II 1.

2 Imunositokimia Semua kelas lekosit manusia menunjukkan antigen khusus ( CD 45 ) yang dapat dideteksi menggunakan antibodi monoklonal yang sesuai ( Mab; lihat Gambar 2.2 ). Dengan mengubah sifat antibodi pertama, tatacara umum ini dapat diadaptasi untuk mengetahui jenis jenis lekosit lainnya seperti makrofag, neutrofil, sel B atau sel T. ///. 2.1 (I) Reagensia Dapar fosfat salin Dulbecco ( Dulbecco's Phosphate buffered saline/ PBS ). Unsur unsur larutan dapar fosfat salin : CaCI2 2H2O KCI KH2PO4 MgCI 2.6H2O NaCI Na2HPO 4 Bubuhkan air sampai 1 liter (2) Dapar salin Tris (Tris Buffered Saline/TBS: larutan induk 10 x disiapkan dan diencerkan 1 : 10 segera sebelum pemakaian). Unsur-unsur larut an dapar salin Tris 10 x : BasaTrizma NaCI Bubuh kan air, atur pH 8,6 dengan 1 air sampai 1 lite
M

0.132g 0,2 0,2 0,1 8,0 g g g g

1.15 g

60,55 g 85,2 g HCI (mol/1) Bubuhkan

(3) Substrat fosfatase lindi disiapkan seperti yang diuraikan di bawah dan disaring. Unsur-unsur substrat fosfatase lindi: Naphthol AS-MX fosfat Dimelilformamid 0,1 M daparTris (0,1 mol/1) pH 8,2" 1 M Levamisol (I mol/1) 2 mg

0,2 ml 9,7 ml 0,1 ml

Garam Fast RedTR, dibubuhkan tepat sebelum pemakaian 10 mg

-

1,21 g basa Trizma dilarutkan dalam air, pH diatur 8,2 dengan 1M HC1, bubuhkan air sampai 100 ml. Antibodi pertama, antibodi monoklonal lawan antigen lekosit umum, berkode CD45 dan tersedia secara luas dan komersial. Antibodi kedua, Immunoglobulin anti-tikus (anti-mouse) diperoleh dari kelinci. Pengenceran yang dipakai akan tergantung dari titer antibodi dan sumber (contoh DAKO). pengenceran 1:25 antibodi Z259 buatan

(4)

(5)

(6)

Fosfatase lindi: kompleks fosfatase anti-lindi (anti-alkaline phos phatase complex (APAAP)). Kembali pengenceran akan tergantung pada titer antibodi dan sumber (contoh pengenceran 1:50 kompleks D651 produksi DAKO).

III. 2.2.

Penyiapan sel Tata cara

(i) Aliquot semen yang sudah mencair (mendekati 0,5 ml) dicampur dengan 5 volume dapar salin fosfat (PBS) dan disentrifugasi pada kecepatan 500 g selama 5 menit pada suhu ruang. Tata cara ini diulangi sebanyak 2 x dan pellet sel diresuspensi dalam PBS ke volume semula dari siapan semen. Suspensi tersebut kemudian dilarutkan dengan volume PBS 2-5 x tergantung dari jumlah sperma. Dua 5 ml aliquot sel ini selanjutnya dikeringkan di udara di atas kaca obyek bersih, difiksasi dan dipulas dengan segera atau dibungkus dalam kertas alumin dan disimpan pada suhu -70C untuk analisis berikutnya. (ii) Sel-sel yang kering di udara difiksasi dalam aseton jenuh selama 10 menit atau dalam campuran aseton, metanol dan 400 g/l formaldehid (dalam perbandingan volumetrik 95 : 95 : 10) selama 90 detik, dicuci 2 x dengan dapar salin Tris (TBS;

lihat III 2.1.), dan dibiarkan kering.

(iii) Masing-masing aliquot sel-sel yaaig difiksasi ditutup dengan 10 l Mab pertama dan dieram dalam kamar yang Iembab selama 30 menit, pada suhu kamar. Kaca obyek selanjutnya dicuci sebanyak 2 x dengan TBS dan dibiarkan kering. (iv) Sel-sel ditutup dengan 10 l antibodi kedua, dieram selama 30 menit dalam kamar Iembab pada suhu kamar, dicuci 2 x dengan TBS dan dikeringkan. (v) Untuk masing-masing siapan ditambahkan 10 l fosfatase lindi: kompleks fosfatase anti-lindi (anti-alkaline phosphatase complex) (APAAP) dan siapan dieram selama 1 jam dalam kamar Iembab pada suhu kamar sebelum dicuci sebanyak 2 x dalam TBS dan dikeringkan. (vi) Untuk memperkuat hasil reaksi, pemulasan dengan antibodi kedua dan APAAP dapat diulang, dengan waktu eram 15 menit untuk masing-masing reagensia. (vii) Sel-sel dicuci sebanyak 2 x dengan TBS, dikeringkan, dan dieram dengan 10 l substrat fosfatase lindi selama 18 menit. (viii) Sesudah reaksi warna fosfatase lindi selesai, kaca obyek dicuci dengan TBS (Tris buffered saline) dan akhirnya dipulas untuk beberapa dctik dengan hematoksilin sebelum dicuci dalam air mengalir dan ditutup dengan medium penutup cair Apathy.

Lampiran IV Teknik pulasan vitalitas sperma I V.I Many a Eosin Eosin Y; Buat larutan 0,5%(5 g/l) Eosin Y (C.1.45380) dalam larutan NaCl cair 0,9% (9 g/I), larutan pemulas baku dapat dibeli dari sejumlah perusahaan di beberapa negara. IV. 1.2 Tatacara (i) Campurkan salu tetes (10- 15 l) semen segar dengan satu tetes larutan Eosin 0,5% (5 g/I) pada kaca obyek kemudian tutup dengan kaca tutup. (ii) Setelah 1 - 2 menit amati siapan melalui mikroskop biasa atau beda-fase dengan pembesaran 400 x. (iii) Cacah sperma yang tidak terwarnai (hidup) dan yang terwarnai (mati) sesuai dcngan cara yang telah diuraikan. IV.2 Eosin-nigrosin (modifikasi icknik Blom) IV.2.1 Reagensia
(1) (2)

IV. 1.1 Reagcusia

Eosin Y (C.I. 45380, 10 g/1. yailu 1% dalam akuades). Nigrosin (C.I. 50420, 100 g/1, yaitu 10% dalam akuades). Campurkan satu tetes semen dengan dua tetes 1% (10 g/1) Eosin Y. Setelah 30 detik bubuhkan 3 tetes dari 10% (100 g/1) larutan nigrosin pada campuran (i) kemudian aduk.

IV. 2.2 Tatacara

(i) (ii)

(iii) Letakkan satu tetes campuran semen-Eosin-Nigrosin pada kaca obyek dan buatlah apusan yang kemudian dikeringkan, apusan tidak boleh terlalu tebal.

