Laporan Praktikum

Genetika Sel

Isolasi DNA Allium cepa L. (dengan cara sederhana)

Universitas Gadjah Mada Yogyakarta 2010

Prosedur isolasi DNA dapat berbeda-beda tergantung tujuan isolasi dan kuantitas yang dibutuhkan (Remelia. Latar Belakang Metode yang ada untuk keperluan penelitian dalam biologi molekuler dan genetik terus berkembang dengan cepat. Bagaimana benang DNA hasil isolasi dari Allium cepa L. Jumlah.BAB I PENDAHULUAN A.? 3. Isolasi DNA merupakan prosedur rutin dalam analisis molekuler. Bagaimana cara/tahapan untuk mengisolasi DNA dengan cara sederhana? 2. Permasalahan 1. diagnosis. penggunaan kit dari berbagai perusahaan bioteknologi cukup menyederhanakan isolasi DNA dan RNA. DNA dan RNA harus diisolasi dalam bentuk dan jumlah yang sesuai. 2009). et. 2000) B.. 2004). dan terapeutik. Metode terbaik untuk isolasi DNA dan RNA dan perbanyakannya tergantung pada tujuan penggunaan. Apakah metode yang digunakan mampu mengisolasi DNA Allium cepa L. kemurnian sampel DNA dan kondisi optimum reaksi menjadi hal yang menentukan dalam analisis genetika molekuler. 2008).al. Agar dapat digunakan untuk manipulasi. Walaupun hampir semua teknik melibatkan banyak kerja dan membutuhkan sejumlah besar materi awal. seperti dalam ekstraksi bawang atau pisang telah dikembangkan untuk memfasilitasi eksperimen yang dapat dilakukan dengan peralatan sederhana serta biaya yang relatif murah (De Boer.? 1 . Oleh karena itu diperlukan metode yang tepat dalam isolasi DNA (Pharmawati. Protokol sederhana dan singkat. Isolasi baik secara klasik maupun dengan kit menggunakan prinsip dasar yang sama (Lyrawati.

Mengetahui apakah metode yang digunakan mampu mengisolasi DNA Allium cepa L. Mengetahui cara/ tahapan untuk mengisolasi DNA dengan cara sederhana. 3. 2 . 2. Melihat benang DNA hasil isolasi dari Allium cepa L.C. Tujuan 1.

Gugus Fosfat Gugus fosfat terikat pada atom C nomor 5 melalui ikatan fosfodiester. Tinjauan Pustaka DNA merupakan polimer asam nukleat yang tersusun secara sistematis dan merupakan pembawa informasi genetik yang diturunkan. Ikatan antara DNA dengan histon ini dapat dipisahkan mengunakan garam dengan konsentrasi tinggi. Asam nukleat merupakan polimer nukleotida yang tersusun atas: 1. terdiri atas DNA. Gula Pentosa Gugus gula pada RNA adalah ribose. 3 . Ukuran DNA yang menyusun kromosom eukariot jauh lebih panjang daripada ukuran selnya. DNA dikemas dalam sistem yang sangat efisien dan kompak mengunakan protein histon.serta basa pirimidin yang terdiri dari Sitosin. Kompleks DNA dan protein histon (nukleosom) menyebabkan kondensasi atau pengemasan DNA menjadi enam kali lebih kompak. 2. Basa Nitrogen Terdapat dua macam basa nitrogen yang menyusun asam nukleat. sedangkan dalam DNA berikatan dengan atom H. Perbedaan keduanya terletak pada atom C nomor 2 yang dalam RNA berikatan dengan gugus hidroksil (OH). 2008) DNA genom merupakan seluruh materi genetik yang dimiliki oleh suatu organisme termasuk di dalamnya DNA yang berinteraksi dengan protein dan RNA. 2008). 3. sedangkan pada DNA adalah deoksiribosa. Timin dan Urasil. yaitu basa purin yang terdiri dari Adenin dan Guanin. protein dan RNA (kurang dari 10%) (Yuwono. 1997). Gugus ini yang menyebabkan asam nukleat bermuatan negatif kuat (Yuwono. Oleh karena itu. yang terdapat pada suatu sel secara bersama-sama (Weaver dan Hedrick.BAB II LANDASAN TEORI A. Rangkaian nukleosom membentuk struktur yang disebut kromatin.

