Laporan Praktikum

Genetika Sel

Isolasi DNA Allium cepa L. (dengan cara sederhana)

Universitas Gadjah Mada Yogyakarta 2010

2009). Oleh karena itu diperlukan metode yang tepat dalam isolasi DNA (Pharmawati. Bagaimana cara/tahapan untuk mengisolasi DNA dengan cara sederhana? 2. et.? 3. Metode terbaik untuk isolasi DNA dan RNA dan perbanyakannya tergantung pada tujuan penggunaan. Agar dapat digunakan untuk manipulasi.? 1 . 2004). Bagaimana benang DNA hasil isolasi dari Allium cepa L.BAB I PENDAHULUAN A. Jumlah. Permasalahan 1. Apakah metode yang digunakan mampu mengisolasi DNA Allium cepa L. diagnosis.al. kemurnian sampel DNA dan kondisi optimum reaksi menjadi hal yang menentukan dalam analisis genetika molekuler. Isolasi DNA merupakan prosedur rutin dalam analisis molekuler. dan terapeutik. Isolasi baik secara klasik maupun dengan kit menggunakan prinsip dasar yang sama (Lyrawati. 2000) B.. Protokol sederhana dan singkat. Prosedur isolasi DNA dapat berbeda-beda tergantung tujuan isolasi dan kuantitas yang dibutuhkan (Remelia. 2008). seperti dalam ekstraksi bawang atau pisang telah dikembangkan untuk memfasilitasi eksperimen yang dapat dilakukan dengan peralatan sederhana serta biaya yang relatif murah (De Boer. Walaupun hampir semua teknik melibatkan banyak kerja dan membutuhkan sejumlah besar materi awal. Latar Belakang Metode yang ada untuk keperluan penelitian dalam biologi molekuler dan genetik terus berkembang dengan cepat. DNA dan RNA harus diisolasi dalam bentuk dan jumlah yang sesuai. penggunaan kit dari berbagai perusahaan bioteknologi cukup menyederhanakan isolasi DNA dan RNA.

Mengetahui apakah metode yang digunakan mampu mengisolasi DNA Allium cepa L. Mengetahui cara/ tahapan untuk mengisolasi DNA dengan cara sederhana. Tujuan 1.C. 2. 2 . Melihat benang DNA hasil isolasi dari Allium cepa L. 3.

terdiri atas DNA.serta basa pirimidin yang terdiri dari Sitosin. Tinjauan Pustaka DNA merupakan polimer asam nukleat yang tersusun secara sistematis dan merupakan pembawa informasi genetik yang diturunkan. sedangkan pada DNA adalah deoksiribosa. yaitu basa purin yang terdiri dari Adenin dan Guanin. Ikatan antara DNA dengan histon ini dapat dipisahkan mengunakan garam dengan konsentrasi tinggi. protein dan RNA (kurang dari 10%) (Yuwono. 1997). Ukuran DNA yang menyusun kromosom eukariot jauh lebih panjang daripada ukuran selnya. DNA dikemas dalam sistem yang sangat efisien dan kompak mengunakan protein histon. sedangkan dalam DNA berikatan dengan atom H. 2. Asam nukleat merupakan polimer nukleotida yang tersusun atas: 1. Gula Pentosa Gugus gula pada RNA adalah ribose. Gugus ini yang menyebabkan asam nukleat bermuatan negatif kuat (Yuwono. Basa Nitrogen Terdapat dua macam basa nitrogen yang menyusun asam nukleat. Gugus Fosfat Gugus fosfat terikat pada atom C nomor 5 melalui ikatan fosfodiester. Oleh karena itu. 3 .BAB II LANDASAN TEORI A. Timin dan Urasil. Kompleks DNA dan protein histon (nukleosom) menyebabkan kondensasi atau pengemasan DNA menjadi enam kali lebih kompak. Rangkaian nukleosom membentuk struktur yang disebut kromatin. 3. 2008) DNA genom merupakan seluruh materi genetik yang dimiliki oleh suatu organisme termasuk di dalamnya DNA yang berinteraksi dengan protein dan RNA. 2008). Perbedaan keduanya terletak pada atom C nomor 2 yang dalam RNA berikatan dengan gugus hidroksil (OH). yang terdapat pada suatu sel secara bersama-sama (Weaver dan Hedrick.

1999). lisis dinding sel dan membran sel. Isolasi DNA adalah pemisahan molekul DNA dari molekul lain seperti dinding sel.Dalam penerapan teknik molekuler. Ekstraksi biasanya dengan menggunakan fenol-klorofom-isoamil alkohol atau ammonium asetat yang akan mengendapkan protein. Protokol ekstraksi DNA genom juga harus memenuhi syarat. B. Detergen akan menyebabkan protein membran terdenaturasi sehingga struktur membran akan rusak. membran sel dan membran ini sehingga strukturnya dapat dilihat dengan jelas. 2009). 1992). purifikasi. karena bersifat sangat polar dan dapat menarik molekul air dari DNA sehingga DNA mengendap (Schleic. 1998). DNA atau RNA ini dapat diperoleh melalui proses isolasi (Pai. Zat kimia yang biasa digunakan adalah detergen. bahan pokok yang harus dimiliki adah DNA atau RNA. Hipotesis Metode yang digunakan pada praktikum ini dapat digunakan untuk mengisolasi DNA Allium cepa L. yaitu mencegah oksidasi zat fenolik yang dapat bereaksi dengan asam nukleat dan protein untuk menghilangkan polisakarida yang mengganggu dengan manipulasi enzimatik dalam penelitian biologi molekuler (Oboh. Presipitasi DNA dapat menggunakan etanol absolute atau isopropanol. serta presipitasi (Kephart. Lisis sel dapat dilakukan secara kimiawi atau enzimatik tergantung sumber DNA-nya. 4 . Tahap dalam isolasi DNA tanaman yaitu pengambilan sampel (jaringan).

Filtrat yang diperoleh dimasukkan ke tube plastik sebanyak 400µL. mikropipet. larutan buffer (dibuat dari campuran akuades steril. Juice bawang Bombay kemudian disaring menggunakan saringan biasa. tip. kertas filter. alkohol 70%.). pellet dikeringanginkan untuk menghilangkan sisa alkohol (bias juga dengan diserap menggunakan tisu). lalu diamati benang-benang DNA yang mulai terpisah. Tube digoyangkan perlahan. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit untuk presipitasi DNA. Kemudian sebanyak 800µL isoprophyl alcohol dingin dimasukkan secara perlahan melalui dinding tabung. C. Cara Kerja Sel-sel umbi bawang bombay dihancurkan menggunakan blender. 5 . Selanjutnya pellet diberi 50 µL pelarut DNA (tris EDTA). Selanjutnya campuran disentrifugasi menggunakan microsentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. dilanjutkan penyaringan menggunakan kertas filter. B. buffer TE (tris EDTA). Supernatan yang diperoleh dari hasil sentrifugasi dipindahkan ke tube baru sebanyak 400µL.BAB III METODOLOGI A. NaHCO3. microsentrifuge. corong gelas. saringan. Alat Tube plastik. Kemudian ditambahkan larutan buffer sebanyak 800µL. Bahan Umbi bawang bombay (Allium cepa L. Supernatan dibuang. dan detergen 10%). Larutan alkohol kemudian dibuang. Tube digoyang-goyangkan dengan cepat dan searah selama 3 menit untuk mencampur filtrat dan buffer. NaCl. pellet dicuci dengan menambahkan 100µL alkohol 70% dan diresuspensi menggunakan sentrifuge dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit. gelas beker. isoprophyl alcohol dingin. lalu disimpan dalam freezer. blender.

Presipitat DNA Allium cepa L. Prinsip dasar isolasi total DNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan dan DNA.BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Kemungkinan tidak hanya terdiri atas DNA tetapi juga terdapat RNA. Kemudian ekstrak sel dipurifikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung DNA total. Pembahasan Tujuan dari praktikum ini adalah untuk melakukan isolasi DNA dari umbi bawang Bombay (Allium cepa L. Dalam teknik isolasi ini tidak diperoleh DNA murni. Umbi bawang Bombay mudah didapat.) dan melihat benang DNA yang diperoleh. memiliki kandungan air yang tinggi dan memiliki kromosom yang relatif besar. purifikasi yang dilakukan hanya memisahkan benang DNA dengan debris selnya. Penggunaan umbi dalam praktikum ini didasarkan bahwa pada umbi kromosomnya lebih lengkap. 6 . melainkan DNA kotor yang masih berikatan dengan protein. Hasil Gambar 1. hasil isolasi (pellet putih di dasar tube) B. Pada teknik isolasi DNA sederhana.

. Kemudian juice yang dihasilkan disaring dua kali. Beberapa saat setelah penambahan isoprophyl alcohol. Larutan buffer merupakan larutan campuran garam dan detergen. Sentrifugasi ini dimaksudkan untuk memisahkan campuran menjadi dua fase. Penambahan ke dalam supernatant harus dilakukan perlahan-lahan dan melalui dinding sel agar tidak merusak benang-benang DNA. fase organik (pellet) yang terbentuk pada bagian dasar tabung merupakan molekul-molekul protein dan polisakarida yang terdenaturasi. yaitu fase terlarut dan fase organik. Lapisan pertama yang tampak bening merupakan isoprophyl alcohol. Ini bertujuan untuk memisahkan DNA genom yang terlarut dalam sari umbi dengan sisa-sisa jaringan umbi yang telah hancur. akan tampak 3 lapisan pada tube. menggunakan saringan biasa dan kertas filter. digunakan untuk merusak membran sel. Faatih. yang terdiri atas 3gr NaCl. Supernatant yang diperoleh dipindahkan ke tube yang lain. lapisan kedua yang tampak seperti 7 . ke tube yang berisi filtrat umbi. dan akuades. sehingga komponen DNA dalam sitoplasma sel dapat keluar dan diisolasi (DeBoer et al. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi pada kecepatan rendah (3000 rpm) selama 15 menit. Garam dalam buffer berfungsi untuk memisahkan molekul DNA dari komponen lainnya dengan membentuk ikatan ionik dengan asam nukleat (kondisi ionik yang lebih stabil).Proses isolasi diawali dengan penghancuran sel yang dilakukan secara mekanis menggunakan blender. Fase terlarut (supernatant) mengandung DNA genom karena memiliki berat molekul lebih ringan dibandingkan fase organiknya. Tube berisi campuran filtrat dan buffer digoyang-goyangkan dengan cepat dan searah selama 3 menit agar larutan menjadi homogen. 10gr NaHCO3. kemudian ditambahkan isoprophyl alcohol dingin. Deterjen dapat berasosiasi dengan protein membran sehingga akan melarutkan protein tersebut sehingga membran sel akan dengan mudah dilisiskan (Sambrook dan Russel. Proses dilanjutkan dengan penambahan larutan buffer. 10ml detergen 10%. 2000. Menurut Seidman dan Moore (2000). 2001). 2009).

Di dalam air. gaya elektrostatik antara ion positif (Na+) dan negatif (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air. tampak benang. ion-ion seperti Na+ Mg2+ akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. 8 . sedangkan lapisan paling bawah merupakan sisa supernatant DNA (Gambar 2) A B C Gambar 2.benang DNA (B) berwarna putih diantara isopropanol (A) dan supernatant (C) Penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA. Presipitasi DNA setelah pemberian isoprophyl alcohol (isopropanol).kumpulan benang putih merupakan benang-benang DNA. Fungsi penambahan pelarut organik seperti etanol atau isopropanol adalah menurunkan konstanta dielektrik air atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi.

Dengan penambahan TE ini. Kemudian ditambahkan buffer TE (Tris EDTA) yang berfungsi melarutkan DNA dan melindungi dari kerusakan oleh endonuklease. sedangkan EDTA mampu menghambat aktivitas endonuklease (Seidman dan Moore. Pellet kemudian dicuci menggunakan alkohol 70% dan diresuspensi dengan sentrifugasi 10000 rpm selama 5 menit.Pelarut Isopropanol Gambar 3. DNA mengendap sebagai pellet berwarna putih di dasar tube. 9 . Setelah dicuci DNA tampak seperti endapan tepung putih. Alkohol yang digunakan untuk mencuci DNA dibuang kemudian pellet dikeringanginkan untuk menghilangkan sisa alkohol. Setelah sentrifugasi. Aktivitas pelarut terhadap DNA Selanjutnya dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit untuk mengendapkan molekul DNA. DNA dapat disimpan dalam waktu yang lama sebelum digunakan untuk analisis selanjutnya karena senyawa Tris dapat mempertahankan pH. Pellet harus terbebas dari alkohol karena dapat merusak pellet DNA. 2000).

BAB V KESIMPULAN 1. DNA yang diperoleh dari metode ini berupa DNA kotor yang masih berikatan dengan protein. 3. juga kemungkinan terdapat pula RNA. Tahapan isolasi DNA dengan cara sederhana meliputi penghancuran jaringan dan lisis sel. 2. Hasil isolasi DNA tampak benang-benang berwarna putih. Dari praktikum yang dilakukan diketahui bahwa metode ini dapat digunakan untuk mengisolasi DNA genom Allium cepa L. Namun. Setelah dilakukan presipitasi dan sentrifugasi DNA tampak sebagai endapan putih di dasar tube. purifikasi dari debris sel dan presipitasi DNA. 10 .

Genetics and Molecular Biology. M. www. 3rd ed. R.catappa) Plant Populations. Seidman.A. Fac. Transmission of Human Disease and Computer Resources for The Clinical and Molecular Geneticist (transl. M. M. Isolation and Restriction Endonuclease Digestion of Onion in Junior College-High School Biology Laboratory.S. R.J.3rd ed.L. Jakarta: Erlangga 11 . Indonesia (ISBN 979508-543-3). R. Yuwono. 2009. T. and Crupper. Russel. London: John Hopkins University press. 2004. S. 3rd ed.. R. Jurnal Biologi 8 (1): 12-16 Ramelia. 2009.) Kultivar Nipponbare. dan P. Genetics. Sobieski. D. 2000. J.. L. 1999. N. D.dan D. Publishers. Biologi Molekuler. dan C. DNA Recombination and Genetic Techniques.Q. London: Prentice Hall Weaver.Moore.C. Brown. New York: CSHL press Schleic. 1992. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Bioscience 26 (3): 15-17 Faatih. Oboh. 2000.F. Analisis Insersi T-DNA Pembawa Transposon pada T0 dan Aktivitas Ds pada T1 Tanaman Padi (Oryza sativa L. Pharmawati.J.. 2009. Dasar – Dasar Genetika.W.Hedrick.C. Rapid Isolation of Genome DNA suitable for PCR from Tropical Almond (T.DAFTAR PUSTAKA DeBoer. Chicago: Wm. Isolasi dan digesti DNA kromosom. L.W. 2001. Jakarta: Erlangga.com/profiles/203/ProfilsinDNA Lyrawati. Unibraw Publ.Indonesian). 1997. 1998. A.. Basic Laboratory Method for Biotechnology.B.Ogunkanmi. Jakarta: FMIPA UI Sambrook. Optimalisasi ekstraksi DNA dan PCR-RAPD pada Grevillea sp. Jurnal Penelitian Sains & Teknologi 10 (1): 61-67 Kephart.Agwu. 2008. International journal of Botany 5(3):250-254 Pai. Agric. 2008. (Proteaceae).promega. Rapid Isolation of Genomic DNA from Small Quantities of Human Tissue.A.