Lampiran V Pemeriksaan morfologi sperma : preparat basah Untuk melakukan pencacahan beda morfologi sperma dari siapan basah, adalah perlu melekatkan sperma pada kaca obyek. Metode yang lazim untuk melakukan hal ini adalah membuat apusan sperma di atas kaca obyek, biarkan kering, dan kemudian difiksasi dengan etanol (lihat lamp.VII.1). Tatacara ini dapat mcnyebabkan artefak morfologi akibat kerusakan osmotik sel-sel tersebut dan ekstrasi komponen oleh etanol. Pendekatan yang sering digunakan untuk mengurangi artefak yaitu dengan merendam sel-sel tersebut dalam larutan isoosmotik (atau memflksasi secara ringan sel-sel tersebut dengan fiksatifaldehid) dan lekatkan sel-sel tersebut pada kaca obyek berlapisan poli-satu-lisin, dengan membiarkan sel-sel terlepas dari larutan tanpa pengeringan yaitu inembentuk preparat basah. Protokol khusus adalah scbagai berikut. V.I (1) Reagensia Dapar Salin fosfat (PBS). PBS terdiri dari 0,8 g NaH,PO4.H2O, 3,8 g Na2HPO4,7H2O dan 16 g NaCl, bubuhkan akuades sampai 2000 ml. (2) Kaca obyek berlapiskan poly-1-lysine. Kaca obyek berlapiskan poly-1 -lysine dibuat dari larutan poly-1 -lisin* dalam dapar salin fosfat dengan meletakkan 1 0 - 2 0 l larutan di bagian tengah lingkaran kecil yang digambar dengan pensil batu intan di atas kaca obyek. Kaca obyek dikeringkan dan dapat disimpan dalam lemari pendingin kurang lebih seminggu.

V.2

Tatacara (i) Encerkan semen sampai 1 x 10 sel/ml dalam larutan pengencer sperma (lihat bagian 2.5.2) atau dalam PBS. (ii) Letakkan kaca obyek berlapiskan poli-1-lisin dalam ruang lembab (contoh : kotak kaca obyek dengan handuk tangan basah). Taruh 10 l semen yang diencerkan dalam lingkaran kecil di atas kaca obyek dan titutup ruang tersebut. (iii) Biarkan sperma mantap dalam larutan dan terikat dengan kaca obyek. Waktu yang diperlukan untuk sel-sel melekat mantap ditentukan secara empiris untuk pertama kali tata cara ini digunakan, tetapi dengan volume sebesar 10 ml, 10 menit sudah cukup. (iv) Setelah sperma mantap ditutup langsung dengan kaca tutup. Sperma tersebut sekarang dapat dilihat dengan mikroskop beda fase. Dibawah kondisi ini sperma tidak akan mengalami kejutan osmotik dan morfologi akan bebas dari artefak akibat persiapan.

Lampiran VI Pulasan Giemsa untuk sperma dan inti sel lain I V.I Reagensia (1)Dapar fosfat 0,066 m (mol/l; pH 6,9): 320 ml KH2PO, 9,1 g/I. 400 ml Na2HPO4, 11,9 g/I. Atur pH dengan NaOH kemudian bubuhkan akuades sampai volume mencapai 1 liter. (2)Larutan Giemsa (harus dibuat setiap kali sebelum dipakai). 7 ml Romanovski-Giemsa. 160 ml dapar fosfat. IV .2 Tatacara (i) (ii) Fiksasikan apusan yang telah kering di udara dengan metanol untuk waktu sedikitnya 5 menit. Keringkan pada suhu kamar. (iii) Pulas dalam pulasan Giemsa selama 30 menit. (iv) Bilas dengan dapar fosfat. (v) Keringkan pada suhu kamar.
t

Lampiran VII Tatacara pulasan papanicolaou yang dimodifikasi untuk sperma Pulasan Papanicolaou dapat membedakan dengan jelas komponen sel yang basofil dan yang asidofil sehingga memungkinkan suatu pemeriksaan yang terperinci terhadap pola kromatin inti. Oleh karena itu metode ini telah lazim digunakan untuk sitologi diagnostik yang rutin. Namun pulasan Papanicolaou baku yang biasa digunakan untuk sitologi vagina memberi hasil yang buruk jika dipakai untuk sperma. Teknik pemulasan inodifikasi yang akan diuraikan ini telah terbukti berguna dalam analisis morfologi sperma dan pemeriksaan sel-sel benih muda. VII.1 Pcmbuatan Siapan . J Apusan harus dikeringkan di udara kemudian di fiksasi dengan Iarutan etanol 95% (950 ml/I) dan eter dalam jumlah yang sama selama 5-15 menit. VII.2 Tatacara pemulasan Apusan yang telah difiksasi dipulas sesuai dengan tatacara di bawah ini : Etanol 80%'(800 ml/I) Etanol 70% (700 ml/1) Etanol 50% (500 mi/I) Akuades Hematoksilin Mayer atau Harris Air mengalir Asam etanol Air mengalir Lanitan scotf Akuades Etanol 50% Etanol 70% 10 celupan 10 celupan 10 celupan 10 celupan 3 menit tepat 3 - 5 menit 2 celupan 3 - 5 menit 4 menit 1 celupan 10 celupan 10 celupan

Etanol 80% Etanol 90% Orange G6 Etanol 95% Etanol 95% EA-50' Etanol 95% Etanol 95% Etanol 95% Etanol 99,5% Silol (3 wadah pemulasan) kira-kira Depex atau medium scnipa.

lOcelupan 10 celupan 2 menit 10 celupan l0 celupan 5 menit 5 celupan 5 celupan 5 celupan 2 menit 1 menit dalam tiap bak

Ganti silol jika rupanya berubah seperti susu. Tutup siapan dengan Periksa keasaman ai r sebelum inembuat berbagai larutan etanol. pH harus 7,0

Satu celupan kira-kira sama dengan satu detik. Larutan scott (lihat bagian VII.3.4) digunakan jika air ledeng terlalu 'keras'. Pulasan dan larutan: Pulasan jadi Papanicolaou (EA-50 dan Orange G6) dapat dibeli. Penisaliaan yang sama biasanya juga membuat siapan hematoksilin.

VII.3

Pembuatan pulasan Pulasan jadi yang dapat dibeli biasanya cukup baik tetapi pulasan dapat juga dibuat di laboratorium. dengan ongkos yang jauh lebih murah, sebagai berikut:

VII. 3.1

Susunan EA-36 sama dengan EA -50: EosinY (C.I. 45380) Bismarck Coklat Y (C.I. 21000) Akuades Etanol 95% Asarn fosfotungstat 10 g 10 g 10 g 300 ml 2000 ml 4g

SF Hijau muda, kekuning-kuningan (C.I. 42095)

Larutan litium karbonat jenuh (dalam akuades)0,5 ml

VII. 3.1.1 Tatacara

Larutan induk: (i) Buat larutan 10% (100 ml/1) dari tiap pulasan sebagai berikut: 10 g Eosin Y dalam 100 ml akuades. 10 g Bismarck coklat Y dalam 100 ml akuades. 10 g SF hijau muda dalam 100 ml akuades.
(ii)

Untuk membuat 2000 ml pulasan, campuran induk di atas sebagai berikut: 50 ml Eosin Y, 10 ml Bismarck Coklat Y 12,5 ml Hijau Muda SF.

