0.85% (steril) TATACARA 1. Keluarkan slaid mikroskop yang disimpan di dalam bekas yang mengandungi alkohol dengan menggunakan sebuah forseps bersih. 2. Pegang slaid supaya aras tangan berada lebih tinggi daripada slaid. 3. Hapuskan alkohol dengan membakarnya dengan api penunu Bunsen. 4. Letakkan slaid di atas kertas penyerap dan biarkan sehingga sejuk. PERHATIAN 1. Jauhkan bekas slaid yang mengandungi alkohol daripada api. 2. Jangan pegang slaid yang dibakar dengan forseps secara tegak untuk mengelak kemungkinan alkohol mengalir ke atas tangan dan menyebabkan kebakaran. 21 Kultur bakteria dari broth 1. Sterilkan gelung dawai.

2. Letakkan 1 gelung penuh kultur cecair di atas sebuah slaid bersih. 3. Sebarkan suspensi bakteria sehingga membentuk bulatan seluas kira-kira 1 2 cm garis pusat. 4. Biarkan supaya kering di udara. 5. Tandakan sudut kiri atas slaid dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. 6. Terbalikkan slaid dan buatkan lingkaran di sekeliling kawasan apusan dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. Kultur bakteria dari media padat (agar) 1. Sterilkan gelung dawai. 2. Letakkan setitis kecil salin steril di atas sebuah slaid bersih. 3. Sentuh 1 koloni bakteria yang terasing dengan gelung dawai. 4. Buatkan suspensi bakteria daripada gelung dawai di dalam titisan salin. 5. Sebarkan sehingga membentuk bulatan seluas kira-kira 1 cm garis pusat. 6. Biarkan sehingga kering di udara. 7. Tandakan sudut kiri atas slaid dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. 8. Terbalikkan slaid dan buatkan lingkaran di sekeliling kawasan apusan dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. Swab yang mengandungi spesimen klinikal Letakkan setitis kecil salin steril di atas sebuah slaid dan emulsifikasikan spesimen dari swab di dalam titisan salin ini. Nanah dan eksudat

Ambil 1 gelung penuh spesimen dan sebarkannya di atas slaid supaya mencapai seluas 1.5 x 2.5 cm. Kahak (sputum) Pindahkan sedikit kahak dari bekas spesimen dengan swab steril ke atas sebuah slaid bersih dan sebarkan seluas 1.5 x 2.5 cm. Urin dan cecair serebrospina 1. Emparkan urin dan cecair serebrospina pada tekanan emparan 10,000 g selama 10 minit pada suhu bilik. 2. Tuangkan supernatan dan masukkan beberapa titis salin steril ke dalam tiub emparan ini. Kacau. 3. Letakkan setitis kecil salin steril di atas sebuah slaid. 4. Buat apusan dengan suspensi bakteria yang diperolehi. NOTA 1. Gunakan setitis suspensi sahaja supaya apusan cepat kering. 2. Gunakan sedikit kultur bakteria supaya apusan yang disediakan membentuk filem yang agak tipis. Pada apusan yang terlalu tebal, sel-sel bakteria akan kelihatan tersusun terlalu rapat dan padat sehingga sukar untuk menentukan morfologinya. 3. Suspensi bakteria harus disebarkan dengan baik supaya menghasilkan apusan yang sama rata. Jika tidak, sel bakteria berada dalam keadaan berkelompok dan kemungkinan pewarnaan yang didapati juga tidak sama rata dan morfologi sel individu sukar untuk ditentukan.

22 4. Dalam pengamatan ke atas sesuatu apusan dengan mikroskop, pastikan bahawa permukaan slaid mikroskop yang mengandungi apusan berada di sebelah atas menghadap kanta objektif. Permukaan slaid di mana terdapatnya apusan ini dapat dipastikan dengan tanda pensil gris yang dapat dikikis atau pena tanda kalis air pada permukaan bawah slaid. 5. Lazimnya, di sekeliling kawasan apusan (di sebelah bawah slaid) dilingkari dengan pensil gris atau pena tanda kalis air supaya tapak di mana terdapatnya apusan mudah dikesan untuk diletak tepat di bawah kanta objektif serta untuk meletakkan titisan minyak rendaman. Fiksasi Bakteria dengan Haba Sebarang proses yang membeku serta memejalkan sel bakteria dan strukturnya dikenali sebagai fiksasi . Sebelum bakteria diwarnai, ia terlebih dahulu difiksasi. Proses ini tidaklah semata-mata bertujuan untuk melekatkan sel bakteria kepada slaid, tetapi juga untuk mengekalkan (mengawet) struktur sel bakteria tersebut serta meningkatkan daya penglihatan ke atasnya. Justeru, fiksasi juga boleh membunuh bakteria. Di samping kebaikan dari segi kesihatan, pembunuhan bakteria adalah penting dalam pewarnaan kerana pada umumnya bakteria yang masih hidup sering bersifat kurang telap terhadap kebanyakan pewarna yang digunakan. Fiksasi boleh dilakukan dengan cara fizikal (haba, dehidrasi) dan cara kimia. Cara yang popular memfiksasi bakteria adalah dengan suatu menggunakan haba dari

sumber api. Tatacara Memfiksasi Bakteria dengan Haba BAHAN 1. Apusan bakteria ke atas slaid mikroskop 2. Penunu Bunsen TATACARA 1. Pegang salah satu penghujung slaid dengan ibu jari dan jari telunjuk dengan apusan di sebelah atas. 2. Lalukan slaid sekali dengan cepat ke dalam api penunu Bunsen. 3. Dengan cepat sentuhkan slaid ke atas tapak tangan. 4. Ulangi prosedur ini sebanyak 3 kali (kesemuanya). 5. Biarkan slaid dingin di udara. NOTA 1. Sebaik-baiknya, biarkan apusan sehingga benar-benar kering sebelum melakukan fiksasi. Pemanasan ke atas apusan yang basah dipercayai boleh mengakibatkan perubahan rupa (distortion) morfologi bakteria yang ketara. 2. Pemanasan yang berlebihan akan menyebabkan perubahan besar dalam bentuk sel bakteria atau sel bakteria menjadi pecah dan mengalami kerosakan. Akibatnya pewarnaan yang diusahakan akan sia-sia sahaja, sebab tidak akan memberikan hasil seperti yang diharapkan dan sebaliknya apa yang diperoleh ialah suatu keadaan yang dikenal sebagai artifak. 3. Adalah lumrah jika di dalam kelas amali terdapat pelajar yang memegang slaid dengan

forseps dan memasukkannya ke dalam api penunu Bunsen dengan tujuan untuk mengeringkan dan sekaligus memfiksasi apusan. Amalan ini tidak digalakkan kerana dengan cara demikian adalah sukar untuk menentukan sama ada fiksasi tercapai atau apusan telah terdedah kepada haba terlalu lama. Melalukan slaid dengan cepat ke dalam api penunu Bunsen sebanyak 3 kali adalah mencukupi bagi tujuan pemfiksasian. Slaid disentuhkan ke atas tapak tangan selepas setiap kali pemanasan. Ini selain mempastikan slaid tidak terlalu panas, juga akan menghilangkan haba dari slaid. Sekiranya slaid dirasakan terlalu panas pada tapak tangan maka besar kemungkinan sel bakteria pada apusan telah mengalami kehancuran atau telah berlaku artifak. 23 3.1.3. PEWARNAAN BAKTERIA Oleh kerana perbezaan indeks biasan antara bakteria dan kawasan sekelilingnya tidak besar, maka jurang perbezaan optikalnya juga adalah sedemikian. Keadaan ini mengakibatkan sel bakteria sukar untuk diamati. Tambahan pula, perbezaan indeks biasan yang kecil antara komponen-komponen sel bakteria juga menyulitkan substruktur bakteria untuk dilihat. Sebagai langkah untuk mengatasi masalah ini perbezaan warna digunakan untuk memudahkan melihat keseluruhan sel bakteria dan juga untuk mempamerkan substruktur bakteria dan segala-galanya mengenai bakteria dengan lebih terperinci. Pewarnaan juga digunakan untuk menunjukkan taburan dan jenis kimia berbagai-bagai komponen sel serta membezakan antara golongan-golongan bakteria. Pewarna dan Jenis Pewarnaan

Bahan pewarna boleh dibahagikan kepada dua golongan: pewarna asid dan pewarna bes. Pada pewarna asid, ciri pewarnaan adalah bergantung kepada anion (ion negatif) dan pada pewarna bes , ciri pewarnaan bergantung kepada kationnya (ion positif). Pewarna yang digunakan, umumnya, berasal daripada terbitan garam asid bebas kerana bentuk ini lebih larut, mampu menyusup masuk ke dalam sel dengan lebih baik dan pewarnaannya lebih kekal. Bakteria menunjukkan kecenderungan atau afiniti yang kuat terhadap pewarna bes (contoh: safranin, metilena biru, kristal ungu) kerana protoplasma bakteria mempunyai kandungan asid nukleik bercas negatif yang tinggi. Apabila diwarnakan dengan pewarna bes, cas yang negatif ini akan bertindak dengan ion positif pewarna bes. Sebaliknya cas negatif ini akan menolak pewarna asid, dengan demikian hanya latar belakang (kawasan di luar bakteria) sahaja yang diwarnai. Apabila sel bakteria diwarnakan dengan satu jenis pewarna sahaja, pewarnaan ini disebut pewarnaan sederhana (simple staining). Pada umumnya dalam pewarnaan ini, keseluruhan sel bakteria diwarnakan secara sama rata dan substruktur atau komponen-komponen selnya tidak dibezakan. Untuk menunjukkan perbezaan yang wujud di kalangan sel bakteria tertentu, tatacara pewarnaan perbezaan yang menggunakan dua atau lebih pewarna digunakan. Intensiti pewarnaan boleh dipertingkatkan (ataupun supaya sasaran dapat diwarnakan) dengan menggunakan haba dalam keadaan tertentu atau menggunakan bahan kimia ( aksentuator) seperti asid asetik, fenol atau anilin. Tindakan aksentuator ini tidak melibatkan

pergabungannya dengan pewarna seperti yang berlaku pada mordan. Mordan adalah bahan kimia yang membolehkan sesuatu pewarna mewarnakan sesuatu bahan, atau mordan mempertingkatkan afiniti ataupun kecenderungan pewarna terhadap struktur tertentu. Pewarnaan yang diterangkan setakat ini dikenal sebagai pewarnaan positif kerana yang diwarnakan ialah bakteria. Dalam pewarnaan negatif, satu filem pewarna gelap meliputi ruang dan celah di antara bakteria-bakteria (latar belakang) dan bakteria tidak diwarnakan. Perlu disedari bahawa ciri-ciri pewarnaan bakteria (serta morfologi) dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti umur kultur dan sumber bakteria, iaitu sama ada berasal daripada spesimen klinikal atau dari kultur pertumbuhan. Pewarnaan Gram Pewarnaan Gram adalah tatacara pewarnaan utama di bidang bakteriologi. Di samping membolehkan bakteria dilihat dengan lebih mudah, pewarnaan ini juga digunakan untuk menggolongkan bakteria. Dalam tatacara pewarnaan Gram, pewarna digunakan secara berlebihan dan kemudian agen penghapus warna atau pembeza digunakan untuk 24 menghilangkan pewarna berkenaan. Bakteria yang mengekalkan pewarna pertama (kristal ungu) disebut sebagai Gram-positif, manakala yang kehilangan pewarna ini dan diwarnai dengan pewarna kedua dinyatakan sebagai Gram-negatif. Larutan iodin Lugol yang berfungsi sebagai mordan dan pelarut organik seperti alkohol dan aseton digunakan digunakan sebagai

pembeza atau pengnyahwarna. Pewarna yang digunakan untuk menggantikan pewarna pertama yang dihilangkan oleh pembeza disebut pewarna balas (counter stain). Hasil tindak balas pewarnaan Gram adalah bergantung kepada komposisi dinding sel bakteria yang berkemampuan untuk mengikat pewarna pertama atau tidak. Protoplasma bakteria, dalam hal ini, sentiasa memberikan tindak balas Gram-negatif. Tatacara Pewarnaan Gram BAHAN 1. Kultur bakteria 2. Kristal ungu 3. Iodin Lugol 4. Aseton-alkohol 5. Safranin/karbol fuksin 6. Kertas turas Tatacara 1. Buat apusan bakteria pada slaid mikroskop, keringkan di udara dan fiksasi apusan tersebut. 2. Liputi apusan dengan kristal ungu selama 1 minit. 3. Cuci dengan air, kemudian singkirkan keseluruhan air tersebut. 4. Liputi pula apusan dengan iodin Lugol selama 1 minit, kemudian buangkan. 5. Pegang slaid di dalam sinki secara condong dan titiskan dengan cepat aseton-alkohol ke atas apusan sehingga tiada warna biru (kristal ungu) terlihat keluar dari apusan (lebih kurang 3-10 saat bergantung kepada ketebalan apusan).

6. Segera cuci dengan air. 7. Kemudian liputi apusan dengan safranin atau karbol fuksin cair selama 30 saat. 8. Cuci dengan air dan keringkan dengan kertas penyerap (lipat kertas turas/penyerap, masukkan slaid ke dalam lipatan dan tekan kertas dari luar sehingga semua air terserap daripada slaid tanpa menggosok permukaan slaid atau apusan). Nota: peringkat No. 8 = cuci & keringkan Pengamatan dan Pentafsiran Sel bakteria berwarna biru: Gram-positif. Sel bakteria berwarna merah/merah jambu: Gram-negatif. NOTA 1. Dalam kebanyakan spesies bakteria, reaksi Gram berubah dengan umur kultur. Kultur tua bakteria Gram-positif memberikan reaksi Gram tak tetap (Gram variable) ada sel yang terwarna biru dan ada yang terwarna merah bercampur di antara satu dengan lainnya. Ada juga bakteria Gram-positif seperti Corynebacterium yang mudah kehilangan warna pertamanya dan seringkali kelihatan sebagai Gram-negatif. 2. Pada beberapa spesies basilus aerobik yang menghasilkan spora (contoh, Bacillus subtilis), sel vegetatifnya akan terwarna Gram-negatif atau granul-granul di dalam sel diwarnakan Grampositif selama beberapa generasi selepas spora bergerminasi. 25 Pewarnaan Ziehl-Neelsen (Pewarnaan Tahan Asid) Mikobakteria yang diwarnakan dengan pewarna fenilmetana (contoh: fuksin bes) dalam larutan anilin

atau fenol akan mengekalkan warna tersebut meskipun telah didedahkan kepada asid yang kuat berbanding dengan bakteria jenis lain. Oleh yang demikian, bakteria golongan pertama ini disebut sebagai bakteria tahan asid . Sifat tahan asid ini merupakan ciri yang berfaedah dan penting dalam membezakan mikobakteria dengan bakteria lain. (Beberapa spesies aktinomiset juga tahan asid). Pada bakteria tahan asid, pewarna fenol mempunyai kelarutan yang tinggi di dalam sel dibandingkan dengan pembeza (penghilang warna). Oleh yang demikian, apabila bakteria yang didedahkan kepada penghilang warna, pewarna berkenaan kekal di dalam sel, manakala pada bakteria tak tahan asid pewarna tersebut akan hanya masuk ke dalam sel dan oleh penghilang warna. Di samping ciri-ciri ini, kadar resap pewarna pada sel yang tahan asid adalah rendah berbanding dengan sel tak tahan asid. Ciri-ciri ini disebabkan oleh perbezaan komposisi kimia (secara dan kualitatif) bakteria tahan asid dan bakteria tak tahan asid. Mikobakteria yang tahan asid mempunyai karbohidrat, alkohol dan asid lemak (seperti asid mikolik) yang tersendiri. Oleh yang demikian, dalam tatacara ini slaid perlu dipanaskan sehingga wap keluar kerana, dalam hal ini, kuantitatif kemudian disingkirkan daripada sel telah diwarnakan

haba digunakan munasabah.

untuk membolehkan

pewarnaan

terlaksana dalam

jangka masa yang

Tatacara Pewarnaan Ziehl-Neelsen BAHAN 1. Kultur bakteria 2. Karbol fuksin Ziehl-Neelsen 3. Alkohol asid 4. Metilena biru 5. Alkohol 6. Sebatang kaca yang satu penghujungnya dibalut kain kasa (gauz) 7. Kertas turas 8. Penunu Bunsen TATACARA 1. Buat apusan bakteria pada slaid mikroskop, keringkan di udara dan fiksasikan apusan tersebut. 2. Banjirkan apusan dengan pewarna karbol fuksin Ziehl-Neelsen. 3. Panaskan slaid dengan api pembakaran kain gauz yang dibasahi dengan alkohol. Lakukan ini sehingga keluar wap dari apusan selama 5-10 minit. (Pastikan pewarna tidak mendidih atau menjadi kering). 4. Biarkan sejuk dan cuci dengan air. 5. Tambahkan alkohol-asid (penghilang warna) selama 25-30 saat.

6. Cuci dengan air. 7. Liputi pula apusan dengan metilena biru selama 30 saat. 8. Cuci dan keringkan dengan kertas penyerap. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Sel bakteria berwarna merah: bakteria tahan asid. Sel bakteria berwarna biru kehijauan: bakteria tak tahan asid. NOTA 1. Pemanasan dilakukan dari bahagian bawah slaid (apusan di permukaan atas) yang diletakkan di atas rak pewarnaan iaitu dengan menggunakan api kecil penunu Bunsen. Sebaliknya boleh juga dengan menggunakan sebatang kaca yang salah satu penghujungnya 26 dibalut dengan kain yang dicelup di dalam alkohol dan kemudian dinyalakan. Elakkan daripada memanaskan slaid dan pewarna dengan memegang slaid dengan forseps dan memasukkannya langsung ke dalam api penunu Bunsen. 2. Kadangkala sel mikobakteria tidak terwarna sama rata dan kelihatan berjalur merah berselang-seli dengan bahagian tanpa warna atau kelihatan berbutir. Ini adalah suatu artifak yang disebabkan oleh beberapa faktor seperti kemurnian pewarna karbol fuksin, daya kelarutan fenol di dalam air dan kehadiran elektrolit di dalam larutan pewarna. 3. Jika spesimen klinikal digunakan, sel pesakit akan berwarna biru-kehijauan. Pewarnaan Albert (Pewarna Granul Metakromatik) Volutin bakteria (granul metakromatik) adalah bahan basofilik yang refraktif. Volutin ini terdiri

daripada polimetafosfat yang mempunyai berat molekul tinggi dan dihubungkaitkan dengan bakteria genus Corynebacterium. Jika diwarnai dengan kelihatan berwarna biru kehitaman dan bukan biru. Keadaan ini disebabkan oleh fenomena metakromasi yang melibatkan perubahan di dalam warna sesuatu bahan. Toluidina biru adalah pewarna metakromatik: apabila pewarna ini masuk ke dalam kompleks granul volutin yang besar, volutin ini mengubahkan spektrum serapan (absorption) toluidina biru supaya pada mata kasar pewarna ini kelihatan telah berubah warnanya dari biru kepada biru kehitaman. Tetapi jika metilena biru digunakan, granul volutin akan kelihatan merah dan bukan biru. Walau bagaimanapun, keadaan ini sebenarnya bukanlah merupakan fenomena metakromasi sungguhpun di dalam bidang bakteriologi ia dinyatakan demikian. Dalam keadaan ini, pendedahan metilena biru kepada udara menyebabkan sebahagian kecil daripada pewarna ini dioksidasi menjadi metilena ungu pada pH tinggi dan metilena ungu secara selektif mewarnakan volutin tersebut. Tatacara Pewarnaan Albert BAHAN 1. Apusan kultur bakteria 2. Pewarna Albert 3. Iodin Gram 4. Kertas turas toluidina biru, komponen ini akan

TATACARA 1. Buat apusan pada slaid mikroskop, keringkan dan fiksasikannya. 2. Liputi apusan dengan pewarna Albert selama 5 minit. 3. Cuci dengan air. 4. Liputi pula apusan dengan iodin Gram selama 1 minit. 5. Cuci dengan air dan keringkan. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Butir-butir berwarna biru kehitaman di dalam sitoplasma bakteria yang berwarna hijau: Kehadiran granul metakromatik. Sitoplasma bakteria yang berwarna hijau dalamnya: Tiada granul metakromatik. Pewarnaan Schaeffer-Fulton (Pewarnaan Spora) Bakteria Genus Bacillus dan Clostridium dicirikan dengan kehadiran struktur bulat atau bujur yang dinamakan spora (atau endospora ). Tapak atau kedudukan spora di dalam sel serta saiz spora berbanding dengan sel yang mengandunginya mempunyai kepentingan taksonomi. Spora bakteria hanya dapat diwarnakan jika mordan atau haba digunakan. Pemanasan meningkatkan ketelapan dinding spora sehingga pewarna malakit hijau dapat dengan mudah masuk dan mewarnai struktur ini. Semasa pendinginan/pencucian pewarna terperangkap di dalamnya, sedangkan pada sel tanpa butir-butir berwarna biru kehitaman di

27 vegetatif, ia tercuci bersih. Pewarna balas memberikan warna yang kontras supaya spora dapat dikesan dengan mudah. Pewarna malakit hijau nampaknya merupakan pewarna terbaik untuk pewarnaan spora bakteria. Tatacara Pewarnaan Schaeffer-Fulton (Pewarnaan Spora) BAHAN 1. Apusan kultur bakteria 2. Malakit hijau 5% 3. Safranin 4. Batang kaca yang dibalut kain kasa pada salah satu penghujungnya 5. Kertas turas 6. Alkohol TATACARA 1. Buat apusan pada slaid mikroskop, keringkan dan fiksasikannya. 2. Liputi apusan dengan malakit hijau 5%. 3. Panaskan sehingga wap keluar beberapa kali tetapi jangan sampai mendidih (tambah pewarna jika akan mengalami kekeringan). 4. Biarkan selama 1 hingga 3 minit. 5. Cuci dengan air. 6. Liputi pula apusan dengan safranin selama 30 saat. 7. Cuci dengan air dan keringkan dengan kertas turas.

PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Butir-butir berwarna hijau di dalam sel bakteria yang berwarna merah ATAU butir-butir berwarna hijau bertaburan di luar sel bakteria. Butir berwarna hijau adalah spora bakteria, manakala bahagian sel vegetatif bakteria berwarna merah. NOTA 1. Jika apusan bakteria tidak dipanaskan secukupnya, spora akan kelihatan tanpa warna atau berwarna pudar. 2. Oleh kerana sebahagian daripada sel telah mengalami lisis, di dalam apusan akan kelihatan spora yang bebas. Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India (Pewarnaan Kapsul) Pewarnaan negatif dengan dakwat India membolehkan bakteria diamati dalam keadaan masih utuh dan tanpa perubahan rupa bentuk yang disebabkan oleh agen kimia (contoh: pewarna) dan agen fisikal (contoh: haba) serta membolehkan morfologinya ditentukan dengan cepat. Walau bagaimanapun, tatacara ini jarang digunakan kecuali untuk mengamati kapsul, iaitu suatu struktur yang menyelubungi keseluruhan sel bakteria dan sukar untuk diwarnai. Teknik ini sebenarnya tidak mewarnai sebarang struktur pada mikroorganisma, tetapi granulgranul halus dakwat India hanya menghasilkan latar belakang yang gelap dalam bidang penglihatan. Disebabkan ketumpatan kapsul lebih rendah daripada sel, maka ia kelihatan lebih terang (di sekeliling sel). 28

Tatacara Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India (Pewarnaan Kapsul) BAHAN 1. Kultur bakteria 2. Larutan salin 0.85% (steril) 3. Penutup slaid 4. Slaid mikroskop 5. Dakwat India (Pelican TM atau Pilot TM ) TATACARA 1. Letakkan setitis kecil kultur cecair ke atas slaid mikroskop atau buatkan suspensi organisma dari sedikit pertumbuhan kultur muda mikroorganisma pada media padat di dalam setitis salin dengan menggunakan dawai inokulasi. 2. Campurkan dengan baik satu gelung kecil dakwat India ke dalam suspensi mikroorganisma yang telah disediakan. 3. Tutup campuran dengan penutup slaid. 4. Kurangkan cahaya mikroskop dengan menurunkan kondensernya dan amati kultur dengan objektif 40X (untuk fungus) atau objektif minyak rendaman (untuk bakteria). PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN

Kapsul kelihatan sebagai suatu lapisan cincin lutcahaya atau bersinar melingkari keseluruhan sel di atas latar belakang yang gelap. NOTA 1. Jika terlalu banyak dakwat digunakan bakteria mungkin tidak dapat dilihat kerana transmisi cahaya terhalang. 2. Intensiti cahaya perlu dikurangkan untuk memberikan kontras yang lebih baik. 3. Ia merupakan tatacara yang paling mudah untuk mengesan kehadiran kapsul dan sering digunakan ke atas spesies bakteria seperti Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae dan fungus Cryptococcus neoformans. Dalam hal ini, ia mempunyai nilai diagnostik. Pewarnaan Negatif Flagela dengan Asid Fosfotungstik Pengamatan flagela bakteria dapat dilihat dengan mikroskop cahaya selepas berlakunya pewarnaan seperti pewarnaan tatacara Gray. Namun demikian, tatacara pewarnaan flagela yang hasilnya kemudian diamati dengan mikroskop cahaya adalah sukar dilakukan. Tambahan pula, ia melibatkan penggunaan logam berat yang akan menyumbang kepada pencemaran alam sekitar. Sebagai pilihan lain, struktur flagela serta tapaknya lebih mudah dipastikan dengan mikroskop elektron melalui pewarnaan negatif dengan asid fosfotungstik. Tatacara Pewarnaan Negatif Flagela dengan Asid Fosfotungstik BAHAN 1. Kultur bakteria 2. Forseps jenis tukang jam tangan, bengkok No.7

3. Grid mikroskop elektron yang disaluti filem Formvar 4. Asid fosfotungstik 1.5%, pH 6.5 5. Kepingan kertas turas gred Whatman No. 1 6. Larutan salin 0.85% (steril) 7. Tabung yang steril 8. Gelung dawai 9. Penunu Bunsen 10. Alat penyimpan grid atau piring Petri yang dialas dengan kertas turas 29 TATACARA 1. Pindahkan 1 ml salin ke dalam tabung. 2. Sterilkan gelung dawai dan pindahkan 1 koloni bakteria ke dalam tabung. 3. Pindahkan 1 titis suspensi bakteria ke atas grid pada permukaan yang disaluti Formvar. 4. Biarkan 1 minit sebelum cairan diserap oleh kepingan kertas turas. 5. Pindahkan 1 titis larutan asid fosfotungstik ke atas grid berkenaan dan biarkan 1 minit. 6. Serapkan larutan asid fosfotungstik dengan menyentuhkan pinggir grid dengan kepingan kertas turas. 7. Simpan grid di atas alat penyimpan grid atau di dalam piring Petri yang dialas dengan kertas turas. Tatacara Pengamatan Grid yang Disaluti Spesimen Bakteria Selepas Pewarnaan Negatif Tatacaranya adalah seperti pengamatan partikel virus (lihat muka surat 41-42). Walau

bagaimanapun, oleh kerana saiz bakteria lebih besar daripada virus, kuasa pembesaran yang digunakan adalah di antara 5000 10 000 kali ganda sahaja. 3.1.4. PENGKELASAN BENTUK DAN SUSUNAN SEL VEGETATIF BAKTERIA Bentuk Kokus Susunan Bakteria yang membiak secara aktif mempunyai kecenderungan untuk mengekalkan susunan selnya yang menjadi ciri bakteria tersebut. Ini merupakan suatu kriteria yang berfaedah dalam pengenalpastian bakteria. Berbagai-bagai susunan sel bakteria dikenali dan telah ditentukan berdasarkan perbezaan dari segi pertumbuhan serta strukturnya. Susunan sel-sel basilus: Tak teratur Spiroket Berfilamen Sel tunggal Berpasangan Berantai 30 Susunan sel-sel kokus: Kokus tunggal Diplokokus Tetrad (berempat) Palisad Basilus Vibrio Spirilla

3.2. PENGAMATAN FUNGUS Seperti juga bakteria, pengamatan fungus boleh dilakukan sama ada melalui pemeriksaan secara langsung ke atas spesimen yang diambil, ataupun ke atas kultur dari sesuatu spesimen klinikal.

