PENENTUAN KADAR TIROSIN DALAM SAMPEL UNKNOWN DENGAN METODE LOWRY

Oleh : I PUTU RAIWATA MERTANJAYA (NIM: 0813031019)

JURUSAN PENDIDIKAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PENDIDIKAN GANESHA SINGARAJA 2011

PENENTUAN KADAR TIROSIN DALAM SAMPEL UNKNOWN DENGAN METODE LOWRY Oleh: I Putu Raiwata Mertanjaya Jurusan Pendidikan Kimia, Undiksha

ABSTRAK Penentuan konsentrasi protein dalam sampel dapat dilakukan dengan beberapa metode yang salah satunya adalah metode Lowry. Metode Lowry ini menggunakan reagen Folin-Ciocalteu yang dapat mendeteksi residu tirosin karena gugus fenolik dalam tirosin dapat mereduksi reagen fosfotungstat dan fosfomolibat menjadi tungstat dan molibdenum yang berwarna biru. Sensitivitas dari reagen Folin-Ciocalteu ini mengalami perubahan yang cukup signifikan apabila ditambahkan dengan ion-ion Cu2+ (metode Biuret). Kompleks Cuprotein yang dihasilkan oleh reagen Biuret, akan menyebabkan reduksi pula pada fosfotungstat dan fosfomolibat dalam reagen Folin Ciocalteu. Pengukuran terhadap beberapa larutan tirosin standar yang memiliki rentangan konsentrasi tertentu dilakukan untuk membuat kurva kalibrasi sehingga dengan membandingkan besarnya absorbansi dari sampel unknown, maka diperoleh konsentrasi tirosin dalam sampel yaitu 3,2072 ppm. Kata-kata kunci : metode Lowry, reagen Folin-Ciocalteu.

ABSTRACT Determination of protein concentration in the sample can be done by several methods, one of which is the method of Lowry. This Lowry method using Folin-Ciocalteu reagent that can detect tyrosine residues because the phenolic group in tyrosine to reduce reagent fosfomolibate and fosfotungstate become blue colored tungstate and molybdenum. Sensitivity of the Folin-Ciocalteu reagent is have significant changes when added to the ions Cu2+ (Biuret method). Cu-protein complex produced by the Biuret reagent also will cause reductions in fosfotungstat and fosfomolibat the Folin Ciocalteu reagent. Measurements of some standard tyrosine solution that has a certain concentration range is made to make the calibration curve so that by comparing the absorbance of unknown samples, the concentration of tyrosine in the sample obtained is 3.2072 ppm. Key words: Lowry method, Folin-Ciocalteu reagent.

PENDAHULUAN Penentuan konsentrasi protein merupakan suatu proses yang rutin dilakukan dalam analisis biokimia. Ada beberapa metode yang digunakan dalam rangka menentukan konsentrasi protein, yaitu metode Biuret, metode Lowry, dan lain sebagainya. Pilihan metode yang baik dan tepat untuk suatu pengukuran tergantung pada beberapa faktor yaitu benyaknya material atau sampel yang tersedia, waktu yang dibutuhkan untuk melakukan pengukuran, serta alat spektrofotometer yang tersedia (spektrofotometer Vis atau UV) (Tika, 2007). Spektroskopi merupakan salah satu metode analisis instrumental yang didasarkan pada interaksi energi (radiasi elektromagentik/cahaya) dan materi (atom/molekul). Struktur elektronik suatu spesi atau suatu molekul sangat menentukan serapan cahaya oleh spesi atau molekul tersebut. Warna senyawa-senyawa kompleks tergantung pada logam yang terlibat dan jumlah orbital d yang dimilikinya, yang berhubungan dengan keadaan oksidasinya. Walaupun demikian, ada beberapa senyawa dari golongan utama dan golongan transisi tidak memiliki orbital d tetapi senyawa tersebut berwarna. Warna tersebut disebabkan oleh transisitransisi elektronik yang melibatkan elektron-elektron valensi yang lain. Spektrofotometri mempunyai aplikasi yang sangat luas pada analisis secara kuantitatif. Hasil pengukuran secara kuantitatif menggunakan metode ini mempunyai akurasi yang tinggi, walaupun tidak seakurat serapan atom atau sinar gamma. Dalam mempelajari sifat kuantitatif dari absorpsi radiasi, berkas radiasi dikenakan pada sampel dan kemudian intensitas radiasi diteruskan dan selanjutnya transmisinya diukur. Kebanyakan pekerjaan analisa menyangkut larutan, dimana zat yang akan dianalisa dilarutkan langsung dalam pelarutnya atau sebelumnya mengalami perlakuan kimia sehingga mampu mangabsorpsi radiasi. Radiasi yang diabsorpsi oleh sampel dapat ditentukan dengan membandingkan intensitas berkas radiasi yang diteruskan. Langkah-langkah umum dalam spektrofotoetri, terutama pada daerah cahaya tampak adalah(1) pembentukan molekul yang dapat menyerap cahaya pada daerah UV atau tampak. Apabila senyawa tersebut sudah menyerap pada daerah kerja dengan intensitas yang cukup, maka langkah ini tidak diperlukan. (2) pembuatan larutan standar dan pemilihan panjang gelombang. (3) pengukuran absorbansi cuplikan. (4) pembuatan kurva kalibrasi. Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV atau tampak harus dilakukan bila senyawa awal (yang dianalisis) tidak menyerap ada daerah tersebut. Oleh karena itu, senyawa tersebut harus diubah menjadi senyawa lain yang menyerap didaerah UV atau
3

