Laporan Praktikum

Genetika Sel

Isolasi DNA Allium cepa L. (dengan cara sederhana)

Universitas Gadjah Mada Yogyakarta 2010

BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Metode yang ada untuk keperluan penelitian dalam biologi molekuler dan genetik terus berkembang dengan cepat. Agar dapat digunakan untuk manipulasi, diagnosis, dan terapeutik, DNA dan RNA harus diisolasi dalam bentuk dan jumlah yang sesuai. Metode terbaik untuk isolasi DNA dan RNA dan perbanyakannya tergantung pada tujuan penggunaan. Walaupun hampir semua teknik melibatkan banyak kerja dan

membutuhkan sejumlah besar materi awal, penggunaan kit dari berbagai perusahaan bioteknologi cukup menyederhanakan isolasi DNA dan RNA. Isolasi baik secara klasik maupun dengan kit menggunakan prinsip dasar yang sama (Lyrawati, 2004). Isolasi DNA merupakan prosedur rutin dalam analisis molekuler. Jumlah, kemurnian sampel DNA dan kondisi optimum reaksi menjadi hal yang menentukan dalam analisis genetika molekuler. Oleh karena itu diperlukan metode yang tepat dalam isolasi DNA (Pharmawati, 2009). Prosedur isolasi DNA dapat berbeda-beda tergantung tujuan isolasi dan kuantitas yang dibutuhkan (Remelia, 2008). Protokol sederhana dan singkat, seperti dalam ekstraksi bawang atau pisang telah dikembangkan untuk memfasilitasi eksperimen yang dapat dilakukan dengan peralatan sederhana serta biaya yang relatif murah (De Boer, et.al., 2000)

B. Permasalahan 1. Bagaimana cara/tahapan untuk mengisolasi DNA dengan cara sederhana? 2. Apakah metode yang digunakan mampu mengisolasi DNA Allium cepa L.? 3. Bagaimana benang DNA hasil isolasi dari Allium cepa L.?

C. Tujuan 1. Mengetahui cara/ tahapan untuk mengisolasi DNA dengan cara sederhana. 2. Mengetahui apakah metode yang digunakan mampu mengisolasi DNA Allium cepa L. 3. Melihat benang DNA hasil isolasi dari Allium cepa L.

BAB II LANDASAN TEORI A. Tinjauan Pustaka DNA merupakan polimer asam nukleat yang tersusun secara sistematis dan merupakan pembawa informasi genetik yang diturunkan. Asam nukleat merupakan polimer nukleotida yang tersusun atas: 1. Basa Nitrogen Terdapat dua macam basa nitrogen yang menyusun asam nukleat, yaitu basa purin yang terdiri dari Adenin dan Guanin,serta basa pirimidin yang terdiri dari Sitosin, Timin dan Urasil. 2. Gula Pentosa Gugus gula pada RNA adalah ribose, sedangkan pada DNA adalah deoksiribosa. Perbedaan keduanya terletak pada atom C nomor 2 yang dalam RNA berikatan dengan gugus hidroksil (OH), sedangkan dalam DNA berikatan dengan atom H. 3. Gugus Fosfat Gugus fosfat terikat pada atom C nomor 5 melalui ikatan fosfodiester. Gugus ini yang menyebabkan asam nukleat bermuatan negatif kuat (Yuwono, 2008) DNA genom merupakan seluruh materi genetik yang dimiliki oleh suatu organisme termasuk di dalamnya DNA yang berinteraksi dengan protein dan RNA, yang terdapat pada suatu sel secara bersama-sama (Weaver dan Hedrick, 1997). Ukuran DNA yang menyusun kromosom eukariot jauh lebih panjang daripada ukuran selnya. Oleh karena itu, DNA dikemas dalam sistem yang sangat efisien dan kompak mengunakan protein histon. Kompleks DNA dan protein histon (nukleosom) menyebabkan kondensasi atau pengemasan DNA menjadi enam kali lebih kompak. Ikatan antara DNA dengan histon ini dapat dipisahkan mengunakan garam dengan konsentrasi tinggi. Rangkaian nukleosom membentuk struktur yang disebut kromatin, terdiri atas DNA, protein dan RNA (kurang dari 10%) (Yuwono, 2008). 3

