Bab I Pendahuluan

Kedelai telah menunjukan beberapa keuntungan kesehatan yang disebabkan karena kandungan nutrisinya yang tinggi dan kandungan fitokimianya. Kedelai tidak hanya kaya protein, tetapi mengandung mineral yang berguna seperti, kalsium, besi, dan serat terlarut. Protein kedelai memenuhi kebutuhan protein pada manusia. Protein dan isoflavon dari kedelai telah terbukti menurunkan resiko penyakit jantung dan sebagai antikanker. Isoflavon merupakan subkelas dari flavonoid atau isomer flavon yang merupakan flavonoid minor, yang jumlahnya sangat sedikit dan sebagai bagi tumbuhan berfungsi sebagai fitoaleksin yaitu senyawa pelindung yang terbentuk dalam tumbuhan untuk pertahanan terhadap serangan penyakit. Isoflavon di alam sering dijumpai dialam dalam bentuk glikosidanya (terikat pada gugus gula). Bentuk glikon dari isoflavon larut dalam pelarut polar, sedangkan bentuk aglikonnya larut dalam pelarut nonpolar. Flavonoid minor isoflavon penyebarannya terbatas pada beberapa jenis tumbuhan. Salah satunya terdapat pada tanaman kacang kedelai (Glycine max). Senyawa isoflavon yang terdapat di kacang kedelai antara lain genistein dan daidzein. Isoflavon sukar dicirikan karena reaksinya tidak khas dengan pereaksi warna manapun. Beberapa isoflavon (misalnya daidzein) memberikan warna biru muda cemerlang dengan sinar UV bila diuapi dengan ammonia, tetapi kebanyakan yang lain (misalnya genistein) tampak sebagai bercak lembayung pudar yang dengan ammonia berubah menjadi coklat pudar (Harbone, 1987). Isoflavon merupakan bagian dari kelompok flavonoid. Isoflavon ditemukan sebagian besar pada kacang kedelai dan memiliki struktur kimia yang hampir sama dengan hormone estrogen. Isoflavon utama yang ditemukan pada kacang kedelai adalah genistein dan daidzein. Karena strukturnya yang mirip dengan estrogen dan dapat berinteraksi dengan reseptor estrogen lain, isoflavon dari kedelai sering digunakan sebagai fitoestrogen (McCuey, 2004) Struktur isoflavon kedelai yang mirip dengan estrogen dan kemudahannya untuk berinteraksi dengan estrogen reseptor membuat isoflavon ini diduga bermanfaat dalam mengatasi sistem somatik, perasaan, dan hal-hal yang berhubungan dengan menopause. Mengkonsumsi suplemen fitoisoflavon telah terbukti dapat berpengaruh pada gejala premenopause. Isoflavonoid dari kedelai juga berpotensi sebagai sarana alternatif dalam terapi kesehatan jangka panjang yang berhubungan dengan menopause dan khususnya osteoporosis (McCuey, 2004). Isoflavon ini boleh dibilang hanya terdapat pada kedelai saja. Isoflavon ini berfungsi melakukan regulasi untuk menghambat pertumbuhan kanker terutama kanker prostat. Selain berfungsi untuk mencegah kanker prostat, biji kedelai juga berfungsi untuk menurunkan resiko terkena penyakit jantung, diabetes, ginjal dan osteoporosis (Asih, 2009). Karena begitu pentingnya fungsi tanaman ini, serta dugaan terhadap adanya senyawa golongan isoflavon yang dikandung, maka banyak penelitan - penelitian dilakukan mengenai isolasi dan identifikasi senyawa golongan isoflavon dari biji kedelai (Glycine max).

Proses identifikasi isoflavon pada kedelai dimulai dengan pengumpulan bahan, kemudian penyederhanaan bentuk bahan dengan mengubah biji menjadi bentuk serbuk. Serbuk ini kemudian dimaserasi yaitu perendaman dengan pelarut, maserasi dilakukan untuk mengeluarkan bahan aktif dari serbuk simplisia. Teknik maserasi dipilih karena peralatan yang digunakan sederhana, dan tidak memerlukan keahlian. Dengan teknik maserasi bahan aktif dapat diperoleh dari simplisia dengan maksimal, karena perendaman yang dilakukan lebih dari satu hari. Teknik lanjutan setelah maserasi yang digunakan adalah kromatografi kolom lambat, metode ini dipilih karena dengan metode ini akan didapat fraksi fraksi yang akan membantu dalam analisis selanjutnya. Selanjutnya adalah pemisahan dengan kromatografi lapis tipis (KLT), metode ini dilakukan untuk memisahkan senyawa isoflavon yang ada dalam fraksi hasil kromatografi kolom. Dengan metode ini didapatkan harga Rf yang spotnya dapat diperjelas dengan penampak bercak dan dilihat dibawah sinar UV. Setelah pemisahan dengan KLT, dilakukan pengujian dengan geseran spektrum. Pengujian dengan geseran spektum membantu dalam menentukan pola oksigenasi. Disamping itu, kedudukan gugus hidroksil fenol bebas pada inti flavonoid dapat ditentukan dengan menambahkan pereaksi geser ke dalam larutan cuplikan dan mengamati pergeseran puncak serapan yang terjadi. Dengan demikian, secara tidak langsung cara ini berguna untuk menentukan kedudukan gula atau metal yang terikat pada salah satu gugus hidroksil fenol (Markham, 1988)