(iii)Tambahkan etanol 95% sampai 2000 ml; bubuhkan 4 g asam fosfotungstat dan 0,5 ml larutan litium karbonat jenuh. (iv) Aduk yang baik dan simpan dalam botol berwarna coklat tua yang tertutup rapat pada suhu kamar. Larutan tersebut stabil untuk 2 - 3 bulan. Sebelum dipakai larutan harus disaring terlebih dahulu.

VII. 3.2

Susunan Orange G6 Kristal Orange G (C.I. 16230) 10 g Akuadcs 100 ml Etanol 95% 100 ml Asam fosfotungstat 0,15 g

VII. 3.2.1 Tatacara Larutan induk no. I Buat larutan cair 10% (100 ml/1) sebagai berikut: (i)
(ii)

Masukkan 10 g kristal Orange G kc dalam 100 ml akuadcs. Kocok yang baik kemudian simpan dalam botol berwama coklat tua pada suhu kamar selama satu minggu sebelum dipakai.

Larutan induk no. 2 (larutan Orange G6 0,5% (5 ml/I)). Pembuatannya sebagai berikut: (i) (ii) 50 ml lamtan induk no. 1 dibubuhkan etanol 95% sampai 1000 ml. Untuk pembuatan 1000 ml lamtan kcrja dari pulasan:
(i)

Bubuhkan 0,15 gram asam fosfotungstat pada 1000 ml lamtan induk no. 2. Aduk yang baik dan simpan dalam botol berwarna coklat tua bertutup pada suhu kamar.

(ii)

(iii) Saring sebelum digunakan. Larutan kerja stabil untuk 2 - 3 bulan. VII. 3.3 Susunan heniatoksilin Harris tanpa asam asetat (kristal gelap: C.1.75290) 12H2O 8 80 160 1600 6 g ml g ml G

Hematoksilin Etanol 95% AlNH4(S04)2 Akuades HgO

VII. 3.3.1
(i)

Tatacara pembuatan campuran pemulas Larutkan alumunium sulfat dalam akuades dengan pemanasan. kristal hematoksilin dalam etanol 95% (950 ml/1), Bubuhkan larutan hematoksilin ke larutan amonium sulfat. Angkat larutan dari pemanas dan sambil mengaduk bubuhkan oksida

(ii) Larutkan (iii)

(iv) Panaskan campuran sampai 95 C. (v) merkuri secara perlahan-lahan. Warna lanitan akan menjadi ungu tua. (vi) Masukkanlah segera wadah itu ke dalam bak air dingin kemudian saring lanitan tersebut setclah dingin. (vii) Simpan dalam botol berwania coklat tua pada sulu kamar selama 48 jam. (viii) Encerkan sejumlah yang diperlukan dengan sejumlah akuades yang sama dan saring kembali. VII. 3.4 Susunan lanitan Scott NaHCO3 MgSO4.7H2O Akuades 3.5 g 20,0 g 1000 ml

Larutan scott hanya dipakai jika air Iedeng biasa 'keras'. Larutan scott harus sering diganti, yaitu setelah dipakai untuk membilas 20 - 25 siapan. VII. 3.5 Susunan larutan etanol asam Etanol 99.5% HCI pekat Akuades 300 ml 2.0 ml 100 ml

LAMPIRAN VIII Pulasan Bryan-Leishman untuk apusan morfologi sperma Catalan: Pakailah apusan baru yang dibuat dari siapan segar, dikeringkan di udara di atas kaca obyek yang bersih. Alkohol formalin 10% (100 ml/I) 1 menit Buat baru scliap kali Etilalkohol 80% (800 ml'!) 5 menit Buat baru sctelah 3 kali pemakaian Etilalkohol 70% (700 mi l ) 5 menit Buat baru sctclah 3 kali pemakaian Etilalkohol 50% (500 mi l ) 5 menit Buat baru sctclah 3 kali pemakaian Alfa-naflol 4 menit Buat baru sctclah 3 liari (Bubuhkan 0,4 ml hidrogen pcroksida 3% (30 ml/I) kepada 200 ml alfa-naflol sesaat sebelum pemakaian: larutan itu akan aktifsclama 3 hari pada suhu kamar).

Air Icdeng mcngalir I'ironin Y Air Icdeng mcngalir Dapar natrium siiral Akuadcs pulasan Pryan dimodillkasi

5 menit 4 menit 3 cclup 3 menit

Alirkan lambat-lambat Buat baru sctiap minggu Alirkan lambat-lambat pH 7,5: dibuat baru setiap kali pemakaian Seliap kali baru Muat baru sctiap 2 kali pamakaian Alirkan lambat-lambat Alirkan lambat-lanihat Dtbuat baru sctiap kali pemakaian

I menit yang 15 menit

Asam asctat glasial l 2 celup %(10m!'l) Air Icdeng mcngalir I menit Dapar dan pulasan 30 menit

leishman (Saring 80 ml larulan induk Leishman. biihuhkan 100 ml dapar (pl( 6.8). kemudian saring kcmbali scsaat scbclum dipakai). Air Iedeng mengalir Keringkan diudara (jangan gunakan kcrtas saring untuk nicngeringkan) l- 2celup Alirkan lambat-lambat

Ganti setelah dipakai 30 siapan. jika anda memakai gelas pulas yang diisi dengan 30 pulasan. Setiap celup lamanya kira-kira 1 dctik.

VIII.I

Perhatian khusus sebelum dipakai. Selain itu dapar dan larutan kerja Leishman harus disaring setiap kali akan dipakai untuk menyingkirkan endapan pulasan.

(1) Pironin Y, pulasan Bryan dan Leishman yang telah modifikasi harus disaring

(2)

intensitas warna akhir dapat diperkuat dengan cara memulas lebih lama di dalam pulasan Leishman dalam dapar atau dikurangi dengan cara mencuci berulang kali. Periksalah intensitas yang diinginkan dengan mikroskop sebelum siapan ditutup.

(3)

Hidrogen peroksida cepat rusak di tempat terang, oleh karena itu larutan induk harus disimpan di dalam botol berwarna coklat tua dan di tempat yang gelap.

(4)

Larutan induk pulasan Leishman harus dimatangkan sebelum dipakai dengan cara menyimpannya selama 7 hari pada suhu kamar dilanjutkan dengan mengeramnya pada suhu 25 - 37 C di tempat gelap selama dua hari. Larutan yang telah matang akan stabil selama satu bulan jika disimpan di dalain wadah yang tertutup dan di ruang gelap.

VIII.2 VIII. 2.1 (i)

Pembuatan larutan: Pulasan Bryan yang dimodifikasi Campur zat berikut ini: Asani asetat glasial 1% EosinY(C. 1.45380) Naftol kuning S (C. 1.10316) 1500 ml 0,5 g 0,5 g

Hijau (fast green FCF) (C.I. 42053) 0,5 g

(iii)

Aduk yang baik kemudian simpan dalam botol yang tertutup rapat. Larutan induk pulasan darah Leishman dan 300 ml metil alkohol absolut.