Tahap dalam isolasi DNA tanaman yaitu pengambilan sampel (jaringan). serta presipitasi (Kephart. membran sel dan membran ini sehingga strukturnya dapat dilihat dengan jelas. 2009). Detergen akan menyebabkan protein membran terdenaturasi sehingga struktur membran akan rusak. Presipitasi DNA dapat menggunakan etanol absolute atau isopropanol. Lisis sel dapat dilakukan secara kimiawi atau enzimatik tergantung sumber DNA-nya.Dalam penerapan teknik molekuler. Hipotesis Metode yang digunakan pada praktikum ini dapat digunakan untuk mengisolasi DNA Allium cepa L. lisis dinding sel dan membran sel. DNA atau RNA ini dapat diperoleh melalui proses isolasi (Pai. 1992). 1998). B. yaitu mencegah oksidasi zat fenolik yang dapat bereaksi dengan asam nukleat dan protein untuk menghilangkan polisakarida yang mengganggu dengan manipulasi enzimatik dalam penelitian biologi molekuler (Oboh. Zat kimia yang biasa digunakan adalah detergen. Ekstraksi biasanya dengan menggunakan fenol-klorofom-isoamil alkohol atau ammonium asetat yang akan mengendapkan protein. Protokol ekstraksi DNA genom juga harus memenuhi syarat. Isolasi DNA adalah pemisahan molekul DNA dari molekul lain seperti dinding sel. karena bersifat sangat polar dan dapat menarik molekul air dari DNA sehingga DNA mengendap (Schleic. 4 . purifikasi. bahan pokok yang harus dimiliki adah DNA atau RNA. 1999).

isoprophyl alcohol dingin. saringan. microsentrifuge. B. Bahan Umbi bawang bombay (Allium cepa L. Juice bawang Bombay kemudian disaring menggunakan saringan biasa. Supernatan yang diperoleh dari hasil sentrifugasi dipindahkan ke tube baru sebanyak 400µL. pellet dicuci dengan menambahkan 100µL alkohol 70% dan diresuspensi menggunakan sentrifuge dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit. larutan buffer (dibuat dari campuran akuades steril. lalu diamati benang-benang DNA yang mulai terpisah. gelas beker. Selanjutnya pellet diberi 50 µL pelarut DNA (tris EDTA). Filtrat yang diperoleh dimasukkan ke tube plastik sebanyak 400µL. blender. lalu disimpan dalam freezer. Larutan alkohol kemudian dibuang. NaCl. Cara Kerja Sel-sel umbi bawang bombay dihancurkan menggunakan blender. tip. Tube digoyang-goyangkan dengan cepat dan searah selama 3 menit untuk mencampur filtrat dan buffer. buffer TE (tris EDTA). Kemudian sebanyak 800µL isoprophyl alcohol dingin dimasukkan secara perlahan melalui dinding tabung. Tube digoyangkan perlahan. Supernatan dibuang. Kemudian ditambahkan larutan buffer sebanyak 800µL. corong gelas. dilanjutkan penyaringan menggunakan kertas filter. pellet dikeringanginkan untuk menghilangkan sisa alkohol (bias juga dengan diserap menggunakan tisu). 5 . Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit untuk presipitasi DNA. Alat Tube plastik. dan detergen 10%). mikropipet.). NaHCO3. C. alkohol 70%.BAB III METODOLOGI A. Selanjutnya campuran disentrifugasi menggunakan microsentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. kertas filter.