Bab II ISI
2

2.1. Senyawa Isoflavonoid Isoflavonoid adalah salah satu golongan senyawa metabolit sekunder yang banyak terdapat pada tumbuh-tumbuhan, khususnya dari golongan leguminoceae (tanaman berbunga kupu-kupu). Isoflavonoid termasuk dalam golongan flavonoid (kelompok senyawa fenol) dengan kerangka dasar 1,2-diarilpropan. Senyawa isoflavon pada umumnya berupa senyawa kompleks atau konjugasi dengan senyawa gula melalui ikatan glikosida (Snyder, 1987).. Kedelai memiliki kandungan isoflavon yang tinggi, khususnya pada bagian hipokotil (germ) yang akan tumbuh menjadi tanaman. Kandungan isoflavon pada kedelai berkisar antara 24mg/gram kedelai. Jenis senyawa isoflavon utama pada kedelai adalah genistin, daidzin, danglistin. Bentuk senyawa demikian ini mempunyai aktivitas fisiologi kecil karena berada dalam bentuk glikosida. Selama proses pengolahan, baik melalui proses fermentasi maupun proses nonfermentasi,senyawa isoflavon dapat mengalami transformasi, terutama melalui proses hidrolisa sehingga diperoleh senyawa isoflavon bebas yang disebut dengan aglikon yang memiliki aktivitas lebih baik. Senyawa aglikon adalah genestein, glisitein, dan daidzein.. Hasil transformasi lebih lanjut dari senyawa aglikon menghasilkan senyawa yang mempunyai aktivitas biologi lebih tinggi yaitu faktor-2 (6,7,4-trihidroksi isoflavon). Hal ini ditunjukkan oleh Murata yang membuktikan bahwa faktor-2 (6,7,4-trihidroksi isoflavon) mempunyai aktivitas antioksidan dan antihemolitik lebih baik dari daidzein dan genistein(Murata, 1985). 2.2. Struktur Kimia - Isoflavon

- Genistein dan Daidzein

2.3. Sifat sifat Sifat dari genistein adalah larut dalam pelarut organik umum, hampir tidak larut dalam air, larut dalam alkali encer dan membentuk warna kuning. Titik lelehnya antara 297 - 298 C. Berat molekulnya 270,23. Sifat dari daidzein adalah titik lebur 315 ~ 323 C (dekomposisi), Puncak penyerapan UV 250nm. Titik leleh 315 ~ 316 . 2.4 Identifikasi - Identifikasi isoflavon Pemeriksaan golongan flavonoid dapat dilakukan dengan uji warna yaitu : 1. Test Wilstatter Beberapa mililiter sampel dalam alcohol ditambahkan 2-4 tetes larutan HCl dan 2-3 potong kecil logam Mg. Perubahan warna yang terjadi diamati dari kuning tua menjadi orange. 2. Test dengan NaOH 10% Beberapa mililiter sampel dalam alcohol ditambahkan 2-4 tetes larutan NaOH 10%. Perubahan warna yang terjadi diamati dari kuning tua menjadi kuning muda. 3. Test dengan H2SO4 (pekat) Beberapa mililiter sampel dalam alcohol ditambahkan 2-4 tetes larutan H2SO4 (pekat). Perubahan warna yang terjadi diamati dari kuning tua menjadi merah tua. - Identifikasi genistein dan daidzein Dapat dilakukan dengan identifikasi KLT-Spektrofotodensitometri Disiapkan plat silica gel GF 254 dengan ukuran 10 x 10 cm Plat silica selanjutnya dicuci dengan 3 mL metanol, lalu diaktivasi pada suhu 1200 C selama 30 menit
4

Disiapkan eluen n-heksana : kloroform : etil asetat ( 9: 1: 0,5 ) sebanyak 10 mL Fraksi dan ekstrak pembanding direkonstitusi dengan 0,5 mL metanol, chamber dijenuhkan dengan eluen Masing-masing fraksi dan ekstrak pembanding ditotolkan pada plat sebanyak 10 l pada titik yang berbeda dengan jarak penotolan 0,7 cm Plat dielusi hingga mencapai jarak elusi 8 cm, lalu plat dikeringkan dengan dianginanginkan Plat dilihat di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm Discan pada spektrofotodensitometer pada panjang gelombang 200-800 nm

Kemudian data hasil scanning dianalisis dan dicocokkan dengan literature. No. 1. 2. Nama kandungan Daidzein Genistein MeOH ( maks nm) 238bh, 249, 260bh, 303 bh 261, 328bh NaOMe ( maks nm) 259, 289bh, 328 276, 327bh

2.5. Biosintesis Isoflavon disintesis sebagai bagian dari jalur fenilpropanoid. Jalur fenilpropanoid memiliki beberapa cabang umum untuk kacang-kacangan maupun non-kacangan, yang memberikan senyawa banyak termasuk lignin, anthocyanin, dan kelas tertentu phytoalexins yang memiliki peran dalam perkembangan normal, serta berperan sebagai pelindung terhadap tekanan lingkungan yang banyak (Dixon et al, 1995. ). Set gen encoding enzim dari jalur dengan tahapan perkembangan dan jaringan-diatur secara khusus, dan dapat disebabkan oleh tekanan lingkungan seperti kekurangan gizi, dingin berkepanjangan, serangan patogen, dan paparan sinar UV ( Dixon dan Paiva, 1995 ). Gen ini termasuk amonia liase fenilalanin (PAL), sintase chalcone (c2), chalcone isomerase (chi), flavanon 3-hidroksilase (f3h), flavanon / reduktase dihydroflavanol (a1), sintase proantosianidin (a2), UDP-GLC: flavonoid 3 Oglukosiltransferase (bz1), dan glutathione S-transferase (bz2).

Diagram parsial dari jalur fenilpropanoid menampilkan intermediet dan enzim yang terlibat dalam sintesis isoflavon, serta beberapa jalur cabang. Enzim dalam huruf tebal dikodekan oleh gen dinyatakan sebagai transgen dalam penelitian ini. Gen pengkode enzim digarisbawahi telah terbukti diaktifkan pada jagung oleh C1 dan panah R. putus putus mewakili beberapa langkah. Enzim ditunjukkan dalam huruf miring.