(iii) Saring sebelum dipakai. VIII. 2.2 (i) (ii) (iii) Campur 0,5 g metilen biru eosin (campuran eosin Y dan metilen biru, C.I.52015) Aduk yang baik dan biarkan menjadi matang di tempat gelap pada suhu kamar selama tujuh hari. Setelah matang pulasan dieram dalam inkubator pada suhu 35-37C selama dua hari. (iv) Setelah masa tersebut, maka larutan induk siap pakai dan harus disimpan di dalam botol tertutup rapat yang berwarna gelap, serta jauhkan dari panas dan cahaya. Larutan induk pulasan darah lain yang dapat dipakai sebagai pengganti larutan Leishman ialah pulasan darah Jenner atau Wright. Larutan tersebut dapat diperoleh dari berbagai perusahaan kimia. Pemulasan dengan pulasan Jenner atau Wright dilakukan pada tahap pemulasan dengan pulasan Leishman. Waktu pemulasan harus disesuaikan untuk memperoleh hasil yang sama. Dapar

Campur 2 tablet dapar, pH 6,8 dengan 200 ml akuades. Jika tidak segera dipakai, periksalah kembali pH sebelum dipakai.

VIII. 2.3 (i) (ii)

Larutan kerja pulasan darah Leishman Campur 80 ml larutan induk yang telah disaring dengan 100 ml dapar dengan pH 6,8 segera sebelum pemakaian. Formalin alkohol: Campur 10 ml larutan fomaldehid 37% dengan 90 ml etilalkohol 95%. Jika perlu dapat dibubuhkan 0,1 g kalsium asetat setiap 200 ml larutan untuk menjamin agar pH netral (7,0).

(iii)

Alfa-naftol: Larutkan 1 g alfa-naftol dalam 100 ml etilalkohol 40%. Sesaat sebelum pemakaian bubuhkan 0,2 ml larutan hidrogen peroksida 3%.

(iv) Pyronin Y: 0,1 g pyronin (C.I. 45005), 4 ml anilin, dan 96 ml etilalkohol 40%. (v) Dapar natrium sitrat: Campur 7 g natrium silrat dengan 1 liter NaCI 0.9% kemudian atur pH sehingga menjadi 7,5.

Lampiran IX Pulasan Shorr untuk aptisan morfologi sperma. IX. I

(1)

I'enyiapan apusan Apusan dibuatdari 20 (alsiapan (50-100 x 10*spcnnatozoa/ml)diatas kaca obyek bcrsih dan biarkan mcngcring.

(2) IX.2.

Fiksasi apusan dcngan 75% ctanol (750 ml/1) untuk kira-kira 1 mcnit. Tatacara pcmulasau

Air mcngalir Hcmatoksilin Air mcngalir Amonium alkoliol Air mcngaiir 50% ml/I) Pcmulas Shorr 50% ctanol 75% ml/1) 95% ml/1) Etanol jcnuh Xylol IX.3
(1)

1 2 - 1 5 cclupan 112-15 celupan 2

J mcnit

5 tcmpat masing-masing 5 mcnit 12-15 cclupan 5 mcnit 3 - 5 mcnit 5 mcnit 5 mcnit

Etanol

(500

ctanol ctanol

(750 (950

5 mcnit 2 tcmpat masing-masing 5 mcnit 2 tempat masing-masing 5 menit.

Rcagcnsia Hematoksilin erence 9253) Papanicolaou No. 1 (Merk, Darmstadt, Germany, Ref

(2)

Amonium alkohol 95 ml etanol 75% + 5 ml amonium hidroksid 25% (250 ml/1) Larutan Shoor (Merk, Reference 9275) atau bubuk BDH Shorr 4 gr, 220 ml Etanol 50%, 2,0 ml Asam asetat glasial Larulkan bubuk dalam alkohol hangat dan biarkan rnendingiii Bubuhkan dengan asam asetat di dalam kap penguapan dan saring.

(3)

63

66 XI. 1
(1)

Lampiran XI Uji Butir intuna Rcagcnsia Butir Imun: Bulir imun anti-IgG, anti-IgA dan anti-IgM dapat diperolch dari Bio-Rad Laboratories (Bio Rad Chemical Division. San Pablo Avenue, Richmond. CA 944806, USA) (Katolog Nos.1705100. - 5114, dan -5 120sccara bcninitan). Untuk tiijuan penapisan, butir-butir koinbinasi ant i-Ig (170 - 5106), yang akan mengidentifikasi semua 'isot\pe', dapat digunakan. Masukkan butir imun kcdalam 10 ml dapar I (lihat bawali) dan simpan pada siilui + 4C. Campuran ini dapat disimpan selama satu bulan. " (2) digunakan. _, Dapar induk: Lanitan Tyrode alau PBS Dulbecco dapat 15111

Larutan Tyrodc CaCl2 X KCI NaH 2PO4 MgCl,.6H 2O NaCl NaHCO 3 Glukosa (g/1) 0.2 0.2 0.05 0.2 8.0 1,0 1.0

PBS dulbecco (g/1) CaCI, KCI KH2PO4 MgCI2.6H,O NaCI Na,HPO,.7H.,O 0,1 0.2 0,2 0.1 8.0 2,16

Larutan hams disaring dengan filter milipor (pori 22 inikroinetcr) scbelum dipakai. "Bronson, R.A.. Coopcr,O.W.& Rosenfcld. D.(1982) Detection of sperm specificanlibod-ics on the spermatozoa surface by iinmunobcad binding. Archives of'Andrology, 9:61; Bron.'ion,R.A., Cooper, O.W. & Rosenfcld,D.(1984) Sperm antibodies: their use in infertility./rer////(y and Sterility, -12:171-183;Clarke,G.N.( 1990) Detection ofantisperm

a n t i b t > d i e s u s i n g i m m u n o b e a d s . I n H a

ndbook ofthe Laboratory Diagnosis Treatment of Infertility^. B A.Keel & B.W. Webster, pp. 177 - 192, CRC. Boca Raton, Florida.

(3)

Dapar I: berisi 0,4% (4 g/1) albumin seaun bovine (BSA: Cohn fraction V); masukkan 0,4 g BSA ke da lain Iarutan dapar induk schingga volume meacapai 100 ml.

(4)

Dapar II: berisi 5% (50 g/l) BSA; masukkan 5,0 g BSA ke dalam Iarutan dapar induk sehingga volume mencapai 100 ml. Scimia lanilan hams disaring dengan filter milipor 0,22 fim atau 0,45 (im sebcliiindipakai Tatacara dapar I dalam tabling sentrifus bagian dasarnya bcrbcntuk kcrucut yang terpisah.

(5)

XI.2

(i) Untuk sctiap tipe butir iimin, masukkan 0,2 ml suspcnsi butir induk ke 10 ml (ii) Masukkan ke dalam tabling scntrifus tcrscbut jumlah semen yang dipcrkikan kemudinn bubuhkan dapar I schingga volume menjadi 10 ml. Jumlah semen yang dipcrhikan ditcntukan olch jumlah dan motilitas spemia scsuai tabcl bcrikut ini:

Jumlah (106/ml) >50 20-50 20-50 20 20

Motilitas (katcgori (a)+(b),% > 40 <40 >40 <40 "Lihat bagian 2.4.2

Semen yang dipcrhikan (ml)

N

0,2 -'

0,4 0.8 1.0 2.0

(iii)

Sctrifiigasi tabling tabling tersebut pada 500 g selamaS - 10 inenit. Resuspensi dengan hati hati pellet spenna dengan 10 ml dapar I yang barn dibuat dan sentrifugasi lagi dengan kecepatan 500 g selama 5 - 1 0 inenit.