Pengamatan ke atasnya boleh dilakukan dalam bentuk pelekapan basah atau terhadap apusan fungus yang telah diwarnai. Berbeza dengan bakteria, di mana pelekapan basahnya hanya terhad kepada ujian motiliti, pelekapan basah fungus berperanan penting dalam pengenalpastian fungus serta diagnosis penyakit yang disebabkan olehnya. Beberapa pewarnaan yang digunakan dalam bidang bakteriologi juga digunakan dalam bidang mikologi sungguhpun prosedurnya disesuaikan untuk fungus. 3.2.1. PENGAMATAN FUNGUS DI DALAM SUSPENSI CAIRAN Pelekapan basah fungus di dalam salin dilakukan dalam pengamatan secara langsung fungus, dan jika perlu, perhitungan jumlah sel epitelium dan sel darah putih dapat dilakukan. Di dalam salin, keutuhan sel dan organisma tersebut dapat dikekalkan. Tatacara Pelekapan Basah Salin BAHAN 1. Spesimen yang disyaki mengandungi fungus 2. Larutan salin 0.85% 3. Kaca penutup slaid TATACARA 1. Letakkan 1 titis salin ke atas slaid mikroskop. 2. Tambahkan 1 titis spesimen. 3. Tutup dengan kaca penutup slaid. 4. Amati dengan objektif 10X (jumlah kuasa 100X) dan kemudian 40X (jumlah kuasa 400X). PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN

Fungus akan kelihatan refraktil, berkilat atau hijau pudar. PERHATIAN 1. Perbezaan di antara yis dengan gelembung udara dan sel darah merah: Sel yis mengandungi badan inklusi. Berantai 31 2. Perbezaan di antara hifa dengan benang kapas: Pinggiran atau lebar (kaliber) benang kapas tidak teratur dan serat benang sering berpilin atau kelihatan melingkari sesuatu paksi dan penghujungnya berumbai. 3. Perbezaan hifa dengan kristal panjang: Penghujung kristal tidak bersambung atau terputus-putus; bentuk kristal berbeza-beza dan larut air. 4. Mosaik fungus (artifak): Jaringan jisim yang mempunyai bentuk yang berbeza-beza dan tidak teratur, biasanya terletak di penghujung atau perbatasan sel. NOTA Intensiti cahaya dikurangkan, dengan kondenser mikroskop diturunkan untuk memberikan kontras yang secukupnya. Pelekapan Basah Kalium Hidroksida ( KOH) Spesimen kikisan kulit dan rambut diamati secara langsung untuk pengesanan fungus dalam pelekapan Berkelompok

basah yang terdiri daripada larutan penjernih . Kulit, rambut dan kuku, yang mengandungi keratin, adalah legap dan latar belakang ini boleh menyelubungi fungus. Masalah ini boleh diatasi dengan menggunakan beberapa persediaan yang boleh menghancurkan serta melarutkan keratin supaya latar belakang menjadi jernih. Jenis larutan kalium hidroksida penjernih termasuklah natrium lauryl 5% di dalam air suling, natrium sulfida 10% di dalam alkohol 20% dan larutan kalium hidroksida ( KOH) atau natrium hidroksida (NaOH). Penjernihan biasanya dilakukan dengan KOH mungkin kerana bahan kimia ini mudah didapati di dalam makmal. KOH (20%) melarutkan keratin dan memudahkan pengamatan ke atas hifa fungus. Gliserin yang ditambah mengakibatkan pelekapan menjadi lambat kering dan menghalang presipitasi KOH. Proses penjernihan dapat dipercepatkan melalui pemanasan. PERHATIAN Pelekapan KOH juga boleh digunakan untuk spesimen kahak ( sputum) atau spesimen daripada vagina yang banyak mengandungi bahan mukoid. Tatacara Pelekapan Basah Kalium Hidroksida ( KOH) BAHAN 1. Spesimen 2. KOH 10-20% 3. Kaca penutup slaid

4. Penunu Bunsen TATACARA 1. Letakkan 1 titis larutan KOH di tengah slaid mikroskop. 2. Masukkan spesimen ke dalam titisan KOH. 3. Tutup spesimen dengan kaca penutup perlahan-lahan. 4. Panaskan dengan api pilot penunu Bunsen sehingga pelekapan basah ini menjadi jernih tanpa pendidihan (5-20 minit). 5. Tekan kaca penutup slaid. 6. Amati dengan objektif 10X dan kemudian 40X (jumlah kuasa, masing-masing 100X dan 400X). Untuk kuku dan kikisan kulit yang keras, tatacara ini dapat diubahsuai dengan penambahan dimetil sulfoksida ( DMSO ) 40%. Pelekapan ini tidak dipanaskan dan diamati dalam masa 20 minit. 32 PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Hifa adalah dalam bentuk filamen kurus dengan bahagian tepinya sejajar dan disusun secara rawak berbanding dengan sel. NOTA 1. Intensiti cahaya dikurangkan untuk memberikan kontras yang secukupnya. 2. Penutup slaid ditekan untuk memperoleh sediaan yang tipis dan untuk mengeluarkan KOH yang berlebihan.

3. Jangan panaskan pelekapan KOH terlalu lama atau dengan suhu yang terlalu tinggi kerana akan terbentuk hablur KOH. 4. Dalam pengamatan ke atas fungus, jangan tersalah anggapan bahawa bahagian tepi sel (dinding sel) adalah hifa. 5. Persediaan menjadi lebih jernih dan oleh yang demikian, fungus lebih mudah dapat diamati jika dibiarkan 1 hingga 2 jam. 6. Pelekapan yang tidak jernih mungkin mengandungi artifak yang mirip dengan struktur fungus. Pelekapan Basah Lactophenol Cotton Blue (LCB) Pelekapan basah yang juga mengandungi sejenis pewarna akan memudahkan pengamatan fungus. Dalam hal ini, persediaan lactophenol cotton blue digunakan untuk membuat pelekapan basah fungus sama ada dari spesimen ataupun dari kultur untuk pengamatan mikroskop. Asid laktik mengekalkan struktur fungus serta menjernihkan latar belakang, fenol membunuh fungus, gliserol mengelak pelekapan basah menjadi kering dan pewarna cotton blue diserap oleh struktur kitin fungus dan mewarnainya, maka memudahkan fungus diamati. Tatacara Pelekapan Basah Lactophenol Cotton Blue (LCB) BAHAN 1. Spesimen fungus 2. Slaid mikroskop 3. Kaca penutup slaid

4. Jarum atau dawai dengan penghujungnya dibengkokkan 5. Lactophenol cotton blue ( LCB ) TATACARA 1. Titiskan 1 titis kecil LCB di tengah-tengah slaid mikroskop. 2. Ambil sebahagian kecil bahan fungus dari kultur dengan menggunakan jarum atau dawai bengkok di atas. 3. Masukkan spesimen ke dalam titisan LCB . 4. Leraikan bahan fungus ini dengan menggunakan 2 dawai. 5. Bakar jarum atau dawai apabila sudah selesai. 6. Tutup spesimen dengan kaca penutup dengan perlahan tanpa menekan spesimen. 7. Amati dengan objektif pembesaran 10X dan 40X. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Miselium (dinding dan septum sel) serta struktur spora (fruiting structures) kelihatan biru tua di atas latar belakang yang berwarna pudar (muda). 33 NOTA 1. Struktur fungus lebih mudah dilihat jika pelekapan ini dibiarkan selama kira-kira 10 minit. 2. Pada kultur fungus, ambillah spesimen daripada bahagian koloni yang terletak di antara tepi dan tengahnya: bahagian tepi dan tengah koloni biasanya terdiri daripada struktur yang sama ada terlalu muda atau terlalu tua dari segi pembentukan spora dan berkemungkinan

akan memberikan hasil pengamatan yang kurang memuaskan. 3.2.2. PEWARNAAN FUNGUS Pewarnaan Gram Semua fungus adalah Gram-positif. Kapsul Cryptococcus neoformans lazimnya menghalang sel yis ini daripada diwarnai dengan sempurna dan seringkali mengakibatkan ia kelihatan seperti bahan lemak Gram-negatif berwarna merah jambu pucat (lavender) dengan badan inklusi yang bergranul berwarna ungu (Gram-positif). Tatacara Pewarnaan Gram Tatacara tersebut adalah seperti yang dilakukan untuk bakteria (lihat pewarnaan Gram, muka surat 23-24). Pewarnaan Tahan Asid Diubahsuai Kinyoun Tatacara ini tidak menggunakan haba untuk memudahkan pewarna memasuki sel. Sebaliknya fungsi haba diambil alih oleh sejenis detergen (Tergitol) yang bertindak di atas permukaan sel. Aktinomiset adalah golongan bakteria yang hampir menyerupai fungus dan secara tradisional dirangkumkan ke dalam bidang mikologi. Nocardia adalah aktinomiset yang bersifat separuh tahan asid. Pewarna tahan asid yang digunakan untuk mikobakteria mungkin menyahwarnakan pewarna secara berlebihan ke atas spesies ini dan memberikan hasil yang negatif palsu. Oleh yang demikian,

suatu pengubahsuaian pewarnaan tahan asid perlu dilakukan khususnya untuk Nocardia . Tatacara Pewarnaan Tahan Asid Diubahsuai Kinyoun BAHAN 1. Kultur fungus (kontrol kultur positif, negatif, kultur yang diuji) 2. Karbol fuksin Kinyoun 3. Etanol 50% 4. Asid sulfurik 1% 5. Metilena biru 2.5% di dalam etanol 95% 6. Kertas turas 7. Penunu Bunsen TATACARA 1. Buatkan 3 apusan tipis. Masing-masing daripada kultur yang diuji, kontrol kultur positif dan negatif dan biarkan kering di udara. 2. Fiksasi apusan dengan haba. 3. Banjiri slaid dengan karbol fuksin Kinyoun dan biarkan selama 5 minit. 4. Cuci dengan air. 5. Banjiri dengan etanol 50% sehingga tiada lagi pewarna yang keluar (biasanya sejurus selepas alkohol ditambah). 6. Cuci dengan air. 7. Hilangkan pewarna dengan asid sulfurik 1% sehingga tiada lagi pewarna yang keluar. 8. Cuci dengan air yang mengalir.

34 9. Liputi dengan larutan metilena biru selama 1 minit. 10. Cuci dengan air dan keringkan. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Nocardia kelihatan merah manakala bakteria lain dan fungus kelihatan biru. Askus yis kelihatan merah manakala blastokonidia berwarna biru. Pewarnaan Asid Periodik-Schiff Dalam pewarnaan asid periodik-Schiff (periodic acid-Schiff mengoksidasi gugusan 1,2-glikol daripada polisakarid fungus ke gugusan aldehid. Grup aldehid yang reaktif ini bergabung dengan reagen Schiff-leuko-fuksin untuk menghasilkan warna fuksin merah ungu. Pewarnaan ini amat berguna untuk mengesan fungus pada keratan tisu serta apusan seperti kikisan kulit. Tatacara Pewarnaan Asid Periodik-Schiff BAHAN 1. Apusan spesimen pada slaid mikroskop 2. Metanol mutlak 3. Asid periodik 1% 4. Reagen Schiff 5. Metil hijau 2% 6. Air suling PA S ), asid periodik

TATACARA 1. Fiksasikan apusan dengan metanol mutlak selama 5 15 minit. 2. Cuci dengan air suling selama 15 minit dan keringkan. 3. Titiskan larutan asid periodik selama 10 minit. 4. Bilas seketika dengan air suling. 5. Titiskan reagen Schiff selama 20 minit. 6. Cuci dengan air paip selama 10 minit sehingga warna merah jambu muncul. 7. Balas warna dengan metil hijau selama 5 10 minit. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Fungus (dan juga komponen tisu) yang mempunyai polisakarida di dalam strukturnya kelihatan merah ungu, nukleus kelihatan biru dan latar belakang adalah hijau. NOTA 1. Keberkesanan tindakan pewarna Schiff boleh diuji dengan menitiskannya ke dalam formalin 40%. Reagen ini masih boleh digunakan jika ia cepat berubah menjadi ungu-merah. Sebaliknya, ia tidak boleh digunakan lagi jika tiada warna yang muncul atau warnanya ungubiru. 2. Aktinomiset tidak diwarnakan dengan baik atau langsung tidak diwarnakan dengan tatacara ini. Pewarnaan Metenamin-Argentum Gomori Pewarnaan metenamin-argentum Gomori dianggap sebagai pewarnaan yang amat berguna dalam penyaringan spesimen klinikal bagi fungus. Pewarnaan ini memberi kontras yang lebih ketara dan

biasanya mewarnakan elemen fungus yang tidak ditunjukkan oleh pewarnaan lain. 35 Tatacara Metenamin-Argentum Gomori BAHAN 1. Apusan spesimen pada slaid mikroskop 2. Ketuhar 3. Asid kromik 5% 4. Natrium bisulfit 1% 5. Larutan metenamin-argentum nitrat (pewarna Gomori) 6. Aurum (emas) klorid 0.1% 7. Natrium thiosulfat 2% 8. Larutan light green 0.04% 9. Alkohol mutlak; alkohol 95%; alkohol 70% 10. Xilena 11. Forseps yang disaluti parafin 12. Permount TM TATACARA 1. Letakkan slaid yang mengandungi apusan di dalam larutan asid kromik selama 1 jam. 2. Cuci dengan air paip selama 15 saat. 3. Bilas dengan natrium bisulfit selama 1 minit.

4. Cuci dengan air paip selama 5 10 minit. 5. Cuci 3 kali dengan air suling. 6. Letakkan slaid di dalam bekas yang mengandungi larutan metenamin-argentum nitrat dan eramkan bekas berkenaan di dalam ketuhar pada suhu 58-60C. 7. Gunakan forseps yang diselaputi dengan parafin untuk mengeluarkan slaid dari larutan metenamin-argentum nitrat dan celupkannya ke dalam air suling. 8. Periksa apusan dengan mikroskop untuk menentukan sama ada fungus telah terwarna perang tua atau memerlukan pengeraman yang lebih lama. 9. Bilas 6 kali dengan air suling apabila kontrol menunjukkan pewarnaan yang optimum telah dicapai. 10. Liputi apusan dengan larutan emas klorid 0.1% selama 2 hingga 5 minit. 11. Bilas dengan air suling. 12. Hilangkan argentum yang tidak tereduksi dengan natrium thiosulfat selama 2 hingga 5 minit. 13. Cuci dengan air. 14. Balas warna dengan pewarna light green selama 30-45 saat. 15. Keringkan dengan 2 pertukaran masing-masing alkohol 70%, 95% dan mutlak. 16. Jernihkan spesimen dengan 2 hingga 3 kali pertukaran xilena. 17. Lekapkan dengan media pelekap Permount TM . PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN

Dinding sel fungus (serta fiber retikulum dan fiber elastik tisu) terwarna hitam, manakala bahagian di dalam miselium dan hifa diwarnakan kelabu tua dan latar belakang adalah hijau muda. Cryptococcus neoformans diwarnai merah muda gelap atau merah. Komponen tisu sebagai latar belakang diwarnai kuning dengan nukleus berwarna hitam. NOTA 1. Larutan stok metenamin-argentum nitrat adalah stabil jika disimpan di dalam peti beku. Presipitasi putih yang muncul berikutan penyimpanan boleh dihilangkan dengan menggoncangnya. 2. Sesetengah bakteria (termasuk Nocardia spp) serta sesetengah komponen tisu juga diwarnakan. Oleh yang demikian semua yang diwarnakan kelabu tua tidak semestinya fungus. 36 3. Pastikan pewarnaan tidak menjadi telalu gelap hingga struktur morfologi halus tidak dapat diamati. 4. Nocardia serta fungus tua dan yang telah mati mungkin memerlukan masa pengeraman yang lebih lama (sehingga 90 minit) dengan larutan metenamin-argentum nitrat untuk diwarnai. 5. Tatacara ini boleh juga digunakan untuk keratan tisu dari ketulan parafin. Dengan spesimen jenis ini, keratan tisu terlebih dahulu dihilangkan parafinnya dengan 2 pertukaran rendaman di dalam xilena dan kemudian dihidrasikan melalui suatu urutan rendaman di dalam alkohol mutlak, alkohol 95% dan air suling. Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India

Pewarnaan ini digunakan untuk menunjukkan kehadiran kapsul yis, khususnya bagi Cryptococcus neoformans di dalam mendapan cairan serebrospina dalam diagnosis kes meningitis. Tatacara Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India Tatacara tersebut adalah seperti yang dilakukan ke atas bakteria (Rujuk tatacara yang sama bagi bakteria) 3.2.3. BENTUK DAN STRUKTUR FUNGUS DALAM KULTUR 1. Morfologi mikroskopik Morfologi fungus bermiselium Hifa: Saiz: garis pusat yang berbeza Pigmentasi: tanpa warna atau berwarna Berseptum atau tak berseptum Bercabang atau tak bercabang Spora aseksual: Bentuk spora yang dihasilkan secara langsung dari miselium vegetatif. Spora asekual (konidia) yang dihasilkan daripada hifa khas yang disebut konidiofor. Bercabang Tak bercabang Membengkak Artrokonidia (artrospora)

Blastokonidia (blastospora) Klamidokonidia (klamidospora) 37 Bentuk konidiofor:

Konidia Makrokonidia (konidia bersaiz besar pada fungus yang menghasilkan konidia yang besar dan kecil) Septum: Berseptum atau tanpa septum Bujur Bentuk: Berasingan Berkelompok Berantai Raket Berbentuk gada (clavate) Bernodul

Susunan dari konidiofor: Mikrokonidia (konidia bersaiz kecil pada fungus yang menghasilkan konidia yang besar dan kecil). Bulut/sfera Bujur (ovoid) Ala buah pear (piriform) Bentuk: Tunggal Sabit 38 3.3. PENGAMATAN VIRUS DENGAN MIKROSKOP ELEKTRON Dalam pengamatan bakteria dan fungus dengan mikroskop cahaya, spesimen yang akan diamati diletakkan pada sebuah slaid kaca yang kemudian diletak di atas pentas mikroskop. Dalam mikroskopi elektron, spesimen diletakkan di atas satu lapisan tipis plastik atau karbon yang disebut filem sokongan . Filem yang nipis serta lembut ini diletak ke atas suatu jaringan halus berbentuk Bertunas Multipel Gada

Sigar Bengkok dan berkeadaan tidak sempurna (distorted)

bulat yang dinamakan grid. Spesimen virus diletakkan di atas lapisan filem ini, diwarnakan secara negatif dan kemudian diamati dengan mikroskop elektron. Komponen asas mikroskop elektron adalah sumber elektron, dan satu siri kanta magnetik yang digunakan untuk membelok dan memfokuskan aliran elektron. Dalam elektron mikroskop jenis transmisi, aliran elektron yang digunakan sebagai sumber radiasi diarahkan ke atas spesimen. Dua elektromagnet mempunyai fungsi seperti kondenser mikroskop cahaya untuk memfokuskan aliran elektron ini ke atas spesimen tersebut. Penaburan elektron oleh spesimen menghasilkan imej yang diperbesar di atas layar pendaflour. Fokus yang halus boleh didapati dengan binokular berkuasa rendah. Mikroskop elektron transmisi mempunyai julat kuasa pembesaran di antara 1500 hingga 500000 kali dan had kuasa resolusi 0.5 nm berbanding dengan kuasa pembesar mikroskop cahaya yang hanya berkisar di antara 30 sehingga 1500 kali dan had resolusi 200 nm. Seperti juga bakteria dan fungus, pengamatan terhadap virus boleh dilakukan secara langsung, sama ada ke atas spesimen yang diambil ataupun ke atas kultur daripada sesuatu spesimen klinikal. Pengamatan ke atasnya boleh dilakukan dengan teknik mikroskopi elektron langsung ataupun dalam bentuk teknik pengubahsuaian mikroskopi elektron imun kesensitifan yang dapat meningkatkan

dalam pengesanan virus melalui mikroskopi elektron tersebut. Penyalutan Grid dengan Lapisan Formvar Virus perlu diletak di atas filem sokongan sebelum partikel virus dapat diwarnakan dan diamati. Bahan-bahan yang berfungsi sebagai filem sokongan adalah plastik nitroselulos (contoh Parlodion TM ), plastik formal polivinil (Formvar TM ), karbon murni, dan kedua-dua jenis plastik tersebut yang distabilkan oleh karbon. Filem sokongan ini diletakkan di atas grid kuprum berbentuk jaringan halus. Tatacara Penyalutan Grid dengan Lapisan Formvar BAHAN 1. Formvar E larutan 0.5% di dalam kloroform 2. Grid kuprum 400 mesh, garis pusatnya bergantung kepada jenis mikroskop elektron 3. Slaid mikroskop 4. Pisau cukur 5. Mangkuk kaca ~ 10 cm isipadu 6. Forseps 7. Air suling

TATACARA 1. Slaid dicelupkan ke dalam larutan formvar selama 15 20 saat. 2. Slaid berkenaan kemudian dikeluarkan dan permukaan slaid dipegang secara tegak dengan paksi panjangnya agak disendengkan dan biarkan sehingga kering. 3. Isikan bekas air dengan air suling sehingga penuh. Tunggu sehingga semua gelembung udara bergerak ke permukaan air. 4. Potong filem di bahagian yang berhampiran dengan tepi slaid supaya terdapat filem berbentuk segi empat. 39 5. Pegang slaid berdekatan dengan mulut dan keluarkan nafas dengan kuat supaya permukaan filem diliputi dengan wap yang terkondensasi dari mulut. 6. Masukkan slaid ke dalam air pada sudut 30 darjah supaya filem terapung bebas pada permukaan air. 7. Letakkan grid dalam 2 barisan di atas filem yang terapung-apung di atas air tersebut. 8. Tekan grid perlahan-lahan dengan forseps untuk mencapai sentuhan yang baik di antara filem dan grid. 9. Letakkan sekeping kertas turas di atas filem dan apabila kertas ini tenggelam ia dikeluarkan dan filem dibiarkan sehingga menjadi kering. NOTA 1. Gunakan slaid mikroskop baru yang sengaja dilap dengan kertas pengering tangan. Slaid yang dicuci dengan teliti (dengan asid alkohol) akan melekatkan filem dengan kuat sehingga

membuatkannya sukar untuk ditanggalkan daripada slaid. 2. Pastikan air yang digunakan bersih. Penyalutan Virus Ke atas Grid dan Pewarnaan Negatif: Teknik Mikroskop Elektron Secara Langsung Spesimen diletakkan di atas filem sokongan melalui kaedah pemindahan titisan tunggal sebelum pewarnaan dilakukan. Proses perlekatan bahan protein ke atas filem memerlukan beberapa saat sahaja dan selepas itu, ia tidak akan tanggal lagi kecuali jika dilarutkan atau dihadamkan. Oleh yang demikian, proses yang berikutnya, seperti pewarnaan virus, dapat dilakukan tanpa kehilangan virus. Pewarnaan negatif melibatkan penanaman (embedding) bahan kecil yang berpartikel, seperti virus, ke dalam suatu lapisan bahan berketumpatan tinggi supaya spesimen dapat diamati sebagai objek yang cerah di atas latar belakang gelap. Keadaan ini wujud kerana kawasan yang mempunyai lebih pewarna seperti kawasan di sekeliling virus dan celah-celah permukaan virus akan menaburkan lebih elektron berbanding dengan kawasan yang kurang pewarna. Oleh yang demikian, jumlah elektron yang sampai ke layar dari kawasan yang mempunyai lebih pewarna adalah lebih rendah dan menyebabkan kawasan ini kelihatan lebih gelap daripada kawasan lainnya. Terdapat beberapa pewarna negatif seperti natrium fosfotungstat, natrium tungstat dan garam

uranium seperti uranil asetat. Tetapi natrium fosfotungstat merupakan pewarna negatif yang utama. Tatacara Pewarnaan Negatif dengan Asid Fosfotungstik BAHAN 1. Sampel virus 2. Forseps halus jenis tukang jam yang bengkok No.7 3. Grid mikroskop elektron yang disaluti filem Formvar 4. Kepingan kertas turas gred Whatman No. 1 5. Kertas lilin 6. Asid fosfotungstik 1.5%, pH 6.5 TATACARA 1. Letakkan setitis (~ 20 l) suspensi virus, air suling dan pewarna dalam 1 barisan di atas sekeping kertas gris. 2. Apungkan 1 grid dengan permukaan filem sokongannya bersentuhan dengan titis suspensi virus selama 3 minit. 3. Dengan forseps halus keluar dan sentuhkan tepi grid dengan sekeping kertas turas supaya dapat menghilangkan cairan yang berlebihan. 40 4. Letakkan grid tersebut di atas kertas gris dan biarkan sehingga kering. 5. Apungkan grid dengan permukaan yang didedahkan kepada virus di atas titisan air suling selama 30 saat.

6. Keluar serta hilangkan cairan yang berlebihan. 7. Apungkan grid dengan permukaan yang didedahkan kepada virus ke atas titis pewarna selama 30 saat. 8. Keluar dan hilangkan cairan yang berlebihan. 9. Pindahkan grid ke sekeping kertas turas yang terletak di dalam sebuah piring Petri. NOTA 1. Asid fosfotungstik seharusnya disediakan dengan menggunakan air suling steril. Ia diagihagihkan dalam jumlah kecil ke dalam botol dan disimpan beku kecuali satu botol untuk kegunaan semasa yang seharusnya disimpan di dalam peti beku. Buang sediaan ini apabila didapati berubah kepada warna kebiruan. 2. Permukaan grid yang disaluti dengan filem yang digunakan untuk melekatkan virus adalah permukaan di sebelah atas kertas turas. 3. Pegang grid dengan kemas dengan menggunakan forseps kerana grid-grid ini amat ringan dan mudah terlepas daripada forseps akibat tarikan tegangan permukaan titisan cecair. 4. Cecair yang berlebihan disingkirkan dengan menyentuhkan bahagian tepi grid sambil dipegang dengan penghujung forseps. Kertas turas yang dikoyak adalah lebih berkesan daripada yang digunting. 5. Bagi spesimen multipel, elakkan daripada berlakunya pencemaran silang dengan menggunakan forseps yang berbeza atau mencelupkan forseps yang telah digunakan di dalam air mendidih setiap kali sebelum digunakan semula. Teknik Mikroskopi Elektron Imun

Kesensitifan mikroskopi elektron (ME) boleh dipertingkatkan iaitu dengan menggunakan antibodi yang spesifik untuk mengelompokkan partikel-partikel virus. Cara ini juga digunakan untuk menentukan identiti virus yang tidak mempunyai morfologi permukaan yang khusus. Tatacara Mikroskopi Elektron Imun BAHAN 1. Sampel virus 2. Forseps halus jenis tukang jam tangan 3. Grid mikroskop elektron yang disaluti filem Formvar 4. Asid fosfotungstik 1.5%, pH 6.5 5. Kepingan kertas turas gred Whatman No. 1 6. Kertas lilin 7. Antiserum yang spesifik terhadap virus berkenaan 8. Larutan salin ditampan fosfat TATACARA 1. Larutkan antiserum dalam larutan salin ditampan fosfat (nisbah antiserum: larutan salin yang digunakan bergantung kepada sediaan antiserum). 2. Campurkan 15 l virus dengan 15 l tiap larutan antiserum ke atas sekeping kertas lilin. 3. Letakkan kertas lilin dengan campuran virus/antiserum di dalam piring Petri yang dialas dengan kertas turas lembap. 4. Eramkan campuran virus/antiserum di dalam bekas ini selama satu jam pada 37C.

5. Letakkan campuran ke atas grid dan warnakan mengikut bahagian tatacara menyaluti grid dengan virus & tatacara pewarnaan negatif dengan asid fosfotungstik di muka surat 39-40. 41 NOTA 1. Dalam tatacara ini, tidak semestinya IgG atau IgM yang murni digunakan. Serum biasa pun sudah mencukupi. 2. Serum haruslah didedahkan kepada suhu tinggi (56C) sebelum digunakan untuk menghapuskan komplemen yang boleh melisiskan sampul (envelop) virus. 3. Campuran virus dan antiserum daripada satu siri pencairan dilakukan untuk mendapatkan konsentrasi antibodi yang optimum untuk menghasilkan pengelompokan virus. Dalam keadaan antibodi yang berlebihan, partikel virus akan disaluti dengan suatu lapisan protein yang tebal dan ini akan menyukarkan pengamatan ke atas struktur virus serta menyebabkan perubahan bentuk vitus berkenaan. 4. Suspensi virus murni boleh menyebabkan partikel virus dikelompokkan secara spontan. Oleh yang demikian, adalah amat penting sekali, jika teknik ini dilakukan dengan menggunakan spesimen tanpa campuran antibodi sebagai kontrol. Pengamatan Spesimen Virus Terletak di atas Grid Mikroskop Elektron Persediaan penggunaan mikroskop memerlukan seseorang yang terlatih di dalam bidang ini. Apa yang akan dibentangkan dalam bahagian ini adalah cara untuk memasukkan spesimen ke dalam mikroskop dan beberapa petua untuk mengamati virus. Tatacara Pengamatan Spesimen Virus dengan Mikroskop Elektron

BAHAN 1. Grid yang diliputi dengan spesimen yang diwarnakan 2. Mikroskop elektron jenis transmisi TATACARA 1. Letakkan spesimen dengan menggunakan forseps di dalam ruang khas pemegang spesimen (berhati-hati supaya tidak tersentuh bahagian pemegang spesimen yang akan diletakkan di dalam ruang hampas udara). 2. Letakkan batang pemegang spesimen ke dalam tapak yang ditetapkan dan tunggu sehingga lampu merah padam, iaitu sebagai isyarat bahawa ruang hampas udara telah pun dicapai di dalam ruang spesimen. 3. Putarkan batang pemegang ke arah lawan pusingan jam, supaya spesimen mencapai tempat yang ditetapkan. 4. Kurangkan kuasa pembesaran kepada 80 kali dan pilih satu kawasan (segi empat sama) untuk diamati. 5. Naikkan kuasa pembesaran kepada 60,000 kali ganda dan dalam masa yang sama pusatkan semula pancaran elektron serta tingkatkan intensitinya. 6. Putarkan tombol fokus sehingga memperolehi imej yang paling jelas. 7. Amati layar melalui tingkap pengamatan. Skan secara teratur kawasan di dalam segi empat tepat yang dipilih supaya seluruh kawasan diamati. 8. Untuk mengamati sesuatu objek dengan lebih teliti dan mendalam, gunakan binokular. NOTA

1. Dalam memilih segi empat tepat untuk diamati, janganlah mendapatkan kawasan yang gelap kerana virus akan terlindung/tersembunyi dan susah untuk diamati. Juga, dalam hal ini, janganlah memilih segi empat yang kelihatan terlalu bersih kerana ia tidak dapat memberikan kontras yang baik di antara virus dengan latar belakangnya. 2. Saiz serta bentuk virus, jika diketahui, akan banyak membantu dalam proses pencarian virus berkenaan. 42 3. Oleh kerana terdapat kemungkinan bahawa taburan virus di atas filem grid tidak rata, amatilah 5 segi empat tepat, iaitu yang berada di tengah, bawah, atas serta kiri dan kanan grid sebelum spesimen tersebut dapat dianggap sebagai tidak mengandungi virus (iaitu pada tahap kesensitifan mikroskop elektron dalam mengesan virus). 3.4. REAGEN PEWARNAAN: RUMUSAN DAN PERSEDIAAN 1. Albert, larutan pewarna Albert Larutkan 0.15 g toluidina biru dan 0.2 g malakit hijau di dalam 2 ml etanol 95%. Campurkan 1 ml asid asetik dan tambahkan 100 ml air suling.