diubah menjadi senyawa berwarna. Pembentukan senyawa dengan rantai konyugasi yang lebih panjang dan pembentukan senyawa kompleks sering dilakukan untuk tujuan ini. Hubungan antara kadar zat penyerap dengan dasarnya absorpsi radiasi dirumuskan oleh Lambert-Beer (1989). Hukum Lambert-Beer menjabarkan pengurangan eksponensial dari intensitas radiasi yang diteruskan karena peningkatan aritmatik dari kadar zat penyerap, sehingga diperoleh persamaan:
log Io 1 A log T log( ) I T

Io/I disebut optical density (OD) atau absorbansi (A), sedangkan I/I o disebut transmitan (T), yaitu proporsi radiasi yang diteruskan. Bila T dikalikan dengan 100% disebut persen transmitansi (%T). Dengan menggunakan notasi-notasi yang merupakan

penggabungan Hukum Beer dengan Hukum Bouguer, maka Hukum Beer dapat dituliskan sebagai berikut A=bC Dimana merupakan absorptivitas molar yang nilainya tergantung pada panjang gelombang dan jenis zat, b merupakan tebal medium penyerap yang biasanya dinyatakan dalam centimeter, C merupakan konsentrasi molar (Muderawan, 2007). Pada saat menentukan konsentrasi protein dalam sampel, harus dilakukan pula pengukuran terhadap beberapa larutan protein standar yang memiliki rentangan konsentrasi tertentu dimana konsentrasi sampel protein berada dalam rentangan tersebut. Protein dimasukkan pertama kali kedalam tabung reaksi, lalu ditambahkan aquades. Seluruh tabung harus mempunyai volume akhir yang sama. Reagen pembentuk kompleks selalu ditambahkan terakhir dan biasanya diperlukan selang waktu tertentu terjadinya reaksi yang sempurna. Larutan standar protein dan sampel diukur dengan spektrofotometri. Hasil pengukuran dibuat dalam kurva kalibrasi standar yang diperoleh dengan mengukur absorbansi sederetan larutan standar. Dengan bantuan kurva kalibrasi, konsentrasi larutan sampel dapat ditentukan dengan mudah atau dihitung dengan persamaam regresi. Berdasarkan kurva kalibrasi, dapat diperoleh persamaan sebagai berikut: y = ax b Dimana: y = absorbansi sampel a = tan
4

x =konsentrasi sampel b=titik potong terhadap sumbu y (intersep)