(iv) Tabung(tabung) spenna : tuang dan buang cairan yang di atas (supernatant).

(v) Tabling (tabling) butir imun: tuang dan buang cairan yang di atas. Resuspensi dengan hati hati butir-butir tersebut dengan 0,2 ml dapar II. (vi) Tabling (tabling) spenna: tuang dan buang cairan yang di atas. Resuspensi dengan hati hati pellet spenna dengan dapar II ke volume cairan scmula. (vii) Letakkan 5 fil tetesan setiap tipe but ir imun di atas satu atau lebih kaca obyek. Bubuhkan 5 yi\ suspensi spenna yang telah dicuci pada masing-masing tetesan butir dan aduk mcrata dengan menggunakan ujung pipet atau tepi kaca tutup. Letakkan kaca tutup berukuran 20 sampai 24 nun2 pada setiap campuran dan setelah dibiarkan selama 10 menit

67

68

dalam ruangan yang lembab, amati mcnggunakan mikroskop beda-fase dcngan pcinbcsaran 400 x sampai 500 x. (viii) Skor secara tcrpisah pcrscnlase spcnna motil yang dilckati butir iinun dalajn siapan. Cacah sekiirang-kurangnya 100 spenna motil per siapan. Catat kclas (igG atau IgA) dan lctak pcrlekatan butir imun pada spenna (kcpala, bagian tcngali. ckor, atau ujung ekor). Uji dianggap posilifjika 20%alau lebih spcnna motil yang dilekati butir dan bcrmakna sccara klinis jika 50% atau lebih spenna motil disclubungi butir. Ikatan yangtcrbatas pada ujungekortidak dianggap bcrmakna sccar;i klinis. XI.3 Uji butir imun tak lan^sunj^ Modifikasi ini dipakai untuk mcndctcksi apakah ada antibodi antispcnna dalam sennn, plasma semen, atau getah servik larut dalajn brornclin. (i) seperti yang dijelaskaii dalam XI.2 langkah (ii), (iii), (iv), dan vi) di atas. (ii) Jumlah spenna yang telah dicuci kemudian disesuaikan sehingga dicapai jumlah 50 x lOVml dalam dapar II. (iii) uji dcngan 40 (j.1 dapar II dan kemudian campur dengan 50 y.] suspensi spenna yang telah dicuci. Eram pada stihu 37C sclama satu jam. (iv) seperti pada XI.2 langkah (iii), (iv) dan (vi) dan ujrtlilakukan seperti pada langkah (vii) darw(viii). XI.4 Kontrol Setiap kali me'.akukan uji hams dilakukan kontrol positif dan negatif. Kontrol positifdapat dibuat dengan memakai sennndari donor (misal, pria yang telnh vasektomi) dengan titer antibodi sperma serum yang tinggi yang ditentukan dengan uji butir imun tak langsung. Sennn ini dibuat sesuai dcngan XI.3 dan diperiksa bersamaan dengan pelaksa-naan tiap uji. Spenna kemudian dicuci dua kali lagi Enccrkan 10 jjlcairan Spenna donor nonnal dicuci qua kali dengan dapar I

Lampiran XII Uji MAR Karena aiitibodi IgA hainpir tidak pernah timbul taiipa antibodi IgG, maka sebagai metode penapisan mtin culcup untuk melakukan uji terhadap IgG saja. Pada uji MAR (Ortlio spenna MAR kit dari Fertility Technologies Inc. Natick, MA, USA), yangdilakukan sebagai berikut: 10 (j.1 semen segar tidak dicuci, 10 \i\ partikel lateks yang dilapisi IgG (dari Fertility Teclmologies Inc.) atau sel darah domba yang dilapisi IgG, dan 10 p.1 antiserum terhadap IgG manusia (dari Hoechst Behring ORCM-0/05, atau Dakopatts A089, Denmark) diletakkan di atas kaca obyek. Tetesan semen dan partikel terlapis IgG dicampur tsrlebili dahulu, dan kemudian tetes antiserum dicainpur dengan memakai suatu kaca tutup besar (40 mm x 24 mm) yang kemudian diletakkan di atas campuran. Setelah 2 sampai 3 menit dan sekali lagi setelah 10 menit siapan basah tersebut kemudian diamati dengan mikroskop biasaatau beda-fase dengan pembesaran 400 x atau 600 x. Jika tidak ada antibodi pelapis spenna, maka spenna akan terlihat berenang bebas di antara partikei-partikel, yang akan berlekatan satu sama lain dalam bentuk kelompok. suatu bukti bahwa siapan efektif. Jika ada antibodi spenna, maka partikel lateks akan tampak melekat pada spenna motil. Pada pemuilaan sperraa motil akan tampak berenang dengan dilekati sedikit atau segumpal partikel. Akhiniya gumpalan partikel akan menjadi sedemikian besarnya sehingga spenna yang dilekati partikel partikel hanya dapat bergerak di tempat saja. Paling sedikit 100 spenna motil yang dicacah. Persentase spenna motil yang dilekati partikel dihitung. 69

70 XIII.

Lampiran XIII Pengukuran seng dalam plasma semen Latar bclakang Assay kolorimctrik mi icl;ih dikcmbangkan imtuk pcncntuan scng dalam scnun, plasma, cairan otak dan urin. Barn-barn ini. uilai kadar scng yang dipcrolch dcngan cara ini dan yang dipcrolch dengan cara spcklroskopi absorbsi atom mciuinjukkan ada suatu korclasi yang baik antara cara ini dan cara spcklroskopi absorbsi atom, scliingga cara ini dapat dianjurkan iintiik digunakan di laboratorinin yang tidak mcmpunyai pcralatan spcktroskopi absorbsi atom." XIII.2 .Stabilitas rcagcnsiu Pada suhu di bawah 25"C kit reagcnsia stabil imtuk bcberapa taluin {kit dapat dibcli dari: WakoPurc Clicinical Industries Ltd.). XIII.3 I'cmbuatan dan stabilitas larutan kromogen Campurreagcn wania A dan wania B dcngan pcrbandingan 4: I (yaitu 20 ml reagen wania A dan 5 ml reagen wania B). Lanitan kromogen ini jikan stabil untuk sntu minggu pada sului 2 - 10"C atau dua hari pada suhu kamar. XIII.4 I'cmbuatan siapan Siaprn semen discntrifugasi sclama 20 menit pada 2000 g. Plasma semen kemudian dituang ke tempat lain dan diencerkan 1 : 200 (yaitu 10 (j.1 plasma semen dibubuhkan kepada 1,99 ml akuades). Campuran tcrsebut hams disimpan dalam Icmari pembeku (freezer) sampai saat akan dilakukan analisis. Catatan: Langkah pengendapan protein dcngan asam triklor asetat (TCA) tidak perlu karcna plasma semen tclali diencerkan banyak sckali sebelum reagen wania dibubuhkan. " Johnson. <(>. <fc Eliassnn. R (1987) Evaluation of a commercially available kit for the colonmclric determination of zinc in human seminal plasma. International Journal of Andralngy. KM35-440.