memiliki kandungan air yang tinggi dan memiliki kromosom yang relatif besar. Umbi bawang Bombay mudah didapat. Presipitat DNA Allium cepa L. Kemungkinan tidak hanya terdiri atas DNA tetapi juga terdapat RNA. 6 . Pada teknik isolasi DNA sederhana.BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Kemudian ekstrak sel dipurifikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung DNA total. Penggunaan umbi dalam praktikum ini didasarkan bahwa pada umbi kromosomnya lebih lengkap. Hasil Gambar 1. Prinsip dasar isolasi total DNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan dan DNA. Pembahasan Tujuan dari praktikum ini adalah untuk melakukan isolasi DNA dari umbi bawang Bombay (Allium cepa L. hasil isolasi (pellet putih di dasar tube) B. purifikasi yang dilakukan hanya memisahkan benang DNA dengan debris selnya.) dan melihat benang DNA yang diperoleh. melainkan DNA kotor yang masih berikatan dengan protein. Dalam teknik isolasi ini tidak diperoleh DNA murni.

10gr NaHCO3. Ini bertujuan untuk memisahkan DNA genom yang terlarut dalam sari umbi dengan sisa-sisa jaringan umbi yang telah hancur. yang terdiri atas 3gr NaCl. kemudian ditambahkan isoprophyl alcohol dingin. Beberapa saat setelah penambahan isoprophyl alcohol. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi pada kecepatan rendah (3000 rpm) selama 15 menit.. ke tube yang berisi filtrat umbi. Lapisan pertama yang tampak bening merupakan isoprophyl alcohol. Kemudian juice yang dihasilkan disaring dua kali. yaitu fase terlarut dan fase organik. Tube berisi campuran filtrat dan buffer digoyang-goyangkan dengan cepat dan searah selama 3 menit agar larutan menjadi homogen. Menurut Seidman dan Moore (2000). Supernatant yang diperoleh dipindahkan ke tube yang lain. sehingga komponen DNA dalam sitoplasma sel dapat keluar dan diisolasi (DeBoer et al. digunakan untuk merusak membran sel. Garam dalam buffer berfungsi untuk memisahkan molekul DNA dari komponen lainnya dengan membentuk ikatan ionik dengan asam nukleat (kondisi ionik yang lebih stabil). fase organik (pellet) yang terbentuk pada bagian dasar tabung merupakan molekul-molekul protein dan polisakarida yang terdenaturasi. akan tampak 3 lapisan pada tube. Deterjen dapat berasosiasi dengan protein membran sehingga akan melarutkan protein tersebut sehingga membran sel akan dengan mudah dilisiskan (Sambrook dan Russel. Faatih. menggunakan saringan biasa dan kertas filter. dan akuades. 2000. Proses dilanjutkan dengan penambahan larutan buffer. 2001). Penambahan ke dalam supernatant harus dilakukan perlahan-lahan dan melalui dinding sel agar tidak merusak benang-benang DNA.Proses isolasi diawali dengan penghancuran sel yang dilakukan secara mekanis menggunakan blender. 10ml detergen 10%. 2009). Fase terlarut (supernatant) mengandung DNA genom karena memiliki berat molekul lebih ringan dibandingkan fase organiknya. Sentrifugasi ini dimaksudkan untuk memisahkan campuran menjadi dua fase. Larutan buffer merupakan larutan campuran garam dan detergen. lapisan kedua yang tampak seperti 7 .

Fungsi penambahan pelarut organik seperti etanol atau isopropanol adalah menurunkan konstanta dielektrik air atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi. Di dalam air. 8 .benang DNA (B) berwarna putih diantara isopropanol (A) dan supernatant (C) Penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA.kumpulan benang putih merupakan benang-benang DNA. tampak benang. Presipitasi DNA setelah pemberian isoprophyl alcohol (isopropanol). gaya elektrostatik antara ion positif (Na+) dan negatif (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air. ion-ion seperti Na+ Mg2+ akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. sedangkan lapisan paling bawah merupakan sisa supernatant DNA (Gambar 2) A B C Gambar 2.