Dalam penentuan konsentrasi, reagen pendeteksi gugus-gugus fenolik, seperti reagen Folin-Ciocalteu telah digunakan dalam penentuan konsentrasi protein oleh Lowry (1951) yang kemudian dikenal dengan metode Lowry. Dalam bentuk yang paling sederhana reagen Folin-Ciocalteu dapat mendeteksi residu tirosin (dalam protein) karena gugus fenolik dalam tirosin dapat mereduksi reagen fosfotungstat dan fosfomolibdat menjadi tungstat dan molibdenum yang berwarna biru. Struktur tirosin ditunjukkan sebagai berikut:

O HO CH2CH C NH2 O H

Gambar 1 .Struktur asam amino tirosin Reagen fosfotungstat dan fosfomolibat merupakan konstituen utama reagen FolinCiocateu yang direduksi menghasilkan tungstat dan molibdenum yang menunjukkan puncak absorpsi yang lebar pada daerah merah dan spektrum sinar tanpak (600-800 nm). Sensitivitas dari reagen Folin-Ciocalteu ini mengalami perubahan yang cukup signifikan apabila ditambahkan dengan ion-ion Cu2+ (metode Biuret). Kompleks Cu-protein yang dihasilkan oleh reagen Biuret, akan menyebabkan reduksi pula pada fosfotungstat dan fosfomolibat dalam reagen Folin Ciocalteu. Kira-kira 75% dari reduksi terjadi diakibatkan oleh kompoleks Cu-protein tersebut, dan 25% direduksi oleh residu-residu tirosin dan triptopan. Reagen Folin Ciocalteu merupakan suatu komposisi kompleks yang diperoleh dengan pemanasan refluks dari Na-tungstat dan Na-molibat dengan asam ortofosfat. Selain itu, disertakan pula komponen-komponen lain untuk meningkatkan kestabilan reagen dalam kondisi normal berwarna kuning pucat.

TUJUAN DAN MANFAAT Tujuan Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mengetahui kadar tirosin darin suatu sampel berdasarkan metode Lowry. Manfaat Manfaat percobaan ini bagi praktikan adalah mengetahui cara menentukan kadar tirosin dalam sampel dengan metode Lowry.

METODE Waktu dan Tempat Percobaan ini dilakukan pada hari Rabu, tanggal 6 April 2011 dari pukul 08.00-12.30 WITA, bertempat di Laboratorium Kimia Organik, Jurusan Pendidikan Kimia, Universitas Pendidikan Ganesha, Singaraja. Alat dan Bahan Alat dan bahan yang digunakan dalam penentuan kadar tirosin dengan metode Lowry ini dapat dilihat pada tabel berikut. Tabel 1. Alat dan Bahan Nama Alat Tabung reaksi Spektrofotometer UV-Vis Batang pengaduk Gelas kimia 100 mL Gelas ukur 5 ml Gelas ukur 50 mL Pipet volumetri 5 mL Pipet tetes Prosedur Kerja Larutan standar tirosin 10 ppm diambil sebanyak 0,2 mL-1,0 mL dan dimasukan ke dalam tabung reaksi 2-6. Sementara itu, pada tabung reaksi 1 tidak dimasukan standar tirosin. Pada tabung 7, larutan sampel unknown diambil sebanyak 0,5 mL dan dimasukkan ke dalam tabung. Ke dalam semua tabung ditambahkan aquades sampai volume 1 mL. Setelah itu, ditambahkan reagen Biuret ke dalam masing-masing tabung sebanyak 5 mL. Dilakukan inkubasi selama 10 menit. Setelah itu, dilakukan penambahan reagen Folin-Ciocalteu sebanyak 0,5 mL ke dalam masing-masing tabung. Stelah diinkubasi selama 30 menit, larutan masing-masing campuran diuji serapan sinar tampaknya dengan spektrofotometer UV-Vis. Tabel 2. Komposisi setiap tabung pada penentuan kadar tirosin dengan metode Lowry Nomor Tabung 1 2 3 4 5 Standar Tirosin 10 ppm (mL) 0,2 0,4 0,6 0,8 Sampel Tirosin (mL) Aquades (mL) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 Reagen Biuret (mL) 5 5 5 5 5 Inkubasi selama 10 menit Reagen Folin-Ciocalteu (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Inkubasi selama 30 menit Penambahan (mL) 6 1,0 5 0,5 7 0,5 0,5 5 0,5
6