XIII.S

Seng baku Seng baku disediakan oleh penisahaan pembuat kit sebagai Ianitan yang mengandung seng 30,6 mikromol/1.

XIII.6

Tatacara assay Panjang gelombang Kuvet Suhu pengeraman 560 urn Tapak jalan caluiya 1 cm 20-25<>c

(1)

Isi ke dalam tiga tabling reaksi masing-masing 0,5 ml air (sebagai blangko), 0,5 ml lanitan baku, dan 0,5 ml plasma semen yang telah diencerkan.

(2)
(3)

Bubiihkan 2,5 ml lanitan kcrja kromogen ke dalam tiap tabling. Campiiryangrata, kcmudian biarkan lanitan pada suhu kainarselama 5 menit. Ukur absorbansi dalam waktu satu jam pada 560 nm dcngan menggimakau nilai lanitan blangko sebagai acuan. Hubungan antara absorbansi {A) dan kadar seng dalam plasma semen akan menipakan garis liuiis sampai sedikitnya 7 mM (mmol/l). t XH1.7

Pcrhitungan Kadar seng dalam plasma semen dihitung berdasarkan nimus: A siapan Kadar seng (mmol/l) = ~~ A baku dimana 30,6 adalah kadar seng baku faktor pengenceran plasma semen. XIII.8 71 Nilai normal 2,4 (iinol atau lebih setiap ejakulat. X 30,6 x 200 ----1000 dalam mikromol/1 dan 200 adalah

Lampiran XIV Penentuan asani sitrat dalant plasma semen XI V.I XIV I.1 (1)
(2)

Roacnsia Boehritiger Kit No. U9706 (metnch ultraviolet) Satu kit cukup untuk 30 pcmcriksaan. Kit bcrisi: Botol 1 (scbagiajibcsarNADH):Bi:atlanitan 1 dcngan nieinbiibiihkan 12 ml akuadcs; simpan pada suhu - 20 C (stabi! selama 4 minggii). Botol 2 (liase sitrat): Buat larutan 2 dcngan nicmbtibuhkan 0,3 ml akuadcs; simpan pada suhu - 20" C (stabiI sclama 4 minggu). i XIV. 1.2

DaparTRA(pH7J) (i) Larutkan 14,9 g tri-ctanolamin dalam 750 ml akuadcs. AturpH scliingga menjadi 7,6 dcngan cara mcmbubuhkan HCI pckat (ii) Lanilkan 0,027 gZnCI2 dalam 250 ml akuadcs. Paslikan balnva sclunih ZnCI, tclali lanit. (iii) ZP.CI2 kcpada lanitan tri-ctanolamin. (iv) XIV.2 Tatacara Sentrifugasi ejakulat pada 3000 g sclama 15 mcnit atau pada 2000 g sclama 20 mcnit. XIV.2.2 Ekstraksi (i) BubulikanO.l ml plasma semen ke dalam 4,95 ml asam triklorastctat (TCA) 15%(150ml/L). (ii) ml 6M NaOH. pH hams lcbili besar dari 7, jika perlu bubuhkan NaOH agar menjadi lebih lindi. Ekstrak hams tampak jeniih. Bubuhkan 0,75 XIV. 2.1 Persiapan plasma semen Bubuhkan lanitan Bubuhkan 0,5 g natrium azida.

XIV. 2.3 Pengukuran (i) Bubuhkan stiatu kuvet pengukur dengan: 0,5 ml lanitnn 1 2,3 ml dapar TRA 0,2 ekstrak plasma semen (ii) Campurdan ukur absorbansi pada 340 nm. Absorbansi Bubuhkan 20 y.\ lanitan 2. (iv) Campur dan Ukur absorbansi. Absorbansi Ar Ar (iii) XIV.3

73

tunggu tcpat 5 menit. (v) Pcrhitungan

Kadarasain sitrnt dalam mM (mmol/1) =-----------------------------x Pcngenceran ekstrak Koefisien (A, - A,) 6,3 = 04,-^x139 t XIV.4 Nilai Normal 52 timol atau lebih setiap ejakulat. extinction' x 3,02 m l 0.2 m l Pcngcnccran absorbansi =______'_ x 58 x _______

74 XV.I. (1)

Lampiran XV Pengukuran asamfosfatase dalam plasma semena Regcnsia Daparsitrat, 0,09 m (mol/l) dcngan pH 4,8. Larutkan 1,73 g asam sitrat bcbas air dalam akuadcs, atur pH sampai4,8dengan 1 mNaOHdanbubuhkanairsainpai lOOmlsimpan pada suhu 4 C. (2) (3) 0,1 M NaOH. Larutan (substrat)/?-nitrofcnol fosfat. Dibuat setiap hari. Hitting volume substrat yang dipcrlukan dan larutkan jumlah garain disodium/>-nitrofenol fosfat yang dibutuhkan dalam dapar sitrat sampai kadar 4 ing/ml (100 f.il substrat per pengukuran. contoh 8 mg dalam 2 ml lanitan untuk pengukuran duplikat dari 8 siapan dan satu blangko) atau gunakan tablet Sigma 5 mg jika penimbang jumlah kecil substrat yang akurat tidak ada.
(4)

/7-Nitrofcnol (PNP), 5 mm (mmol/1). larutan induk untuk kurva baku. Larutkan 0.0695 g PNP dalam akuadcs. panaskan lanitan jika pcrlu, dan jadikan 100 ml dalam labu ukur simpan pada suhu 4 C.

(5)

Sodium bisulfat (NaHS04.H,0, 12 g/l air) Mctode g selama 10 menit untuk memisahkan spenna. Jika siapan tidak diassay dengan segera, pipet 20 (al plasma semen ke dalam 20 ^1 lanitan sodiumbisulfat dalam sebuah tabling Eppendorf(pHcampuran harus diantara 5 dan 6) untuk menstabilkan asam fosfatase selama penyimpanan pada suhu kamar untuk beberapa jam, pada suhu 4C untuk beberapa hari, atau pada suhu - 20 C untuk beberapa bulan.

XV.2.

(i) Tidak lebih dari 30 menit setelah pencairan, sentrifugasi ejakulat pada 300

(ii).