Dalam penerapan teknik molekuler, bahan pokok yang harus dimiliki adah DNA atau RNA. DNA atau RNA ini dapat diperoleh melalui proses isolasi (Pai, 1992). Isolasi DNA adalah pemisahan molekul DNA dari molekul lain seperti dinding sel, membran sel dan membran ini sehingga strukturnya dapat dilihat dengan jelas. Tahap dalam isolasi DNA tanaman yaitu pengambilan sampel (jaringan), lisis dinding sel dan membran sel, purifikasi, serta presipitasi (Kephart, 1999). Lisis sel dapat dilakukan secara kimiawi atau enzimatik tergantung sumber DNA-nya. Zat kimia yang biasa digunakan adalah detergen. Detergen akan menyebabkan protein membran terdenaturasi sehingga struktur membran akan rusak. Ekstraksi biasanya dengan menggunakan fenol-klorofom-isoamil alkohol atau ammonium asetat yang akan mengendapkan protein. Presipitasi DNA dapat menggunakan etanol absolute atau isopropanol, karena bersifat sangat polar dan dapat menarik molekul air dari DNA sehingga DNA mengendap (Schleic, 1998). Protokol ekstraksi DNA genom juga harus memenuhi syarat, yaitu mencegah oksidasi zat fenolik yang dapat bereaksi dengan asam nukleat dan protein untuk menghilangkan polisakarida yang mengganggu dengan manipulasi enzimatik dalam penelitian biologi molekuler (Oboh, 2009).

B. Hipotesis Metode yang digunakan pada praktikum ini dapat digunakan untuk mengisolasi DNA Allium cepa L.

BAB III METODOLOGI A. Alat Tube plastik, mikropipet, tip, gelas beker, corong gelas, saringan, kertas filter, blender, microsentrifuge. B. Bahan Umbi bawang bombay (Allium cepa L.), larutan buffer (dibuat dari campuran akuades steril, NaCl, NaHCO3, dan detergen 10%), isoprophyl alcohol dingin, alkohol 70%, buffer TE (tris EDTA). C. Cara Kerja Sel-sel umbi bawang bombay dihancurkan menggunakan blender. Juice bawang Bombay kemudian disaring menggunakan saringan biasa, dilanjutkan penyaringan menggunakan kertas filter. Filtrat yang diperoleh dimasukkan ke tube plastik sebanyak 400L. Kemudian ditambahkan larutan buffer sebanyak 800L. Tube digoyang-goyangkan dengan cepat dan searah selama 3 menit untuk mencampur filtrat dan buffer. Selanjutnya campuran disentrifugasi menggunakan microsentrifuge

dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang diperoleh dari hasil sentrifugasi dipindahkan ke tube baru sebanyak 400L. Kemudian sebanyak 800L isoprophyl alcohol dingin dimasukkan secara perlahan melalui dinding tabung. Tube digoyangkan perlahan, lalu diamati benang-benang DNA yang mulai terpisah. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit untuk presipitasi DNA. Supernatan dibuang, pellet dicuci dengan menambahkan 100L alkohol 70% dan diresuspensi menggunakan sentrifuge dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit. Larutan alkohol kemudian dibuang, pellet dikeringanginkan untuk menghilangkan sisa alkohol (bias juga dengan diserap menggunakan tisu). Selanjutnya pellet diberi 50 L pelarut DNA (tris EDTA), lalu disimpan dalam freezer.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil

Gambar 1. Presipitat DNA Allium cepa L. hasil isolasi (pellet putih di dasar tube)