Substrat untuk memproduksi isoflavon genistein adalah perantara dalam cabang dari jalur fenilpropanoid yang mengarah pada sintesis dari flavonoid, yang meliputi flavanon, flavon, flavonol, proanthocyanidins, dan anthocyanin. Substrat ini, naringenin, adalah produk dari sintase chalcone isomerase dan chalcone, enzim yang umum untuk kebanyakan tanaman (Gambar diagram parsial ). Aktivitas senyawa chalcone reduktase (CHR) diperlukan untuk menghasilkan substrat untuk sintesis kedua isoflavon, liquiritigenin, yang diubah menjadi daidzein (Gambar diagram parsial ). Kacang-kacangan dan beberapa spesies lainnya memiliki fungsi enzimatik yang unik yang melakukan migrasi 2,3 pada cincin B-dari naringenin atau liquiritigenin, sehingga menghasilkan isoflavon. Enzim kunci ini yang diarahkan perantara jalur fenilpropanoid dari flavonoid untuk isoflavonoid adalah isoflavon sintase (IFS).
6

2.6. Tumbuhan asal

Kedelai (Glycine max L) Nama Tanaman Nama ilmiah : Glycine max L. Merrill

Nama lokal

: Kedelai (Indonesia), Dele (Jawa), Kacang Bulu (Sunda), Kedhele (Madura), Retak Menjong (Lampung), Kacang Rimang (Minangkabau), Sarupapa (Titak), Kadale (Ujung Pandang), Lawui (Bima), Gadelei (Halmahera) : Soybean (Inggris), Soyaboon (Belanda)

Nama asing

Klasifikasi Tanaman Kingdom Divisi Sub divisi Kelas Ordo Famili Marga Spesies : Plantae : Spermatophyta : Angiospermae : Dicotyledonnae : Leguminales : Leguminoceae : Glycine : Glycine max L. Merrill

Menurut Handbook of Pharmacognosy deskripsi biji kedelai adalah sebagai berikut. Biji berbentuk bulat telur, dengan panjang sekitar 6-11 mm, lebar sekitar 5-8 mm, dan tebal antara 4-7 mm. 100 biji kedelai beratnya antara 14,5 sampai 33 mg. Biji kedelai berwarna kuning pucat atau kekuning-kuningan. Epidermis dari beberapa kulit biji terdiri dari sel-sel prisma poligon dengan tinggi 45 sampai 60 mikron dan lebar 7 sampai 20 mikron, akibat penebalan dinding antiklinal selulosa, sedangkan hipodermis berbentuk "bearercells" dengan tinggi 40 hingga 120 mikron dan lebar 30 hingga 40 mikron di bagian atas dan dasar, serta 18 hingga 30 mikron di bagian tengah. Minyak kacang kedelai berwarna kuning emas, jika dipanaskan sampai 260oC berubah menjadi pucat; dengan berat jenis 0,922 ke 0,928; nilai penyabunan 190-195; nilai yodium 130-142; indeks bias 1,4680 pada 40C. Morfologi Tanaman Kedelai Tanaman kedelai umumnya tumbuh tegak, berbentuk semak, dan merupakan tanaman semusim. Morfologi tanaman kedelai didukung oleh komponen utamanya, yaitu akar, daun, batang, polong, dan biji sehingga pertumbuhannya bisa optimal (Irwan, 2006).
7

Akar

Akar kedelai mulai muncul dari belahan kulit biji yang muncul di sekitar misofil. Calon akar tersebut kemudian tumbuh dengan cepat ke dalam tanah, sedangkan kotiledon yang terdiri dari dua keping akan terangkat ke permukaan tanah akibat pertumbuhan yang cepat dari hipokotil. Sistem perakaran kedelai terdiri dari dua macam, yaitu akar tunggang dan akar sekunder (serabut) yang tumbuh dari akar tunggang. Selain itu kedelai juga seringkali membentuk akar adventif yang tumbuh dari bagian bawah hipokotil. Pada umumnya, akar adventif terjadi karena cekaman tertentu, misalnya kadar air tanah yang terlalu tinggi. Perkembangan akar kedelai sangat dipengaruhi oleh kondisi fisik dan kimia tanah, jenis tanah, cara pengolahan lahan, kecukupan unsur hara, serta ketersediaan air di dalam tanah. Pertumbuhan akar tunggang dapat mencapai panjang sekitar 2 m atau lebih pada kondisi yang optimal, namun demikian, umumnya akar tunggang hanya tumbuh pada kedalaman lapisan tanah olahan yang tidak terlalu dalam, sekitar 30-50 cm. Sementara akar serabut dapat tumbuh pada kedalaman tanah sekitar 20-30 cm. Akar serabut ini mula-mula tumbuh di dekat ujung akar tunggang, sekitar 3-4 hari setelah berkecambah dan akan semakin bertambah banyak dengan pembentukan akar-akar muda yang lain (Irwan, 2006). Batang dan cabang

Hipokotil pada proses perkecambahan merupakan bagian batang, mulai dari pangkal akar sampai kotiledon. Hipokotil dan dua keping kotiledon yang masih melekat pada hipokotil akan menerobos ke permukaan tanah. Bagian batang kecambah yang berada diatas kotiledon tersebut dinamakan epikotil. Pertumbuhan batang kedelai dibedakan menjadi dua tipe, yaitu tipe determinate dan indeterminate. Perbedaan sistem pertumbuhan batang ini didasarkan atas keberadaan bunga pada pucuk batang. Pertumbuhan batang tipe determinate ditunjukkan dengan batang yang tidak tumbuh lagi pada saat tanaman mulai berbunga. Sementara pertumbuhan batang tipe indeterminate dicirikan bila pucuk batang tanaman masih bisa tumbuh daun, walaupun tanaman sudah mulai berbunga. Disamping itu, ada varietas hasil persilangan yang mempunyai tipe batang mirip keduanya sehingga dikategorikan sebagai semideterminate atau semiindeterminate. Jumlah buku pada batang tanaman dipengaruhi oleh tipe tumbuh batang dan periode panjang penyinaran pada siang hari. Pada kondisi normal, jumlah buku berkisar 15-30 buah. Jumlah buku batang indeterminate umumnya lebih banyak dibandingkan batang determinate. Cabang akan muncul di batang tanaman. Jumlah cabang tergantung dari varietas dan kondisi tanah, tetapi ada juga varietas kedelai yang tidak bercabang. Jumlah batang bisa menjadi sedikit bila penanaman dirapatkan dari 250.000 tanaman/hektar menjadi 500.000 tanaman/hektar. Jumlah batang tidak mempunyai hubungan yang signifikan dengan jumlah biji yang diproduksi. Artinya, walaupun jumlah cabang banyak, belum tentu produksi kedelai juga banyak (Irwan, 2006). Daun