Encerkan plasma semen 10.000 kali untuk assay, yaitu untuk siapan yang distabilkan (sudah diencerkan 1 : 1), encerkan 10 u.1 dalam 0,5 "Modifikasi dari Heite, H g A. Wetterner, W (1979) Acid Phospatase in seminal fluid: Method of estimation and diagnostic significance. Andrologia. 11 : 1 1 3 - 2 2

ml dapar sitrat dan selanjutnya encerkan 10 fil dari pengenceran ini ke da I am 1 ml dapar. (iii) Untuk mengontrol assay, ambil dua campuran (pools) plasma semen yang distabilkan, simpan pada suhu - 20 C, satu berisi aktivitas fosfatase asam tinggi dan lairmya dengan aktivitas asam fosfatase rendah yang telah diassay sebelumnya, encerkan kedua campuran dan assay bcrsamaan dengan siapansiapan. (iv) Masukkan 0,1 ml ianitan snbstrat pada masing-masing tabling assay-dan panaskan selama 5 mcnit pada suhu 37 C. Bubuhkan siapan yang diencerkan dan eram pada suhu 37 C selama 30 menit tepat. Tabung-tabung tanpa siapan juga dicram sebagai blangko. (v) Hcntikan rcaksi cnzim dengan membubuhkan 1 ml Ianitan NaOH dan baca absorbansi pada 405 nm tcrhadap assay blangko. (Pcmakaian tartrai untuk membedakan asam fosfatase lairmya dari cnzim prostat secara uimim tidak perlu dikarenakan aktivitas yang sangat tinggi enzim tcrscbut). Siapkan dan baca PNP kurva baku tepat sebchun pembacaan siapan-siapan. Masukkan 400 ^15 mM (mmol/1) Ianitan induk ke dalam labu ukur dan buat menjadi 20-ml dengan 0,1 M (mol/l) NaOH (lanitan ini adalah 100 fiMyaitu umol/l). j Larulkan 100 mm lanitan ini dengan 0,1M NaOH untuk rnendapal-kan baku dari 0, 20.40.60. 80 dan 100 f.iM dan baca absorbansinya. XV.3 Pcrhitungnn 1 unit asam fosfatase = I ftmol PNP yang dihasilkan per menit pada suhu 37C. Slope kurva baku (S) = absorbansi unit per \iM. Absorbansi bersih siapan (A) = absorbansi yangdiukur-absorbansi blangko. Faktor (F) = totai volume pengeraman *- volume siapan + 30 menit x faktor pengencer plasma semen = 1110-=- 10 + 30 x 10000 Aktifitas asam fosfatase daiam plasma semen = (A -r.S)x FinU/ml = (A + .V)x F+ 1000 U/ml = (A -filx 37 U/ml Total aktifitas = U/ml x volume ejakulan dalam ml = U per ejakulat. Nilai normal 75 = 200 U per ejakulat atau lebih.

Lampiran XVI Penentuan fruktosa dalam plasma semen manusia0 XVI. I

(1)

Rcagcnsia ZnSO4.7H,O l.S%(l, Reagen lndol. Bubuhkan 200 mg asam benzoat kcpada panas(kira-kira60C). Jikasclunih asam bciizoattclahlanit. 100 ml bubuhkan

(2) NaOH0,l'M
(3)

akuades, kemudiaii laniikar. dengan cara mcngocoknya dalam bak air 25 mg iudol. Lanitan kcmudian disaring dan disimpan pada 4C.
(4)

Larutan indukfruktosa bakti (2,8 niM): 50.4 mg fruktosa dilanitkan ke dalam 100 ml akuades. Dapat disimpan dalam keadaanbcku dalam siapan yang sesuai.

(5)

Larutan kerja fruktosa haku: Pada hari akan dilakukan analisis, satu bagian laaitan induk dicnccrkan mcnjadi masing-masingO,28 mM dan 0,14 mM.

XVI.2 (i)

Pcrsiapan plasma semen Encerkan plasma semen menjadi 1 : 50dcngancara mcmbubuhkanO, 1 ml semen kepada 4,9 ml akuades. (ii> Masukkan 1 ml plasma semen yang telah

diencerkan ke dalam tabling sentrifus. (iii) kemudian diaduk. (iv) Bubuhkan 0,2 ml NaOH kemudian adtik yang rata. Biarkan tabling selama 15 menit kemudian scntrifugasi Gunakan 0,5 ml dari cairan supernatan jemih untuk (Total pengenceran plasma semen adalah 50 x (1 + 0,3 + 0,2) ml -s- 1 ml, yaitu 75 kali), (v) pada 2000 g selama 20 meuit. (vi) analisis. "Karvonen, MJ.& Malm. M. (1955) Colorimetric determinalion of fructose with intlol. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 7:305 -307 Bubulikan 0.3 ml seng sulfat 1,8% ke dalam tabling di atas

XVI.3

Tatacara cksperi men ml cairan supernntan plasma semen yang telah dien-cerkan dan dideproteinasi. Ke dalam tabling kedua masukkan 0,5 ml dari 0,28 inM lanilan kerja fniktose baku, ke dalam tabling ketiga masukkan 0,5 ml dari 0,14mM lamtan fniktose baku, dan ke dalam tabling keempat inasukkaii 0,5 ml akuades (Reagensia blangko).

(i) Ainbil 4 tabling gclas dengan penutup. Ke da lain tabling pertama masokkan 0,5

(ii) Pada setiap tabling di auis bubuhkan 0,5 ml reagen indol dan 5,0 ml HCI pekat.* (iii) Tiituplah tabling kemudian eram selaina 20 nienit pada temperatiir 50 C. (iv) Dinginkan dalam air es schingga mencapai suhu kamar, kemudian baca absorbansi pada 470 nm. XVI.4 Pcrhitungan Kadar fruktosa (nimol/l) di nuiiui: dalam plasma semen: AtxFx <p

As adalah absorbansi siapnn plasma semen. f adalah pcngcnccran (fraksi volume) siapan, dan F adalah rata-rata fnktor baku fruktosa, niciutn.it ninius: j 0.14 F= /, ( ----- + s, .s--- ) 0,28

diiuaua Sl dan .S', mcnipakan bacaan rata-rata absorbansi untuk fruktosa beiku. inasiiig-masing 0.14 mM dan 0.28 mM. Faktor pengenceran ^dari plasma semen adalah 75 (lihat XVI.2). XVL5 Nilai normal 13 HJTIOI atau lebih setiap ejakulat. * jika penggunaan HCI pekat tidak menyenangkan, sebagai gantinya tetapi nicrupakan 77 assayenziniatikyanglcbilinialialmenggunakan spektrofotometerultraviolet(Boehringer Mannlieim kit No. 139106).

78

Lampiran XVII Penentuan alfa-glukosidase netral dalam plasma semen. Dalam scbagian besar studi klinik tcrdaluilu, total aktifitas enziin diukur pada pF5 6,8. Scbagai tambahan nntiik isocnzim netral yang bcrasat dari cpidid>mis. plasma sen ten jnga ntcngandung isoenzim asam yang berasal dari prostat dan dapat dihambat sccara seleklif (Pagnin dkk, 1984). Assay berikut incningkalkan kekhususan peng-ukuran alfaglukosidase scbagai pctanda cpididymis (Cooper dkk, 1990). XVII.1 (1) Kcagcnsia Dapar fosfat pH 6,8 (0.1 in) mengandung 1% sodium dodesjJsulfat (SDS) penghambat alfa-glucosidasc asam. Campur 12 ml K,HPO4 (0.2 M) dan 13 ml KH,PO,, (0,2 in), dan jadikan 40 ml dengan akuades. Atur pH sampai 6,8 dengan lncnambahkan lebih banyak KH,PO,, jika pH Icbih dari 6.8 atau lebih banyak K,HPO Jika pH kurang dari 6,8. Jadikan volume akhir 50 ml dan simpan pada suhu 4 C. Tepat sebclum dipakai, lanilkan SDS dalam volume dapar yang diperlukan (yaitu 50 mg untuk 5 ml). (2) /7-Nitrofenol glukopiranosid (PNPG; substrat, 5g/l dapar); volume yang diperlukan dibuat baru untuk setiap assay. Tambahkan jumlah yang tepat dari PNPG ke volume yang diperlukan dari reagensia (contoh: 25 mg/5ml). Panaskan dan adtik di atas piringan panas pada suhu 50 C untuk kira-kira 10 menit supaya larut. (3) Kastanospcmtin (lmM; penghambat alfa-glukosidase). Induk 10 mm: lamtkan 1 mg kastanospennin dalam 0,53 ml akuades dan simpan pada suhu -20 C. Larutan lmM: bubuhkan 0,1 ml induk 10 mM dalam 0,9 ml akuades dan simpan 0,2 ml larutan tersebut pada suhu 4 C. Sisa larutan disimpan pada suhu -20 C. (4) Na,CO, (0,1 M) Lamtkan 6,20 g Na,COvH,O dalam 500 ml akuades.

(5)

p-Nitrofenol (PNP; 5 mM; untuk kurva baku); buat I am tan bam setiap 3 bulan. Larutkan 0,0695 g PNP dalam akuades, paiiaskaii larutan jika perlu dan jadikan 100 ml dalam labu ukur. Simpan pada suhu 4 C dalam botol benvama coklat.

XVir.2 Mctodc (i) Siapkan bak air pada suhu 37 C untuk pcngeramaii. (ii) suhu -20 C. (iii) Siapkan lanitan PNPG (2 x 100 ul untuk setiap siapanatau blangko). (iv) posiliO ke dalam 100 ul PNPG dalam tabling Eppcndorf dan vortex. (v) Scbagai blangko air: 10 f.il air dalam 100 ul PNPG. (vi) untuk kontrol interassay: 10 ul dari plasma semen yang incngandung glukosidase tinggi dan 10 f.il dari plasma semen yang incngandung glukosidase rendah dan masukkan masingmasing kc dalam 100 ul PNPG. (vii) plasma semen dari siapan dengau glukosidase tinggi dan rendah (atau siapan individu yang sama)masing-masing dalam |00ul PNPG. Bubuhkanmasing-masing 5 ul kastanospenuiu. (viii) jam dakjm bak air pada suiiu 37 C (suhu dan waktu pengcraman yang tepat adalah mencntukan). (ix) Na2CO3 pada masing-masing tabling dan vortex. (x) tabling ke 96 piring suinur (96-wellplate) dan baca absorbansi pada 405 nmgunakan blangko air untuk diatur kc angka 0. (xi) sebelum pembacaan absorbansi). Masukkan 400 ul 5mM lanitan induk ke dalam labu ukur 20 ml dan jadikan 20 ml dengan 0,1 M Na,CO, (laaitan in i adalah 100 |iM . Eiiccrkan lanitan 100 uM (\i mol/1) dcugan 0,1 M Na2CO3 untuk memberikan baku 0, 20, 40,60,80 dan 100 \\M dan baca absorbansi. XVII.3 Pcrhitungan I unitalfa-glukosidasc= 1 nmol PNPdihas!!kanpermenitpada37C. Slope dari Siapkan kurva PNP baku (kurang dari 1 jam Pindahkan 250 ul dari masing-masing Henlikan pengcraman dengan penambahan 1 ml 0,1 M Vortex masing-masing tabling dan cram sclama 4 Scbagai blangko semen masukkan 10 ul Sebagai baku internal Lctakkan duplikat 10 ul plasma semen (menggunakan pipct pemindah Cairkan dan vortex sperma bebas plasma semen yang disimpan pada

kurva baku (S) = absorbansi unit nM. Absorbansi bersih siapan (A) = absorbansi rata-rata blangko semen. Faktor (F) = total volume -s- volume siapan
H-

240 men it = 0,46 Aktifitas alfa-glukosidasc netral dalam siapan = (A + S)

FmU/ml Aktifitas total = mU/ml x volume ejakulat = mU/ejakuIat. 79

XVII.4 Nilai normal 20 mil per ejakulat atau lebih. Catafa/i.-volumeyangdigunakandalammetodediatas (volumetotal 1,1 ml) adalah untuk pemakai pembaca 96-well plate dan tabling Eppendorf. Volume ini dapat ditakarkan sccara proporsional jika digunakan cuvettes spektrofotomcter dan tabling erain yang berbeda, dan ko-reksi yang sesuai hams dilakukan untuk perhitungan hasil peme-riksaan. Rujukan Cooper,T.G., Ycung, C.H., Naslian, D., Jockcnliovel, F& Nieschlag,. (1990) Improvement in the assessment of human epididymal ftinction by the use of inhibitors in the asssay of-alfa-glucosidase in semional plasma. International Jaurnai ofAndrology . 13:279-305 Paquin, R., Chapdclaine. P., Dube. J.Y. & Trcmblay. R.R. (1984) Similar biochemical properties of human seminal plasma and epididymal alfa-l,4glucosidase. Journal of Andrology.5:277-82.

Lampiran XVIII Uji Bengkak hipo-osmotik (Hypo-osmotic swelling test) untuk spermcf XVIir.l Larutan Pcmhcngkak Larutkan0.735g sodiumsilratNajCjHjOj.ZHjOdan t,351gfmktosa ke dalain 100 ml akuadcs. Simpan cairan larutan ini dalam keadaan bcku pada sului -20 C. Cairkan dan aduk dengan baik sebelum dipakai. XVIII.2 Mctodc Panaskan I ml larutan pcnibcngknk dalain tabling Eppendarf tertutup pada suhu 37 C selama kira-kira 5 menit. Bubuhkan 0,1 ml semen yaag tclah incncair dan aduk dengan pipct secara hati-hati. Biarkan pada suhu 37 C paling sedikit 30 menit (tetapi tidak lebih lama dari 120 menit) dan periksa scl-sel spenna dengan mikroskop beda fase. Bengkak dari spenna dibuktrkan scbagai penibahan dalain bentuk ckor, sepcrti ditunjukkan pada gainbar. XVIII. 1. Ulangi dua kali skor spenna yangmembengkakdalain 100 spenna yangdicacah dan hitung skor rata-rata. Penamptlan ikentalik perubahan morfologi khas akibat pengaruh hipoosnwxik a lidak berubah. b - g bertMgai nucam perutiahan ekor. Daerah ekor ditandai yang membengkak ipfemi manusia arsinn (a) (e) (f)

(b)

Jjyondra. R.S.. Van der Ven. II.II.. I'crcz-Pclaez, M.. Crabo. B.G &

Zaneveld. L.J.D. (I 9S4) Development of an assay to asses the functional integrity of the human sperm membrane and its relationship to other semen characteristics. Journal of Reproduction MiJ Fenihiv. 70 -28 81 2 I 9