Jumlah 1 rak 1 set 1 buah 2 buah 1 buah 1 buah 1 buah 3 buah

Nama Bahan Kristal Na2CO3 Larutan NaOH 0,1 N Kristal CuSO4.5H2O Krostal Na-tartarat Reagen Folin Ciocalteu Tirosin Aquades

Jumlah 2 gram 100 mL 1 gram 2 gram 50 mL 2 gram 500 mL

dan Pembacaan serapan dengan UV-Vis pada panjang gelombang 700 nm A700 nm 0,000 0,031 0,052 0,075 0,102 0,132 0,021 HASIL DAN PEMBAHASAN Dalam percobaan ini dilakukan analisis kadar tirosin dalam sampel dengan menggunakan metode Lowry. Prinsip metode Lowry adalah untuk menentukan konsentrasi protein yang didalamnya terdapat asam amino yang mengandung gugus fenolik seperti tirosin dan triptopan. Pada metode ini digunakan spektrofotometer UV-Vis untuk menganalisis absorbansi larutan standar dan sampel. Larutan yang dianalisis harus menunjukkan warna tertentu sehingga dapat menyerap cahaya tampak pada daerah UV-tampak. Reagen Folin Ciocalteu yang dapat mendeteksi gugus fenolik yang terdapat dalam residu tirosin dan triptopan (dalam protein). Gugus fenolik yang terdapat dalam asam amino ini dapat mereduksi fosfotungstat dan fosfomolibat yang terkandung dalam reagen Folin-Ciocalteu menjadi tungstat dan molibdenum yang berwarna biru. Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut:
3O Mo O (kuning pucat) fosfomolibat HO OH O O H O P OH + H 2N C CH 2 C OH molibdenum (ion berwarna biru) MoO 2 + H 2N C CH 2 C OH H O + H 3 PO 4

12

OH HO O

Gugus fenolik pada residu tirosin

Gambar 2. Reduksi fosfomolibat menjadi molibdenum oleh gugus fenolik

Reaksi reduksi yang terjadi pada fosfotungstat dapat dilihat pada gambar berikut.

H 3 PW 12 O 40 asam fosfotungstat

H O (PW 12 O 40) ion fosfotungstat (kuning pucat) 3+ H 2N C CH 2 C OH WO 4 2tungstat (ion berwarna biru) + H 2N

H O C CH 2 C OH + H 3 PO 4

OH HO O

Gambar 3. Reduksi fosfotungstat menjadi tungstat oleh gugus fenolik Dari reaksi diatas diketahui bahwa fofotungstat dan fosfomolibat bertindak sebagai agen pereduksi gugus-gugus fenolik yang terdapat dalam larutan yang dianalisis, dimana gugus fenolik itu sendiri bertidak sebagai oksidator yang mengoksidasi fosfotungstat dan fosfomolibat menjadi tungstat dan molibdenum yang merupakan ion kompleks yang berwarna biru. Tungstat dan molibdenum yang dihasilkan dalam reaksi menunjukkan puncak absorpsi yang lebar pada daerah merah dan spektrum sinar tampak pada panjang gelombang 600-800 nm. Jumlah residu tirosin untuk mengoksidasi dalam reaksi diatas sedikit maka diperlukan konstituen yang dapat meningkatkan sensitivitas reagen Folin-Ciocalteu. Dalam percobaan ini dilakukan penambahan reagen Biuret. Penambahan reagen Biuret pada tabung 1-6 (berisi larutan standar) dan tabung 7 yang berisi sampel tidak mengubah warna larutan. Larutan kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar. Penambahan reagen Biuret ke dalam larutan bertujuan untuk meningkatkan sensitivitas reagen Folin-Ciocalteu, dimana dengan penambahan reagen Biuret akan terbentuk kompleks Cu2+ dengan residu asam amino yang terdapat dalam larutan uji menghasilkan kompleks Cu-protein. Kompleks Cu-protein yang dihasilkan oleh reagen Biuret akan menyebabkan juga reduksi pada reagen Folin Ciocalteu, dimana sebanyak 75% dari reduksi yang terjadi akibat adanya kompleks Cu-protein, sedangkan 25% sisanya direduksi oleh residu-residu tirosin dan triptopan. Dengan adanya penambahan reagen tersebut intensitas warna yang dihasilkan akan meningkat empat kali lipat.Kompleks ini terbentuk adalah sebagai berikut.