2. Aseton-alkohol Campurkan aseton dan etil alkohol 95% dalam nisbah isipadu yang sama. 3. Alkohol asid Campurkan 5 ml asid hidroklorik dengan 95 ml etanol 95%. 4. Asid sulfurik

Campurkan 1 ml asid sulfurik pekat ke dalam 100 ml air suling. Lakukan di dalam almari asap. 5. Karbol fuksin Ziehl-Neelsen Larutkan 4 g fuksin bes di dalam 20 ml etanol 95%. Larutkan 5 g fenol di dalam 100 ml air suling. Campurkan kedua-dua sediaan ini. 6. Karbol fuksin Kinyoun Larutkan 2 g fuksin bes di dalam 10 ml etanol 95%. Larutkan 8 g fenol di dalam 100 ml air suling. Campurkan kedua-dua sediaan ini. 7. Karbol fuksin (0.05%) Larutan 0.05g fuksin bes di dalam 100 ml air suling. 8. Iodin Gram Larutkan 1 g kalium iodid di dalam 70 ml air suling. Tambahkan 0.5 g iodin dan tambah air sehingga mencapai 100 ml. Goncang sehingga keseluruhan iodin tersebut larut. 9. Kristal ungu Larutkan 1 g kristal ungu di dalam 100 ml air suling. 10. Lactophenol cotton blue Campurkan 20 ml asid laktik dengan 40 ml gliserol dan 40 ml air suling. Tambahkan 20 g kristal fenol dan larutkan dengan air panas di dalam penganggas air pada suhu 70C. Kemudian tambahkan 0.075 g cotton blue. Larutkan pewarna cotton blue dengan meletakkan bekas di dalam penganggas air. Saring larutan ini dengan kertas turas. 11. Light green, Larutan pewarna

Larutkan 0.2 g Light Green, SF yellowish di dalam 100 ml air suling dan tambah 0.2 ml asid asetik glacial . Campurkan 1 bahagian larutan stok ini dengan 5 bahagian air suling untuk digunakan dalam pewarnaan. 12. Malakit hijau (5.0%) Larutkan 5 g pewarna di dalam 100 ml air suling. 13. Metilena biru (0.3%) Larutkan 0.3 g metilena biru di dalam 30 ml etanol dan tambahkan 100 ml air suling. 43 14. Metenamin-argentum nitrat, larutan stok Campurkan 50 ml larutan argentum nitrat 5% yang disediakan di dalam air suling dengan 100 ml metenamin (heksa-metilena-tetra-amin) 3% yang disediakan di dalam air suling. 15. Metenamin-argentum nitrat, larutan pewarnaan Larutkan 2 ml boraks (borax) 5% di dalam 25 ml air dan kemudian campurkan larutan ini dengan 25 ml larutan stok metenamin-argentum nitrat. 16. Reagan Schiff-leuko-fuksin Larutkan 1g fuksin bes di dalam 200 ml air suling yang mendidih. Kemudian kurangkan suhu kepada 50C dan saringkan dengan kertas turas. Tambahkan 20 ml 1N HCl dan 1g kalium metabisulfit bentuk kontang. Biarkan di tempat gelap selama 2 hari. Tambahkan 0.5 g arang kayu yang teraktivasi dan goncang sekali-sekala dalam tempoh 1 jam. Saring dengan kertas turas dan simpan larutan reagen Schiff ini di dalam botol gelap di dalam peti beku. 17. Safranin (0.5%)

Larutkan 0.5 g safranin di dalam 100 ml air suling. 44 4. PENGKULTURAN MIKROB Mikroorganisma dan virus dikulturkan untuk beberapa tujuan. Dalam mikrobiologi diagnostik, ujian yang dijalankan ke atas kultur sesuatu mikrob tertentu dapat membantu mengenal pasti atau menentukan identiti mikrob berkenaan. Jika mikrob ini merupakan suatu agen baru yang mungkin belum dikenali, melalui pengkulturan dapatlah diwujudkan satu sumber atau bekalan kultur agen berkenaan supaya kajian boleh dijalankan untuk menentukan ciri-cirinya. Dalam bidang perindustrian dan bioteknologi, mikrob merupakan salah satu komponen yang harus diperolehi bagi penghasilan sesuatu produk, misalnya vaksin. Keadaan pengkulturan mikrob adalah berbeza-beza bergantung kepada jenis mikrob, misalnya bakteria ataupun virus. Kadangkala keadaan yang berbeza ini wujud walaupun di kalangan mikrob daripada golongan yang sama. 4.1. PENGKULTURAN BAKTERIA 4.1.1. JENIS MEDIA KULTUR Media kultur digunakan terutama untuk pertumbuhan bakteria (dan mikroorganisma lain) dan terdapat dalam bentuk pepejal, separuh pepejal dan cecair. Di samping pertumbuhan, media

juga digunakan untuk pemencilan, ujian motiliti dan menentukan ciri-ciri metabolik dan fisiologi bakteria. Media boleh dibahagikan kepada media sintetik (media yang diketahui kandungannya) dan media tiruan atau kompleks. Media sintetik adalah media yang semua komponennya merupakan bahan kimia yang nyata dan spesifik daripada segi kandungannya; manakala media tiruan adalah media yang mengandungi bahan-bahan kompleks seperti ekstrak daging lembu, yis atau darah di mana kandungannya kurang jelas atau tidak dapat dipastikan. Dari segi penggunaan, media kultur dibahagikan kepada beberapa golongan: Media dasar (juga dipanggil media nutrien atau media basal) yang mengandungi infusi , pepton , garam dan air. Infusi Ekstraks daging. Pepton Hasil daripada penghadaman enzim ke atas bahan organik. Contoh; Pepton soya disediakan daripada tindakan enzim terhadap kacang soya, pepton P adalah penghadaman daging oleh pepsin. Contoh: Agar nutrien, broth nutrien, broth infusi (otak-jantung, jantung, otak atau hati). Media diperkaya (enriched media) adalah media dasar yang dicampurkan dengan bahan yang boleh menggalakkan pertumbuhan seperti cecair tubuh (contohnya darah, serum), vitamin tertentu, asid amino, protein atau sebarang nutrien yang memiliki ciri yang khas dan tepat. Media pengaya (enrichment media) digunakan untuk pertumbuhan bakteria yang tidak tumbuh

baik pada media dasar atau kerana pertumbuhannya pada media ini lebih baik dan cepat berbanding dengan bakteria yang lazimnya tumbuh dengan pesat dan seringkali mengatasi kecepatan pertumbuhannya dalam media dasar. 45 1. Contoh media diperkaya Nama media Bahan campuran khas Agar darah Darah utuh Agar coklat Darah yang dipanaskan Broth (atau agar) serum Serum Agar darah triptos Darah, triptos Agar Mueller-Hinton Kanji Sumber darah: kambing biri-biri, arnab atau kuda. Media pemilih (selective) adalah media dasar atau media diperkaya yang dicampurkan dengan bahan yang menghalang pertumbuhan majoriti jenis bakteria dan memberikan kelebihan kepada segolongan kecil bakteria lain yang diinginkan untuk tumbuh. Media ini juga meningkatkan peluang untuk memencilkan bakteria tertentu di dalam sesuatu kultur campuran. Media pembeza (differential) adalah media dasar atau media diperkaya yang mengandungi bahan kimia

khusus yang akan bertindak ke atas sesetengah jenis bakteria melalui cara yang membolehkan bakteria berkenaan dikenali, misalnya dalam bentuk perubahan warna koloni (fermentasi) ataupun perubahan kepada media itu sendiri (hemolisis). Pada hakikatnya, kebanyakan media pembeza juga mempunyai reagen yang dapat menghalang pertumbuhan bakteria tertentu dan dalam hal ini, ia juga dianggap sebagai media pemilih. Media pengaya (enrichment) digunakan untuk pemencilan (misalnya patogen usus) dengan merencat atau menekan pertumbuhan saprofit dan/atau flora normal tubuh. Dari segi fungsi, media pengaya boleh juga disifatkan sebagai media pemilih. Sebagai contoh, dalam broth selenit F natrium selenit pada pH 7.0 adalah toksik terhadap bakteria koliform dan dengan demikian, ia memberi peluang kepada Salmonella dan/atau persaingan pertumbuhan spesies koliform lainnya. 2. Contoh media yang mempunyai ciri pemilih dan pembeza Nama media Bahan pemilih Ciri pembezaan Ciri Indikator MacConkey Hempedu Fermentasi laktosa Neutral red Potassium telurit Kalium telurit Reduksi telurit Kalium telurit Shigella untuk membiak dengan lebih baik kerana kekurangan atau ketiadaan

Deoksikolat sitrat Natrium deoksikolat Fermentasi laktosa Neutral red Kesan penghasilan H 2 S Ferik ammonium Sitrat Garam manitol Natrium klorida Fermentasi manitol Fenol merah Lowenstein-Jensen Malakit hijau Fermentasi laktosa akan menyebabkan koloni menjadi merah atau merah jambu. Fermentasi manitol menghasilkan koloni bakteria berwarna kuning. Penghasilan H 2 S akan menukar ferik ammonium sitrat kepada ferik sulfida dan pembentukan warna hitam pada koloni bakteria. Reduksi telurit akan menghasilkan koloni berwarna hitam. 46 4.1.2. BENTUK MEDIA AGAR Media kultur dipadatkan dengan agar dan disediakan dalam 2 bentuk, sebagai satu lapisan rata di dalam plat Petri (juga dipanggil plat agar/piring agar) dan dalam bentuk cerun (agar cerun/ condong) di dalam tabung atau botol. Tiap-tiap bentuk agar mempunyai fungsi tersendiri. Pada umumnya, bakteria dikulturkan ke atas plat media agar melalui teknik plat garisan untuk mendapatkan koloni bakteria yang terpencil, manakala pengkulturan pada cerun agar digunakan

untuk ujian biokimia atau sebagai kultur simpanan. Tatacara Menyediakan Plat Media Agar BAHAN 1. Media agar 2. Bikar air yang mendidih 3. Penganggas air 4. Piring Petri TATACARA 1. Larutkan media agar berisipadu kecil di dalam bikar air mendidih dan media agar berisipadu besar di dalam penganggas air atau autoklaf. 2. Letakkan larutan media agar ke dalam penganggas air bersuhu 50C. 3. Tuangkan 15 20 ml agar ke dalam setiap piring Petri bergaris pusat 90 cm. 4. Putarkan plat supaya agar tersebar sama rata. 5. Biarkan sehingga beku. 6. Eramkan secara terbalik dengan penutup dalam keadaan terbuka pada suhu 37C selama semalaman. 7. Pada keesokan harinya pastikan tiada pertumbuhan (bakteria/fungus) atau kontaminasi berlaku ke atas media. 8. Tutup plat dan simpan pada suhu 4 8C jika tidak digunakan. NOTA

1. Sungguhpun suhu yang tinggi diperlukan untuk mencairkan agar, apabila keseluruhan agar menjadi cair, suhu tersebut mestilah diturunkan kepada 48C sebelum darah dan bahan lain yang tidak tahan panas dicampurkan. Sebaliknya jika agar dibiarkan sehingga terlalu sejuk, besar kemungkinan bahan pelengkap (supplement) ini tidak akan bercampur dengan baik dan merata di dalam media. 2. Pada agar yang tidak mengandungi bahan protein seperti darah, ada baiknya juga jika media agar dituangkan selepas suhu diturunkan kerana ini akan mengurangkan pemeluapan. 3. Elakkan daripada menggoncang media agar sebelum dituangkan ke dalam plat. Tindakan menggoncang ini hanya akan menyebabkan pembentukan gelembung udara di dalam media dan mengakibatkan media plat yang tidak rata apabila membeku kelak. Jika setelah penuangan media, masih terdapat gelembung udara pada permukaan media plat, segera hilangkan dengan mengarahkan/ melalukan api penunu Bunsen ke atas gelembung-gelembung tersebut sehingga semuanya terhapus/ tersingkir sebelum media menjadi beku. 4. Semasa media agar digunakan, pastikan permukaannya tidak basah. Jika didapati demikian, media tersebut perlulah dikeringkan terlebih dahulu kerana penginokulasian di atas media yang berkeadaan sedemikian hanya akan menyulitkan pemencilan mikroorganisma nantinya. Koloni-koloni bakteria

yang seharusnya telah terasing, akan saling bersentuhan dan bercantum semula di antara satu dengan lain; apatah lagi jika di kalangan bakteria yang ingin dipencilkan terdapat spesies yang dapat bergerak atau menunjukkan kemampuan untuk menyebar (swarming), misalnya Proteus spp. 47 Tatacara Menyediakan Media Agar Condong/Cerun BAHAN 1. Media agar 2. Bikar air yang mendidih 3. Penganggas air 4. Tabung/botol TATACARA 1. Tuangkan 10 hingga 15 ml media agar yang telah dicairkan ke dalam setiap tabung atau botol. 2. Tutup tabung atau botol tersebut dan sterilkan. 3. Setelah pensterilan, letakkan tabung atau botol dalam keadaan condong dan biarkan membeku pada suhu bilik. 4. Simpan media cerun agar pada 4 8C jika tidak digunakan. NOTA 1. Media agar untuk tujuan persiapan media agar cerun disediakan dan dibahagi-bahagikan ke dalam

tabung atau botol dan kemudian disterilkan. Ini boleh mengelakkan daripada tercemar semasa membahagikan media yang telah disterilkan terlebih dahulu ke dalam tabung atau botol, sungguhpun teknik aseptik diamalkan. 2. Sebaliknya, jika sesuatu bahan yang ingin dicampurkan ke dalam media adalah daripada jenis yang tidak tahan panas, maka media dalam isipadu yang besar tersebut perlu disterilkan terlebih dahulu. Selepas pensterilan, dinginkan sehingga mencapai suhu sekitar 48C. Kemudian tambahkan bahan berkenaan yang steril dan campurkan dengan baik dan merata. Kemudian, dengan teknik aseptik, bahagi-bahagikan media berkenaan dalam isipadu yang ditetapkan ke dalam tabung atau botol yang terlebih dahulu disterilkan. 4.1.3. KULTUR MURNI Plat Garisan Kultur murni adalah kultur yang mengandungi satu jenis atau spesies bakteria sahaja. Umumnya, kultur murni diperolehi dengan menggunakan media padat, sama ada melalui teknik plat garisan atau teknik plat tuangan (pour plate). Teknik plat garisan merupakan teknik yang paling mudah untuk mendapatkan koloni terpisah dan terasing. Berdasarkan teori bahawa satu koloni bakteria merupakan hasil daripada pertumbuhan yang berasal daripada satu sel bakteria, maka satu koloni akan hanya terdiri daripada satu jenis atau spesies sahaja. Bakteria daripada koloni ini kemudian boleh ditumbuhkan semula supaya semua koloni di dalam sesuatu plat terdiri daripada jenis bakteria

yang sama. Kultur yang sedemikian ini dikenali sebagai kultur murni dan menunjukkan pertumbuhan koloni yang morfologinya kelihatan serupa di antara satu dengan lain. Kultur murni penting kerana ia diperlukan dalam kajian-kajian mengenai pelbagai ciri sesejenis bakteria, misalnya ciri morfologi koloni, biokimia, morfologi sel, reaksi pewarnaan, reaksi imunologi dan kepekaannya terhadap berbagai agen antimikrob. Tatacara Plat Garisan BAHAN 1. Kultur bakteria 2. Piring Petri yang mengandungi media agar 48 3. Gelung dawai 4. Penunu Bunsen TATACARA 1. Labelkan plat Petri yang mengandungi media pertumbuhan yang steril (pada bahagian dasar atau bawahnya dan bukan di atas penutupnya). 2. Letakkan plat Petri tersebut dengan bahagian dasarnya di sebelah atas. 3. Sterilkan gelung dawai melalui pembakaran api penunu Bunsen dan setelah sejuk, ambil spesimen dengannya. 4. Pegang dan angkat bahagian dasar plat sehingga permukaan media yang terdedah menghadap anda.

5. Letakkan gelung yang mengandungi spesimen di atas permukaan media agar kira-kira 1 cm daripada dinding plat Petri tersebut. 6. Sebarkan inokulum seluas 1 cm garis pusat. 7. Bermula daripada sebaran di atas gariskan inokulum dengan menggerakkan gelung bolakbalik supaya garisan meliputi satu kawasan seluas kira-kira sepertiga daripada plat. 8. Garisan seterusnya bermula daripada kawasan di sekitar penghujung garisan-garisan pertama. 9. Bakar semula gelung dawai dan biarkan sejuk. Putarkan plat ~ 90 darjah dan buatkan pula beberapa garisan mengulangi prosedur di atas sehingga garisan meliputi keseluruhan kawasan permukaan media. 10. Pastikan garisan yang terakhir tidak menyentuh sebaran inokulum yang pertama. 11. Piring Petri yang telah diinokulasi dieramkan pada suhu tertentu dalam keadaan terbalik. NOTA 1. Gunakan penghujung gelung dawai sahaja untuk menyentuh permukaan media supaya mendapatkan garisan yang halus dan tipis. 2. Dalam membuat garisan, yang penting ialah menyentuh gelung pada permukaan media dan menggariskannya; usahakan menggaris perlahan-lahan supaya anda tidak sampai mencung-kil atau merobek media sehingga mengakibatkan media menjadi pecah-pecah. 3. Pastikan juga garisan yang dibuat tersebut rapi, berterusan tetapi terpisah serta tidak saling memotong atau bersilang di antara garisan atas dengan yang di bawahnya supaya mendapatkan koloni bakteria yang berasingan. 4. Gelung dawai dibakar semula selepas garisan dibuat pada bahagian pertama piring Petri

supaya inokulum (jumlah bakteria) dikurangkan, maka koloni bakteria yang terpisah akan didapati. 5. Jangan bercakap semasa melakukan prosedur ini untuk mengelakkan semburan air liur terjatuh ke atas permukaan media agar. 6. Piring Petri yang telah diinokulasi dieramkan secara terbalik supaya sebarang pemeluapan yang berlaku pada penutupnya tidak akan menitis ke atas kultur. Bekerjalah berdekatan dengan sumber api. Terbalikkan plat Petri yang me-ngandungi media dengan bahagian dasarnya di sebelah atas. Dengan gelung dawai steril pindahkan kultur/spesimen ke atas media plat dan inokulum seluas 1 cm garis pusat. 49 RAJAH 4.1 Cara melakukan plat garisan 4.1.4. CIRI-CIRI KOLONI BAKTERIA Kajian mengenai koloni bakteria adalah penting kerana ia boleh memberikan maklumat lanjut mengenai identiti, aktiviti biokimia, ciri genetik dan antigenik bakteria berkenaan. Koloni bakteria biasanya diamati berdasarkan pertumbuhannya di atas media padat. Seperti juga ciri-ciri morfologi sel bakteria, ciri-ciri koloni bakteria dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti jenis media, suhu pertumbuhan, umur kultur, strain bakteria dan semua keadaan ini biasanya diambil kira dan dinyatakan semasa menghurai sesuatu koloni bakteria.

1. Bentuk: Bulat Tidak teratur Berfilamen Berserabut Bertitik bujur 2. Pinggiran/konfigurasi (ditentukan dengan mikroskop): Menyeluruh Beralun Lobate Erose

Gariskan inokulum secara bolek-balik bermula daripada sebarannya sehingga meliputi kira-kira sepertiga kawasan plat. Putarkan plat 60-90 darjah dan buatkan pula beberapa garisan. Ulangi kaedah ini sehingga garisan meliputi keseluruhan kawasan permu-kaan media. 50 3. Permukaan: Elevasi Datar Menaik Cembung Umbonat Pulvinat Cembung papilat Cembung berkerut

4. Permukaan: Tekstur Licin Kasar Berkontour : permukaan licin dan undulat (beralun) secara tak teratur. Batasan secara radial : permukaan berbatas-batas yang terpancar dari tengah-tengah koloni. Berkerut

5. Permukaan: Konsistensi Kelihatan kering & rapuh. Pertumbuhan yang nipis seperti membran. Seperti mentega atau lekit. Likat: Pertumbuhan mengikut bekas garisan dawai inolukasi. 6. Ciri optik: Luster Legap Lutsinar Opalesens : Seperti warna baiduri (warna putih-kebiruan atau warna susu dengan ciri warna yangkekilatan berubah-ubah) Iridesens : Warna yang berubah dengan sudut (posisi) koloni dipandang. Pudar Berkilat Fotogenik memancar di dalam gelap. Pendaflour satu warna dengan cahaya transmisi dan warna lain (yang cerah dan terserlah) dengan cahaya pantulan (berpendafluor). 7. Struktur dalam (ditentukan dengan mikroskop): Bergelung 51 8. Perubahan kepada media Hemolisis (pada agar darah) Berfilamen Bergranul

Penghasilan pigmen Perubahan kepada media pembeza Penghasilan bau atau aroma Istilah Bahasa Malaysia dan Istilah Bahasa Inggeris dalam pencirian koloni bakteria tidak teratur irregular berserabut rhizoid bertitik punctiform menyeluruh entire beralun indulate keriting curled datar flat menaik raised cembung convex imbonat imbonate pulvinat pulvinate cembung papilat convex papillate cembung berkerut convex rugose batasan secara radial radially ridged berkerut rugose rapuh brittle seperti mentega/lekit butyrous

pudar dull berkilat glistening, glossy 4.1.5. KEADAAN PERTUMBUHAN BAKTERIA DI DALAM MAKMAL Oleh kerana penyesuaian bakteria kepada alam sekelilingnya, maka bakteria dari lingkungan yang berbeza memerlukan keadaan sekeliling yang berbeza pula untuk pertumbuhan yang optimum. Oleh yang demikian, pengkulturan bakteria di dalam makmal hanya dapat dicapai jika keadaan alam persekitarannya dapat diwujudkan. Di samping pengaruh kandungan media ke atas pertumbuhan bakteria, beberapa faktor lain di alam sekeliling juga mempengaruhi pertumbuhan dan tumbesarannya. Faktor ini termasuk suhu pengeraman, air, aras oksigen, osmolariti media dan kepekatan ion hidrogen (pH). Pengeraman Bakteria dalam Keadaan Anaerobik Pada bakteria heterotrof, tenaga yang digunakan untuk menjalankan proses biosintesis berpunca daripada tindakan oksidatif ke atas bahan organik. Ada bakteria yang hanya boleh menggunakan oksigen bebas sebagai penerima akhir hidrogen ( aerob obligat). Oleh yang demikian ia hanya dapat tumbuh dalam kehadiran oksigen. Sebaliknya, terdapat juga bakteria yang sama sekali tidak dapat menggunakan oksigen sebagai penerima akhir hidrogen (anaerob obligat). Justeru itu ia tidak dapat tumbuh dalam keadaan kehadiran oksigen dan kemungkinan akan mengalami kematian apabila terdedah kepada gas berkenaan. Terdapat pula segolongan bakteria yang dinamakan aerotoleran kerana berkeupayaan untuk tumbuh di dalam udara, sungguhpun ia tidak menjalankan metabolisme oksidatif. Bakteria golongan ini melakukan

fermentasi meskipun dalam kehadiran oksigen. Sekumpulan besar bakteria mempunyai sistem enzim yang boleh menggunakan oksigen atau terbitan organik sebagai penerima akhir hidrogen ( aerob fakultatif atau anaerob fakultatif). Bakteria jenis ini boleh tumbuh secara anaerobik dan dalam keadaan ini akan memfermentasi karbohidrat dengan menghasilkan produk fermentasi seperti berbagai-bagai jenis asid. Walau bagaimanapun, apabila ditumbuhkan dalam kehadiran udara (oksigen), metabolismenya akan berubah kepada keadaan aerobik dan 52 karbohirat umumnya akan dioksidasi kepada air dan CO 2 . Terdapat segolongan bakteria lagi yang menunjukkan pertumbuhan optimum pada kadar oksigen yang rendah dan bakteria ini dikenal sebagai mikroaerofilik. Tatacara Mewujudkan Keadaan Anaerobik di dalam Balang Anaerobik dengan GasPak tm BAHAN 1. Balang anaerobik (jenama GasPak) 2. Satu paket GasPak 3. Pipet 4. Air 5. Penunu Bunsen 6. Satu pek katalis

7. Indikator redoks TATACARA 1. Gunakan balang anaerobik yang sedia dilengkapi dengan 1 pek mangkin aktif yang dilekatkan kepada penutupnya. 2. Masukkan media plat yang telah diinokulasi ke dalam balang. 3. Potong salah satu sudut atas paket GasPak dan letakkan sampul GasPak secara menegak di sebelah susunan plat. 4. Letakkan indikator redoks (oksidasi-reduksi) di sebelah susunan plat. 5. Masukkan 10 ml air paip ke dalam GasPak dengan pipet. 6. Kemudian lekapkan penutup tepat pada kedudukannya menutupi mulut balang. 7. Pasang alat pencengkam penutup supaya balang tertutup dengan rapi dan rapat sehingga tidak dapat ditembusi udara. 8. Eramkan keseluruhan balang bersama isi kandungannya di dalam inkubator 37C semalaman. Katalis biji-biji aluminium disaluti paladium GasPak TM kit penjana/pembebas hidrogen NOTA 1. Balang jenama GasPak menggunakan katalis atau mangkin sejuk yang tidak perlukan dipanaskan

sejurus sebelum GasPak digunakan. Butir-butir mangkin yang terpakai dipulihkan kepada aktiviti penuh dengan dipanaskan di dalam ketuhar pada suhu 160-170C selama 2 jam. Mangkin ini kemudian disimpan di dalam tempat kering atau balang pengering (desikator). 2. Pada balang anaerobik yang menggunakan mangkin yang perlu dipanaskan dengan arus elektrik atau api, pastikan proses ini dilakukan jauh dari gas yang boleh meletup. 3. Indikator redoks metilena biru digunakan untuk memastikan keadaan anaerobik dicapai. Dalam keadaan tanpa oksigen metilena biru akan menghilangkan warnanya. Tetapi masa kehilangan warnanya dicapai lebih lewat daripada pencapaian keadaan anaerobik di dalam balang. Tatacara Mewujudkan Keadaan Anaerobik dengan Pengisian Gas Nitrogen ke dalam Balang Anaerobik BAHAN 1. Balang anaerobik (plastik atau logam)/bekas berbentuk silinder 2. Tangki silinder gas campuran (N 2 85%, CO 2 5%, H 2 10%)