Tanaman kedelai mempunyai dua bentuk daun yang dominan, yaitu stadium kotiledon yang tumbuh saat tanaman masih berbentuk kecambah dengan dua helai daun tunggal dan daun
8

bertangkai tiga (trifoliate leaves) yang tumbuh selepas masa pertumbuhan. Umumnya, bentuk daun kedelai ada dua, yaitu bulat (oval) dan lancip (lanceolate). Kedua bentuk daun tersebut dipengaruhi oleh faktor genetik. Bentuk daun diperkirakan mempunyai korelasi yang sangat erat dengan potensi produksi biji. Umumnya, daerah yang mempunyai tingkat kesuburan tanah tinggi sangat cocok untuk varietas kedelai yang mempunyai bentuk daun lebar. Daun mempunyai stomata, berjumlah antara 190-320 buah/m2.Umumnya, daun mempunyai bulu dengan warna cerah dan jumlahnya bervariasi. Panjang bulu bisa mencapai 1 mm dan lebar 0,0025 mm. Kepadatan bulu bervariasi, tergantung varietas, tetapi biasanya antara 3-20 buah/mm2. Jumlah bulu pada varietas berbulu lebat, dapat mencapai 3-4 kali lipat dari varietas yang berbulu normal. Contoh varietas yang berbulu lebat yaitu IAC 100, sedangkan varietas yang berbulu jarang yaitu Wilis, Dieng, Anjasmoro, dan Mahameru. Lebat-tipisnya bulu pada daun kedelai berkait dengan tingkat toleransi varietas kedelai terhadap serangan jenis hama tertentu. Hama penggerek polong ternyata sangat jarang menyerang varietas kedelai yang berbulu lebat. Oleh karena itu, para peneliti pemulia tanaman kedelai cenderung menekankan pada pembentukan varietas yang tahan hama harus mempunyai bulu di daun, polong, maupun batang tanaman kedelai (Irwan, 2006). Bunga

Tanaman kacang-kacangan, termasuk tanaman kedelai, mempunyai dua stadium tumbuh, yaitu stadia vegetatif dan stadia reproduktif. Stadium vegetatif mulai dari tanaman berkecambah sampai saat berbunga, sedangkan stadia reproduktif mulai dari pembentukan bunga sampai pemasakan biji. Tanaman kedelai di Indonesia yang mempunyai panjang hari rata-rata sekitar 12 jam dan suhu udara yang tinggi (>30 C), sebagian besar mulai berbunga pada umur antara 5-7 minggu. Tanaman kedelai termasuk peka terhadap perbedaan panjang hari, khususnya saat pembentukan bunga. Bunga kedelai menyerupai kupu-kupu. Tangkai bunga umumnya tumbuh dari ketiak tangkai daun yang diberi nama rasim. Jumlah bunga pada setiap ketiak tangkai daun sangat beragam, antara 2-25 bunga, tergantung kondisi lingkungan tumbuh dan varietas kedelai. Bunga pertama yang terbentuk umumnya pada buku kelima, keenam, atau pada buku yang lebih tinggi. Pembentukan bunga juga dipengaruhi oleh suhu dan kelembaban. Pada suhu tinggi dan kelembaban rendah, jumlah sinar matahari yang jatuh pada ketiak tangkai daun lebih banyak. Hal ini akan merangsang pembentukan bunga. Setiap ketiak tangkai daun yang mempunyai kuncup bunga dan dapat berkembang menjadi polong disebut sebagai buku subur. Tidak setiap kuncup bunga dapat tumbuh menjadi polong, hanya berkisar 20-80%. Jumlah bunga yang rontok tidak dapat membentuk polong yang cukup besar. Rontoknya bunga ini dapat terjadi pada setiap posisi buku pada 1- 10 hari setelah mulai terbentuk bunga. Periode berbunga pada tanaman kedelai cukup lama yaitu 3-5 minggu untuk daerah subtropik dan 2-3 minggu di daerah tropik, seperti di Indonesia. Jumlah bunga pada tipe batang determinate umumnya lebih sedikit dibandingkan pada batang tipe indeterminate. Warna bunga yang umum pada berbagai varietas kedelai hanya dua, yaitu putih dan ungu. Polong dan biji