Residu Protein

NH 2 R1 CH C NH R2 CH C NH R3 CH C OH O R3 O Cu 2+ R2 O R1

NH 2 CH C NH CH C NH CH C OH O O O

Gambar 4. Kompleks Cu-protein yang dihasilkan dari reagen Biuret dengan protein Pengukuran absorbansi sampel perlu dilakukan pembuatan kurva kalibrasi dari larutan standar. Larutan standar yang digunakan adalah larutan standar tirosin 10 ppm, yang kemudian diencerkan dengan aquades untuk memperoleh konsentrasi 2, 4, 6, 8, dan 10 ppm. Selanjutnya ke dalam larutan standar tersebut ditambahkan reagen Biuret yang berfungsi untuk membentuk kompleks Cu-protein sehingga terjadi reduksi fosfotungstat dan fosfomolibat menjadi tungstat dan molibdenum dari reagen Folin Ciocalteu. Hasil yang diperoleh setelah larutan standar pada tabung 1 sampai 6 ditambahkan reagen Folin Ciocalteu adalah larutan berwarna biru bening yang kepekatannya meningkat dari tabung 1 sampai tabung 6. Selanjutnya larutan diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. Warna biru tersebut mengindikasikan terbentuknya tungstat dan molibdenum yang berwarna biru dalam reaksi tersebut. Hal yang sama juga terjadi pada tabung 7 yang berisi sampel, dimana terbentuk warnna biru setelah inkubasi selama 30 menit. Setelah dilakukan pengukuran menggunakan spektrofotometer UV-Vis Shimadzu 1700 didapatkan data absorbansi dalam tabel berikut ini:

Gambar 5. Hasil pengukuran absorbansi dan kurva kalibrasi larutan standar Dari kurva kalibrasi di atas, diperoleh persamaan garis lurus sebagai berikut.

Gambar 6. Persamaan garis lurus kurva kalibrasi. Jadi : A = K1C = 0,0130 C

10

Pengukuran larutan sampel dengan spektrofotometer UV-Vis absorbansi sebesar 0,021 seperti yang ditunjukkan pada gambar berikut.

menunjukkan

Gambar 7. Hasil pengukuran absorbansi dan konsentrasi sampel Dari hasil pengukuran UV-Vis, diperoleh absorbansi sampel sebesar 0,021 dan konsentrasi sampel sebesar 1,6036 ppm. Sampel yang diukur dengan pengenceran 2 kali dari larutan sampel awal. Maka konsentrasi tirosin pada sampel awal adalah: Konsentrasi tirosin pada sampel awal =

1,6036 ppmx 1 mL 0,5 mL

= 3,2072 ppm Konsentrasi tirosin pada sampel unknown ini sebenarnya adalah 2,5 ppm, namun praktikan memperoleh konsentrasi sebesar 3,2072 ppm. Perbedaan ini kemungkinan besar disebabkan oleh ketelitian dalam larutan sampel yang digunakan. Pada saat pengenceran volume aquades yang digunakan kurang, sehingga konsentrasi larutan sampel lebih pekat daripada yang seharusnya. Kesalahan relatif praktikan = SIMPULAN Berdasarkan hasil percobaan dapat diperoleh konsentrasi tirosin dalam sampel unknown dengan metode Lowry adalah sebesar 3,2072 ppm.

(3,2072 2,5) ppm x100% 28,29% 2,5 ppm

DAFTAR PUSTAKA Muderawan, I Wayan. 2007. Buku Ajar Instrumen. Singaraja : Universitas Pendidikan Ganesha Singaraja Redhana, I Wayan dan Siti Maryam. 2003. Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja: IKIP Negeri Singaraja. Tika, I Nyoman. 2007. Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja: Universitas Pendidikan Ganesha. -------. 2010. Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja: Universitas Pendidikan Ganesha.
11