53 TATACARA 1. Gunakan balang anaerobik yang terpakai (atau bekas plastik berbentuk silinder yang mempunyai dua lubang kecil pada penutupnya). 2. Masukkan media plat yang telah diinokulasi ke dalam bekas ini dan kemudian tutup rapat dengan bantuan pencengkam penutup tersebut. 3. Buka salah satu kepala salur gas dan hubungkan dengan tiub ke sebuah pam vakum dan kemudian sedut keluar udara di dalam balang sehingga terbentuk ruang hampa gas sepenuhnya. 4. Tutup rapat kepala salur gas pertama ini dan sambungkan sebuah tiub pada kepala kedua yang menghubungkannya dengan tangki silinder gas campuran. 5. Buka kepala salur gas kedua ini dan salurkan gas ke dalam balang sehingga terisi penuh kemudian tutup dengan rapat. 6. Tanggalkan semua tiub penyambung pada balang dan tutup lubang kepala salur gas dengan pita selofan. 7. Eramkan balang bersama isi kandungannya di dalam inkubator 37C selama semalaman. NOTA Penutup bekas yang digunakan mesti berbentuk bulat kerana bentuk ini mempastikan ia tidak ditembusi

udara. Tatacara Balang Lilin dalam Pengeraman Kultur dalam Keadaan Atmosfera Karbon Dioksida BAHAN 1. Bekas logam dengan penutup berbentuk bulat (tin susu tepung) 2. Sebatang lilin 3. Slaid mikroskop TATACARA 1. Lekatkan sebatang lilin kepada sebuah slaid kaca mikroskop. 2. Nyalakan lilin tersebut dan masukkannya ke dalam bekas. 3. Tempatkan lilin berjauhan dengan piring Petri yang mengandungi media yang telah diinokulasi. 4. Tutup tin dengan rapat dan biarkan sebentar sebelum tin dieramkan supaya lilin terpadam dengan sendirinya. Prosedur ini akan mengelakkan kemungkinan lilin yang sedang menyala daripada terjatuh dari tempatnya semasa tin dipindahkan. NOTA 1. Gunakan tin dengan penutup berbentuk bulat supaya tin dapat ditutup dengan rapat. 2. Pastikan saiz tin yang digunakan tidak terlalu kecil supaya terdapat sedikit ruangan untuk menempatkan lilin yang menyala pada jarak yang agak berjauhan dengan piring Petri. 3. Keadaan atmosfera yang dicapai di dalam balang lilin adalah CO

2 5%. Tatacara Menggunakan Inkubator Karbon Dioksida dalam Pengeraman Kultur dalam Keadaan Atmosfera Karbon Dioksida Inkubator CO 2 merupakan suatu alat yang lumrah didapati di makmal mikrobiologi. Dengan adanya alat ini pengeraman kultur bakteria (ataupun kultur sel) di dalam atmosfera CO 2 adalah lebih mudah dilakukan di samping kehadiran ruang yang boleh memuatkan lebih banyak kultur. Instrumentasi adalah di luar skop buku ini dan haruslah mengikuti arahan dengan teliti di dalam buku operasi (manual) yang dibekalkan 54 bersama-sama dengan alat ini. Apa yang akan dibentangkan di sini hanyalah beberapa nota mengenai jenis inkubator CO 2 dan penggunaan alat ini. NOTA 1. Alat inkubator CO

2 yang mempunyai jaket air adalah lebih cekap dalam menstabilkan suhu dan melambatkan penurunan suhu jika bekalan elektrik terputus. 2. Alat inkubator CO 2 yang mempunyai sensor jenis inframerah membolehkan paras CO 2 di da-lam inkubator kembali ke paras asalnya dengan lebih cepat berbanding dengan sensor jenis konduktiviti termal (haba). Oleh yang demikian, ia lebih sesuai bagi inkubator yang kerapkali dibuka. 3. Alat inkubator CO 2 yang lebih moden mempunyai mekanisme yang menghentikan bekalan gas ini secara automatik semasa pintu dibuka dan menyambungnya semula hanya apabila pintu ditutup semula. Sistem ini mengelakkan pembaziran gas. 4. Rancangkan terlebih dahulu dalam tempoh masa kerja, apa yang akan disimpan atau dikeluarkan daripada inkubator CO 2 ini supaya dapat mengelak daripada terlalu kerap membuka-nya. 5. Pastikan juga terlebih dahulu apa yang akan dikeluarkan daripada inkubator CO 2

atau dimasukkan supaya dapat mengurangkan lamanya ia dibuka. 6. Jangan gunakan inkubator CO 2 yang sama untuk kultur bakteriologi dan kultur sel untuk mengelakkan pencemaran bersilang. 7. Pada kultur bakteria, aras CO 2 ditetapkan pada 7% dan kultur sel 5%. 4.2. PENGKULTURAN FUNGUS 4.2.1. MEDIA KULTUR Media kultur utama yang digunakan untuk kultur primer fungus (pengkulturan daripada spesimen klinikal) adalah agar dekstrosa Sabouraud ( SDA) yang merupakan sejenis media dasar seperti juga agar nutrien. Media padat ini terdiri daripada dekstrosa 4%, pepton 1% yang sesuai untuk fungus dan agar 1.5-2% dan mempunyai pH asid 5.6. Keadaan pH asid dan tanpa bahan yang kaya menghalang pertumbuhan kebanyakan jenis bakteria tetapi membenarkan pertumbuhan fungus, sama ada kontaminan (fungus saprofitik daripada alam sekitar) atau fungus patogenik, kecuali Histoplasma capsulatum dan beberapa strain aktinomiset seperti Nocardia asteriodes . Agar dekstrosa Sabouraud yang dicampurkan dengan cycloheximide 0.05% dan

Chloramphenicol

0.005% mengurangkan pencemaran oleh bakteria dan fungus bukan patogenik. Ini memberi peluang yang lebih baik kepada fungus patogenik untuk tumbuh, sungguhpun terdapat banyak juga fungus patogenik yang terhalang pertumbuhannya. Media ini biasanya digunakan untuk pengkulturan dermatofit dan Candida albicans kerana spesies-spesies ini tidak sensitif terhadap kedua-dua jenis agen antimikrob tersebut. Agar infusi otak dan jantung dicampur 5% darah kambing biri-biri merupakan sejenis media yang diperkaya dan digunakan untuk pemencilan Histoplasma dan Nocardia . Media agar ini boleh dibekukan di dalam piring Petri atau tabung uji. 4.2.2. PENGKULTURAN FUNGUS Fungus wujud dalam dua bentuk: yis dan hifa atau miselium. Pengkulturan fungus ke atas plat agar boleh menonjolkan dua bentuk ini iaitu koloni yis kelihatan bulat dan agak lekit, manakala koloni berhifa atau miselium seperti kapas atau permaidani pada permukaan media. Pada fungus berfilamen, pengamatan kultur secara in situ dapat dilakukan dengan teknik kultur slaid. Pengkulturan Candida albicans di dalam serum lembu misalnya boleh menunjukkan penghasilan tiub germa oleh yis berkenaan. Ini merupakan suatu ujian diagnostik. 55 Tatacara Penginokulasian Plat Agar dengan Kultur Yis Tatacaranya adalah seperti yang dilakukan dengan bakteria iaitu melalui teknik garisan ke atas plat (sila

rujuk bahagian 4.1.3) NOTA Kultur fungus dalam bentuk yis dieramkan pada suhu 37C. Tatacara Penginokulasian Plat Agar dengan Kultur Berfilamen BAHAN 1. Kultur koloni fungus 2. Plat agar/cerun agar 3. Jarum inokulasi 4. Penunu Bunsen TATACARA 1. Sterilkan jarum inokulasi dengan pembakaran api penunu Bunsen. 2. Masukkan jarum ke dalam koloni fungus pada tapak di antara tengah dan tepi koloni fungus. 3. Cungkilkan sedikit kultur dan letakkan inokulum ini di tengah-tengah plat agar atau tabung cerun agar. 4. Eramkan pada suhu 30C dan/atau 37C selama 4 minggu. NOTA 1. Untuk mengelakkan pencemaran oleh fungus khususnya dari udara, penginokulasian kultur disarankan dilakukan di dalam kabinet biohazard kelas 2 yang memberi perlindungan kepada pengguna, fungus yang dikulturkan serta alam sekeliling. 2. Inokulum daripada tapak di antara pertengahan dan tepi koloni yang diambil, kerana koloni yang

di tepi mungkin terlalu muda dan belum bersporulasi atau membentuk spora, manakala di bahagian pertengahannya pula mungkin sudah agak tua dan steril, atau tidak mengandungi spora atau badan pembuahan (fruiting body) lagi. 3. Sungguhpun suhu bilik (25C) digunakan sebagai suhu pengeraman oleh beberapa makmal, perlulah diingat bahawa dalam hal ini, pertumbuhan fungus adalah lebih lambat. Tatacara Membuat Kultur Slaid BAHAN 1. Kultur fungus 2. Agar dekstrosa atau agar dekstrosa kentang 3. Piring Petri 4. Balang alkohol 5. Penunu Bunsen 6. Sebatang kaca berukuran 6 cm 7. Penutup slaid 8. Slaid mikroskop 9. Air suling (steril) 10. Pisau pembedahan (steril) 11. Dawai inokulasi lurus 56 TATACARA

1. Bakarkan sebatang kaca berukuran 6 cm di bahagian tengahnya sehingga menjadi lembut. 2. Bengkokkan batang kaca itu sehingga mencapai bentuk V dan biarkan sehingga sejuk di udara. 3. Sterilkan batang kaca ini dengan pembakaran alkohol. 4. Biarkannya sejuk dan letakkan di dalam sebuah piring Petri. 5. Sterilkan sekeping slaid mikroskop dengan pembakaran alkohol dan letakkannya di atas batang kaca berbentuk V. 6. Potong seketul agar (agar dekstrosa, agar dekstrosa kentang) berukuran 1 cm persegi dan letakkan di atas slaid. 7. Inokulasi fungus dengan menyentuh keempat-empat sudut ketulan agar. 8. Sterilkan sekeping kaca penutup slaid dengan pembakaran alkohol dan letakkan di atas permukaan ketulan agar. 9. Tekan kaca penutup slaid supaya terdapat kontak yang baik di antara permukaan agar dan penutup tersebut. 10. Tuangkan sekitar 5 ml air suling steril ke dalam piring Petri ini untuk memberikan kelembapan yang berterusan semasa pengeraman kultur. 11. Tutup plat Petri dan eramkan pada suhu bilik. 12. Letakkan piring Petri di atas pentas mikroskop dan amati pertumbuhan fungus dari masa ke

masa. 13. Apabila struktur reproduktif mulai terlihat, lepaskan penutup kaca (yang mempunyai pertumbuhan fungus pada permukaannya) daripada ketulan agar dan amati dengan sediaan pelekapan basah lactophenol cotton blue. 14. Amati juga fungus yang tumbuh pada permukaan slaid dengan pelekapan basah lactophenol cotton blue. NOTA 1. Dalam tatacara ini, 4 objek iaitu batang kaca berbentuk V, slaid mikroskop, penutup slaid dan jarum inokulasi disterilkan dengan pembakaran api atau alkohol. Tunggu sehingga objek yang disterilkan menjadi sejuk sebelum meneruskan dengan prosedur selanjutnya. 2. Semasa pengambilan inokulum, pastikan jarum dimasukkan tepat ke dalam koloni supaya inokulum mengandungi bahagian vegetatif fungus bersama bahagian aerialnya (yang mengandungi spora). 3. Pastikan air di dalam piring Petri yang memberikan kelembapan kepada atmosfera ruangan kultur slaid sentiasa ada dan tidak sampai kering dan tambah jika perlu. 4. Dalam penyediaan pelekapan basah, jangan tekan penutup slaid kerana ini boleh mengakibatkan struktur konidia terpisah daripada hifa. Tatacara Kultur yang Merangsang Penghasilan Tiub Germa

BAHAN 1. Kultur yis 2. Tabung uji 3. Penganggas air 4. Jarum inokulasi 5. Slaid mikroskop 6. Penutup slaid 7. Serum lembu (steril) TATACARA 1. Masukkan 0.5 ml serum lembu (steril) ke dalam satu tabung uji. 2. Masukkan 1 koloni yis ke dalam serum dan leraikan sel-sel dari koloni dengan menggoncanggoncangkan jarum inokulasi di dalam serum. 57 3. Eramkan pada suhu 37C selama 3 jam di dalam penganggas air. 4. Buat pelekapan basah selepas 1 jam, 2 jam dan 3 jam, dan amati penghasilan tiub germa di bawah mikroskop. PERHATIAN Tiub germa akan kelihatan sebagai filamen yang muncul daripada blastospora tanpa adanya penyempitan mahupun pembengkakan pada bahagian-bahagian tertentu di sepanjang filamen tersebut. Dengan penyempitan Tanda penyempitan NOTA

1. Serum yang digunakan kali pertama harus diuji dengan suatu strain Candida albicans yang telah dipastikan boleh mengeluarkan tiub germa. 2. Pastikan ampaian yis yang disediakan tidak tebal kerana inokulum yang besar akan mengurangkan bilangan sel yang menunjukkan tiub germa (10 5 10 6 sel/ml adalah kepekatan optimum). 4.2.3. CIRI-CIRI KOLONI FUNGUS Dalam catatan mengenai morfologi koloni fungus, adalah penting jenis media pertumbuhannya juga disebutkan kerana fungus boleh mempamerkan ciri yang berbeza-beza menurut jenis media yang digunakan. Di samping jenis media, beberapa faktor lain seperti suhu pengeraman dan umur koloni juga mempengaruhi tekstur koloni fungus. Pigmentasi pada permukaan fungus biasanya dihasilkan oleh spora dan hifa, di dalam struktur itu sendiri, manakala pigmentasi pada bahagian dasar koloni ditentukan melalui pigmen hifa vegetatif dan pigmen larut yang meresap ke dalam agar. Walau bagaimanapun, pigmentasi pada fungus sering kali tidak digunakan sebagai ciri pengesahan utama spesies-spesiesnya kerana ciri ini umumnya tidak stabil atau berubah, sekalipun daripada strain yang sama.

PERHATIAN Dalam pengamatan fungus pada kultur plat agar, seboleh-bolehnya elakkan daripada membuka penutup Petri/botol, kerana ini akan menyebabkan terjadinya aerosol yang mengandungi spora fungus yang akan bertebaran di udara dan boleh tersedut oleh bukan sahaja orang yang sedang mengkajinya, tetapi juga mereka yang berada di dalam ruangan yang sama. Bagi sesetengah individu ini boleh menimbulkan alahan yang serius. Morfologi Keseluruhan Koloni Fungus 1. Tofografi: Mendatar dan berlipat secara terpencar Mendatar dan tepian bulat menyeluruh 58 Mendatar dan berlipat tak teratur Mendatar dan tepian bergerigi Bertimbun dan ala-tombol Bertimbun dan bahagian tengahnya tertekan Menaik ala-butang Kraterforme hingga ke bentuk plikatil Berkerut Serebriforme (serupa otak) 2. Tekstur: Krim (seperti rupa koloni yis) seperti tekstur lilin Berserbuk

Berkapas Bergranul (berpasir/berbutir) seperti baldu 3. Pigmentasi: (permukaan dan dasar koloni) Berbeza bergantung kepada umur dan jenis fungus Istilah Bahasa Malaysia Bahasa Inggeris tepian bulat menyeluruh entire edge tepian bergerigi fringed edge berlipat tak teratur irregular folding tengahnya tertekan depressed center ala-tombol knob-like ala-butang button-like menaik raised ala-tekstur lilin glabrous ala-baldu velvety 59 4.3. PENGKULTURAN VIRUS Berbeza dengan bakteria dan fungus, virus hanya boleh beraplikasi di dalam sel hidup. Oleh demikian, sel yang dapat ditumbuhi dan dibiakkan in vitro boleh merupakan suatu sumber media untuk pembiakan virus. Oleh itu kita perlu menumbuhkan sel-sel tertentu terlebih dahulu untuk

dijadikan kultur bagi pembiakan virus. Aspek-aspek mengenai pertumbuhan sel secara in vitro ini dikenal se-bagai kultur sel. 4.3.1. KULTUR SEL DALAM VIROLOGI Media Kultur Sel Semua media yang digunakan dalam kultur sel atau tisu pada asasnya mengandungi suatu campuran tiruan yang terdiri daripada garam-garam tak organik yang disebut larutan garam seimbang atau larutan garam fisiologik. Larutan ini dicampurkan dengan asid amino dan vitamin serta glukosa sebagai sumber tenaga. Fenol merah digunakan sebagai penunjuk pH. Serum (biasanya serum lembu) diperlukan untuk pengkulturan sel dan sistem fisiologik ini memerlukan suatu sistem pengawalan pH iaitu sejenis larutan tampan. Media ini mengekalkan pH, tekanan osmotik dan membekalkan tenaga. Antibiotik juga dicampurkan ke media untuk mengawal daripada pencemaran serta pertumbuhan mikrob. 1. Media Maklumat tentang kesesuaian sesuatu media untuk sesejenis kultur sel boleh didapati dari buku maklumat yang dikeluarkan oleh syarikat yang memasarkan media kultur berkenaan atau dari artikel jurnal. Media ini umumnya didapati dalam bentuk serbuk atau cecair dan dalam kepekatan 1X atau 10X. Jika sesuatu jenis media yang berkepekatan 10X didapati dalam bentuk cecair, maka ia dipilih dan

diutamakan daripada bentuk lainnya. Jika media berbentuk serbuk, ia terlebih dahulu dilarutkan di dalam air suling supaya mencapai kepekatan 5X atau 10X. Media yang pekat boleh disimpan di dalam bekas-bekas yang lebih kecil. Agih-agihkan media ini dalam isipadu 10 atau 20 ml di dalam botol universal dan simpan beku, pada suhu 20C jika boleh. Apabila hendak digunakan media dikeluarkan dari simpanan dan biarkannya pada suhu bilik buat seketika dan kemudian buatkan suatu pencairan berkepekatan 1X dan campurkan bahan-bahan yang diperlukan untuk pertumbuhan. Pastikan semua media serbuk dilarutkan sehingga kelihatan betul-betul jernih. Media mesti disterilkan melalui penyaringan dengan penyaring membran berukuran liang 0.2 m. 2. Serum Jenis serum yang diperlukan bergantung kepada jenis kultur sel. Dalam kebanyakan kultur sel, serum lembu yang menjadi pilihan. Gunakan serum fetus lembu kerana serum ini berbeza dengan serum lembu dewasa atau anak lembu, terutama disebabkan ia bebas daripada antibodi yang mungkin dapat menghalang pengkulturan virus dalam kultur sel. Pastikan serum fetus lembu yang diperolehi mempunyai jangka hayat simpanan yang panjang. Eramkan serum lembu di dalam penganggas air pada suhu 50C selama 30 minit untuk menghapuskan bahan atau faktor-faktor yang terdapat di dalamnya yang boleh menghalang pertumbuhan sel apabila digunakan nanti.

Agihkan ke dalam isipadu 10 atau 20 ml. Labelkan nombor pengeluaran (batch number), dan tarikh diagihkan. Simpan beku, seharusnya pada suhu 20C. Pastikan sampel dari sesuatu botol itu steril dan dapat menampung pertumbuhan kultur sel dengan baik dengan membandingkannya dengan serum yang diketahui memberikan hasil yang baik. 60 3. Sistem Penampan pH yang Digunakan di dalam Media Kultur Sel Pertumbuhan sel haiwan di dalam media kultur sel yang lengkap biasanya adalah optimum apabila media ditampan dalam julat pH 7.2 hingga 7.4. Larutan penampan pH yang sering kali digunakan di dalam media kultur sel adalah natrium bikarbonat . Larutan penampan ini digunakan dalam sistem tertutup (bekas kultur ditutup rapat) yang diseimbangkan dengan udara atau sistem terbuka (seperti piring Petri) yang diseimbangkan dengan atmosfera yang mengandungi kadar CO 2 yang tinggi seperti di dalam inkubator CO 2 . Kepekatan natrium bikarbonat yang digunakan adalah bergantung

kepada jenis media. Adalah sesuai jika ia disediakan dalam kepekatan 10X yang seterusnya hanya perlu dicairkan menjadi 1X apabila hendak digunakan nantinya di dalam media lengkap. Larutan natrium bikarbonat disterilkan melalui penyaringan ataupun diautoklaf. Larutan tampan HEPES (asid N-2-Hidroksietilpiperazin-N-2-etanasulfonik) yang berfungsi sebagai zwitterion boleh digunakan sebagai larutan penampan menggantikan natrium bikarbonat dalam sistem terbuka dan ia digunakan pada kepekatan mutlak 20 mM . Jika natrium bikarbonat diperlukan juga sebagai nutrien maka kepekatannya seharusnya tidak melebihi 10 m M (0.85 g/l). 4. Persediaan Natrium Bikarbonat Larutkan 5.6g NaHCO 3 di dalam 95.5 ml air suling dan campurkan 0.5 ml fenol merah 0.4%. Gaskan dengan CO 2 sehingga warna media menjadi oren. Saringkan dengan menggunakan penyaring membran berukuran liang 0.2 m atau diautoklaf pada 20 tekanan paun setiap inci (pound per square inch: psi). Agih-agihkannya ke dalam botol yang kemudian ditutup rapat. Simpan pada suhu bilik. 5. Antibiotik juga

Antibiotik dicampurkan ke media kultur untuk menghalang pertumbuhan mikrob. Antibiotik yang sesuai adalah antibakteria berspektrum luas (aktif terhadap bakteria Gram-positif dan Gram-negatif) dan berkesan terhadap mikoplasma. Amphotericin B adalah agen antifungus. Kepekatan yang sesuai digunakan adalah Gentamicin 30 g/ml dan Amphotericin B 5 g/ml. Kedua-dua agen antimikrob ini disediakan dalam kepekatan 100X di dalam air suling steril (jika dibekalkan dalam bentuk serbuk), disaring melalui penyaring dengan saiz liang 0.2 m, diagih-agihkan dalam isipadu 1.0 ml dan disimpan beku. Larutan antibiotik dicairkan 1:100 di dalam media. Untuk kedua-dua jenis antibiotik ini, gunakan gred yang ditentukan khusus untuk kultur sel. Tatacara dalam Persediaan Media Kultur Sel BAHAN 1. Media kultur sel 2. Serum fetus lembu 3. Antibiotik (Gentamicin dan Amphotericin B) 4. NaHCO 3 5. Air suling (steril) 6. Bekas (steril) 7. Pipet bersukat (steril) TATACARA Gentamicin dan Amphotericin B ( Fungizone). Gentamicin adalah agen

1. Biarkan reagen yang disimpan beku seperti media, serum dan antibiotik mencair pada suhu bilik di atas meja. Jangan masukkan ke dalam penganggas air untuk mengelakkan pencemaran. 2. Lapkan permukaan luar setiap bekas dengan tuala kertas sehingga kering. 3. Tuangkan media ke dalam 1 botol steril jika kesemua kandungannya diperlukan (jika hanya sebahagian sahaja media yang diperlukan, gunakan pipet steril untuk memindahkannya). 61 4. Campurkan isipadu air suling yang diperlukan diikuti dengan larutan penampan dan antibiotik. 5. Campurkan serum supaya mencapai peratus kepekatan yang diperlukan. Biasanya media pertumbuhan memerlukan 5 10% serum dan media pengekal 0 2%. 6. Simpan media pertumbuhan atau pengekal pada suhu 4C. Tempoh simpanan media yang mengandungi serum adalah 4 minggu. 7. Sebelum media digunakan, goncangkannya terlebih dahulu untuk menentukan kehadiran pencemaran yang berat yang ditandai dengan kekeruhan pada media tersebut. PERHATIAN Persediaan ini dilakukan dengan menggunakan kabinet aliran udara laminar kelas 1 atau kelas 2. NOTA 1. L-glutamina, salah satu komponen sesetengah media, adalah tidak stabil dalam bentuk cecair. Oleh yang demikian, bagi media yang seharusnya mengandungi L-glutamina, asid amino ini perlulah ditambahkan ke dalamnya jika media tersebut disimpan lebih daripada 2

minggu. 2. Serum yang dibeku dan dicairkan kadangkala mengandungi serpihan-serpihan yang mendap di dasar botol. Ini bukanlah suatu pencemaran, tetapi seboleh-bolehnya elakkan daripada menggunakannya. TRIPSINISASI Tripsinisasi adalah proses peleraian tisu atau sel selapisan kepada sel-sel individu menggunakan enzim tripsin. Tatacara untuk Tripsinisasi Tisu Seluruh BAHAN 1. Seluruh haiwan atau tisu 2. Gunting 2 pasang 3. Gunting bengkok dan tajam 4. Alat pengaduk magnet 5. Magnet disaluti silikon/teflon 6. Kelalang kon 7. Larutan tripsin-versena 8. Etanol 70% 9. Larutan salin ditampan fosfat (phosphate buffered saline: PBS ) yang mengandungi 30 g/ml Gentamicin dan Fungizone 5 g/ml 10. Penyaring kasar (steril) 11. Mikroskop cahaya jenis terbalik

12. Bekas kultur sel PERSEDIAAN 1. Larutan tripsin dan versena Larutkan 1.0 % tripsin dan 0.4% versena di dalam PBS . Campurkan kedua-dua jenis larutan ini dalam isipadu yang sama. Sterilkan dengan menggunakan penyaringan membran dengan liang 0.2 m. Simpan pada suhu 4C. 62 2. PBS tanpa kalsium dan magnesium Larutkan 8.0g NaCl, 0.2g KCl, 1.15g Na 2 HPO 4 , 0.2g KH 2 PO 4 di dalam 950 ml air suling. Aturkan nilai pH larutan kepada 7.3. Tambahkan air suling sehingga mencapai satu liter. Agih-agihkan larutan ini ke dalam botol dan sterilkan dengan autoklaf pada 10 psi (suhu mencapai aras 115C) selama 15 minit. Simpan pada suhu bilik.

TATACARA 1. Bunuh haiwan yang berkenaan dan letakkan menelentang supaya bahagian tubuh atau tapak di mana pembedahan akan dijalankan terdedah. 2. Lap kulit bahagian yang terdedah ini dengan etanol 70% dan bedah/potong untuk mendapatkan organ yang diperlukan. 3. Tatacara berikut dilakukan dalam keadaan aseptik dengan menggunakan peralatan yang steril. 4. Keluarkan organ dan letakkan di dalam piring Petri di mana ia dipotong menjadi serpihanserpihan kecil berukuran 2 mm3. 5. Masukkan PBS yang mengandungi antibiotik dan antifungus. Goyang piring Petri perlahanlahan untuk membersihkan potongan-potongan tisu. 6. Pindahkan potongan tisu ke dalam sebuah kelalang kon yang mengandungi magnet yang disaluti teflon atau silikon. Masukkan larutan tripsin-versena (lebih kurang 20 ml setiap 1g tisu). 7. Aduk kandungan kelalang dengan pengaduk magnet pada suhu 37C. 8. Tuangkan larutan tripsin 10 minit selepas proses ini bermula. Tambahkan tripsin baru dan aduk semula. 9. Dari masa ke masa tuangkan sel yang telah dileraikan daripada tisu dan simpan pada 4C. Tambahkan tripsin baru setiap kali ini dilakukan. 10. Saring suspensi sel melalui penyaring kasar untuk memisahkan sel-sel dari serpihan tisu-tisu besar. Emparkan suspensi sel pada 400 g selama 15-30 minit dan leraikan mendapan sel di dalam media yang sesuai dan lakukan perhitungan hidup.

11. Ubah kepekatan sel menjadi 2 x 10 5 sel/ml media pertumbuhan dan kulturkan di dalam bekas kultur. NOTA 1. Semua alat dan reagen yang digunakan disterilkan terlebih dahulu. 2. Suhu 37C dapat dicapai dengan melakukan proses peleraian di dalam bilik panas atau dengan menggunakan alat pengaduk magnet yang juga berfungsi sebagai plat pemanas. Dalam pilihan kedua, kelalang tidak diletakkan secara langsung di atas plat pemanas tetapi dimasukkan ke dalam sebuah bikar berisi air yang ditempatkan di atas plat pemanas tersebut. 3. Elakkan daripada terjadinya pembentukan buih (frothing) semasa tisu diaduk. Tripsinisasi Sel Selapisan dan Pengeraman Kultur Sel Sesetengah jenis kultur sel wujud sebagai suspensi di dalam bekas kultur, manakala majoriti akan melekat pada permukaan bekas kultur dan tumbuh membentuk satu lapisan sel. Sebelum sel ini boleh dipindahkan ke tempat lain atau separuh daripadanya dikeluarkan untuk mengelak kesesakan yang akan menghalang pertumbuhan dan menjejaskan keupayaannya untuk hidup (viabilitinya), sel mestilah ditanggalkan dari permukaan bekas kultur. Tatacara untuk Tripsinisasi Sel Selapisan dan Pengeraman Kultur Sel BAHAN

1. Campuran tripsin 0.25% dan versena 0.2% 2. PBS tanpa kalsium dan magnesium (steril) 63 3. Pipet bersukat (steril) 4. Mikroskop cahaya jenis terbalik 5. Kabinet aliran udara laminar kelas 1 atau 2 PERSEDIAAN 1. Larutan tripsin dan versena Larutkan tripsin 0.5% dan versena 0.4% di dalam PBS . Campurkan 2 jenis larutan ini dalam isipadu yang sama. Sterilkan dengan menggunakan penyaring membran dengan liang 0-2 m. Simpan pada suhu 4C. 2. PBS tanpa kalsium dan magnesium Larutkan 8.0g NaCl, 0.2g KCl, 1.15g Na 2 HPO 4 dan 0.2g KH 2 PO 4

di dalam 950 ml air suling. Aturkan nilai pH larutan kepada 7.3. Tambahkan air suling sehingga mencapai 1 liter. Agihagihkan ke dalam botol dan sterilkan dengan autoklaf pada 10 psi (115C) selama 15 minit. Simpan pada suhu bilik. TATACARA 1. Keluarkan media secara aseptik dengan pipet bersukat. 2. Cuci 2 kali dengan PBS : pipet PBS ke dalam bekas, goncangkan bekas kultur supaya PBS meliputi sel monolapisan, pipet keluar PBS . 3. Biarkan botol berdiri tegak selama 1 hingga 2 minit sebelum cecair yang mengalir ke dasar bekas dipipet keluar. 4. Masukkan sedikit campuran tripsin dan versena dan goncangkan botol untuk meliputi ke seluruh monolapisan sel. 5. Eramkan pada suhu 37C selama 1 hingga 5 minit. Dalam masa ini, amati sel dengan mikroskop untuk menentukan sama ada sel telah menjadi bulat dan/atau telah tanggal. 6. Pipet media pertumbuhan (isipadunya bergantung kepada saiz bekas) ke dalam bekas dan cuci sel daripada permukaan bekas dengan memancutkan media daripada pipet yang dipasang dengan bal penyedut getah untuk meleraikan kelompok sel. 7. Hitunglah suspensi sel dengan hemositometer. 8. Aturkan kepekatan suspensi sel supaya mencapai 1 x 10 5 sel/ml media pertumbuhan.