Polong kedelai pertama kali terbentuk sekitar 7-10 hari setelah munculnya bunga pertama. Panjang polong muda sekitar 1 cm. Jumlah polong yang terbentuk pada setiap ketiak tangkai daun sangat beragam, antara 1-10 buah dalam setiap kelompok. Pada setiap tanaman, jumlah polong dapat mencapai lebih dari 50, bahkan ratusan. Kecepatan pembentukan polong dan pembesaran biji akan semakin cepat setelah proses pembentukan bunga berhenti. Ukuran dan bentuk polong menjadi maksimal pada saat awal periode pemasakan biji. Hal ini kemudian diikuti oleh perubahan warna polong, dari hijau menjadi kuning kecoklatan pada saat masak. Gambar polong kedelai Di dalam polong terdapat biji yang berjumlah 2-3 biji. Setiap biji kedelai mempunyai ukuran bervariasi, mulai dari kecil (sekitar 7-9 g/100 biji), sedang (10-13 g/100 biji), dan besar (>13 g/100 biji). Bentuk biji bervariasi, tergantung pada varietas tanaman, yaitu bulat, agak gepeng, dan bulat telur. Namun demikian, sebagian besar biji berbentuk bulat telur. Biji kedelai terbagi menjadi dua bagian utama, yaitu kulit biji dan janin (embrio). Pada kulit biji terdapat bagian yang disebut pusar (hilum) yang berwarna coklat, hitam, atau putih. Pada ujung hilum terdapat mikrofil, berupa lubang kecil yang terbentuk pada saat proses pembentukan biji. Warna kulit biji bervariasi, mulai dari kuning, hijau, coklat, hitam, atau kombinasi campuran dari warna-warna tersebut. Biji kedelai tidak mengalami masa dormansi sehingga setelah proses pembijian selesai, biji kedelai dapat langsung ditanam. Namun demikian, biji tersebut harus mempunyai kadar air berkisar 12-13% (Irwan, 2006). 2.7. Simplisia Pengumpulan bahan baku (Pemanenan)

Waktu panen suatu organ tanaman dari suatu jenis tanaman sangat berhubungan erat dengan pembentukan senyawa bioaktif dalam organ tanaman tersebut. Waktu yang tepat untuk panen adalah pada saat senyawa bioaktif berada dalam jumlah maksimal pada organ tanaman yang dikumpulkan. Biji dapat dapat dipanen pada saat mulai mengeringnya buah atau sebelum semuanya pecah. Sortasi basah

Sortasi basah dilakukan untuk membersihkan benda-benda asing dari luar. Seperi tanah, kerikil, rumput, bagian tanaman lain, bagian lain tanaman, dan bahan yang rusak. Pencucian

Air yang digunakan dapat dari berbagai sumber namun tetap harus memperhatikan kemungkinan adanya pencemaran. Pengeringan

Tujuan pengeringan organ tanaman atau tanaman yang dipanen adalah untuk mendapatkan simplisia yang awet, tidak rusak dan dapat digunakan atau disimpan dalam jangka waktu relatif lama dengan cara mengurangi kandungan air dan menghentikan reaksi enzimatik yang mungkin dapat menguraikan senyawa bioaktif dan menurunkan mutu atau merusak simplisia itu. Air dalam sel dan jaringan tumbuhan yang ada setelah sel atau jaringan itu mati akan
10

merupakan media pertumbuhan jamur. Demikian pula enzim-enzim tertentu dalam sel akan menguraikan senyawa bioaktif tertentu, sesaat setelah sel mati dan selama sel atau organ tersebut masih mengandung jumlah air tertentu yang memungkinkan reaksi enzimatik berlangsung. Pengeringan dapat dilakukan dengan dua tahap, yaitu pengeringan alamiah dan pengeringan buatan. Pengeringan alamiah bergantung dari zat aktif yang dikandung dalam organ tanaman yang dikeringkan, dapat dilakukan dengan dua cara pengeringan yaitu dengan panas sinar matahari langsung dan tidak dikenai sinar matahari langsung. Pengeringan dengan sinar matahari langsung dilakukan untuk mengeringkan organ tanaman yang relatif keras (kayu, kulit kayu, biji, dan lain-lain) dan mengandung senyawa bioaktif yang relatif stabil. Pengeringan yang tidak dikenai sinar matahari langsung dilakukan dengan diangin-anginkan di tempat teduh (bunga) atau ditutup dengan kain hitam (daun, rimpang). Digunakan kain hitam karena kain hitam dapat menyerap panas bukan sinarnya, sehingga uv terhalang (uv dapat merusak zat aktif). Pengeringan buatan menggunakan alat yang dapat diatur suhu, kelembaban, tekanan, dan sirkulasi udaranya. Sortasi kering

Sortasi setelah pengeringan sebenarnya merupakan tahap akhir penyiapan simplisia. Tujuan sortasi disini adalah memisahkan benda-benda asing seperti bagian-bagian tanaman yang masih ada dan tertinggal pada simplisia kering. Proses ini dilakukan sebelum simplisia dibungkus kemudian disimpan. Pengepakan dan Penyimpanan

Mutu simplisia akan menjadi turun kalau kondisi penyimpanan tidak diperhatikan. Tujuan penyimpanan yang baik dari suatu simplisia adalah untuk mencegah menurunnya mutu simplisia dalam masa penyimpanan. Wadah yang bersih, kedap udara diperlukan untuk simplisia. Kekedapan terhadap udara luar diperlukan untuk mencegah masuknya kelembaban udara yang tinggi dari luar ke dalam wadah. Udara tropik dengan kelembaban tinggi memudahkan pertumbuhan jamur. Wadah dari logam tidak dianjurkan karena dalam beberapa hal berpengaruh terhadap kadar senyawa aktif. Wadah dari plastik tebal kualitas baik atau dari gelas berwarna gelap relative baik. Pengaruh-pengaruh luar yang perlu dicegah antara lain masuknya serangga, sinar matahari langsung, dan kotoran udara lain. Ruang penyimpanan simplisia yang telah diwadahi juga perlu diperhatikan. Suhu rendah, kelembaban relatif rendah, tekanan udara dalam ruang relatif tinggi dari tekanan udara luar atau sistem sirkulasi udara yang baik, adalah kondisi ruang yang dianjurkan. Di samping itu perlu juga diatur letak dan susunan wadah di dalam ruang sehingga memudahkan orang mencari simplisia yang diperlukan. 2.8. Ekstraksi dan isolasi
11