B. Pembahasan Tujuan dari praktikum ini adalah untuk melakukan isolasi DNA dari umbi bawang Bombay (Allium cepa L.) dan melihat benang DNA yang diperoleh. Penggunaan umbi dalam praktikum ini didasarkan bahwa pada umbi kromosomnya lebih lengkap. Umbi bawang Bombay mudah didapat, memiliki kandungan air yang tinggi dan memiliki kromosom yang relatif besar. Prinsip dasar isolasi total DNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan dan DNA. Kemudian ekstrak sel dipurifikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung DNA total. Pada teknik isolasi DNA sederhana, purifikasi yang dilakukan hanya memisahkan benang DNA dengan debris selnya. Dalam teknik isolasi ini tidak diperoleh DNA murni, melainkan DNA kotor yang masih berikatan dengan protein. Kemungkinan tidak hanya terdiri atas DNA tetapi juga terdapat RNA.

Proses isolasi diawali dengan penghancuran sel yang dilakukan secara mekanis menggunakan blender. Kemudian juice yang dihasilkan disaring dua kali, menggunakan saringan biasa dan kertas filter. Ini bertujuan untuk memisahkan DNA genom yang terlarut dalam sari umbi dengan sisa-sisa jaringan umbi yang telah hancur. Proses dilanjutkan dengan penambahan larutan buffer, yang terdiri atas 3gr NaCl, 10gr NaHCO3, 10ml detergen 10%, dan akuades, ke tube yang berisi filtrat umbi. Larutan buffer merupakan larutan campuran garam dan detergen, digunakan untuk merusak membran sel, sehingga komponen DNA dalam sitoplasma sel dapat keluar dan diisolasi (DeBoer et al., 2000; Faatih, 2009). Garam dalam buffer berfungsi untuk memisahkan molekul DNA dari komponen lainnya dengan membentuk ikatan ionik dengan asam nukleat (kondisi ionik yang lebih stabil). Deterjen dapat berasosiasi dengan protein membran sehingga akan melarutkan protein tersebut sehingga membran sel akan dengan mudah dilisiskan (Sambrook dan Russel, 2001). Tube berisi campuran filtrat dan buffer digoyang-goyangkan dengan cepat dan searah selama 3 menit agar larutan menjadi homogen. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi pada kecepatan rendah (3000 rpm) selama 15 menit. Sentrifugasi ini dimaksudkan untuk memisahkan campuran menjadi dua fase, yaitu fase terlarut dan fase organik. Fase terlarut (supernatant) mengandung DNA genom karena memiliki berat molekul lebih ringan dibandingkan fase organiknya. Menurut Seidman dan Moore (2000), fase organik (pellet) yang terbentuk pada bagian dasar tabung merupakan molekul-molekul protein dan polisakarida yang terdenaturasi. Supernatant yang diperoleh dipindahkan ke tube yang lain, kemudian ditambahkan isoprophyl alcohol dingin. Penambahan ke dalam supernatant harus dilakukan perlahan-lahan dan melalui dinding sel agar tidak merusak benang-benang DNA. Beberapa saat setelah penambahan isoprophyl alcohol, akan tampak 3 lapisan pada tube. Lapisan pertama yang tampak bening merupakan isoprophyl alcohol, lapisan kedua yang tampak seperti

kumpulan benang putih merupakan benang-benang DNA, sedangkan lapisan paling bawah merupakan sisa supernatant DNA (Gambar 2)

A B C

Gambar 2. Presipitasi DNA setelah pemberian isoprophyl alcohol (isopropanol), tampak benang- benang DNA (B) berwarna putih diantara isopropanol (A) dan supernatant (C) Penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA. ion-ion seperti Na+ Mg2+ akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. Di dalam air, gaya elektrostatik antara ion positif (Na+) dan negatif (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air. Fungsi penambahan pelarut organik seperti etanol atau isopropanol adalah menurunkan konstanta dielektrik air atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi.

Pelarut Isopropanol

Gambar 3. Aktivitas pelarut terhadap DNA

Selanjutnya dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit untuk mengendapkan molekul DNA. Setelah sentrifugasi, DNA mengendap sebagai pellet berwarna putih di dasar tube. Pellet kemudian dicuci menggunakan alkohol 70% dan diresuspensi dengan sentrifugasi 10000 rpm selama 5 menit. Setelah dicuci DNA tampak seperti endapan tepung putih. Alkohol yang digunakan untuk mencuci DNA dibuang kemudian pellet dikeringanginkan untuk menghilangkan sisa alkohol. Pellet harus terbebas dari alkohol karena dapat merusak pellet DNA. Kemudian ditambahkan buffer TE (Tris EDTA) yang berfungsi melarutkan DNA dan melindungi dari kerusakan oleh endonuklease. Dengan penambahan TE ini, DNA dapat disimpan dalam waktu yang lama sebelum digunakan untuk analisis selanjutnya karena senyawa Tris dapat mempertahankan pH, sedangkan EDTA mampu menghambat aktivitas endonuklease (Seidman dan Moore, 2000).

BAB V KESIMPULAN

1. Tahapan isolasi DNA dengan cara sederhana meliputi penghancuran jaringan dan lisis sel, purifikasi dari debris sel dan presipitasi DNA. 2. Dari praktikum yang dilakukan diketahui bahwa metode ini dapat digunakan untuk mengisolasi DNA genom Allium cepa L. Namun, DNA yang diperoleh dari metode ini berupa DNA kotor yang masih berikatan dengan protein, juga kemungkinan terdapat pula RNA. 3. Hasil isolasi DNA tampak benang-benang berwarna putih. Setelah dilakukan presipitasi dan sentrifugasi DNA tampak sebagai endapan putih di dasar tube.

10

DAFTAR PUSTAKA

DeBoer, R.L., Sobieski, R.J., and Crupper, S.S. 2000. Isolation and Restriction Endonuclease Digestion of Onion in Junior College-High School Biology Laboratory. Bioscience 26 (3): 15-17 Faatih, M. 2009. Isolasi dan digesti DNA kromosom. Jurnal Penelitian Sains & Teknologi 10 (1): 61-67 Kephart, D. 1999. Rapid Isolation of Genomic DNA from Small Quantities of Human Tissue. www.promega.com/profiles/203/ProfilsinDNA
Lyrawati, D. 2004. DNA Recombination and Genetic Techniques, Transmission of Human Disease and Computer Resources for The Clinical and Molecular Geneticist (transl.Indonesian). Agric. Fac. Unibraw Publ., Indonesia (ISBN 979508-543-3). Oboh,B.Q., L.A.Ogunkanmi, N.Agwu. 2009. Rapid Isolation of Genome DNA suitable for PCR from Tropical Almond (T.catappa) Plant Populations. International journal of Botany 5(3):250-254

Pai, A.C. 1992. Dasar Dasar Genetika. Jakarta: Erlangga. Pharmawati, M. 2009. Optimalisasi ekstraksi DNA dan PCR-RAPD pada Grevillea sp. (Proteaceae). Jurnal Biologi 8 (1): 12-16 Ramelia, M. 2008. Analisis Insersi T-DNA Pembawa Transposon pada T0 dan Aktivitas Ds pada T1 Tanaman Padi (Oryza sativa L.) Kultivar Nipponbare. Jakarta: FMIPA UI Sambrook, J.dan D.W. Russel. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. New York: CSHL press Schleic, R. 1998. Genetics and Molecular Biology.3rd ed. London: John Hopkins University press. Seidman, L.A. dan C.J.Moore. 2000. Basic Laboratory Method for Biotechnology. London: Prentice Hall Weaver, R.F. dan P.W.Hedrick. 1997. Genetics. 3rd ed. Chicago: Wm.C. Brown. Publishers. Yuwono, T. 2008. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga

11