9. Pada jenis kultur sel yang tumbuh dengan pesat, tutup penutup bekas kultur dengan rapat. 10. Pada jenis kultur sel yang tumbuh dengan lambat atau perlahan, alirkan campuran gas (9% CO 2 , 10% O 2 , 81.5% N 2 ) ke dalam bekas kultur menggantikan udara di dalam ruang bekas sebelum penutupnya ditutup dengan rapat. Pada sistem terbuka, kultur sel ini dieramkan di dalam inkubator CO 2 yang mengandungi CO 2 pada kadar 5%. 11. Goncangkan bekas kultur sel sebelum diletakkan di dalam inkubator supaya sel-sel bertaburan sama rata. NOTA 1. Masa yang diambil untuk penanggalan sel daripada permukaan dalam bekas bergantung kepada jenis kultur yang terlibat. Sel akan mengalami kerosakan atau mati jika didedahkan terlalu lama. Amatilah selalu dengan mikroskop untuk menentukan sama ada sel telah

berbentuk bulat. Peganglah kultur sel hampir tegak lurus dan ketuk permukaan bekas kultur untuk menentukan sama ada sel boleh ditanggalkan (dilepaskan) daripada permukaan atau belum. 2. Jika didedahkan terlalu lama kepada tripsin, sel-sel akan mati. Aktiviti tripsin ini boleh dihapuskan oleh serum. Oleh itu, untuk menghalang aktiviti tripsin tersebut, media yang mengandungi serum digunakan dalam mensuspensikan sel selepas sel-sel ditanggalkan. 3. Jika campuran tripsin dan versena yang digunakan sedikit sahaja, sel tidak perlu dicuci melalui emparan dan supernatannya dituang keluar untuk menghilangkan campuran tripsin dan versena tersebut. Pencairan dengan media pertumbuhan boleh mengurangkan kepekatan tripsin dan versena kepada suatu aras yang tidak akan menjejaskan pertumbuhan sel. 64 4. Semasa mencuci sel-sel daripada permukaan bekas kultur, peganglah bekas supaya permukaan di mana terdapatnya sel adalah di atas. Pada posisi ini lapisan sel lebih mudah diamati dan sel-sel ditanggalkan dengan lebih mudah kerana tidak diselaputi oleh lapisan media semasa dicuci. 5. Dalam keadaan tertentu, kepekatan sel mestilah ditentukan terlebih dahulu supaya jenis sel dengan kepekatan yang diperlukan boleh ditetapkan. Tetapi, dalam keadaan yang telah menjadi kebiasaan seperti pertumbuhan sel di dalam bekas kultur yang sama ukurannya, tatacara nisbah perpisahan (split ratio) boleh digunakan. Dalam cara ini, kultur sel dari satu bekas kultur dibahagikan (dibelah) kepada dua hingga empat bahagian (bergantung kepada jenis kultur sel) dan setiap bahagian dikulturkan secara berasingan di dalam bekas kultur

yang mempunyai isipadu yang sama dengan bekas induk. Tatacara Menghitung Sel dengan Menggunakan Hemositometer BAHAN 1. Suspensi sel 2. 0.1% tripan biru di dalam PBS 3. Hemositometer jenis Neubauer 4. Mikroskop cahaya PERSEDIAAN Tripan biru 0.1% di dalam PBS Larutkan 0.1% tripan biru di dalam 10 ml air suling. Saringkan melalui kertas turas. Simpan di dalam peti beku. Larutkan 1/10 dengan 10X PBS sebelum digunakan. TATACARA 1. Hemositometer Neubauer mempunyai sembilan segi empat sama (SES ) yang besar terletak di tengah. 2. SES ini dibahagikan pula kepada 25 SES yang dipisahkan oleh tiga garis. 3. Hitung sel di dalam SES yang kecil ini. 4. Hitunglah sekurang-kurangnya 100 sel (ini bermakna bahawa pada suspensi tidak mengandungi banyak sel, maka sel-sel di dalam kesemua 25 SES kecil dihitung. Tetapi jika suspensi mengandungi banyak sel maka perhitungan sel-sel di dalam kesemua SES kecil tidak perlu dilakukan lagi. Apa yang perlu hanyalah menghitung sel-sel di dalam SES kecil yang terletak di tengah dan di keempat-empat sudut hemositometer tersebut sahaja).

5. Sebagai panduan, sel yang menyentuh atau melintang garis sebelah kiri dan atas setiap segi SES dihitung atau diambil kira, manakala yang menyentuh atau melintang garis bawah dan kanan SES tidak dihitung atau diabaikan. 6. Bilangan sel ml -1 = Kriopengawetan Sel yang Hidup Oleh kerana kultur sel adalah suatu hidupan, ada kemungkinan kultur sel ini boleh terhapus disebabkan kemusnahan akibat pencemaran oleh bakteria atau fungus, atau ia mengalami kematian kerana keadaan pertumbuhan yang tidak sesuai. Untuk mengelakkan daripada kehilangan sel-sel ini sebahagian dari-pada kultur sel berkenaan haruslah disimpan dalam keadaan yang boleh mengekalkan viabilitinya tanpa pertumbuhan. Sebab kedua kenapa penyimpanan sel ini diperlukan adalah kerana sesuatu kultur sel itu hanya digunakan pada masa-masa tertentu sahaja. Dalam hal ini, penjimatan kos, tenaga dan masa boleh dicapai jika kultur sel ini disimpan sewaktu tidak digunakan. Satu sebab lain yang penting dalam hal penyimpanan kultur sel ini, walaupun tidak jumlah sel yang dihitung x 25 x 10 4 x faktor pencairan jumlah SES yang digunakan

65 begitu ketara, ialah untuk mengekalkan ciri-ciri kultur sel tertentu. Apabila sesuatu sel dikulturkan untuk jangka masa yang berlarutan terdapat kemungkinan ciri-cirinya akan berubah: yang paling sering dikesan ialah sensitivitinya terhadap virus menjadi berkurangan. Jika perubahan yang tidak sesuai berlaku dalam kultur sel yang sedang digunakan, kultur ini boleh digantikan dengan kultur sel lain yang disimpan. Kultur simpanan ini lazimnya masih mempunyai ciri-ciri yang dikehendaki kerana ia merupakan kultur sel yang mempun-yai riwayat pensubkulturan yang awal. Tatacara Kriopengawetan Sel yang Hidup BAHAN 1. Kultur sel 2. Campuran larutan tripsin (0.5%) dan versena (0.02%) 3. Media pertumbuhan 4. PBS (steril) 5. Tripan biru 6. Dimetil sulfoksida (DMSO ) 7. Kriovial 8. Peti beku suhu 70 C 9. Tangki nitrogen cair untuk menyimpan spesimen 10. Alat emparan

11. Mikroskop cahaya 12. Mikroskop cahaya terbalik 14. Kapas 15. Kertas timah nipis PERSEDIAAN Dimetil sulfoksida (DMSO ) 10% v/v di dalam media pertumbuhan Tambahkan 1 ml DMSO ke dalam 9 ml media yang mengandungi serum 10% pada hari kultur sel akan disimpan. Dalam hal ini, pensterilan ke atas bahan adalah tidak perlu kerana DMSO dianggap steril. TATACARA 1. Sediakan suspensi sel di dalam media yang mengandungi serum 10% (lihat tatacara tripsinisasi sel, ms 62-64). 2. Pindahkan ke dalam 1 tabung atau botol steril dan tambahkan media jika perlu. 3. Emparkan pada 200 g selama 15 minit. 4. Keluarkan supernatan dan masukkan media pertumbuhan yang mengandungi DMSO 10%. 5. Campurkan dan hitung jumlah sel untuk menentukan kadar sel hidup. 6. Atursuaikan supaya kepekatan sel adalah 2 x 10 6 sel setiap ml. 7. Pindahkan 1 ml ke dalam setiap kriovial.

8. Labelkan kriovial dengan nama sel, nombor pindahan sel (cell passage no.) dan tarikh. 9. Balutkan dengan kapas, kemudian balut dengan kertas timah dan masukkan ke dalam satu kotak polistirena (5-10 cm tebal). 10. Simpan pada lantai peti bek 70 C semalaman dan segera pindahkan ke dalam bekas yang mengandungi nitrogen cecair, jika ada. NOTA 1. Pilih kultur sel yang sihat, iaitu dalam fasa tumbesaran logaritmanya dan hampir mencapai lapisan sel yang meliputi keseluruh permukaan bekas kultur. 2. Jika sel mengambil masa yang lama untuk mencapai keadaan di atas, tukarkan media kultur sekitar 24 jam sebelum sel diproses. 3. Jangan tambah DMSO kepada suspensi sel secara langsung ke dalam media pertumbuhan. 66 Tambahkan media pertumbuhan yang mengandungi DMSO yang tersedia kepada sel-sel selepas diemparkan. 4. Adukkan suspensi sel sejurus sebelum diagihkan ke dalam botol kriovial untuk memperoleh suspensi sel yang sama rata. 5. Adalah penting suhu kultur sel yang disimpan dikurangkan secara beransur-ansur. Ini dicapai dengan kriovial dibalut dengan kapas serta kertas timah dan disimpan di dalam kotak polistirena. 6. Oleh kerana amat sukar untuk mengekalkan suhu peti beku pada 70 C, adalah lebih selamat

jika sel disimpan di dalam nitrogen cair. Untuk mengelakkan penyejatan, bekas nitrogen cair disimpan di dalam bilik sejuk dan dipastikan nitrogen cair ditambahkan semula dalam tempoh masa yang sesuai mengikut kekerapan bekas tersebut dibuka. 7. Walaupun ampul kaca atau polipropilen boleh digunakan sebagai bekas untuk simpanan, kriovial lebih mudah dikendalikan kerana dilengkapi dengan penutup, manakala ampul biasanya harus ditutup melalui penaupan dengan pembakaran api. Lagipun, kadangkala ampul yang dimasukkan ke dalam air untuk pencairan boleh meletup jika penaupan tidak dilakukan dengan sempurna. 8. Kultur sel yang disimpan pada 70 C harus dikulturkan selepas 6 bulan sebelum disimpan semula. Amalan ini dipraktikkan kerana sel haiwan yang disimpan pada suhu 70 C tidak boleh mengekalkan viabilitinya dalam masa yang begitu lama. Kita juga harus menyedari bahawa ada kemungkinan suhu 70 C tersebut tidak dicapai di seluruh ruangan simpanan di dalam peti beku. 9. Sebelum sesuatu kumpulan kultur sel yang disimpan dianggap sempurna, pastikan salah satu bekas kultur sel daripada kumpulan ini boleh dihidupkan semula tanpa terjadinya sebarang pencemaran mikrob. Tatacara Mengkulturkan Semula Sel yang Dikrioawetkan BAHAN 1. Kriovial kultur sel 2. Media pertumbuhan 3. Penganggas air 37 C

4. Bekas kultur sel 5. Pipet steril 6. Inkubator suhu 37 C TATACARA 1. Keluarkan sebuah kriovial dari tempat simpanan dan serta-merta pindahkannya ke dalam penganggas air. 2. Pegang kriovial di dalam penganggas air sehingga semua pembekuan menjadi cair. 3. Jika ampul kaca digunakan, tudung ampul dengan sehelai kain dan pakai kaca mata pelindung kerana ampul yang tidak ditaup dengan sempurna boleh meletup. 4. Keluarkan kriovial/ampul sejurus selepas suspensi sel menjadi cair. 5. Keringkan permukaan luar ampul dan lap dengan alkohol. 6. Pindahkan kandungan kriovial atau ampul ke dalam sebuah bekas kultur dan campurkan media pertumbuhan ke dalamnya. 7. Eramkan pada 37 C. 8. Selepas beberapa jam hingga semalaman, selepas sel telah melekat pada permukaan bekas kultur pipet keluar media dan gantikan dengan media baru. NOTA 1. Semasa kandungan kriovial dicairkan, pastikan aras air tidak mencapai penutupnya untuk mengelak kemungkinan air menyentuh bahagian mulut kriovial dan berlakunya pencemaran. 67 2. Sama ada kriovial digoncang untuk menggalakkan pembekuan suspensi sel supaya lebih

cepat mencair atau tidak bergantung kepada jenis sel tertentu kerana terdapat jenis sel yang viabilitinya terjejas akibat goncangan dengan kuat. 3. Lap keseluruhan bahagian luar bekas dengan alkohol untuk mengelakkan pencemaran. 4. Untuk memperoleh pemulihan kultur sel yang lebih cepat, pada peringkat awal tempoh pertumbuhan sel, eramkan kultur di dalam inkubator CO 2 , atau di dalam bekas khas yang mengandungi CO 2 5%, atau udara di dalam ruangan bekas kultur digantikan dengan campuran gas yang mengandungi CO 2 5%. 5. Media kultur dibuang dan digantikan dengan yang baru secepat boleh supaya DMSO dan selsel yang mati yang boleh menjejaskan pertambahan sel-sel yang hidup disingkirkan. Tatacara Inokulasi Kultur Sel dengan Virus BAHAN 1. Suspensi virus 2. Larutan garam seimbang Hank dengan antibiotik (pencair virus) 3. Kultur sel dalam bentuk monolapisan penuh 4. PBS (steril)

TATACARA 1. Lakukan pencairan virus supaya mencapai pergandaan infektiviti (multiplicity of infection, m.o.i.) yang sesuai. 2. Amati kultur sel dan pilih kultur yang hampir atau baru mencapai monolapisan yang lengkap atau penuh (seluruh permukaan bekas kultur sel diliputi dengan sel). 3. Keluarkan media dari bekas kultur. 4. Cuci 2 kali dengan PBS . 5. Masukkan suspensi virus ke dalam bekas kultur dan sebarkan ke seluruh lapisan sel. 6. Eramkan pada suhu yang sesuai (biasanya pada suhu 37 C) selama 30-60 minit. 7. Goncangkan bekas setiap 10-15 minit untuk menyebarkan semula suspensi virus ke seluruh monolapisan. 8. Masukkan media pertumbuhan dan eramkan pada suhu yang sesuai. 9. Amati kehadiran kesan sitopatik (untuk virus sitopatik) setiap hari atau selang sehari. NOTA 1. Jika banyak kultur sel perlu diinokulasi dalam masa yang sama, media boleh dikeluarkan dengan pipet yang dihubungkan kepada sebuah pam udara. Jika kultur berada di dalam bekas kaca, kandungannya bolehlah dituang. Permukaan bekas kaca dibakar sebelum dan sesudah cecair dituang. 2. Pergandaan infektiviti, adalah nisbah partikel virus berinfeksi dan sel. Jika m.o.i yang terlalu tinggi digunakan ada kemungkinan sebahagian besar virus yang tak lengkap dihasilkan. 3. Penjerapan virus dilakukan dalam isipadu cecair yang kecil untuk memudahkan kontak di

antara virus dan sel. Bekas kultur sel digoncang bukan sahaja untuk menyebarkan virus tetapi juga untuk mempastikan seluruh sel monolapisan sentiasa diliputi cecair untuk mengelak daripada kekeringan. 4. Penjerapan boleh dilakukan pada suhu bilik atau pada suhu pengeraman kultur. 5. Sama ada inokulum virus dikeluarkan selepas tempoh penjerapan atau tidak bergantung kepada keperluan. 6. Persediaan ini dilakukan dengan menggunakan kabinet biohazard kelas 2. 7. Pilih suhu pengeraman yang optimum untuk sesejenis virus yang dikulturkan. Pada kebanyakan virus haiwan, suhu pengeraman adalah 37 C sungguhpun pada virus respiratori suhu yang lebih rendah, yakni 35 C merupakan suhu yang optimum. 68 4.3.2. PENGKULTURAN VIRUS DENGAN MENGGUNAKAN TELUR BEREMBRIO Telur ayam berembrio hidup merupakan suatu sistem yang digunakan untuk pengkulturan beberapa jenis virus. Tiga jenis tapak pada telur membran amnion, membran alantoik dan membran korioalantoik boleh digunakan bergantung kepada jenis virus yang terlibat. Sebelum inokulasi dilakukan adalah penting untuk menentukan terlebih dahulu sama ada telur yang akan digunakan tersebut mempunyai embrio yang masih hidup dan kedua, tapak yang sesuai untuk suntikan. Pengamatan Telur Melalui Transiluminasi (Penyuluhan) Embrio telur dipastikan hidup dengan cara transiluminasi yang diberi istilah candling dalam bahasa

Inggeris kerana pada zaman dahulu cahaya lilin digunakan untuk tujuan ini. Pada masa ini, yang digunakan ialah kotak cahaya atau lampu suluh yang telah diubahsuai. Tatacara Penyuluhan Telur BAHAN 1. Telur berembrio 2. Lampu suluh 3. Kertas manila 4. Pita selofan 5. Gunting 6. Pena penanda PERSEDIAAN Alat untuk penyuluhan Gulungkan sekeping kertas manila supaya berbentuk kon. Gunakan pita selofan untuk melekatkannya dan mengekalkan bentuk ini. Gunting kedua-dua penghujung kon ini supaya tepinya menjadi sama rata dan garis pusat bahagian yang lebih besar adalah sama dengan ukuran kepala lampu dan bahagian kecil adalah lebih kurang sama dengan ukuran penghujung telur yang lebih bulat. Pasangkan penghujung kon yang besar kepada kepala lampu suluh. Perkukuhkan kontak ini dengan menambahkan pita selofan. Dengan ini cahaya lampu akan ditujukan ke luar melalui lubang yang lebih kecil. TATACARA 1. Pilih tempat yang gelap.

2. Tekan lubang terowong lampu suluh kepada cangkerang telur. 3. Nyalakan lampu dan amatilah bahagian dalam telur. 4. Pastikan salur darah korioalantoik telur berembrio kelihatan jelas sekali dan embrio bergerak-gerak, bentuk embrio juga jelas kelihatan, khususnya mata embrio yang besar dan kehadiran ruang udara. Semua ini adalah tanda yang menunjukkan bahawa embrio tersebut masih hidup. NOTA Pilih telur yang bersih dan mempunyai cangkerang yang berwarna putih pudar untuk memudahkan pengamatan bahagian dalamnya. 69 Suntikan Virus ke dalam Ruang Alantoik Pertumbuhan virus di dalam membran alantoik digunakan untuk virus influenza dan paramiksovirus yang telah disesuaikan beraplikasi dalam keadaan makmal. Tatacara Penyuntikan Virus ke dalam Ruang Alantoik BAHAN 1. Telur berembrio berumur 10 hingga 12 hari 2. Jarum (28 gauge) dan picagari 3. Etanol 70% 4. Penggerudi berputar yang dipasang dengan cakera pemotong 5. Pita selofan

TATACARA 1. Suluh telur untuk menentukan embrio masih hidup. 2. Tandakan dengan pena tanda satu tapak yang agak berjauhan dengan sebarang salur darah. 3. Gerudi satu lubang atau celah yang kecil pada cangkerang pada tapak yang ditandakan untuk mendedahkan membran cangkerang. 4. Lap tapak celah tersebut dengan etanol. 5. Suntikkan 0.1 ml inokulum ke dalam celah ini dengan jarum yang dimasukkan beberapa mm ke dalam celah. 6. Tutup celah dengan pita selofan. 7. Eramkan dengan tapak yang diinokulasi virus di sebelah atas selama 1 hingga 3 hari mengikut keperluan. Suntikan Virus ke dalam Ruang Amniotik Cara ini digunakan untuk pemencilan primer (kali pertama virus ditumbuh dalam keadaan makmal) virus influenza dan mumps. Tatacara Penyuntikan Virus di dalam Ruang Amniotik BAHAN 1. Telur berembrio berumur 10-12 hari atau 12-14 hari 2. Jarum panjang (11/4) dan picagari berisipadu 1 ml 3. Etanol 70% 4. Penggerudi berputar yang dipasang dengan cakera pemotong

5. Pita selofan 6. Parafin cair 7. Gunting kecil dengan penghujungnya bengkok 8. Swab steril TATACARA 1. Suluh telur untuk menentukan embrio masih hidup. 2. Tandakan dengan pena penanda tapak ruang udara. 3. Ketuk dan pecahkan cangkerang tepat di atas ruang udara berkenaan dengan pemegang gunting dan guntingkan satu lubang besar sehingga mencapai pinggir ruang udara. 4. Terbalikkan telur untuk membersihkan membran cangkerang daripada cebisan-cebisan cangkerang. 5. Lapkan membran cangkerang dengan parafin cecair supaya membran cangkerang menjadi jernih. 70 6. Suntikkan 0.1 ml inokulum ke pundi amniotik dengan menusukkan jarum ke tapak yang berhampiran dengan kepala embrio. 7. Tutup lubang dengan pita selofan. 8. Eramkan dengan tapak yang diinokulasi di sebelah atas selama dua hingga tiga hari pada suhu 37C. Penyuntikan Virus ke atas Membran Korioalantoik Pengkulturan virus di atas membran korioalantoik membolehkan perbezaan di antara poksvirus

jenis variola dengan vaksinia dan di antara virus herpes simplex taip 1 dengan taip 2 berdasarkan morfologi poks yang dihasilkan. Tatacara Penyuntikan Virus ke atas Membran Korioalantik BAHAN 1. Telur berembrio berumur 10 sehingga 12 hari 2. Jarum (28 gauge) dan picagari 3. Etanol 70% 4. Penggerudi berputar yang dipasang dengan cakera pemotong 5. Pita selofan 6. Pena penanda 7. Bal penyedut getah besar 8. Larutan salin 0.85% (steril) TATACARA 1. Suluh telur untuk menentukan embrio masih hidup. 2. Tandakan dengan pena penanda satu tapak yang tidak mendekati mana-mana salur darah. 3. Gerudikan satu celah cangkerang yang kecil pada tapak yang ditandakan tersebut untuk mendedahkan membran cangkerang sahaja. 4. Gerudikan satu lubang kecil di kawasan ruang udara. 5. Lap tapak celah dengan etanol. 6. Letakkan setitis larutan salin yang steril di atas celah. 7. Tekan bal penyedut getah besar dengan sepenuhnya dan lekapkan penghujungnya pada

lubang di ruang udara. 8. Lepaskan tekanan bal getah, supaya membran korioalantoik di bawah celah tersedut dan kelihatan terjatuh atau terlepas daripada cangkerang dan suatu pundi udara terbentuk. 9. Suntikkan 0.1 ml inokulum ke dalam celah ini dengan jarum yang dimasukkan beberapa mm ke dalam celah. 10. Tutup celah dengan pita selofan. 11. Eramkan dengan tapak yang diinokulasi di sebelah atas selama 1 hingga 3 hari mengikut keperluan. Tatacara Mengumpulkan Cecair Alantoik BAHAN 1. Telur berembrio selepas penyuntikan virus dan pengeraman 2. Gunting 3. Pipet Pasteur 4. Botol (steril) 5. Etanol 70% 71 TATACARA 1. Letakkan telur di dalam peti sejuk selama beberapa jam atau di dalam peti beku suhu 20 C selama 1 jam. 2. Lap cangkerang di bahagian atas ruang udara telur dengan etanol. 3. Pecahkan cangkerang di atas ruang udara dan guntingkan satu lubang besar.

4. Gunakan pipet Pasteur untuk menolak embrio dan pundi kuning telur ke tepi dan kumpulkan cecair alantoik dengan menggunakan pipet Pasteur lain. NOTA Telur disejukkan untuk membunuh embrio serta mengecutkan salur darah supaya pengumpulan cecair yang mengandungi virus dilakukan tanpa pencemaran dengan sel darah merah. Tatacara Mengumpulkan Cecair Amniotik BAHAN 1. Telur berembrio selepas penyuntikan virus dan pengeraman 2. Forseps 3. Pipet Pasteur 4. Botol (steril) 5. Larutan salin 0.85% (steril) TATACARA 1. Letakkan telur di dalam peti sejuk selama beberapa jam atau di dalam peti beku suhu 20 C selama 1 jam. 2. Tanggalkan pita selofan yang menutupi ruang udara. 3. Pegang pundi amniotik dengan forseps dan tembusinya dengan pipet Pasteur untuk mengeluarkan cecair amniotik daripada ruang amniotik. NOTA Jika cecair amniotik didapati kurang, tambahkan 0.5 ml larutan salin yang steril. Sedut dan

keluarkan cecair daripada pipet beberapa kali sebelum dikumpulkan. Tatacara Pengambilan Membran Korioalantoik BAHAN 1. Telur berembrio selepas penyuntikan virus dan pengeraman 2. Gunting 3. Piring Petri 4. Forseps 5. Larutan salin 0.85% (steril) 6. Etanol 70% TATACARA 1. Letakkan telur di dalam peti sejuk selama beberapa jam atau di dalam peti beku suhu 20 C selama 1 jam. 2. Tanggalkan pita selofan yang menutupi tapak suntikan pada permukaan telur. 3. Lap tapak suntikan dengan alkohol. 72 4. Pecahkan cangkerang di atas celah dengan bahagian pemegang gunting dan potong cangkerang sehingga ke pinggir ruang udara palsu. 5. Pegang membran korioalantoik ini dan gunting di sekelilingnya sehingga semuanya terlepas daripada cangkerang. 6. Cuci membran korioalantoik yang dikeluarkan di dalam larutan salin steril dan

rentangkannya di dalam piring Petri. 73 5. PENGENALPASTIAN AGEN MIKROB 5.1. UJIAN MAKMAL DALAM PENGENALPASTIAN BAKTERIA Bakteria mempunyai kisaran aktiviti biokimia yang amat luas; yang merangkumi proses kemusnahan dan proses pembinaan (atau sintesis). Aktiviti yang luas ini dikawal oleh faktor genetik serta alam sekelilingnya. Daripada segi genetik, sesuatu aktiviti biokimia ditentukan oleh enzim-enzim yang dihasilkan oleh bakteria. Dalam pengenalpastian bakteria, faktor ini dengan spesifisiti sesejenis enzim terhadap substrat tertentu membolehkan bakteria dikenal pasti dalam keadaan sekeliling yang terkawal seperti di makmal. Misalnya, beberapa kumpulan bakteria tertentu menghasilkan bahan pertengahan metabolisme yang spesifik seperti asetil-metil-karbinol berikutan fermentasi glukos yang boleh digunakan untuk membezakan kumpulan bakteria yang menghasilkannya daripada yang tidak. Kehadiran sesejenis enzim dikenal pasti secara tidak langsung melalui tindakannya terhadap sesuatu substrat. Hasilan aktiviti enzim ini boleh berupa gas atau terbitan bukan gas. Gas yang dihasilkan dikesan secara langsung melalui pengamatan penghasilan gelembung gas atau secara tidak langsung melalui penggantian cecair di dalam tiub Durham dengan gas, kehadiran rekahan atau celahcelah di dalam agar atau melalui tindakan kimia yang menghasilkan terbitan yang berwarna dan tidak larut (misalnya H

2 S). Hasilan bukan gas ditunjukkan oleh tindakan kimia yang menghasilkan terbitan yang berwarna. Penghasilan asid ditunjukkan oleh perubahan warna indikator pH (sesuatu jenis pewarna) yang bergantung kepada jenis indikator yang digunakan (contoh, Andrade: neutral kuning pucat, asid merah, alkalin tanpa warna; bromthymol blue: neutral hijau, asid kuning, alkali biru). Enzim juga boleh ditunjukkan dalam tindakan serologi yang menghasilkan kompleks enzim (sebagai antigen) antibodi yang muncul sebagai presipitasi. Ujian Fermentasi Gula: Penghasilan Asid dan Gas Fermentasi adalah suatu proses kimia yang melibatkan oksidasi-reduksi. Proses in berlaku dalam keadaan anaerobik, iaitu tanpa oksigen bebas, dan substrat organik merupakan penerima terakhir elektron. Dalam fermentasi karbohidrat beberapa produk dihasilkan termasuk pelbagai jenis asid dan gas. Bakteria berbeza dalam jenis karbohidrat yang boleh digunakan sebagai sumber tenaga melalui proses fermentasi, jenis dan kuantiti asid campuran (mixed acids) pelbagai jenis asid organik yang berasal dari asid piruvik yang dihasilkan serta kemampuan menghasilkan gas. Oleh yang demikian, perbezaan ini merupakan salah satu ciri penting dalam pengenalpastian spesis bakteria. Dalam ujian bakteriologi, fermentasi dipastikan secara tidak langsung melalui pengamatan perubahan warna indikator pH akibat penghasilan asid. Akan tetapi penurunan pH boleh dicapai

melalui proses penggunaan karbohidrat yang bukan anaerobik, iaitu bukan fermentasi, ataupun dari menggunakan substrat bukan karbohidrat. Oleh yang demikian, tidak semua ujian yang digunakan untuk menguji kebolehan sesejenis bakteria mendegradasikan secara enzimatik gula menjadi produk asid merupakan proses fermentatif. Walau bagaimana pun, istilah fermentasi digunakan secara longgar dalam konteks ujian bakteriologi diagnostik. Dalam hal ini sungguhpun tidak semua substrat yang digunakan dalam ujian fermentasi adalah gula, misalnya manitol adalah sejenis alkohol, istilah gula meliputi senarai substrat berkenaan. Tatacara Ujian Fermentasi Gula: Penghasilan Asid dan Gas BAHAN 1. Kultur bakteria pada plat agar 2. Media cecair gula di dalam tabung reaksi atau botol Bijou 3. Gelung dawai 4. Penunu Bunsen 74 Media cecair gula: (media dasar yang mengandungi jenis-jenis gula atau karbohidrat tertentu dan indikator pH, serta dilengkapi dengan tiub Durham) TATACARA 1. Sterilkan gelung dawai melalui pembakaran api penunu Bunsen dan biarkan sehingga dingin. 2. Sentuhkan pada 1 koloni bakteria pada media plat. 3. Inokulasikan kultur ini ke dalam media cecair yang mengandungi sejenis gula. Ulangkan

inokulasi ke dalam media yang mengandungi gula lain. 4. Tutup rapat media yang telah diinokulasi dan tunggangkan sekali supaya keseluruhan tiub Durham dipenuhi media dan sama sekali tidak mengandungi gelembung udara di dalamnya. 5. Tegakkan semula botol media. 6. Eramkan pada 37C selama semalaman. 7. Amati perubahan warna media dan penghasilan gas (yang terperangkap di dalam tiub Durham). NOTA 1. Media cecair terdiri daripada gula 1% di dalam air pepton 1%. Biasanya media ini juga disertakan sejenis indikator pH. 2. Tiub Durham adalah sebuah tabung/tiub kecil yang boleh dimuatkan di dalam botol Bijou dan diletakkan terbalik (dengan mulutnya di bawah). Jika pada mulanya tiub ini hanya dipenuhi dengan media, setelah penghasilan gas oleh mikroorganisma, gas ini akan mengganti media yang dimaksudkan dan akan terperangkap di dalam tiub maka kehadiran ruang tanpa media menunjukkan kehadiran gas. 3. Catatkan hasil selepas 24 jam pengeraman dan seterusnya pengeraman dilanjutkan selama beberapa hari sebelum hasilnya dinyatakan sebagai negatif. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN 1. Penghasilan asid Ujian positif: Media berwarna merah Ujian negatif: Tanpa perubahan warna media

Pentafsiran hasil positif: Bakteria dapat menfermentasikan gula berkenaan 2. Penghasilan gas Ujian positif: Ruang kosong di dalam tiub Durham Ujian negatif: Tiub Durham masih dipenuhi media Pentafsiran hasil positif: Bakteria menghasilkan gas semasa menfermentasi gula Ujian Tiga Gula-Besi Media tiga gula-besi atau Triple Sugar Iron ( TSI) merupakan sejenis media campuran yang digunakan untuk membezakan spesies bakteria dalam famili Enterobacteriaceae dengan berdasarkan kepada kemampuan spesies-spesies ini untuk memfermentasi gula dekstros, laktos atau sukros atau kombinasi daripada ketiga-tiga gula tersebut; penghasilan gas dan penghasilan hidrogen sulfid. Media TSI disediakan dalam agar condong. Bahagian permukaan agar (agar condong) (slant) adalah terdedah kepada udara maka wujud dalam keadaan aerobik. Sebaliknya, bahagian puntung agar (di bahagian dasar tabung) (butt) dilindungi dari udara dan wujud dalam keadaan anaerobik (walaupun bukan 100%). Gula yang digunakan adalah glukosa (0.1%) , laktosa (1.0%) dan sukrosa (1.0%). Indikator pH, sebagai penunjuk fermentasi, adalah fenol merah yang akan menjadi kuning pada pH 6.8 (keadaan asid). Media TSI ditampan pada pH 7.4 iaitu pH alkali maka warna agar kelihatan oren-kemerahan atau merah.

75 Peptid dan asid amino yang berasal dari pepton di dalam media TSI didegradasikan melalui proses dekarboksilasi oksidatif kepada amina, sejenis terbitan alkali. Proses in dipercepatkan oleh bakteria yang tumbuh di bahagian permukaan agar. Di bahagian puntung, oksigen di dalam udara tidak dapat sampai maka proses dekarboksilasi oksidatif adalah pada tahap minimum. Jika bakteria yang diinokulasi tidak menfermentasi karbohidrat, asid tidak dihasilkan dan warna merah akan kekal di seluruh media. Jika bakteria hanya boleh menfermentasi glukosa, kuantiti asid yang dihasilkan adalah terhad kerana kuantiti glukosa yang digunakan adalah rendah (0.1%). Walau bagaimanapun, kuantiti ini mencukupi untuk bahagian permukaan dan puntung agar menjadi kuning. Tetapi di permukaan agar yang terdedah kepada oksigen udara, amina dihasilkan dan lama kelamaan (18-24 jam selepas pengeraman) kuantitinya mencapai aras yang mampu mengatasi kesan kuantiti rendah asid yang dihasilkan, pH asid di bahagian permukaan agar akan berubah semula menjadi alkali (ungu-merah) manakala bahagian puntung agar (bahagian dasar tabung) akan kekal asid (kuning) kerana di situ amina yang dihasilkan tidak mencukupi untuk mengatasi kesan asid. Jika laktosa atau sukrosa, atau kedua-duanya difermentasi kuantiti asid yang dihasilkan daripada salah satu di antara kedua gula ini adalah besar kerana konsentrasi kedua-dua gula ini adalah tinggi iaitu masing-masing 1%. Jadi, walaupun amina dihasilkan kuantiti asid yang

dihasilkan terlalu besar untuk perubahan pH kembali kepada keadaan alkali maka bahagian condong mahupun bahagian puntung agar akan tetap berkeadaan asid (kuning). Sukrosa dicampurkan untuk menyaringkan spesies Salmonella dan Shigella kerana kedua-dua bakteria ini tidak menfermentasi sukrosa atau laktosa. Penghasilan gas ditunjukkan dengan kehadiran gelembung gas atau bahagian puntung agar akan kelihatan pecah-pecah. Hidrogen sulfid yang dihasilkan akan bertindakbalas dengan ferrous sulfat dan suatu presipitasi hitam (ferik sulfid) akan terbentuk di dalam media. Tatacara Ujian Tiga Gula Besi BAHAN 1. Kultur bakteria 2. Cerun agar TSI di dalam tabung uji 3. Dawai inokulasi lurus (dawai lurus) 4. Penunu Bunsen (Reagen TSI: Dari sumber komersial) TATACARA 1. Sterilkan keseluruhan dawai lurus melalui pembakaran dan biarkan supaya sejuk. 2. Sentuhkan penghujung dawai kepada koloni bakteria. 3. Tusukkan inokulum menembusi cerun agar TSI di dalam tabung sehingga ke dasarnya. 4. Tarik semula dawai dan gariskan organisma di atas permukaan agar yang condong. 5. Eramkan semalaman dan teruskan selama 48 jam (jika perlu).

PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Rujuk kepada Jadual 5.1 76 NOTA 1. Tabung TSI harus ditutup secara longgar sahaja selepas diinokulasi supaya udara dapat masuk ke dalam tiub kultur untuk membolehkan berlakunya oksidasi dan perubahan balik condong agar daripada asid (kuning) ke alkali (ungu-kemerahan). 2. Oleh kerana sesetengah spesies Proteus dan beberapa spesies lainnya boleh memberikan reaksi pada TSI yang serupa dengan Salmonella ataupun Shigella, maka untuk membezakan spesies-spesies ini ujian urease dilakukan. (Salmonella dan Shigella adalah urease-negatif, manakala Proteus, urease-positif). Ujian Indol Bakteria menghasilkan indol (benzopyrrole) daripada asid amino triptofan akibat tindakan enzim triptofanase. Indol bertindak dengan para-dimetil-aminobenzaldehid dan menghasilkan pewarna rosindole (warna merah tua). Sungguhpun tindak balas kimia asas dalam pengesanan indol adalah sama, terdapat beberapa jenis reagen untuk mengesannya. Walau bagaimanapun, reagen Kovac merupakan yang paling popular digunakan di masa kini. Tatacara Ujian Indol BAHAN 1. Kultur bakteria

2. Air pepton di dalam tabung uji 3. Broth triptofan di dalam tabung uji JADUAL 5.1 Pola Hasil Tindakan Bakteria ke atas TSI Rupa Agar Penghasilan Tafsiran Kemungkinan Condong Puntung Gas H 2 S Bakteria (Jenis) Merah* Merah Tiada fermentasi gula Alcaligenes, Pseudomonas, Mimae Ungu-kemerahan Kuning Fermentasi glukosa Shigella dysenteriae, S. sonnei, Morganella morganii, proteus rettgeri,Providencia, Serratia Ungu-kemerahan Kuning Fermentasi glukosa + Salmonella cholera-suis,S.enteriti-dis paratyphi, Proteus rettgeri,M. morganii, Providencia, Shigella Ungu-kemerahan Kuning Fermentasi glukosa _ + Salmonella typhosa, Proteus mira bilis,P.vulgaris,Arizona,Citro-bacter, Edwardsiella Ungu-kemerahan Kuning Fermentasi glukosa + + Salmonella typhimurium, S. enter itidis,S. schottmuelleri, Pro-teus mirabilis, P. vulgaris, Arizona, Citrobacter,Ed-wardsiella Kuning Kuning Fermentasi glukosa & Hafnia,Klebsiella,Staphylococcus,

laktosa atau sukrosa Streptococcus, Serratia Kuning Kuning Fermentasi glukosa & + Aerobacter aerogenes, A. cloacae, . laktosa atau sukrosa E. coli, Klebsiella, Proteus rettgeri,Providencia Kuning Kuning Fermentasi glukosa & + + Proteus vulgaris, P. mirabilis, laktosa atau sukrosa Citrobacter, Arizona * Atau tiada perubahan dan warna agar seperti warna sebelum diinokulasi 77 4. Pipet Pasteur (steril) 5. Reagen Kovac PERSEDIAAN Reagen Kovac Masukkan 10 g p-dimetilaminobenzaldehid ke dalam 150 ml alkohol jenis amilalkohol, isoamilalkohol atau butilalkohol. Panaskan di dalam penganggas air pada 56C sehingga larut. Biarkan sehingga dingin. Dengan perlahan dan hati-hati campurkan 50 ml HCl pekat (Lakukan di dalam kabinet asap). Reagen ini berwarna kuning muda. Simpan di dalam botol gelap dengan penutup kaca di dalam peti beku. Reagen ini stabil selama beberapa tahun. TATACARA 1. Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton.

2. Masukkan 2 titis suspensi ini ke dalam broth triptofan. 3. Eramkan selama 24 48 jam. 4. Masukkan 5 titis (~ 0.5 ml) reagen Kovac (berwarna kuning). 5. Goncang dan biarkan selama 10 minit. 6. Amatilah pembentukan lapisan warna (cincin) pada permukaan suspensi. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Merah tua Ujian negatif: Kuning Pentafsiran hasil positif: Penghasilan indol akibat degradasi protein triptofan oleh bakteria. NOTA Di samping reagen Kovac, reagen Ehrlich juga boleh digunakan dalam ujian Indol. Walau bagaimanapun, dalam ujian yang menggunakan reagen Ehrlich, media diuji biasanya dicampurkan kloroform sejenis bahan kimia yang toksik. Ujian indol yang dilakukan dengan reagen Kovac tidak memerlukan kloroform. Ujian Metil-Merah Metil-merah pada pH neutral dan asid sederhana (nilai 7-6) berwarna kuning tetapi menjadi merah pada pH yang agak rendah iaitu di bawah nilai 4.4. Ciri ini digunakan untuk membezakan di antara spesies bakteria yang menghasilkan asid kuat (strong acids) dalam kuantiti besar dan spesies

bakteria yang tidak berbuat demikian. Bakteria yang menggunakan tapak jalan fermentasi asid campuran dalam katabolisme glukosa biasanya menghasilkan kuantiti pelbagai jenis asid organik (formik, asetik, laktik) yang mencukupi untuk menurunkan pH media di bawah nilai 4.4 manakala bakteria yang menggunakan tapak jalan fermentasi butilena glikol tidak menghasilkan asid. Dalam penciptaan ujian metil-merah, kepekatan komponen media yang sesuai untuk ujian metilmerah serta ujian Voges Proskauer telah ditentukan dan media untuk kedua-dua ujian ini kemudian dipasarkan sebagai media MR-VP (Methyl Red Voges Proskauer). Tatacara Ujian Metil-Merah BAHAN 1. Kultur bakteria 2. Air pepton 3. Broth MR-VP di dalam tabung uji 4. Metil-merah (Media MR-VP: Dari sumber komersial) 78 PERSEDIAAN Reagen metil-merah Larutkan 0.1 g metil-merah di dalam 300 ml etanol 95%. Campurkan air suling sehingga 500 ml. TATACARA 1. Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton.

2. Masukkan 2 titis suspensi ini ke dalam 0.5 ml broth MR-VP. 3. Eramkan selama 24 jam pada 37C. 4. Masukkan 2 titis metil-merah ke dalam setiap 0.5 ml kultur. 5. Goncang dan biarkan seketika. 6. Amatilah pembentukan warna di permukaan media PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Warna merah jambu sehingga merah. Ujian negatif: Warna kuning. Pentafsiran hasil positif: Menunjukkan penghasilan asid dalam kuantiti tinggi hasil fermentasiglukosa oleh bakteria. NOTA 1. Inokulum yang tebal adalah penting supaya kuantiti asid yang besar dapat dihasilkan untuk membolehkan ujian dibaca berikutan pengeraman selama 18-24 jam. 2. Jika hasil yang kurang pasti didapati, ujian diulangi ke atas kultur dengan pengeraman yang lebih lama. 3. Warna oren, warna pertengahan di antara kuning dan merah tidak dianggap positif. Ujian Voges-Proskauer Asetil-metil karbinol (atau asetoin) adalah metabolit pertengahan/perantaraan dalam proses penghasilan butilena glikol pada fermentasi glukosa. Penghasilan asetoin merupakan salah satu kriteria dalam fermentasi glukosa oleh bakteria yang digunakan dalam pengenalpastian. Dalam

kehadiran KOH dan oksigen (dari udara) asetoin secara spontan (tidak melibatkan enzim) dioksidasi menjadi metabolit pertengahan, diasetil. Diasetil kemudian bertindak dengan kumpulan NH 2 bebas daripada kumpulan guanidina (kreatin adalah sumber kumpulan guanidina) untuk menghasilkan kompleks berwarna merah. Sensitiviti ujian ini dipertingkatkan dengan penambahan a -naftol. Tatacara Ujian Voges-Proskauer BAHAN 1. Kultur bakteria 2. Air pepton 3. Broth MR-VP (0.5 ml) di dalam tabung uji 4. a -naftol 5% dalam alkohol pekat 95% 5. KOH (40% yang mengandungi 0.5% kreatin) TATACARA 1. Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. 2. Masukkan dua titis suspensi ini ke dalam 1.0 ml broth MR-VP. 3. Eramkan pada 37C selama 24 48 jam. 4. Tambahkan 0.6 ml larutan a -naftol. 5. Masukkan pula 0.2 ml larutan KOH. 6. Goncang dengan baik dan biarkan selama 5 20 minit.

7. Amati pembentukan warna. 79 PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Merah. Ujian negatif: Tiada perubahan atau kuning. Pentafsiran hasil positif: dalam proses fermentasi glukosa oleh sesetengah bakteria. NOTA Oleh kerana suatu perubahan warna akan berlaku di antara permukaan campuran kultur dan reagen, maka elakkan daripada menggerak-gerakkan tabung sehingga membolehkan warna tersebut muncul segera selepas reagen dicampurkan dan tabung digoncang supaya sebati. Kadangkala tindak balas mengambil masa yang lama (~ 2 jam) sebelum kemunculan warna yang dimaksudkan. Ujian Sensitiviti Terhadap Bacitracin dan Optochin Sensitiviti terhadap Bacitracin, sejenis antibiotik, digunakan untuk membezakan streptokokus kumpulan A Lancefield daripada streptokokus b-hemolitik lainnya. Kajian yang telah dilakukan menunjukkan bahawa kebanyakan streptokokus kumpulan A (93-98%) sensitif terhadap konsentrasi rendah Bacitracin dan sebaliknya streptokokus bukan kumpulan A amnya resistan. Sensitiviti terhadap Optochin (ethylhydrocuprein hydrochloride) pula digunakan untuk membezakan Streptococcus pneumoniae daripada streptokokus a -hemolitik lainnya. Ujian ini Kehadiran asetil-metil-karbinol (asetoin), suatu hasil pertengahan

menunjukkan

korelasi yang rapat dengan ujian kelarutan hempedu. Pneumokokus ( Streptococcus pneumoniae ) selain larut di dalam hempedu, adalah sensitif terhadap Optochin dan menghasilkan zon rencatan pertumbuhan di sekeliling disk tersebut. Streptokokus a -hemolitik yang lainnya pula tumbuh sehingga mencapai ke pinggir disk atau kadangkala hanya menghasilkan zon rencatan pertumbuhan yang biasanya dibaca sebagai resistan. Kesimpulannya, Streptococcus pyogenes (atau streptokokus kumpulan A Lancefield) sensitif terhadap Bacitracin, manakala Sebaliknya, streptokokus selain daripada kedua spesies ini menunjukkan keresistanan sama ada terhadap Bacitracin bagi kumpulan b-hemolitik atau terhadap Optochin bagi kumpulan a -hemolitik menurut ujian yang dilakukan di atas. Tatacara Ujian Sensitiviti Terhadap Bacitracin dan Optochin BAHAN 1. Kultur bakteria 2. Agar darah 3. Swab (steril) 4. Gelung dawai 5. Jarum/forseps steril 6. Disk Bacitracin dan disk Optochin Streptococcus pneumoniae sensitif terhadap Optochin.

(Reagen Bacitracin dan Optochin: Dari sumber komersial) TATACARA 1. Ambil 1 koloni bakteria streptokokus b-hemolitik dan buat garisan-garisan pada permukaan agar darah. 2. Sapukan permukaan agar dengan menggunakan swab steril pada arah 90 daripada arah garisan pertama bakteria untuk mendapatkan lapisan bakteria yang tersebar dan sama rata di atas permukaan media. 3. Letakkan secara aseptik dengan menggunakan jarum atau forseps steril 1 disk Bacitracin ke atas agar sejurus sebelum pengeraman kultur. 80 4. Tekan disk pada permukaan agar dengan forseps atau jarum steril supaya tidak tanggal. 5. Eramkan pada 37C selama 18 sehingga 24 jam. 6. Amati zon perencatan pertumbuhan bakteria. 7. Ulangi kaedah di atas dengan menggunakan kultur streptokokus a -hemolitik dan disk Optochin. Pengeraman seharusnya dilakukan dalam CO 2 5-10% untuk mencapai pertumbuhan optimum. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif Bacitracin: Zon kepekatan perencatan pertumbuhan, saiz yang bergantung kepada

reagen yang digunakan. Disk dengan dua unit Bacitracin: 15 20 mm garis pusat (termasuk garis pusat disk). Ujian positif Optochin: Disk Optochin jenama Oxoid, code DD1: 5 mm atau lebih zon perencatan yang diukur dari tepi disk. Disk dengan 15 mg Optochin: 18 mm atau lebih dari tepi disk. Pentafsiran hasil positif: Bakteria sensitif terhadap Bacitracin/Optochin. Ujian Keperluan Faktor Tumbesaran X dan V Disk kertas yang diserap dengan faktor tumbesaran digunakan untuk membezakan antara spesies bakteria genus berdasarkan sama ada media dasar memerlukan penambahan faktor tumbesaran X (hemin) dan faktor V ( NAD, juga dinamakan koenzim I) supaya pertumbuhan bakteria dapat berlaku. Koloni spesies bakteria yang menunjukkan pertumbuhan di sekeliling disk yang mengandungi faktor tumbesaran X, V, dan X bersama V tertentu menandakan ia memerlukan faktor tersebut dan sebaliknya, ia tidak mempunyai kemampuan untuk mensintesis faktor berkenaan dalam kuantiti yang optimum. Tatacara Ujian Keperluan Faktor Tumbesaran X dan V BAHAN 1. Kultur bakteria 2. Agar nutrien Haemophilus. Spesies Haemophilus dan Bordetella boleh dikenal pasti

3. Air pepton 4. Swab (steril) 5. Gelung dawai 6. Jarum/forseps (steril) 7. Disk faktor X, V, XV (Disk faktor X, V dan XV : Dari sumber komersial) TATACARA 1. Buat suspensi murni bakteria di dalam air pepton. 2. Inokulasi seluruh permukaan plat agar nutrien dengan bakteria berkenaan dengan menggaris-gariskannya menggunakan gelung dawai. 3. Letakkan disk-disk yang mengandungi faktor tumbesaran secara aseptik di atas agar kira-kira 1 atau 2 cm daripada pinggir media dalam pola sebagai berikut: misalnya disk Faktor X : tepat pada titik jam tangan yang menunjukkan jam 12; disk faktor V : tepat pada jam 4; manakala disk XV, tepat pada jam 8. 4. Eramkan pada suhu 37C selama 18 dan teruskan sehingga 48 jam, jika perlu dalam atmosfera CO 2 5-10%. 5. Amati kehadiran atau tidaknya pertumbuhan di sekeliling disk. 81 PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN

Pertumbuhan di sekeliling disk dengan: Faktor X dan XV memerlukan faktor X sahaja Faktor V dan XV memerlukan faktor V sahaja Faktor XV sahaja memerlukan faktor X mahupun faktor V Bakteria yang memerlukan faktor X dan V atau salah satu di antaranya adalah spesies Haemophilus, manakala yang tidak memerlukan faktor X atau V adalah B. pertussis . NOTA 1. Simpan disk pada suhu 4C dan bukan pada 0C. 2. Perhatikan bahawa media yang digunakan berupa media minimum, iaitu agar nutrien yang mana spesies-spesies yang diuji tidak mungkin tumbuh padanya tanpa penambahan faktor tumbesaran tertentu. Elakkan daripada menggunakan agar darah, apatah lagi agar coklat dalam melakukan ujian ini. Penggunaan Sitrat Koser mencipta sejenis media broth asas yang mengandungi natrium ammonium fosfat sebagai sumber tunggal nitrogen, dan natrium sitrat sebagai sumber tunggal karbon. Bakteria golongan aerogen boleh menggunakan sitrat sebagai sumber karbon, manakala golongan koliform tidak. Dalam ujian yang menggunakan media Koser, hasilnya ditafsir berdasarkan berlakunya kekeruhan pada media broth akibat pertumbuhan bakteria. Seterusnya, Simmons mengubahsuai media Koser

tersebut dengan menambahkan agar dan indikator, bromthymol blue, yang kelihatan hijau pada pH 6.8 dan biru pada pH lebih 7.6. Pengubahsuaian ini membolehkan pertumbuhan bakteria dikesan dengan lebih mudah kerana dalam metabolisme karbon pada sitrat (pertumbuhan positif), suatu tindak balas alkali berlaku dan ini ditunjukkan dengan perubahan pada warna media daripada hijau kepada biru tua. Kadangkala bacaan hasil ujian tidak semata-mata berdasarkan kepada perubahan warna, tetapi sama ada terdapat atau tidaknya pertumbuhan bakteria pada garis inokulasi di atas media. Kehadiran pertumbuhan bererti kemampuan bakteria mengurai sitrat sebagai sumber karbon, dan hasil ujian dinyatakan sebagai positif untuk sitrat. Perubahan warna, dalam hal ini, mempermudahkan lagi pembacaan hasil ujian. JADUAL 5.1 Keperluan bakteria untuk faktor X dan V Pertumbuhan Berlaku Dengan Faktor: Spesies XVX V H. influenzae + H. parainfluenzae ++ H. aegyptius + H. ducreyi ++ H. hemolyticus +++ H. parahemolyticus ++ B. pertussis ++++ 82 Ujian Penggunaan Sitrat BAHAN 1. Kultur bakteria

2. Dawai lurus 3. Cerun agar sitrat Simmons di dalam botol Bijou (Agar sitrat Simmons: Dari sumber komersial) TATACARA 1. Sterilkan keseluruhan dawai lurus dan biarkan sehingga sejuk. 2. Sentuhkan pada koloni bakteria dengan penghujung dawai. 3. Buatkan 1 garisan tipis bakteria pada permukaan agar. 4. Eramkan pada 37C selama semalaman atau 48 jam, jika perlu. 5. Amatilah perubahan warna pada media. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Pertumbuhan dengan/tanpa media menjadi biru. Ujian negatif: Tiada pertumbuhan atau media tetap hijau. Pentafsiran ujian positif: Kemampuan menggunakan sitrat sebagai sumber tunggal karbon. NOTA 1. Gunakan sedikit sahaja inokulum supaya semasa penginokulasian inokulum ini tidak kelihatan sama sekali pada garis inokulasi dan untuk mengelakkan reaksi positif palsu akibat bakteria yang mati membebaskan karbon dan nitrogen dalam kuantiti yang boleh menampung pertumbuhan. 2. Elakkan daripada mengambil sebarang bahan nutrien daripada media kultur di mana inokulum diambil. 3. Kultur yang menunjukkan pertumbuhan tanpa perubahan pH (perubahan warna) juga

dianggap positif kerana pada sesetengah bakteria yang lambat tumbuh keadaan tindak balas alkali tidak dapat dicapai dalam tempoh pengeraman yang ditetapkan. Pengeraman selama 48 jam mungkin diperlukan untuk bakteria yang lambat tumbuh supaya warna biru dapat muncul. Ujian Urease Urea adalah substrat spesifik yang dihidrolisis oleh enzim urease kepada ammonia dan karbon dioksida. Ammonia menyebabkan campuran tindak balas menjadi alkali. Tanda kehadiran urease dapat dikesan melalui indikator pH yang menunjukkan perubahan warna media daripada oren (pH 6.8) kepada merah jambu (pH 8.1) Ujian untuk mengesan penghasilan enzim urease oleh bakteria biasanya digunakan dalam pengenalpastian bakteria genus Proteus. Walau bagaimanapun, bakteria-bakteria lain yang juga penting dalam perubatan mempunyai kemampuan untuk menghasilkan urease. Terdapat beberapa jenis ujian urease dengan sensitiviti yang berbeza-beza. Tahap sensitiviti ini ditentukan terutamanya oleh kandungan larutan penampan. Pemilihan dari segi jenis ujian ini adalah bergantung kepada kegunaannya. Oleh kerana pH media boleh ditingkatkan melalui sesuatu tindak balas lain, maka hasil positif palsu untuk urease memang terdapat. Untuk mengesan keadaan seperti ini ujian kawalan terhadap media yang tidak mengandungi urea diperlukan. 83 Tatacara Ujian Urease

BAHAN 1. Kultur bakteria 2. Air pepton 3. Broth urea di dalam botol Bijou 4. Gelung dawai 5. Pipet Pasteur steril TATACARA 1. Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. 2. Masukkan 2 titis suspensi ini ke dalam broth urea. 3. Eramkan selama 24 jam. 4. Amati warna broth urea. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Positif: Merah. Negatif: Kuning. Pentafsiran hasil positif: Kehadiran enzim urease yang menghidrolisis urea kepada ammonia. Ujian Oksidase Ujian oksidase menentukan kehadiran sitokrom C, sejenis enzim respiratori. Oleh yang demikian, ujian ini hanya positif untuk bakteria yang memiliki sitokrom C. Sitokrom adalah protein yang mengandungi heme dan merupakan enzim oksidatif dalam kitaran respiratori yang terlibat dalam fosforilasi oksidatif. Dalam ujian oksidase tatacara Kovacs, reagen oksidase adalah tetrametil-pfenilena-diamina dihidroklorida 1%. Enzim oksidase sitokrom tidak bertindak secara langsung

dengan reagen oksidase, tetapi menyebabkan oksidasi sitokrom C yang kemudian menyebabkan oksidasi tetrametil-p-fenilena-diamina dihidroklorida sehingga membentuk sejenis bahan kimia berwarna biru yang disebut biru Wunster. Sitokrom C yang direduksi (ditambah elektron) dalam tindakan ini diubah secara tidak langsung kepada bentuk yang teroksidasi oleh oksidase sitokrom yang menerima elektronnya. Enzim oksidase sitokrom kemudian menggantikan elektron tersebut kepada oksigen untuk menghasilkan air dengan ion hidrogen. Ujian ini digunakan untuk membezakan streptokokus (oksidase-negatif) daripada neisseria (oksidase-positif). Tatacara Ujian Oksidase BAHAN 1. Kultur bakteria 2. Slaid mikroskop 3. Kepingan kecil kertas turas Whatman No. 1 4. Reagen oksidase (tetrametil-p-fenilena-diamina dihidroklorida 1%) 5. Kayu aplikator TATACARA 1. Letakkan sekeping kertas turas kecil di atas slaid mikroskop bersih. 2. Titiskan 2 hingga 3 titis reagen oksidase ke atas kertas turas. 84 3. Ambil koloni bakteria dengan kayu aplikator dan goreskan ke atas kertas turas pada bahagian yang menyerap reagen oksidase.

4. Amati kemunculan warna dalam beberapa saat. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Kemunculan warna lavender (ungu pudar) yang cepat (dalam beberapa saat) menjadi biru/ungu. Ujian negatif: Tiada perubahan warna atau warna muncul hanya setelah beberapa minit. Pentafsiran hasil positif: Perubahan segera ke warna biru/ungu menunjukkan bakteria memilikim sitokrom C. NOTA 1. Reagen ini mesti disediakan segar kerana sifatnya yang tidak stabil. Auto-oksidasi oleh oksigen bebas dari udara boleh berlaku dan oleh yang demikian reagen ini dengan sendirinya akan berubah menjadi biru atau ungu jika dibiarkan di udara agak lama. 2. Reagen yang baru disediakan perlu dibiarkan selama 15 minit untuk menjadi masak sebelum digunakan. 3. Pastikan dan patuhi tempoh masa yang ditetapkan untuk mentafsirkan hasil ujian ini kerana pada ujian yang disimpan lama sebelum dibaca hasil positif palsu boleh berlaku kerana warna biru atau ungu boleh muncul akibat auto-oksidasi yang berlaku ke atas reagen. 4. Gunakan kayu aplikator atau dawai platinum untuk mengambil koloni. Dawai nikrom juga boleh mempengaruhi hasil ujian dan memberikan hasil positif palsu. 5. Tatacara alternatif ujian oksidase ini adalah dengan membanjiri kultur pada piring Petri dengan reagen dan kemudian segera menyingkirkan bahan yang berlebihan ini dengan pipet. Hasilnya ditunjukkan dengan perubahan warna koloni bakteria kepada warna ungu

(oksidase-positif) atau tiada perubahan warna (oksidase-negatif). Ujian Koagulase Ujian untuk menentukan penghasilan enzim koagulase oleh stafilokokus adalah suatu ujian penting dalam mikrobiologi diagnostik. Ia membezakan stafilokokus patogenik kerana berkemampuan untuk menghasilkan enzim ini, daripada yang tidak menghasilkannya atau tidak patogenik. Terdapat dua jenis koagulase; yang satu terikat pada dinding sel bakteria (koagulase terikat) dan tidak bebas, dan yang satu jenis lagi dirembeskan oleh sel ke dalam media atau cairan (koagulase bebas). Ujian slaid di mana penggumpalan atau pengelompokan bakteria dihasilkan dipercayai disebabkan oleh koagulase terikat yang terdapat pada dinding sel. Enzim bentuk ini bertindak secara langsung ke atas fibrinogen haiwan-haiwan tertentu dan menghasilkan fibrin yang memerangkap Sebaliknya, koagulase yang dihasilkan secara bebas bertindak dengan protrombin untuk menghasilkan trombin, yang seterusnya bertindak ke atas fibrinogen untuk menghasilkan fibrin (pembekuan). Tatacara Ujian Koagulase Slaid BAHAN 1. Kultur bakteria 2. Larutan salin 0.85% 3. Slaid mikroskop 4. Gelung dawai bakteria sehingga berlakunya penggumpalan/pengelompokan tersebut.

5. Plasma arnab 85 TATACARA 1. Letakkan setitis larutan salin steril di atas sebuah slaid mikroskop yang bersih dan kering. 2. Ambil beberapa koloni bakteria dengan gelung dawai steril. 3. Buatkan suspensi bakteria ini di dalam titisan salin. 4. Tambahkan setitis plasma arnab kepada suspensi dan campurkan dengan gelung dawai. 5. Goncangkan slaid dan amatilah penggumpalan (clumping) bakteria yang akan kelihatan sebagai kelompak-kelompak putih dalam masa 15 saat. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Pembentukan gumpalan bakteria. Ujian negatif: Tiada penggumpalan dan suspensi bakteria kelihatan homogen. Pentafsiran hasil positif: Bakteria memiliki enzim koagulase. NOTA 1. Mana-mana bakteria yang boleh menggunakan sitrat sebagai sumber tenaga boleh membebaskan kalsium yang akan mengakibatkan pembekuan plasma jika plasma tersebut diambil daripada darah yang bercampur sitrat. Oleh yang demikian, adalah amat penting untuk mempastikan bahawa bakteria yang diuji adalah benar-benar kultur murni stafilokokus, dan ujian ini digunakan semata-mata untuk membezakan antara strain yang menghasilkan koagulase daripada yang tidak. 2. Gunakan plasma arnab atau manusia dan bukan spesies mamalia lain kerana kebanyakan

plasma daripada spesies lain tidak bertindak dengan koagulase stafilokokus. Perlu juga diperhatikan bahawa kadangkala plasma manusia yang digunakan mengandungi bahan perencat yang akan memberikan hasil negatif palsu. 3. Plasma perlulah diuji terlebih dahulu dengan strain kawalan positif dan negatif sebelum digunakan. Seterusnya, supaya hasil ujian boleh dipercayai dan diterima tanpa ragu-ragu, ujian haruslah dilakukan juga ke atas beberapa jenis bakteria kawalan yang memberikan hasil positif kuat, positif lemah dan kawalan negatif. 4. Pastikan koloni bakteria boleh diemulsifikasi di dalam salin supaya tidak menimbulkan masalah dalam pembacaan hasilnya nanti. 5. Ujian positif palsu boleh berlaku jika penggumpalan yang berlaku lewat diambil kira. 6. Hasil positif yang berlaku lewat atau negatif diuji semula dengan ujian koagulase tabung kerana terdapat strain S. aureus yang menghasilkan hanya koagulase bebas yang tidak bertindak dalam ujian koagulase slaid. Tatacara Ujian Koagulase Tabung BAHAN 1. Kultur bakteria 2. Larutan salin 0.85% 3. Tabung uji steril 4. Gelung dawai 5. Plasma arnab 6. Penganggas air pada 37C

TATACARA 1. Sediakan 1:9 pencairan plasma arnab atau manusia di dalam larutan salin. 2. Sediakan suspensi stafilokokus di dalam larutan salin (atau gunakan kultur broth). 3. Campurkan 1 isipadu suspensi bakteria dengan 5 isipadu larutan plasma. 86 4. Campurkan dengan memutarkan tabung uji di antara kedua dua tapak tangan. Jangan campur dengan goncangan. 5. Eramkan pada suhu 37C di dalam penganggas air dan amati selepas 1, 3 dan 6 jam dan selepas semalaman, jika masih negatif. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Pembentukan pembekuan. Ujian negatif: Campuran tetap cair. Pentafsiran hasil positif: Bakteria memiliki enzim koagulase NOTA 1. Untuk memudahkan pembekuan diamati, tabung uji dicondongkan. Pembekuan jika hadir, akan kekal di dasar tabung uji. 2. Sesetengah strain stafilokokus menghasilkan enzim fibrinolisin yang akan melisis semula pembekuan plasma yang dihasilkan. Untuk mengelakkan daripada memperolehi hasil yang negatif palsu, tabung haruslah diamati beberapa kali di sepanjang tempoh pengeraman. Pastikan tabung tidak digoncang semasa mengamati dan membaca hasil ujian (penghasilan pembekuan) kerana ini akan mengakibatkan pembekuan menjadi terlerai dan tidak dapat

dikesan. 3. Spesimen yang memberi hasil negatif pada masa pengeraman 6 jam dieramkan semula semalaman kerana terdapat strain S. aureus yang kadar penghasilan koagulasenya adalah rendah maka masa yang panjang diperlukan untuk koagulase mencapai aras yang memberi hasil yang positif (hasil positif yang lewat) Ujian Katalase Katalase adalah enzim dengan bahagian (moieti) yang mengandungi besi. Tindak balas kimia yang berlaku dalam ujian katalase adalah : 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2 . Penghasilan gelembung gas (oksigen) adalah tanda bagi ujian yang positif. Ujian katalase digunakan khususnya untuk membezakan antara stafilokokus (katalase positif) dengan streptokokus (katalase negatif) dan juga kadangkala digunakan dalam pengenalpastian pelbagai jenis bakteria. Tatacara Ujian Katalase

BAHAN 1. Kultur bakteria 2. Slaid mikroskop 3. Kayu aplikator 4. Hidrogen peroksida 3% TATACARA 1. Letakkan setitis larutan hidrogen peroksida di atas sebuah slaid kaca bersih dan kering. 2. Sentuhkan penghujung kayu aplikator kepada koloni bakteria. 3. Masukkan organisma ke dalam titisan reagen di atas slaid. 4. Amatilah kehadiran gelembung-gelembung gas yang dihasilkan dengan cepat, rancak dan berterusan. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Penghasilan dan pembebasan gas dengan cepat dicirikan dengan gelembunggelembung gas yang dibebaskan dengan rancak. 87 Ujian negatif: Tiada sebarang tindak balas. Penghasilan segelintir gelembung kecil selepas 20-30 saat tidak dianggap positif. Pentafsiran hasil positif: Bakteria memiliki enzim katalase. NOTA 1. Jangan gunakan dawai gelung kerana positif palsu boleh berlaku. 2. Jangan gunakan kultur yang berusia lebih daripada 24 jam untuk mengelak daripada

memperolehi hasil negatif palsu kerana enzim ini hanya dapat dikesan pada kultur hidup yang masih segar dan mungkin tiada lagi pada kultur tua. 3. Pada kultur anaerobik, dedahkan kultur kepada udara selama setengah jam sebelum ujian dilakukan untuk membolehkan oksidasi aerobik ke atas katalase yang tereduksi berlaku. 4. Gunakan H 2 O 2 pada kepekatan 3% untuk mendapatkan hasil ujian yang terbaik atau optimum. Larutan H 2 O 2 disimpan di dalam botol gelap di dalam peti beku. 5. Seboleh-bolehnya elakkan daripada mengambil koloni yang tumbuh pada permukaan media agar darah. Ini untuk mengelakkan daripada terambil bersama sel darah dan mendapatkan hasil yang positif palsu seperti di atas. Tetapi, sekiranya hal ini tidak dapat dielakkan, berhati-hatilah dalam pengambilan tersebut untuk mempastikan hasil yang tepat dan betul. 6. Ujian katalase plat: Ujian ini boleh dilakukan ke atas koloni di atas plat kultur dengan me-nuangkan reagen ke atas koloni berkenaan KECUALI jika media kultur tersebut adalah agar darah kerana ia boleh memberikan hasil positif palsu. Perlu ditekankan di sini bahawa

darah juga mengandungi enzim katalase yang dapat bertindak balas dengan reagen. Ujikan juga se-bahagian daripada plat agar yang belum diinokulasi dengan bakteria dengan menuangkan sedikit reagen di atasnya sebelum meneruskan dengan ujian katalase plat ini untuk mengelak-kan hasil positif palsu. Ini adalah kerana sesetengah media mungkin mengandungi sedikit katalase yang boleh memberikan tindak balas yang lemah dan lambat serta boleh menyulitkan pembacaan hasil. Penghasilan Hidrogen Sulfida Bakteria boleh menghasilkan H 2 S daripada terbitan sulfur organik yang didapati di dalam pepton yang digunakan atau daripada terbitan sulfur tak organik yang dicampurkan dengan media kultur. Penghasilan H 2 S oleh sesejenis bakteria menandakan keupayaan bakteria tersebut untuk mereduksi sulfur kepada sulfida. Sesetengah bakteria yang menghasilkan H 2 S tidak dapat tumbuh pada media yang mengandungi terbitan ferum (besi). Oleh yang demikian, H 2 S yang dihasilkan oleh bakteria

golongan ini dikesan dengan kertas yang diserapkan dengan larutan plumbum asetat 5%. Kertas ini hanya diletakkan pada sisi mulut tabung di atas kultur bakteria pada agar condong, tanpa menyentuh permukaan agar tersebut kerana plumbum asetat boleh menghalang pertumbuhan sesetengah bakteria. Gas H 2 S yang dibebaskan akan dikesan melalui perubahan warna kertas putih kepada warna hitam akibat pembentukan plumbum sulfida. Tatacara Ujian Penghasilan Hidrogen Sulfida BAHAN 1. Kultur bakteria 2. Cerun agar nutrien di dalam tabung 3. Dawai lurus 4. Kertas turas 5. Plumbum asetat 5% TATACARA 1. Gariskan bakteria ke atas cerun agar di dalam tabung uji. 2. Serapkan sekeping kertas turas dengan plumbum asetat 5% dan biarkan sehingga kering. 88 3. Gantung kertas ini pada sisi mulut tabung uji dan pastikan kertas ini tidak menyentuh permukaan agar.

4. Eramkan pada 37C semalaman. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian hasil positif: Kertas menjadi hitam. Ujian hasil negatif: Tiada perubahan warna pada kertas. Pentafsiran hasil positif: Bakteria boleh menghasilkan H 2 S daripada sulfur. Ujian Nagler Penentuan penghasilan enzim lesitinase oleh bakteria adalah berfaedah dalam pengenalpastian bakteria genus Clostridium khususnya Clostridium perfringens ( Clost. welchii ) sungguhpun terdapat laporan yang menyatakan bahawa bakteria lain seperti Pseudomonas aeruginosa juga boleh menghasilkan enzim ini. Enzim lesitinase C menghidrolisis lesitin (lecithin-phosphatidyl choline) kepada fosforilkolin dan sejenis digliserid. Enzim ini juga bertindak ke atas fosfolipid lainnya; dan lesitinase A, B dan D juga bertindak ke atas lesitin tetapi terhadap terbitan-terbitan lain yang dihasilkan. Ujian Nagler pada mulanya dilakukan dengan menumbuhkan bakteria pada media agar kuning telur. Selepas pengeraman, hasilnya menunjukkan kehadiran suatu zon opalesens (antibodi anti-lesitinase) di sekeliling koloni yang menandakan penghasilan lesitinase oleh bakteria. Fenomena ini kali pertama dilaporkan oleh Nagler yang pada waktu itu menggunakan serum

sebagai sumber lesitin. Mekanisme penghasilan opalesens dipercayai disebabkan oleh tiga faktor iaitu lemak digliserid yang dihasilkan, lemak bebas daripada kuning telur selepas lesitin dihancurkan dan protein tak larut air (vitellin, vitellenin) daripada kuning telur yang mempresipitasikan lemak bebas. Tatacara Ujian Nagler BAHAN 1. Kultur bakteria 2. Agar nutrien 3. Penganggas air pada 50C 4. Ekstrak Fildes 5. Emulsi kuning telur pekat 6. Piring Petri 7. Antitoksin Clostridium perfringens ( Cl. welchii) (antibodi anti-lesitinase) 8. Swab (steril) 9. Gelung dawai (Reagen agar Nagler dan kuning telur : Dari sumber komersial) TATACARA 1. Cairkan 20 ml agar nutrien yang steril (Difco: Blood Agar Base CM55). 2. Turunkan suhu kepada 50C dengan membiarkan media di dalam penganggas air selama 15 minit. 3. Campurkan 1 ml ekstrak Fildes.

4. Campurkan emulsi kuning telur pekat (Difco: SR47) untuk mencapai kepekatan 5% dan tuangkan agar campuran ini ke dalam sebuah piring Petri. Biarkan kering. 5. Titiskan 2 titis antitoksin (antilesitinase) Cl. perfringens pada setengah bahagian daripada media plat. 6. Sebarkan antitoksin ini sama rata ke atas permukaan setengah plat agar dan biarkan ia meresap dan kering. 7. Buatkan 1 garisan bakteria melintasi kedua-dua bahagian setengah plat agar ini (bahagian yang disapu antitoksin dan yang tidak). 8. Eramkan secara anaerobik. 89 PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Lesitinase dihasilkan jika zon opalesens hanya kelihatan di sekeliling koloni di bahagian setengah plat agar tanpa antitoksin, manakala pada bahagian setengah plat agar yang disapu dengan antitoksin tidak terbentuk zon opalesens. Ujian negatif: Tidak terbentuk zon opalesens di sekeliling koloni pada keseluruhannya (pada kedua-dua kawasan disapu antitoksin dan tidak). Pentafsiran hasil positif: Bakteria menghasilkan serta merembeskan enzim lesitinase yang dikenal pasti kerana aktivitinya menghasilkan zon opalesens dihalang oleh antibodi anti-lesitinase (antitoksin). Ujian Elek

Strain melalui

Corynebacteria diphtheriae yang menghasilkan toksin dapat dikesan secara in vitro

penghasilan presipitasi apabila toksin ini bertindak dengan antitoksin. Penghasilan garis presipitasi adalah hasil suatu tindak balas serologi yang melibatkan antigen (toksin) dan antibodi (antitoksin). Walau bagaimanapun, secara tradisi ujian ini dimasukkan ke bahagian ujian biokimia. Tatacara Ujian Elek BAHAN 1. Kultur bakteria yang diuji 2. Kultur bakteria kawalan positif (disahkan menghasilkan toksin difteria) 3. Kultur bakteria kawalan negatif (disahkan tidak menghasilkan toksin difteria) 4. Agar dasar Elek 5. Penganggas air 50C 6. Serum lembu 7. Kertas turas 8. Piring Petri yang steril 9. Antitoksin difteria 10. Inkubator (Reagen agar dasar jenis Elek: Dari sumber komersial) TATACARA 1. Cairkan 10 ml agar dasar Elek.

2. Turunkan suhu kepada 50C dengan membiarkan di dalam penganggas air selama 15 minit. 3. Campurkan 2 ml serum lembu. 4. Tuangkan agar campur serum ke dalam piring Petri. 5. Letakkan sekeping kertas turas ke dalam 1 piring Petri kosong yang steril. 6. Titiskan 1 ml antitoksin difteria (1000 unit) ke atas jalur kertas supaya diserap dan biarkan kering. 7. Letakkan kertas yang mengandungi antitoksin di tengah piring agar sejurus selepas agar mem-beku. 8. Biarkan agar menjadi kering. 9. Inokulasi permukaan agar dengan bakteria (kawalan positif, kawalan negatif dan yang diuji) secara tegak lurus (90) melintasi jalur kertas antitoksin. 10. Eramkan dan amati selepas 24 jam dan 48 jam. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Garis presipitasi kelihatan muncul daripada sudut pertumbuhan bakteria yang diuji dan bakteria kawalan positif. Ujian negatif: Tiada garis presipitasi. Pentafsiran ujian positif: Bakteria menghasilkan toksin difteria. 90 NOTA 1. Plat harus disediakan pada hari ujian dilakukan. 2. Gunakan inokulum yang tebal.

3. Pastikan strain kawalan negatif dan strain kawalan positif diikut sertakan. 4. Jika plat dieramkan lebih 48 jam, kemungkinan garis presipitin juga dihasilkan oleh strain kawalan negatif (dan juga Corynebacterium akibat antigen yang umum kepada semua korinebakteria). Ujian Motiliti dengan Menggunakan Agar Separuh Pejal Media pertumbuhan dengan kepekatan agar yang rendah (0.4% atau <) merupakan suatu media separuh pejal yang membolehkan bakteria bergerak dan menyebar ke pelbagai arah di dalamnya. Jika bakteria mempunyai kemampuan untuk bergerak atau bersifat motil ia akan menunjukkan penyebaran yang bermula dari garis inokulasi. Bakteria yang tak motil akan tetap pada garis inokulasi dan sama sekali tidak akan tersebar. Garam tetrazolium digunakan dalam ujian motiliti ini kerana ia memudahkan pengesanan pertumbuhan serta penyebaran bakteria secara visual di dalam media. Garam tetrazolium adalah tanpa warna dan akan diubah kepada formazan, kompleks tak larut berwarna merah hasil pereduksian oleh bakteria yang tumbuh. Tatacara Ujian Motiliti (Pergerakan) pada Agar Separuh Pejal BAHAN 1. Kultur bakteria 2. Agar nutrien (0.4% atau <) yang mengandungi indikator (garam tetrazolium) di dalam tabung uji 3. Dawai lurus 4. Inkubator

TATACARA 1. Sterilkan keseluruhan dawai lurus. 2. Sentuh koloni bakteria dengan penghujung dawai. 3. Tusukkan hujung dawai ke dalam agar separuh pejal sehingga ke dasar tabung. 4. Eramkan semalaman. 5. Amati pola pertumbuhan bakteria. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Pertumbuhan bakteria (merah) tersebar daripada garis tusukan dawai lurus. Ujian negatif: Pertumbuhan bakteria terhad kepada garis tusukan. Pentafsiran ujian: Ujian positif bakteria motif; ujian negatif bakteria tak motil. NOTA 1. Beberapa bakteria seperti Pseudomonas adalah aerobik dan akan hanya menunjukkan motiliti pada bahagian atas media ini. 2. Oleh kerana keseluruhan dawai lurus akan ditusuk ke dalam agar maka pastikan keseluruhan dawai ini dibakar untuk mensterilkannya. 3. Pertumbuhan beberapa jenis bakteria tertentu mungkin dihalang oleh garam tetrazolium. 4. Dawai yang ditusuk ke dalam media dikeluarkan seboleh-bolehnya bertepatan dengan garis kemasukannya. Elakkan daripada menggerakkan dawai ke kiri atau ke kanan semasa dikeluarkan (dan juga semasa dawai ditusuk) kerana ini akan menyebabkan pertumbuhan yang kelihatan tersebar dan memberi tafsiran positif palsu mengenai mobiliti. 91

6. UJIAN SENSITIVITI ANTIBIOTIK IN VITRO Rawatan penyakit dengan sesuatu bahan atau sebatian kimia dinamakan kemoterapi. Agen kemoterapi yang dihasilkan berikutan aktiviti metabolik bakteria atau fungus disebut antibiotik. Senarai antibiotik yang dipencilkan dan dikenal pasti sememangnya cukup panjang, namun demikian kebanyakannya tidak mempunyai nilai perubatan kerana sesetengahnya mungkin terlalu toksik terhadap pengguna atau sukar diperolehi. Pada masa ini kebanyakan antibiotik dan terbitannya yang digunakan dalam rawatan dihasilkan secara sintetik atau buatan. Seseorang doktor haruslah mengetahui mengenai tahap kerentanan (susceptibility) sesuatu mikroorganisma terhadap antibiotik tertentu supaya memudahkannya membuat keputusan yang sesuai dalam rawatan serta pengurusan seseorang pesakit. Maklumat ini boleh diperolehi di makmal umumnya melalui dua teknik atau pendekatan iaitu ujian resapan disk dan asai pencairan tiub. 6.1. UJIAN RESAPAN DISK Dalam ujian resapan disk, organisma yang diuji digariskan (atau diinokulasi dan kemudian disebarkan) memenuhi permukaan media agar di dalam piring Petri. Cara lain ialah organisma dicampurkan dengan media agar yang masih cecair dan kemudian dituangkan ke dalam piring. Biasanya larutan antibiotik ini tidak terus diletakkan ke atas agar, tetapi terlebih dahulu diserapkan ke dalam disk-disk kertas (satu disk satu jenis antibiotik dengan satu unit pencairan). Kemudian disk diletakkan di atas inokulum yang telah disebarkan pada permukaan agar atau pada permukaan

media agar yang telah dicampur organisma sebelum pengeraman. Antibiotik tersebut akan merembes keluar daripada disk dan meresap ke dalam media. Jika kultur bakteria sensitif terhadap sesuatu antibiotik, suatu zon rencatan pertumbuhan akan terbentuk di sekeliling disk yang mengandungi antibiotik tersebut. Sebaliknya, jika ia resistan, pertumbuhan akan berlaku sehinggalah mencapai ke pinggir disk, bahkan kadangkala boleh tumbuh di bawah disk. Pendekatan ini disebut sebagai ujian resapan disk dan terdapat dua tatacara yang umum, iaitu tatacara Stoke dan tatacara perbandingan. Dalam ujian resapan disk, prosedur pertama (awal) adalah penginokulasian hanya bakteria yang diuji, atau bersama bakteria kawalan, pada keseluruhan permukaan media plat agar. Tatacara Membuat Inokulasi Bakteria pada Keseluruhan Permukaan Media Plat Agar BAHAN 1. Suspensi bakteria yang diuji di dalam air pepton 2. Swab (steril) 3. Plat agar darah Mueller-Hinton TATACARA 1. Celupkan swab steril ke dalam suspensi bakteria yang berada di dalam tabung uji. 2. Putarkan swab pada dinding sebelah dalam tabung untuk menyingkirkan suspensi yang berlebihan. 3. Sapukan swab sambil memutarkannya pada permukaan media agar untuk penginokulasian mengikut corak seperti diterangkan di bawah:

Sapukan swab mula-mula ke satu arah sehingga memenuhi keseluruhan permukaan media dan kemudian sapukan pula menurut arah kira-kira 90 darjah daripada arah sapuan semula. 4. Buangkan swab ke dalam bekas khas yang mengandungi disinfektan. 92 Tatacara Membuat Inokulasi 2 Jenis Bakteria di Bahagian yang Berasingan pada Permukaan Media Plat Agar BAHAN 1. Suspensi bakteria yang diuji di dalam air pepton 2. Suspensi bakteria kawalan 3. Swab (steril) 4. Plat agar darah Mueller-Hinton 5. Alat pemutar plat Petri TATACARA 1. Letakkan plat agar di atas pentas pemutar plat Petri. 2. Celupkan swab yang steril ke dalam suspensi bakteria kawalan. 3. Putarkan swab pada dinding sebelah dalam tabung uji berkenaan untuk menyingkirkan suspensi yang berlebihan. 4. Buka penutup plat Petri dan inokulasi media dengan mula-mula menyentuh bahagian tengah plat dengan swab yang mengandungi bakteria kawalan sehinggalah penginokulasian ini memenuhi suatu kawasan bulatan kira-kira 5 cm garis pusat. Kaedah ini dilaksanakan sejajar dengan pergerakan alat pemutar plat.

5. Lakukan kaedah 2 dan 3 untuk bakteria yang akan diuji. 6. Sentuhkan dengan swab yang mengandungi bakteria yang diuji bahagian tepi plat dan liputi kawasan permukaan agar ini dengan inokulum ini sehingga hampir menyentuh pinggir kawasan inokulum pertama. Suatu garis perbatasan antara kedua-dua jenis bakteria kawalan dan ujian akan diperolehi di mana disk-disk antibiotik akan diletakkan nanti. NOTA Pastikan swab tidak terlalu basah atau meninggalkan kesan yang tidak diingini pada permukaan agar. Ujian Resapan Disk: Tatacara Perbandingan BAHAN 1. Kultur bakteria (masing-masing untuk ujian dan kawalan) 2. Gelung dawai 3. Penunu Bunsen 4. Tabung air pepton 5. Swab (steril) 6. Jarum atau forseps (steril) 7. Disk antibiotik 8. Inkubator 9. Pembaris TATACARA Hari pertama

1. Sterilkan gelung dawai. 2. Pindahkan 3 koloni bakteria (garis pusat 1-2 mm) ke dalam 1 tabung air pepton. 3. Goncangkan untuk mendapatkan suspensi yang homogenus. 4. Inokulasi strain bakteria ini pada keseluruhan permukaan media agar dengan swab steril (rujuk kepada tatacara di ms. 93). 93 5. Biarkan supaya permukaan media menjadi kering dan kemudian letakkan disk-disk antibiotik di atas media dengan menggunakan jarum atau forseps steril dan tekan disk ke atas permukaan agar. Pastikan terdapat jarak yang sekurang-kurangnya 1.5 cm antara 1 dengan lain mahupun antara disk dengan dinding plat. 6. Ulangi kaedah 1 hingga 5 untuk strain kawalan pada plat lain yang mengandungi media yang sama. 7. Eramkan plat pada 37C semalaman. Hari kedua 8. Pastikan pertumbuhan bakteria yang diuji dan bakteria kawalan adalah secara kuantitatif hampir sama. 9. Balikkan plat dan ukurlah garis pusat zon tanpa pertumbuhan bakteria (zon rencatan). 10. Bandingkan hasil sensitiviti kedua-dua strain terhadap antibiotik dan tentukan sama ada strain yang diuji sensitif, separuh sensitif (intermediate) atau resistan. NOTA 1. Jika suatu carta rujukan piawai diperolehi atau sudah tersedia, ujian ke atas strain kawalan

tidak perlu dijalankan. Seseorang hanya perlu merujuk kepada carta tersebut untuk menentukan pola sensitiviti strain bakteria yang diuji menurut senarai yang ditetapkan di dalam carta berkenaan. Ini bagi menyatakan sama ada bakteria tersebut sensitif, separuh sensitif, atau resistan. 2. Tatacara perbandingan berdasarkan carta atau suatu piawai yang tersedia dikenali sebagai Tatacara Kirby-Bauer. Ujian Resapan Disk: Tatacara Stoke BAHAN 1. Kultur bakteria (masing-masing untuk ujian dan kawalan) 2. Gelung dawai 3. Penunu Bunsen 4. Tabung air pepton 5. Swab (steril) 6. Alat pemutar plat Petri 7. Jarum atau forseps (steril) 8. Disk antibiotik 9. Inkubator 10. Pembaris TATACARA Hari pertama 1. Inokulasi bakteria yang diuji dan bakteria kawalan di atas plat yang sama di bahagian yang

berasingan (rujuk kepada bahagian tatacara di m.s. 94). 2. Letak dan tekan disk antibiotik tepat di atas garis perbatasan antara kedua-dua kultur supaya sebelah disk berada di kawasan kultur kawalan dan sebelah lagi di kawasan kultur yang diuji. Pastikan terdapat jarak sekurang-kurangnya 1.5 cm antara satu disk dengan yang lain dan juga disk dengan dinding plat. 3. Eramkan plat pada 37C semalaman. 94 Hari kedua 4. Balikkan plat dan ukurlah jejari zon tanpa pertumbuhan bakteria (zon rencatan, bermula daripada titik pusat disk). 5. Buat perbandingan antara zon tanpa pertumbuhan yang dihasilkan terhadap strain ujian dengan zon yang dihasilkan terhadap strain kawalan untuk menentukan keresistanan bakteria kepada sesuatu antibiotik. NOTA 1. Agar Mueller-Hinton merupakan media yang paling sesuai untuk ujian sensitiviti resapan disk. Bagi bakteria yang sukar tumbuh pada media ini bolehlah dicampurkan darah 5% sebagai nutrien tambahan. 2. Disk antibiotik harus diletakkan sejurus selepas inokulasi dilakukan. Kelewatan meletakkan disk menyebabkan bakteria tumbuh sebelum antibiotik dapat meresap ke dalam media dan bertindak ke atas bakteria. Ini menghasilkan pembacaan yang kurang tepat. 3. Gunakan isipadu agar yang sama setiap kali supaya ketebalan agar dalam piring Petri

sentiasa sama. Dalam keadaan ini, kepekatan antibiotik yang meresap ke dalam media agar juga akan sentiasa sama. 4. Jangan gunakan disk antibiotik yang telah tamat tempoh penggunaannya atau melebihi tarikh pelupusannya. 5. Kultur plat harus dieramkan sejurus selepas disk diletakkan. Jika ini tidak dipatuhi, besar kemungkinan zon rencatan pertumbuhan yang lebih besar akan dihasilkan kerana resapan antibiotik terlebih dahulu berlaku sebelum pertumbuhan bakteria bermula. 6. Zon rencatan yang berbentuk bujur boleh disebabkan oleh disk yang tergeser di atas permukaan media atau disk diletakkan terlalu rapat dengan pinggir piring. Dalam keadaan ini, ukuran garis pusat atau jejari yang terkecil yang diambil kira. 7. Pastikan pertumbuhan bakteria yang diuji dan kawalan hampir sama secara kuantitatif untuk memberikan perbandingan yang tepat di antara kedua-duanya. 8. Stafilokokus yang menghasilkan zon rencatan yang jelas, tetapi memperlihatkan juga pertumbuhan bakteria yang berbonjol di sekitar pinggir zon harus dilaporkan sebagai resistan. Fenomena ini mungkin ditemui di kalangan stafilokokus penghasil enzim betalaktamase yang diuji dengan disk antibiotik yang mengandungi penisilin dan terbitannya. 6.2. UJIAN PENCAIRAN TABUNG Pendekatan yang lebih kuantitatif untuk menguji sensitiviti bakteria terhadap sesuatu antibiotik adalah tatacara pencairan tabung. Ia memakan masa lebih lama, oleh itu tidak disyorkan sebagai tatacara rutin. Dalam prosedur ini, antibiotik disediakan dalam pencairan dua kali ganda di dalam suatu siri tabung media pertumbuhan. Kemudian setiap tiub diinokulasi dengan organisma

berkenaan dan kepekatan perencatan minimum (minimum inhibitory concentration: MIC ) ditentukan. Ini dilakukan dengan mengamati tiub berkepekatan antibiotik terendah atau paling minimum dalam siri pencairan yang menghalang pertumbuhan bakteria (tiub yang jernih tepat disebelah tiub yang mula menunjukkan kekeruhan). Sama ada antibiotik berkenaan bersifat bakterisiadal (membunuh bakteria) atau bakteriostatik (merencat pertumbuhan bakteria) dapat dipastikan dengan melakukan pensubkulturan daripada tiub yang tidak menunjukkan pertumbuhan tersebut ke atas media agar tanpa antibiotik. Kepekatan terendah untuk antibiotik yang menunjukkan hasil tiada pertumbuhan bakteria pada subkultur dianggap sebagai kepekatan antibiotik terendah yang berupaya membunuh bakteria tersebut minimum (minimum bactericidal concentration: MBC). 95 Tatacara Ujian MIC (Kepekatan Perencatan Minimum) BAHAN 1. Kultur broth bakteria yang diuji 2. Kultur broth bakteria kawalan 3. Tabung-tabung uji (steril) 4. Pipet bersukat 5. Antibiotik 6. Inkubator bersuhu 37C TATACARA kepekatan bakterisidal

1. Sediakan 2 siri tabung yang mengandungi siri pencairan 2 kali ganda antibiotik yang diuji di dalam broth dengan kepekatan tertinggi antibiotik 200 g atau 200 unit setiap ml (tabung bersaiz 13 mm x 100 mm, isipadu larutan 0.5 ml). 2. Lakukan pencairan kultur broth semalaman bakteria yang diuji dan bakteria kawalan sebanyak 1:1000 di dalam broth baru untuk memperoleh ~ 10 5 bakteria hidup setiap ml. 3. Masukkan 0.5 ml ke dalam setiap tabung, termasuk satu tabung yang mengandungi broth tanpa antibiotik (tabung kawalan positif). Pastikan terdapat juga 1 tabung yang mengandungi antibiotik dengan broth yang tidak mengandungi bakteria (tabung kawalan negatif). 4. Eramkan pada 37C semalaman. 5. Goncang dan amatilah setiap tabung daripada kedua-dua siri tabung ini untuk menentukan pertumbuhan bakteria (positif - keruh; negatif - jernih). NOTA 1. Pastikan tabung yang steril digunakan dan pencairan dibuat secara teknik aseptik. 2. Kultur tabung harus dieramkan sejurus selepas bakteria dicampurkan. 3. Untuk memastikan sama ada berlaku pertumbuhan atau tidak, cara yang mudahnya adalah dengan merujuk kepada tabung kawalan positif yang mengandungi bakteria tanpa antibiotik (keruh), dan tabung kawalan negatif yang mengandungi antibiotik sahaja (jernih). 4. Bakteria kawalan adalah bakteria yang sensitif terhadap antibiotik yang digunakan dalam

ujian ini dan mesti beri hasil yang positif sebelum hasil bakteria yang diuji boleh diterima. Tatacara Ujian MBC (Kepekatan Bakterisidal Minimum) BAHAN 1. Siri tabung ujian MIC 2. Plat-plat agar 3. Pipet Pasteur TATACARA 1. Gunakan pena penanda untuk membahagikan permukaan dasar setiap plat media kepada 2 bahagian sama besar untuk mendapatkan 2 separuh plat bagi setiap plat media. 2. Tuliskan nombor siri tabung (atau kepekatan antibiotik) pada setiap separuh plat. 3. Pastikan permukaan agar betul-betul kering. 4. Dengan menggunakan pipet yang sama, titiskan (secara terpisah) 3 titis kandungan setiap tabung yang didapati jernih sahaja dalam siri tabung ujian MIC ke atas separuh plat. Mulakan penitisan dari separuh tabung dengan kepekatan antibiotik yang tertinggi hinggalah kepada tabung dengan kepekatan yang paling rendah. 5. Biarkan titisan larutan mengering sebelum mengeramkan plat pada 37C semalaman. 96 6. Amati pertumbuhan koloni di atas plat bagi setiap pencairan. 7. Tentu dan pastikan pencairan yang terendah di mana tidak terdapat pertumbuhan bakteria lagi. Ini merupakan kepekatan bakterisidal minimum. 97

7. UJIAN SEROLOGI DALAM MIKROBIOLOGI Suatu aspek yang penting dalam bidang mikrobiologi adalah pengesanan jenis mikrob yang merupakan agen etiologi sesuatu penyakit. Dalam hal ini, pengesanan identiti sesejenis mikrob adalah sukar kerana ia mempunyai saiz yang amat kecil dan tidak dapat dilihat dengan mata kasar. Sungguhpun mikroskop boleh digunakan, kebanyakan mikrob seperti bakteria memiliki morfologi kasar yang sama, maka adalah sukar untuk menentukan identiti kebanyakan mikrob berdasarkan pengamatan secara langsung. Oleh kerana mikrob merupakan antigen yang baik, mikrob berkemampuan menghasilkan antibodi yang bertindak secara spesifik dengannya. Oleh yang demikian, tindakan sesuatu mikrob dengan antibodi yang spesifik terhadapnya adalah suatu pendekatan yang digunakan dalam pengenalan identiti sesuatu mikrob. Tindakan antigen mikrob dengan antibodi dapat dikenal pasti dengan beberapa cara seperti mewujudkan presipitasi atau aglutinasi. Percantuman antibodi dengan enzim membolehkan antibodi yang melekat kepada antigen dikesan apabila tindakan enzim menukar warna substratnya. Jika percantuman adalah dengan fluorokrom, pancaran cahaya berwarna tertentu seperti warna hijau-kuning oleh fluorokrom FITC adalah tanda kehadiran kompleks antigenantibodi. Di bidang mikrobiologi, terdapat banyak ujian serologi dan banyak variasi sesuatu ujian. Ada juga

ujian yang merupakan ujian rekaan makmal sendiri (in-house) di samping ujian komersial. Dalam bahagian ini hanya tiga ujian mikrobiologi, iaitu ELISA , aglutinasi lateks dan imunopendafluor, diterangkan kerana ketiga-tiga ujian berkenaan mempunyai aplikasi dalam bidang bakteriologi, mikologi dan virologi. ELISA komersial, maka kit daripada pengeluar yang berbeza mempunyai tatacara tersendiri. Oleh yang demikian, rasanya tidaklah sesuai untuk dibahaskan tentang tatacara masing-masing. Walau bagaimanapun, aspek umum kedua-dua ujian berkenaan akan dibentangkan. 7 . 1 ELISA Asai imunosorben bergabung enzim (enzyme-linked immunosorbent assay) atau lebih terkenal dengan singkatan ELISA adalah sejenis imunoasai yang antigen atau antibodi larut dilekatkan kepada suatu permukaan pepejal seperti permukaan manik atau telaga tanpa menghilangkan reaktiviti komponen imunologiknya. Asai ini merupakan imunoasai heterogenus kerana ia mempunyai suatu peringkat di mana komponen yang dilabelkan (gabungkan) enzim yang telah bertindak dengan ligannya dipisahkan daripada komponen yang sama yang tidak bertindak. Pemisahan ini dilakukan melalui pencucian. ELISA terdiri daripada beberapa jenis asai: tatacara persaingan, tatacara dwilapisan antibodi, tatacara dwilapisan antibodi yang diubahsuai, tatacara perencatan, fasa pepejal anti-IgM dan dan aglutinasi lateks biasanya dilakukan dengan reagen

tatacara secara tidak langsung (asai untuk pengesanan antibodi). ELISA boleh merupakan asai kuantitatif atau kualitatif, sungguhpun kebanyakan ELISA untuk kegunaan dalam mikrobiologi adalah termasuk dalam golongan kedua ini. NOTA 1. Ikuti arahan dengan tepat mengenai tatacara yang dinyatakan oleh pengeluar ujian. 2. Jangan gunakan reagen selepas tarikh pelupusan bagi mengelakkan kemungkinan hasil negatif palsu. 3. Rancangkan kekerapan ujian yang akan dijalankan untuk mengoptimumkan penggunaan sesuatu kit kerana reagen dan fasa pepejal (telaga, manik) yang disaluti antigen atau antibodi juga digunakan kerana sampel kawalan positif dan negatif turut diasaikan dengan sampel ujian setiap kali ujian dijalankan. 98 4. Reagen komersial biasanya mempunyai sensitiviti yang amat tinggi dan ini boleh menimbulkan hasil positif palsu jika pencucian antara peringkat pengeraman dengan reagen tidak dilakukan dengan sempurna, sama ada daripada segi masa cucian mahupun bilangan cucian yang dilakukan. 5. Jangan tunggu terlalu lama selepas hasil asai dibaca, khususnya, jika ia dilakukan dengan menggunakan alat pembaca ELISA . Dalam sesetengah sistem enzim-indikator, penyimpanan lama, umpamanya semalaman sungguhpun pada suhu peti beku, akan menukar warna hasil ujian daripada apa yang didapati sejurus selepas asai tamat, sungguhpun tindak balas enzim ke atas substratnya telah dihentikan dengan bahan kimia yang sesuai.

6. Jangan lakukan ujian dengan menggunakan reagen daripada beberapa kit yang mempunyai nombor pengeluaran yang berbeza. 7. Pastikan sisa asai seperti cucian dimasukkan di dalam bekas disinfektan yang sesuai untuk mengelakkan berlakunya infeksi ke atas pengguna makmal. Ujian Aglutinasi Lateks Slaid Antibodi atau antigen boleh digabungkan dengan partikel polistirin (digelarkan lateks kerana warna putihnya menyerupai lateks tumbuhan) bagi mengesan antigen atau antibodi masingmasing. Pergabungan antigen dengan antibodi akan menyebabkan kelompok-kelompok besar partikel lateks yang dapat diamati dengan mata kasar. Ujian ini adalah cepat serta mudah dilakukan dan tidak memerlukan alat radas yang mahal atau canggih. Tambahan pula, ujian ini tidak membazirkan reagen jika dilakukan ke atas sebilangan sampel yang kecil. Sungguhpun ujian aglutinasi lateks slaid mudah dilakukan, beberapa peraturan harus dipatuhi supaya hasil yang didapati boleh diyakini. Di pasaran, terdapat berbagai-bagai jenama ujian aglutinasi lateks untuk pengesanan berbagaibagai antigen/antibodi. Tidak semuanya boleh dianggap memuaskan dari segi spesifisiti dan sensitiviti. Para pengguna harus mempastikan sesuatu ujian itu bermutu tinggi dan sesuai untuk tujuan mereka. NOTA

1. Ikut arahan dengan tepat mengenai tatacara yang dinyatakan oleh pengeluar ujian. 2. Biarkan reagen mencapai suhu bilik sebelum ujian dilakukan kerana penggunaan kit sejurus selepas dikeluarkan dari peti beku mungkin memberikan hasil yang kurang memuaskan, atau pun hasil negatif palsu. 3. Goncang botol-botol reagen supaya memperolehi suspensi reagen lateks yang sama rata sebelum reagen lateks digunakan. 4. Titisan reagen lateks yang dititiskan daripada botol reagen adalah berbeza-beza. Titisan dengan isipadu yang sama boleh dicapai dengan menggunakan mikropipet. 5. Baca hasil ujian pada masa yang ditetapkan selepas ujian dimulakan. Oleh kerana ujian direka dengan sensitiviti yang tinggi, ada kemungkinan hasil negatif palsu didapati jika sampel diuji lebih daripada masa yang ditetapkan. 6. Jangan gunakan reagen selepas tarikh pelupusan supaya mengelakkan kemungkinan hasil positif palsu. 7. Jangan lakukan ujian dengan menggunakan reagen daripada beberapa kit yang mempunyai nombor pengeluaran yang berbeza. 8. Titisan besar reagen daripada botol reagen mungkin menggalakkan para pengguna berusaha untuk mengurangkan isipadu reagen bagi mengurangkan kos. Amalan ini seharusnya jangan dilakukan kerana mengurangkan isipadu reagen boleh menimbulkan hasil negatif palsu. 9. Pastikan sisa daripada asai seperti cucian dimasukkan di dalam bekas disinfektan yang sesuai untuk mengelakkan berlakunya infeksi ke atas pengguna makmal. 99

Ujian Imunopendafluor Tidak Langsung Kehadiran sejenis antigen (misalnya, komponen mikrob) dapat dikenal pasti secara tidak langsung melalui pengamatan mikroskop apabila antigen berkenaan digabung secara spesifik dengan antibodi yang secara langsung tercantum fluorokrom ( ujian langsung ). Dalam pendekatan lain, gabungan secara spesifik antibodi dengan sesuatu antigen dikenal pasti melalui gabungan antibodi berkenaan dengan antibodi terhadapnya yang tercantum fluorkrom ( ujian tak langsung ). Fluorokrom adalah sebatian semula jadi atau sintetik yang boleh menyerap cahaya gelombang tertentu dan sejurus selepas itu mengeluarkan tenaga sebagai cahaya dengan gelombang yang lebih panjang. Dalam lain perkataan, cahaya suatu warna diserap dan cahaya warna lain dikeluarkan oleh fluorokrom. Jenis warna (gelombang cahaya) yang dikeluarkan adalah khas untuk sejenis fluorokrom. Sungguhpun terdapat berbagai jenis fluorokrom seperti rodamin dan Texas Red, fluoresein adalah fluorokrom yang paling umum digunakan kerana ia mempunyai beberapa kelebihan: 1. Nisbah amaun tenaga yang dikeluarkan kepada tenaga yang diserap adalah amat tinggi (~85%) maka ia memberi sensitiviti yang baik. 2. Pancaran cahayanya pada gelombang 520 m adalah di kawasan sensitiviti pengamatan yang paling baik maka ia memberi sensitiviti yang baik. 3. Autopendafluor berwarna hijau-kuning jarang berlaku, maka ia meningkatkan spesifisiti.

4. Fluoresein digunakan dalam bentuk fluorescein isothiocyanate ( FITC) kerana kehadiran kumpulan sianat yang mempunyai afiniti untuk protein membolehkan antibodi dicantum dengannya. Tatacara Ujian Imunopendafluor Tidak Langsung BAHAN 1. Slaid mikroskop atau slaid khas untuk ujian imunopendafluor 2. Piring Petri 3. Kertas turas 4. Kayu aplikator 5. Varnis kuku 6. Antiserum 7. Konjugat antibodi terhadap antiserum dan FITC (konjugat) 8. Larutan salin yang ditampankan fosfat ( PBS ) 9. Metanol 10. Air suling 11. Larutan PBS 90% dan gliserol 10% 12. Inkubator bersuhu 37C 13. Mikroskop imunopendafluor TATACARA Penyediaan spesimen sel yang diuji ke atas slaid mikroskop 1. Titiskan suspensi sampel (sel diinfeksi mikrob dan ditanggalkan dari permukaan bekas

kultur, atau sel dari spesimen klinikal) ke atas sekeping slaid mikroskop atau di dalam telaga cetak slaid mikroskop khas untuk ujian imunopendafluor. 2. Sebarkan sehingga meliputi kawasan bulat seluas 1 cm garis pusat slaid mikroskop atau memenuhi seluruh telaga. 3. Biarkan kering. Fiksasi spesimen (spesimen yang dititiskan kepada slaid mikroskop atau sel yang ditumbuhkan di atas slaid penutup dan diinfeksi dengan virus) 100 4. Celup di dalam metanol pada suhu 4C selama 2 minit. 5. Keluarkan dan biarkan kering. 6. Kelilingi spesimen dengan 1 bulatan varnis kuku. Tindak balas dengan reagen antibodi 7. Alas satu piring Petri dengan sekeping kertas turas dan basahkan dengan air. 8. Patahkan sebatang kayu aplikator di bahagian tengahnya dan letakkan dalam bentuk V di atas kertas turas di dalam piring Petri (Ini merupakan bekas lembap). 9. Letakkan slaid di atas kayu aplikator supaya slaid berada lebih tinggi daripada aras kertas turas. 10. Letakkan spesimen yang berada pada penutup slaid di atas slaid yang diletakkan di atas kayu aplikator. 11. Titiskan persediaan antiserum (sumber antibodi terhadap virus) ke atas spesimen dan

sebarkan supaya meliputi seluruh spesimen. 12. Tutup piring Petri dan eramkan dalam alat inkubator bersuhu 37C selama 30-60 minit. 13. Bilas spesimen ke atas slaid (atau penutup slaid) dengan PBS . 14. Rendam dalam PBS selama 3 minit di dalam piring Petri (cuci). 15. Cuci semula 2 kali. 16. Masukkan di dalam bekas lembap. 17. Titiskan persediaan konjugat ke atas spesimen dan sebarkan supaya meliputi ke seluruh spesimen. 18. Tutup piring Petri dan eramkan di dalam inkubator bersuhu 37C selama 30-60 minit. 19. Bilas spesimen yang ada di atas slaid (atau penutup slaid) dengan PBS . 20. Cuci 3 kali dengan PBS . 21. Bilas dengan air suling. 22. Biarkan kering di dalam tempat gelap seperti laci yang tertutup. 23. Spesimen di atas penutup slaid dilekapkan di atas setitis kecil larutan PBS gliserol, penutup slaid berkenaan ditekan. 24. Amati dengan mikroskop pendafluor. NOTA 1. Fiksasi spesimen yang terlalu lama mungkin menimbulkan pendafluor yang tak spesifik. 2. Pencucian yang dilakukan selepas pengeraman boleh dipendekkan serta lebih berkesan jika PBS dalam bekas yang mengandungi slaid spesimen dikacau dengan alat magnet yang berputar.

3. Reagen konjugat antibodi-fluorokrom biasanya diperolehi daripada sumber komersial. Oleh yang demikian, pastikan ia berfungsi dengan baik sebelum amaun yang lebih besar dibeli. 4. Reagen konjugat, dan lebih-lebih lagi antiserum, biasanya digunakan dalam pencairan yang amat tinggi. Oleh yang demikian, amaun yang kecil digunakan setiap kali. Untuk mengelakkan kehilangan aktiviti biologinya akibat reagen selalu dicairkan dan dibeku, reagen berkenaan boleh disimpan pada suhu 20C tanpa dibeku jika ia dicampurkan dengan isipadu sama gliserol. 5. Sinaran pendafluor latar belakang boleh ditindaskan dengan spesimen dieramkan dengan metilin biru selepas tindakan dengan konjugat antibodi-fluorokrom. 6. Biarkan lampu raksa mikroskop bernyala kira-kira 15 minit bagi menstabilkan pancaran cahayanya sebelum spesimen diamati. 7. Pastikan mikroskop imunopendafluor dinyalakan sekurang-kurangnya 20 minit sebelum ia dipadamkan supaya jangka hayat lampu raksa dapat dikekalkan lama. 8. Spesimen harus dibaca (diamati dengan mikroskop pendafluor) secepat mungkin kerana intensiti cahaya pendafluor akan berkurang. Penyimpanan spesimen di dalam tempat yang gelap akan melambatkan proses ini. Jika reagen bermutu tinggi dan ujian dilakukan dengan sempurna, spesimen masih boleh dibaca selepas disimpan semalaman. 101 Apusan bakteria-membuat, 20-21 Asepsis-pemindahan benda dari botol yang tertutup, 13 Balang anaerobik-penggunaan, 52

Balang lilin-mewujudkan atmosfera karbon dioksida, 53 Bantuan pemula-rawatan, 10 Disinfektan-penggunaan, 10 Fiksasi bakteria dengan haba-membuat, 22 GasPak-mewujudkan keadaan anaerobik, 52 Inokulasi plat agar dengan kultur yis, 47-49 Inokulasi plat agar dengan 1 jenis bakteria untuk ujian sensitiviti antibiotik, 91 Inokulasi plat agar dengan 2 jenis bakteria untuk ujian sensitiviti antibiotik, 92 Inkubator CO 2 - penggunaan, 53-54 Kultur sel-inokulasi dengan virus, 67 Kultur sel-kriopengawetan kultur sel yang hidup, 64-65 Kultur sel-penghitungan dengan menggunakan hemosi-ometer, 64 Kultur sel-pengkulturan semula sel yang dikrioawetkan, 66 Kultur sel-persediaan media, 60-61 Kultur sel-tripsinisasi seluruh tisu, 61-62 Kultur sel-tripsinisasi sel selapisan dan pengermaan

kultur sel, 62-63 Kultur slaid fungus-membuat, 55-56 Kultur yis-merangsang penghasilan tiub germa, 56-57 Media agar-menyediakan di dalam plat Petri, 46 Media agar-menyediakan sebagai cerun, 47 Media bakteria-jenis, 44-45 Mikroskop elektron-menyaluti grid dengan Formvar, 38-39 Mikroskop elektron-pengamatan spesimen bakteria, 23 Mikroskop elektron-pengamatan spesimen virus, 41 Mikroskop elektron-pewarnaan negatif, 39-40 Mikroskop elektron-tatacara imun, 40 Mikroskop cahaya-mengelakkan pertumbuhan fungus, 16 Mikroskop cahaya-pembersihan kanta, 16 Mikroskop cahaya-penggunaan, 14-15 Pensterilan gelung dawai dengan api, 11 Pensterilan menggunakan alkohol yang membakar, 12-13 Pewarnaan Albert (pewarnaan granul metakromatik), 26

Pewarnaan asid periodik-Schiff, 34 Pewarnaan Gram untuk bakteria, 23 Pewarnaan Gram untuk fungus, 33 Pewarnaan kapsul (rujuk kepada pewarnaan negatif dengan dakwat India), 27 Pewarnaan Kinyoun (terubahsuai) untuk fungus, 33 Pewarnaan metenamina-argentum Gomori, 34-35 INDEKS Pewarnaan negatif dengan dakwat India, 36 Pewarnaan Schaeffer-Fulton, 26-27 Pewarnaan spora (rujuk kepada pewarnaan Schaeffer Fulton), 27 Pewarnaan tahan asid (rujuk kepada pewarnaan Ziehl-Neelsen), 25 Pewarnaan Ziehl-Neelsen, 25 Pelekapan basah bakteria, 17 Pelekapan basah KOH untuk fungus, 31 Pelekapan basah lactophenol coton blue untuk fungus, 32 Pelekapan basah salin untuk fungus, 30 Pelekapan titisan tergantung untuk bakteria, 17-19 Plat garisan-teknik, 47-49

Prosedur umum makmal mikrobiologi, 9 Slaid mikroskop-membersihkan dan simpanan, 20 Telur-melakukan penyuluhan, 68 Telur-membuat inokulasi membran korioalantoik, 70 Telur-membuat inokulasi ruang amniotik, 69 Telur-membuat inokulasi ruang alantoik, 69 Telur-mengumpulkan cecair alantoik, 70-71 Telur-mengumpulkan cecair amniotik, 71 Telur-mengambil membran korioalantoik, 71-72 Ujian aglutinasi lateks slaid, 98 Ujian ELISA , 97-98 Ujian Elek, 89 Ujian Fermentasi gula dan penghasilan gas, 73-74 Ujian Indol, 76-77 Ujian Imunopendafluor, 99-100 Ujian Katalase, 86-87 Ujian keperluan faktor pertumbuhan X dan V, 80-81 Ujian Koagulase, 84-86 Ujian Oksidase, 83-84 Ujian Metil-merah, 77-78 Ujian MIC (Kepekatan Perencatan Minimum) tabung,

95 Ujian MBC (Kepekatan Bakterisidal Minimum), 95 Ujian Motiliti bakteria di dalam agar separuh pepejal, 90 Ujian Resapan disk: Tatacara perbandingan, 92-93 Ujian Resapan disk: Tatacara Stokes, 93-94 Ujian Sensitiviti: Bacitracin, 79 Ujian Sensitiviti: Optochin, 79 Ujian Tiga gula besi, 74-76 Ujian Urease, 82-83 Ujian Voges-Proskauer, 78