- Ekstraksi Sekitar 1740 g serbuk biji kedelai dimaserasi dengan metanol teknis sebanyak 10L. Ekstrak yang diperoleh kemudian disaring dan diuapkan dengan menggunakan penguap putar vakum (rotary vacuum evaporator) sampai diperoleh ekstrak kental metanol sebanyak 71,82 g. Ekstrak ini kemudian dihidrolisis dengan HCl 2N selama 2-3 jam. Hasil hidrolisis diekstraksi dengan nheksana. Ekstrak n-heksana yang diperoleh diuapkan dengan penguap putar vakum sehingga diperoleh ekstrak kental n-heksana sebanyak 2,61 g, kemudian ekstrak kental yang diperoleh diuji dengan uji flavonoid. Pemisahan dan pemurnian dilakukan dengan cara kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom. a). Kromatografi lapis tipis ( KLT ) Pemisahan dengan KLT digunakan untuk mencari fase gerak yang terbaik yang akan digunakan dalam kromatografi kolom. Fase diam yang digunakan pada KLT adalah silika gel GF254 dan sebagai fase gerak digunakan nheksana, kloroform, etil asetat dan n-butanol. Bejana kromatografi sebelum digunakan untuk elusi, terlebih dahulu dijenuhkan dengan fase geraknya. Sedikit fraksi positif flavonoid yaitu fraksi n-heksana dilarutkan dengan pelarutnya (eluen yang akan dipakai) kemudian ditotolkan pada plat kromatografi lapis tipis dengan menggunakan pipa kapiler. Setelah kering lalu dimasukkan dalam bejana. Bila fase gerak telah mencapai batas yang ditentukan, plat diangkat, dan dikeringkan di udara terbuka. Sebagai penampak noda digunakan asam sulfat. Noda yang terbentuk diamati dengan lampu UV 254 nm dan 366 nm kemudian dihitung Rf-nya. b). Kromatografi kolom Fase diam yang digunakan pada kromatografi kolom adalah silika gel, sedangkan fase geraknya digunakan fase gerak yang memberikan pemisahan terbaik pada KLT. Silika gel 60 (70-100) Mesh terlebih dahulu dipanaskan dalam oven pada suhu 1100C, kemudian ditambahkan sedikit fase geraknya sehingga menjadi bubur. Pelarut (fase gerak yang digunakan) dimasukkan ke dalam kolom sampai hampir penuh dan keadaan kran kolom tertutup. Setelah itu kecepatan aliran kolom diatur dan bubur dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam kolom sampai seluruh bubur masuk ke dalam kolom. Setelah bubur masuk, fase diam ini dielusi hingga homogen (kolom ini didiamkan selama 1 hari sehingga diperoleh pemampatan yang sempurna). Sementara itu sampel dilarutkan dalam pelarut, kemudian sampel dimasukkan dengan hati-hati melalui dinding kolom dan aliran fase gerak diatur. Begitu sampel masuk ke dalam fase diam, fase gerak ditambahkan secara kontinyu sampai terjadi pemisahan. Eluat ditampung pada botol penampung fraksi setiap 3 mL, kemudian keseluruhan fraksi yang dihasilkan dilakukan KLT penggabungan. Fraksi hasil KLT penggabungan yang mempunyai pola pemisahan sama (harga Rf sama) digabungkan, kemudian diuapkan dengan penguap putar vakum dan masing-masing kelompok fraksi yang diperoleh diuji dengan pereaksi flavonoid.
12

2.9. Penentuan struktur molekul Karakterisasi golongan senyawa flavonoid dilakukan dengan metode spektrofotometri UV-Vis dan spektrofotometri inframerah. a). Karakterisasi golongan senyawa flavonoid dengan spektrafotometer UV-Vis Pengukuran spektrum UV-Vis dilakukan pada panjang gelombang 250-500 nm. Sebanyak 1 mg isolat dilarutkan dalam 100 mL methanol (larutan persediaan), kemudian diukur panjang gelombangnya. Selanjutnya untuk mengetahui kedudukan gugus hidroksi pada inti flavanoid dilakukan dengan menambahkan pereaksi geser ke dalam larutan cuplikan. Pereaksi geser yang digunakan antara lain natrium hidroksida, natrium asetat, natrium asetat dan asam borat, aluminium klorida, aluminium klorida dan asam klorida. Tahapan keja penggunaan pereaksi geser adalah sebagai berikut : a). Setelah mengukur spektrum cuplikan dalam metanol, ditambahkan 3 tetes NaOH ke dalam kuvet, dikocok hingga bercampur. Kemudian diukur panjang gelombangnya. Setelah diukur, cuplikan dibuang dan sel dicuci. b). Pengukuran spektrum dengan pereaksi geser NaOAc dilakukan dengan cara menambahkan serbuk NaOAc dalam kuvet yang berisi larutan persediaan hingga terdapat kira-kira 2 nm lapisan NaOAc pada dasar kuvet, lalu dikocok, kemudian diukur. Pengukuran spektrum NaOAc + H3BO3 diukur setelah ditambahkan serbuk H3BO3 pada larutan persediaan yang kemudian dicampur/dikocok (banyaknya serbuk H3BO3 kira-kira setengah dari NaOAc yang ditambahkan sebelumnya). Setelah diukur, cuplikan dibuang dan sel dicuci. c). Pengukuran spektrum dengan pereaksi geser AlCl3 dilakukan dengan menambahkan enam tetes pereaksi geser AlCl3 ke dalam larutan persediaan, kemudian diukur panjang gelombangnya. Untuk spektrum dengan pereaksi geser AlCl3 + HCl dilakukan dengan cara menambahkan tiga tetes HCl, kemudian dicampur dan diukur. Akhirnya cuplikan dibuang dan sel dicuci. b). Karakterisasi gugus fungsi golongan senyawa flavonoid dengan spektrofotometer inframerah (IR) Isolat aktif yang diduga golongan senyawa flavonoid yang telah murni dicampur dengan nujol. Campuran yang terbentuk selanjutnya ditempatkan pada dua buah lempeng kristal NaCl dan dimasukkan ke dalam alat inframerah, kemudian diukur serapannya. 2.10. Aktivitas biologic a. Anti tumor/ anti kanker

13

Dari sejumlah senyawa flavonoida dan isoflavonoida, yang banyak disebut berpotensi sebagai anti tumor / anti kanker adalah genistein, yang merupakan isoflavon aglikon (bebas). Potensi tersebut antara lain :

menghambat perkembangan sel kanker payudara menghambat aktivitas enzim DNA isomerase II menghambat regulasi siklus sel sifat antioksidan dan anti angiogenik yang disebabkan oleh sifat reaktif terhadap senyawa radikal bebas sifat mutagenic pada gen endoglin ( gen transforman factor pertumbuhan beta atau TGF ). Mekanisme ini dapat berlangsung apabila konsentrasi genistein lebih besar dari 5M.

b. Anti Kolesterol Efek isoflavon terhadap penurunan kolesterol telah terbukti tidak saja pada binatang percobaan seperti tikus dan kelinci, tetapi juga pada manusia. Efek yang lebih luas terbukti pula pada perlakuan terhadap tepung kedelai, dimana tidak saja kolesterol yang turun, tetapi juga trigliserida VLDL dan LDL. Mekanisme lain penurunan kolesterol oleh isoflavon diterangkan melalui pengaruh terhadap peningkatan katabolisme sel lemak untuk pembentukan energy, yang berakibat pada penurunan kandungan kolesterol. c. Estrogen dan osteoporosis Estrogen merupakan hormon yang diproduksi terutama oleh ovarium dan sebagian oleh ginjal pada bagian korteks adrenalis. Dalam tubuh kita berfungsi antara lain untuk pertumbuhan secara normal, serta untuk memelihara kesehatan tubuh pada orang dewasa, baik pada wanita maupun pada pria. Khusus pada wanita, hormon ini peranannya lebih luas, tidak saja berfungsi sebagai sistem reproduksi, tetapi juga berfungsi untuk tulang, jantung, dan mungkin juga otak (Barnes dan Kein, 1998). Pada wanita menjelang menopause, produksi estrogen menurun sehinngga dapat menimbulkan berbagai gangguan. Untuk itu, perlu dipikirkan bagaimana mensubstitusi hormon agar fungsi hormonalnya masih dapat dipertahankan. Dalam keadaan demikian, penggunaan estrogen yang dikombinasikan dengan progesteron sinttetik (hormon RT) dapat mencegah proses osteoporosis. Di sisi lain, dikatakan bahwa estrogen juga dapat mencegah risiko kanker. Dalam melakukan kerjanya, estrogen membutuhkan estrogen reseptor (ERs) yang dapat "on/off" di bawah kendali gen pada kromosom yang disebut _-ER. Beberapa target organ seperti pertumbuhan dada, tulang, dan empedu bersifat responsif terhadap _-ER ini. Isoflavon,
14

khususnya genistein, dapat terikat dengan _-ER. Walaupun ikatannya lemah, tetapi dengan ER mempunyai ikatan sama dengan estrogen. Senyawa isoflavon terbukti juga mempunyai efek hormonal, khususnya efek estrogenik. Efek estrogenik ini terkait dengan struktur isoflavon yang dapat ditransformasikan menjadi equol, dimana equol ini mempunyai struktur fenolik yang mirip dengan hormon estrogen. Mengingat hormon estrogen berpengaruh pula terhadap metabolisme tulang, terutama proses klasifikasi, maka adanya isoflavon yang bersifat estrogenik dapat berpengaruh terhadap berlangsungnya proses klasifikasi. Dengan kata lain, isoflavon dapat melindungi proses osteoporosis pada tulang sehingga tulang tetap padat dan masif. d. Pengaruh pada Sistem Sirkulasi dan Penyakit Jantung Koroner Berbagai pengaruh positif isoflavon terhadap sistem peredaran darah dan penyakit jantung banyak ditunjukkan oleh para peneliti pada aspek yang berlainan. Hasil penelitian Chen dkk., (1986) menyatakan bahwa isoflavon dan poli-metoksiflavone yang diekstrak dari tanaman Leguminosa Milletha riticalata dan Baishinia champiomi yang terikat pada protein, mempunyai sifat menghambat agregasi platelet (keping-keping sel darah), dilatan koroner, dann menghambat introphy otot jantung (cardio trophyc) sehingga dapat memperlancar sistem sirkulasi darah. Murata dan Ikehata (1968) mengatakan bahwa efek antihemolisis (pecahnya sel-sel darah merah) dari ekstrak tempe naik berbanding lurus dengan waktu inkubasi. Hasil ekstraksi tersebut, setelah dikristalisasi dan diidentifikasi, ternyata mempunyai struktur 6, 7, 4'trihidroksi isoflavon (Faktor-II) dengan daya antihemolisis setaraf dengan vitamin E dalam percobaannya pada darah yang tanpa atau telah diinduksi lebih dulu dengan asam dialurat. Di samping aktivitas tersebut, senyawa flavon mempunyai aktivitas vasodilator yang telah dijual dalam bentuk obat, yaitu Crataegut (Schwabe) dan Cratylene (Madaus) yang diekstrak dari tanaman Citaegus oxycantha. Obat lain yang berpotensi pula untuk melancarkan sirkulasi darah yaitu Tebonin (Schwabe) yang diekstrak dari tanaman Ginko biloba (Achmad, 1990). Studi di Universitas Yale menunjukkan bahwa pasien penderita (Osler-Weber-Rendu atau OWR) dengan diet kedelai hampir dapat menghentikan perdarahan hidung. OWR adalah penyakit keturunan dimana pasien menderita perdarahan hidung pada periode tertentu karena mutasi genetik yang menyebabkan kerusakan protein yang berfungsi sebagai signal terhadap hormon TGF- (transforming growth factor-betha). Penghentian perdarahan ini dapat diteranngkan melalui fungsi isoflavon sebagai interface dengan TGF-. Khususnya isoflavon pada tempe yang aktif sebagai antioksidan, yaitu 6,74' tri hidroksi isoflavan, terbukti berpotensi sebagai anti-kontriksi pembuluh darah (konsentrasi 5 g/ml) dan juga berpotensi menghambat pembentukan LDL (low density lipoprotein). Dengan demikian, isoflavon dapat mengurangi terjadinya arteriosclerosis pada pembuluh darah (Jha, 1985; Jha, 1997).

15

Pengaruh isoflavon terhadap penurunan tekanan darah dan risiko CVD (cardio vascular desease) banyak dihubungakan dengan sifat hipolipidemik dan hipokholesteremik senyawa isoflavon (Teramoto, dkk. 2000).

Bab III Penutup

Kesimpulan Isoflavonoid adalah salah satu golongan senyawa metabolit sekunder yang banyak terdapat pada tumbuh-tumbuhan, khususnya dari golongan leguminoceae (tanaman berbunga kupu-kupu). Isoflavonoid termasuk dalam golongan flavonoid (kelompok senyawa fenol) dengan kerangka dasar 1,2-diarilpropan. Senyawa isoflavon pada umumnya berupa senyawa kompleks atau konjugasi dengan senyawa gula melalui ikatan glikosida (Snyder, 1987)..
16

Kedelai memiliki kandungan isoflavon yang tinggi, khususnya pada bagian hipokotil (germ) yang akan tumbuh menjadi tanaman. Kandungan isoflavon pada kedelai berkisar antara 24mg/gram kedelai. Jenis senyawa isoflavon utama pada kedelai adalah genistin, daidzin, danglistin. Bentuk senyawa demikian ini mempunyai aktivitas fisiologi kecil karena berada dalam bentuk glikosida. - Identifikasi isoflavon bisa dilakukan dengan uji warna, yaitu : 1. Test Wilstatter 2. Test dengan NaOH 10% 3. Test dengan H2SO4 (pekat) - Identifikasi genistein dan daidzein, dapat dilakukan dengan identifikasi KLTSpektrofotodensitometri. Isoflavon disintesis sebagai bagian dari jalur fenilpropanoid. Jalur fenilpropanoid memiliki beberapa cabang umum untuk kacang-kacangan maupun non-kacangan, yang memberikan senyawa banyak termasuk lignin, anthocyanin, dan kelas tertentu phytoalexins yang memiliki peran dalam perkembangan normal, serta berperan sebagai pelindung terhadap tekanan lingkungan yang banyak (Dixon et al, 1995. ). Karakterisasi golongan senyawa flavonoid dilakukan dengan metode spektrofotometri UV-Vis dan spektrofotometri inframerah. Isoflavon mempunyai beberapa khasiat diantaranya: - anti tumor / anti kanker - anti kolesterol - Hormon estrogen

Daftar Pustaka

Blount JW, Dixon RA, Paiva NL (1992) Stress response in alfalfa (Medicago sativa L.): XVI. Antifungal activity of medicarpin and its biosynthetic precursors: implications for the genetic manipulation of stress metabolites.Physiol Mol Plant Pathol 41:333349. Dixon RA, Harrison MJ, Paiva NL (1995) The isoflavonoid phytoalexin pathway: from enzymes to genes to transcription factors. Physiol Plant93:385392. Dixon RA, Paiva NL (1995) Stress-induced phenylpropanoid metabolism.Plant Cell 7:10851097. Eldridge AC, Kwolek WF (1983) Soybean isoflavones: effect of environment and variety on composition. J Agric Food Chem 31:394396.
17

Graham TL (1995) Cellular biochemistry of phenylpropanoid responses of soybean to infection by Phytophthora sojae. in Handbook of Phytoalexin Metabolism and Action. eds Daniel M, Purkayastha RP (Marcel Dekker, New York), pp 85116. Hahlbrock K (1981) Flavonoids. in Biochemistry of Plants, eds Stumpf PK,Conn EE (Academic Press, New York), 7:425456. Jung W, Yu O, Lau SC, O'Keefe DP, Odell J, Fader G, McGonigle B Identification and expression of isoflavone synthase, the key enzyme for biosynthesis of isoflavones in legumes.Nat Biotechnol182000208212; erratum Jung W, Yu O, Lau SC, O'Keefe DP, Odell J, Fader G, McGonigle B (2000) Nat Biotechnol 18: 559 Kochs G, Grisebach H (1986) Enzymic synthesis of isoflavones. Eur J Biochem 155:311318. Messina MJ (1999) Legumes and soybeans: overview of their nutritional profiles and health effects. Am J Clin Nutr 70:439S450S. Pueppke JL (1996) The genetics and biochemical basis for nodulation of legumes by rhizobia. Crit Rev Biotechnol 16:151. Steele CL, Gijzen M, Qutob D, Dixon RA (1999) Molecular characterization of the enzyme catalyzing the aryl migration reaction of isoflavonoid biosynthesis in soybean. Arch Biochem Biophys 367:146150. Tamagnone L, Merida A, Parr A, Mackay S, Culianez-Macia FA, Roberts K, Martin C (1998) The AmMYB308 and AmMYB330 transcription factors fromAntirrhinum regulate phenylpropanoid and lignin biosynthesis in transgenic tobacco. Plant Cell 10:135154. Welle R, Grisebach H (1988) Isolation of a novel NADPH-dependent reductase which coacts with chalcone synthase in the biosynthesis of 6-deoxychalcone. FEBS Lett 236:221225. Welle R, Schroder G, Schiltz E, Grisbach H, Schroder J (1991) Induced plant responses to pathogen attack: analysis and heterologous expression of the key enzyme in the biosynthesis of phytoalexins in soybean (Glycine max L. Merr. cv. Harosoy 63). Eur J Biochem 196:423430. Winkel-Shirley B (1999) Evidence for enzyme complexes in the phenylpropanoid and flavonoid pathways. Physiol Plant 107:142149. www.ejournal.unud.ac.id www.scribd.com

18