Pellet harus terbebas dari alkohol karena dapat merusak pellet DNA. Alkohol yang digunakan untuk mencuci DNA dibuang kemudian pellet dikeringanginkan untuk menghilangkan sisa alkohol. Aktivitas pelarut terhadap DNA Selanjutnya dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit untuk mengendapkan molekul DNA. 9 . Dengan penambahan TE ini.Pelarut Isopropanol Gambar 3. Setelah sentrifugasi. Kemudian ditambahkan buffer TE (Tris EDTA) yang berfungsi melarutkan DNA dan melindungi dari kerusakan oleh endonuklease. DNA mengendap sebagai pellet berwarna putih di dasar tube. sedangkan EDTA mampu menghambat aktivitas endonuklease (Seidman dan Moore. DNA dapat disimpan dalam waktu yang lama sebelum digunakan untuk analisis selanjutnya karena senyawa Tris dapat mempertahankan pH. Setelah dicuci DNA tampak seperti endapan tepung putih. Pellet kemudian dicuci menggunakan alkohol 70% dan diresuspensi dengan sentrifugasi 10000 rpm selama 5 menit. 2000).

juga kemungkinan terdapat pula RNA. 3. Tahapan isolasi DNA dengan cara sederhana meliputi penghancuran jaringan dan lisis sel. 10 . Hasil isolasi DNA tampak benang-benang berwarna putih. 2.BAB V KESIMPULAN 1. Namun. Dari praktikum yang dilakukan diketahui bahwa metode ini dapat digunakan untuk mengisolasi DNA genom Allium cepa L. DNA yang diperoleh dari metode ini berupa DNA kotor yang masih berikatan dengan protein. Setelah dilakukan presipitasi dan sentrifugasi DNA tampak sebagai endapan putih di dasar tube. purifikasi dari debris sel dan presipitasi DNA.

. J. Oboh. dan C. T. 1998. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.Q. Jakarta: FMIPA UI Sambrook. L.catappa) Plant Populations. (Proteaceae). M.W. Russel. R. Transmission of Human Disease and Computer Resources for The Clinical and Molecular Geneticist (transl. 2008. 1997. London: John Hopkins University press. R. Basic Laboratory Method for Biotechnology. R.J. New York: CSHL press Schleic.Ogunkanmi.C. International journal of Botany 5(3):250-254 Pai. M.Hedrick. DNA Recombination and Genetic Techniques. 2008. A. 2004.Agwu. Analisis Insersi T-DNA Pembawa Transposon pada T0 dan Aktivitas Ds pada T1 Tanaman Padi (Oryza sativa L. 2001. R.Indonesian). Rapid Isolation of Genome DNA suitable for PCR from Tropical Almond (T. Biologi Molekuler. 2000. 1999. 2009. Isolation and Restriction Endonuclease Digestion of Onion in Junior College-High School Biology Laboratory.B. Genetics and Molecular Biology. dan P.. Rapid Isolation of Genomic DNA from Small Quantities of Human Tissue.L.promega.W. Optimalisasi ekstraksi DNA dan PCR-RAPD pada Grevillea sp. Bioscience 26 (3): 15-17 Faatih. 3rd ed. 2000. 3rd ed. Brown. D. D. Genetics.J.F. Agric.A. 2009. Sobieski. Jakarta: Erlangga. 1992.com/profiles/203/ProfilsinDNA Lyrawati. Jakarta: Erlangga 11 .. Jurnal Biologi 8 (1): 12-16 Ramelia. Chicago: Wm. Publishers.DAFTAR PUSTAKA DeBoer. www. Isolasi dan digesti DNA kromosom. Yuwono. Unibraw Publ. Jurnal Penelitian Sains & Teknologi 10 (1): 61-67 Kephart. Fac. London: Prentice Hall Weaver.C.A.S.3rd ed. Indonesia (ISBN 979508-543-3). Pharmawati..) Kultivar Nipponbare. Dasar – Dasar Genetika. Seidman. S.dan D. M. and Crupper. L. 2009. N.Moore.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful