P. 1
buku who

buku who

|Views: 35|Likes:
Published by Diana Indah Lestari

More info:

Published by: Diana Indah Lestari on Sep 28, 2012
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOC, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

11/29/2012

pdf

text

original

II 1.

2 Imunositokimia Semua kelas lekosit manusia menunjukkan antigen khusus ( CD 45 ) yang dapat dideteksi menggunakan antibodi monoklonal yang sesuai ( Mab; lihat Gambar 2.2 ). Dengan mengubah sifat antibodi pertama, tatacara umum ini dapat diadaptasi untuk mengetahui jenis – jenis lekosit lainnya seperti makrofag, neutrofil, sel B atau sel T. ///. 2.1 (I) Reagensia Dapar fosfat salin Dulbecco ( Dulbecco's Phosphate buffered saline/ PBS ). Unsur – unsur larutan dapar fosfat salin : CaCI2 2H2O KCI KH2PO4 MgCI 2.6H2O NaCI Na2HPO 4 Bubuhkan air sampai 1 liter (2) Dapar salin Tris (Tris Buffered Saline/TBS: larutan induk 10 x disiapkan dan diencerkan 1 : 10 segera sebelum pemakaian). Unsur-unsur larut an dapar salin Tris 10 x : BasaTrizma NaCI Bubuh kan air, atur pH 8,6 dengan 1 air sampai 1 lite
M

0.132g 0,2 0,2 0,1 8,0 g g g g

1.15 g

60,55 g 85,2 g HCI (mol/1) Bubuhkan

(3) Substrat fosfatase lindi disiapkan seperti yang diuraikan di bawah dan disaring. Unsur-unsur substrat fosfatase lindi: Naphthol AS-MX fosfat Dimelilformamid 0,1 M daparTris (0,1 mol/1) pH 8,2" 1 M Levamisol (I mol/1) 2 mg

0,2 ml 9,7 ml 0,1 ml

Garam Fast RedTR, dibubuhkan tepat sebelum pemakaian 10 mg
-

1,21 g basa Trizma dilarutkan dalam air, pH diatur 8,2 dengan 1M HC1, bubuhkan air sampai 100 ml. Antibodi pertama, antibodi monoklonal lawan antigen lekosit umum, berkode CD45 dan tersedia secara luas dan komersial. Antibodi kedua, Immunoglobulin anti-tikus (anti-mouse) diperoleh dari kelinci. Pengenceran yang dipakai akan tergantung dari titer antibodi dan sumber (contoh DAKO). pengenceran 1:25 antibodi Z259 buatan

(4)

(5)

(6)

Fosfatase lindi: kompleks fosfatase anti-lindi (anti-alkaline phos phatase complex (APAAP)). Kembali pengenceran akan tergantung pada titer antibodi dan sumber (contoh pengenceran 1:50 kompleks D651 produksi DAKO).

III. 2.2.

Penyiapan sel Tata cara

(i) Aliquot semen yang sudah mencair (mendekati 0,5 ml) dicampur dengan 5 volume dapar salin fosfat (PBS) dan disentrifugasi pada kecepatan 500 g selama 5 menit pada suhu ruang. Tata cara ini diulangi sebanyak 2 x dan pellet sel diresuspensi dalam PBS ke volume semula dari siapan semen. Suspensi tersebut kemudian dilarutkan dengan volume PBS 2-5 x tergantung dari jumlah sperma. Dua 5 ml aliquot sel ini selanjutnya dikeringkan di udara di atas kaca obyek bersih, difiksasi dan dipulas dengan segera atau dibungkus dalam kertas alumin dan disimpan pada suhu -70°C untuk analisis berikutnya. (ii) Sel-sel yang kering di udara difiksasi dalam aseton jenuh selama 10 menit atau dalam campuran aseton, metanol dan 400 g/l formaldehid (dalam perbandingan volumetrik 95 : 95 : 10) selama 90 detik, dicuci 2 x dengan dapar salin Tris (TBS;

lihat III 2.1.), dan dibiarkan kering.

(iii) Masing-masing aliquot sel-sel yaaig difiksasi ditutup dengan 10 µl Mab pertama dan dieram dalam kamar yang Iembab selama 30 menit, pada suhu kamar. Kaca obyek selanjutnya dicuci sebanyak 2 x dengan TBS dan dibiarkan kering. (iv) Sel-sel ditutup dengan 10 µl antibodi kedua, dieram selama 30 menit dalam kamar Iembab pada suhu kamar, dicuci 2 x dengan TBS dan dikeringkan. (v) Untuk masing-masing siapan ditambahkan 10 µl fosfatase lindi: kompleks fosfatase anti-lindi (anti-alkaline phosphatase complex) (APAAP) dan siapan dieram selama 1 jam dalam kamar Iembab pada suhu kamar sebelum dicuci sebanyak 2 x dalam TBS dan dikeringkan. (vi) Untuk memperkuat hasil reaksi, pemulasan dengan antibodi kedua dan APAAP dapat diulang, dengan waktu eram 15 menit untuk masing-masing reagensia. (vii) Sel-sel dicuci sebanyak 2 x dengan TBS, dikeringkan, dan dieram dengan 10 µl substrat fosfatase lindi selama 18 menit. (viii) Sesudah reaksi warna fosfatase lindi selesai, kaca obyek dicuci dengan TBS (Tris buffered saline) dan akhirnya dipulas untuk beberapa dctik dengan hematoksilin sebelum dicuci dalam air mengalir dan ditutup dengan medium penutup cair Apathy.

45380) dalam larutan NaCl cair 0.1 Reagensia (1) (2) IV. (iii) Cacah sperma yang tidak terwarnai (hidup) dan yang terwarnai (mati) sesuai dcngan cara yang telah diuraikan. 1.2 menit amati siapan melalui mikroskop biasa atau beda-fase dengan pembesaran 400 x. yaitu 10% dalam akuades).I.9% (9 g/I).5% (5 g/I) pada kaca obyek kemudian tutup dengan kaca tutup.1 Reagcusia Eosin Y (C. 1.I Many a Eosin Eosin Y. IV. apusan tidak boleh terlalu tebal.2 Tatacara (i) (ii) (iii) Letakkan satu tetes campuran semen-Eosin-Nigrosin pada kaca obyek dan buatlah apusan yang kemudian dikeringkan. 100 g/1. (ii) Setelah 1 . IV. 45380. 50420. larutan pemulas baku dapat dibeli dari sejumlah perusahaan di beberapa negara.2 Eosin-nigrosin (modifikasi icknik Blom) IV.1. Setelah 30 detik bubuhkan 3 tetes dari 10% (100 g/1) larutan nigrosin pada campuran (i) kemudian aduk.Lampiran IV Teknik pulasan vitalitas sperma I V. Campurkan satu tetes semen dengan dua tetes 1% (10 g/1) Eosin Y. Nigrosin (C.I. .2. 10 g/1. Buat larutan 0. IV. 2.2 Tatacara (i) Campurkan salu tetes (10.5%(5 g/l) Eosin Y (C.15 µl) semen segar dengan satu tetes larutan Eosin 0. yailu 1% dalam akuades).

VII.PO4.8 g NaH. 3.H2O. PBS terdiri dari 0. Kaca obyek berlapiskan poly-1 -lysine dibuat dari larutan poly-1 -lisin* dalam dapar salin fosfat dengan meletakkan 1 0 . . adalah perlu melekatkan sperma pada kaca obyek. Tatacara ini dapat mcnyebabkan artefak morfologi akibat kerusakan osmotik sel-sel tersebut dan ekstrasi komponen oleh etanol.1). biarkan kering.I (1) Reagensia Dapar Salin fosfat (PBS). Kaca obyek dikeringkan dan dapat disimpan dalam lemari pendingin kurang lebih seminggu. Metode yang lazim untuk melakukan hal ini adalah membuat apusan sperma di atas kaca obyek.2 0 µl larutan di bagian tengah lingkaran kecil yang digambar dengan pensil batu intan di atas kaca obyek.Lampiran V Pemeriksaan morfologi sperma : preparat basah Untuk melakukan pencacahan beda morfologi sperma dari siapan basah.8 g Na2HPO4. V. Pendekatan yang sering digunakan untuk mengurangi artefak yaitu dengan merendam sel-sel tersebut dalam larutan isoosmotik (atau memflksasi secara ringan sel-sel tersebut dengan fiksatifaldehid) dan lekatkan sel-sel tersebut pada kaca obyek berlapisan poli-satu-lisin. Protokol khusus adalah scbagai berikut. dengan membiarkan sel-sel terlepas dari larutan tanpa pengeringan yaitu inembentuk preparat basah. (2) Kaca obyek berlapiskan poly-1-lysine.7H2O dan 16 g NaCl. dan kemudian difiksasi dengan etanol (lihat lamp. bubuhkan akuades sampai 2000 ml.

5. . Waktu yang diperlukan untuk sel-sel melekat mantap ditentukan secara empiris untuk pertama kali tata cara ini digunakan. 10 menit sudah cukup. (iii) Biarkan sperma mantap dalam larutan dan terikat dengan kaca obyek.2) atau dalam PBS. Sperma tersebut sekarang dapat dilihat dengan mikroskop beda fase.2 Tatacara (i) Encerkan semen sampai 1 x 10 sel/ml dalam larutan pengencer sperma (lihat bagian 2.V. (ii) Letakkan kaca obyek berlapiskan poli-1-lisin dalam ruang lembab (contoh : kotak kaca obyek dengan handuk tangan basah). (iv) Setelah sperma mantap ditutup langsung dengan kaca tutup. Taruh 10 µl semen yang diencerkan dalam lingkaran kecil di atas kaca obyek dan titutup ruang tersebut. Dibawah kondisi ini sperma tidak akan mengalami kejutan osmotik dan morfologi akan bebas dari artefak akibat persiapan. tetapi dengan volume sebesar 10 ml.

400 ml Na2HPO4. 9.Lampiran VI Pulasan Giemsa untuk sperma dan inti sel lain I V. 7 ml Romanovski-Giemsa.2 Tatacara (i) (ii) Fiksasikan apusan yang telah kering di udara dengan metanol untuk waktu sedikitnya 5 menit. 160 ml dapar fosfat. (2)Larutan Giemsa (harus dibuat setiap kali sebelum dipakai).1 g/I.9 g/I. 11. t . IV . (v) Keringkan pada suhu kamar. pH 6.066 m (mol/l.I Reagensia (1)Dapar fosfat 0.9): 320 ml KH2PO. Keringkan pada suhu kamar. (iii) Pulas dalam pulasan Giemsa selama 30 menit. Atur pH dengan NaOH kemudian bubuhkan akuades sampai volume mencapai 1 liter. (iv) Bilas dengan dapar fosfat.

VII. Teknik pemulasan inodifikasi yang akan diuraikan ini telah terbukti berguna dalam analisis morfologi sperma dan pemeriksaan sel-sel benih muda.2 Tatacara pemulasan Apusan yang telah difiksasi dipulas sesuai dengan tatacara di bawah ini : Etanol 80%'(800 ml/I) Etanol 70% (700 ml/1) Etanol 50% (500 mi/I) Akuades Hematoksilin Mayer atau Harris Air mengalir Asam etanol Air mengalir Lanitan scotf Akuades Etanol 50% Etanol 70% 10 celupan 10 celupan 10 celupan 10 celupan 3 menit tepat 3 . VII.1 Pcmbuatan Siapan . Oleh karena itu metode ini telah lazim digunakan untuk sitologi diagnostik yang rutin. J Apusan harus dikeringkan di udara kemudian di fiksasi dengan Iarutan etanol 95% (950 ml/I) dan eter dalam jumlah yang sama selama 5-15 menit.5 menit 2 celupan 3 .5 menit 4 menit 1 celupan 10 celupan 10 celupan . Namun pulasan Papanicolaou baku yang biasa digunakan untuk sitologi vagina memberi hasil yang buruk jika dipakai untuk sperma.Lampiran VII Tatacara pulasan papanicolaou yang dimodifikasi untuk sperma Pulasan Papanicolaou dapat membedakan dengan jelas komponen sel yang basofil dan yang asidofil sehingga memungkinkan suatu pemeriksaan yang terperinci terhadap pola kromatin inti.

4) digunakan jika air ledeng terlalu 'keras'. kekuning-kuningan (C.1 Tatacara . • VII. sebagai berikut: VII.Etanol 80% Etanol 90% Orange G6 Etanol 95% Etanol 95% EA-50' Etanol 95% Etanol 95% Etanol 95% Etanol 99. 45380) Bismarck Coklat Y (C.5 ml VII. 3. 42095) Larutan litium karbonat jenuh (dalam akuades)0.I. dengan ongkos yang jauh lebih murah.0 • • Satu celupan kira-kira sama dengan satu detik.1 Susunan EA-36 sama dengan EA -50: EosinY (C. 21000) Akuades Etanol 95% Asarn fosfotungstat 10 g 10 g 10 g 300 ml 2000 ml 4g SF Hijau muda. • lOcelupan 10 celupan 2 menit 10 celupan l0 celupan 5 menit 5 celupan 5 celupan 5 celupan 2 menit 1 menit dalam tiap bak Ganti silol jika rupanya berubah seperti susu. Penisaliaan yang sama biasanya juga membuat siapan hematoksilin.3.5% Silol (3 wadah pemulasan) kira-kira Depex atau medium scnipa. Pulasan dan larutan: Pulasan jadi Papanicolaou (EA-50 dan Orange G6) dapat dibeli. 3.I.1.3 Pembuatan pulasan Pulasan jadi yang dapat dibeli biasanya cukup baik tetapi pulasan dapat juga dibuat di laboratorium.I. pH harus 7. Larutan scott (lihat bagian VII. Tutup siapan dengan Periksa keasaman ai r sebelum inembuat berbagai larutan etanol.

(ii) Untuk membuat 2000 ml pulasan.5 ml Hijau Muda SF. 10 g SF hijau muda dalam 100 ml akuades. bubuhkan 4 g asam fosfotungstat dan 0.3 bulan. (iii)Tambahkan etanol 95% sampai 2000 ml. (iv) Aduk yang baik dan simpan dalam botol berwarna coklat tua yang tertutup rapat pada suhu kamar. . Sebelum dipakai larutan harus disaring terlebih dahulu. 10 ml Bismarck Coklat Y 12. Larutan tersebut stabil untuk 2 .5 ml larutan litium karbonat jenuh. campuran induk di atas sebagai berikut: 50 ml Eosin Y.Larutan induk: (i) Buat larutan 10% (100 ml/1) dari tiap pulasan sebagai berikut: 10 g Eosin Y dalam 100 ml akuades. 10 g Bismarck coklat Y dalam 100 ml akuades.

3 Susunan heniatoksilin Harris tanpa asam asetat (kristal gelap: C. 16230) 10 g Akuadcs 100 ml Etanol 95% 100 ml Asam fosfotungstat 0.15 g VII. VII. (ii) (iii) Saring sebelum digunakan. Larutan kerja stabil untuk 2 . I Buat larutan cair 10% (100 ml/1) sebagai berikut: (i) (ii) Masukkan 10 g kristal Orange G kc dalam 100 ml akuadcs.75290) 12H2O 8 80 160 1600 6 g ml g ml G Hematoksilin Etanol 95% AlNH4(S04)2 Akuades HgO . 3.I. Larutan induk no. 2 (larutan Orange G6 0.15 gram asam fosfotungstat pada 1000 ml lamtan induk no.1 Tatacara Larutan induk no. 3.2 Susunan Orange G6 Kristal Orange G (C. Untuk pembuatan 1000 ml lamtan kcrja dari pulasan: (i) Bubuhkan 0. Kocok yang baik kemudian simpan dalam botol berwama coklat tua pada suhu kamar selama satu minggu sebelum dipakai. Pembuatannya sebagai berikut: (i) (ii) 50 ml lamtan induk no. 3.VII.3 bulan. 2. 1 dibubuhkan etanol 95% sampai 1000 ml.5% (5 ml/I)). Aduk yang baik dan simpan dalam botol berwarna coklat tua bertutup pada suhu kamar.2.1.

VII.1 (i) Tatacara pembuatan campuran pemulas Larutkan alumunium sulfat dalam akuades dengan pemanasan. Angkat larutan dari pemanas dan sambil mengaduk bubuhkan oksida (ii) Larutkan (iii) (iv) Panaskan campuran sampai 95° C.5 Susunan larutan etanol asam Etanol 99. (vii) Simpan dalam botol berwania coklat tua pada sulu kamar selama 48 jam.25 siapan. (v) merkuri secara perlahan-lahan. yaitu setelah dipakai untuk membilas 20 . (viii) Encerkan sejumlah yang diperlukan dengan sejumlah akuades yang sama dan saring kembali. (vi) Masukkanlah segera wadah itu ke dalam bak air dingin kemudian saring lanitan tersebut setclah dingin.5% HCI pekat Akuades 300 ml 2.5 g 20.VII. kristal hematoksilin dalam etanol 95% (950 ml/1). Warna lanitan akan menjadi ungu tua. 3. 3.7H2O Akuades 3.0 g 1000 ml Larutan scott hanya dipakai jika air Iedeng biasa 'keras'.4 Susunan lanitan Scott NaHCO3 MgSO4. 3. Larutan scott harus sering diganti.3. VII. Bubuhkan larutan hematoksilin ke larutan amonium sulfat.0 ml 100 ml .

Air Icdeng mcngalir I'ironin Y Air Icdeng mcngalir Dapar natrium siiral Akuadcs pulasan Pryan dimodillkasi 5 menit 4 menit 3 cclup 3 menit Alirkan lambat-lambat Buat baru sctiap minggu Alirkan lambat-lambat pH 7. kemudian saring kcmbali scsaat scbclum dipakai). • . Air Iedeng mengalir Keringkan diudara (jangan gunakan kcrtas saring untuk nicngeringkan) l.8).LAMPIRAN VIII Pulasan Bryan-Leishman untuk apusan morfologi sperma Catalan: Pakailah apusan baru yang dibuat dari siapan segar. Setiap celup lamanya kira-kira 1 dctik.4 ml hidrogen pcroksida 3% (30 ml/I) kepada 200 ml alfa-naflol sesaat sebelum pemakaian: larutan itu akan aktifsclama 3 hari pada suhu kamar). jika anda memakai gelas pulas yang diisi dengan 30 pulasan.2celup Alirkan lambat-lambat • Ganti setelah dipakai 30 siapan. Alkohol formalin 10% (100 ml/I) 1 menit Buat baru scliap kali Etilalkohol 80% (800 ml'!) 5 menit Buat baru sctelah 3 kali pemakaian Etilalkohol 70% (700 mi l ) 5 menit Buat baru sctclah 3 kali pemakaian Etilalkohol 50% (500 mi l ) 5 menit Buat baru sctclah 3 kali pemakaian Alfa-naflol 4 menit Buat baru sctclah 3 liari (Bubuhkan 0. dikeringkan di udara di atas kaca obyek yang bersih. biihuhkan 100 ml dapar (pl( 6.5: dibuat baru setiap kali pemakaian Seliap kali baru Muat baru sctiap 2 kali pamakaian Alirkan lambat-lambat Alirkan lambat-lanihat Dtbuat baru sctiap kali pemakaian I menit yang 15 menit Asam asctat glasial l 2 celup %(10m!'l) Air Icdeng mcngalir I menit Dapar dan pulasan 30 menit leishman (Saring 80 ml larulan induk Leishman.

(1) Pironin Y. pulasan Bryan dan Leishman yang telah modifikasi harus disaring .I Perhatian khusus sebelum dipakai.VIII. Selain itu dapar dan larutan kerja Leishman harus disaring setiap kali akan dipakai untuk menyingkirkan endapan pulasan.

1. Setelah matang pulasan dieram dalam inkubator pada suhu 35°-37°C selama dua hari. C. oleh karena itu larutan induk harus disimpan di dalam botol berwarna coklat tua dan di tempat yang gelap.I.1 (i) Pembuatan larutan: Pulasan Bryan yang dimodifikasi Campur zat berikut ini: Asani asetat glasial 1% EosinY(C. Larutan tersebut dapat diperoleh dari berbagai perusahaan kimia. Larutan induk pulasan darah lain yang dapat dipakai sebagai pengganti larutan Leishman ialah pulasan darah Jenner atau Wright.37° C di tempat gelap selama dua hari. VIII.2 (i) (ii) (iii) Campur 0. Periksalah intensitas yang diinginkan dengan mikroskop sebelum siapan ditutup.52015) Aduk yang baik dan biarkan menjadi matang di tempat gelap pada suhu kamar selama tujuh hari. 2. 1. Dapar .10316) 1500 ml 0.2 VIII. (4) Larutan induk pulasan Leishman harus dimatangkan sebelum dipakai dengan cara menyimpannya selama 7 hari pada suhu kamar dilanjutkan dengan mengeramnya pada suhu 25° .5 g 0. (iv) Setelah masa tersebut. 42053) 0.I. 2. Waktu pemulasan harus disesuaikan untuk memperoleh hasil yang sama. (3) Hidrogen peroksida cepat rusak di tempat terang.(2) intensitas warna akhir dapat diperkuat dengan cara memulas lebih lama di dalam pulasan Leishman dalam dapar atau dikurangi dengan cara mencuci berulang kali. VIII. Pemulasan dengan pulasan Jenner atau Wright dilakukan pada tahap pemulasan dengan pulasan Leishman.5 g Hijau (fast green FCF) (C. serta jauhkan dari panas dan cahaya. (iii) Saring sebelum dipakai. Larutan yang telah matang akan stabil selama satu bulan jika disimpan di dalain wadah yang tertutup dan di ruang gelap. Larutan induk pulasan darah Leishman dan 300 ml metil alkohol absolut.5 g metilen biru eosin (campuran eosin Y dan metilen biru.5 g (iii) Aduk yang baik kemudian simpan dalam botol yang tertutup rapat.45380) Naftol kuning S (C. maka larutan induk siap pakai dan harus disimpan di dalam botol tertutup rapat yang berwarna gelap.

8 dengan 200 ml akuades. pH 6. periksalah kembali pH sebelum dipakai.Campur 2 tablet dapar. Jika tidak segera dipakai. .

.

Formalin alkohol: Campur 10 ml larutan fomaldehid 37% dengan 90 ml etilalkohol 95%.8 segera sebelum pemakaian. (iv) Pyronin Y: 0. 45005). (v) Dapar natrium sitrat: Campur 7 g natrium silrat dengan 1 liter NaCI 0. Sesaat sebelum pemakaian bubuhkan 0. dan 96 ml etilalkohol 40%.1 g pyronin (C.3 (i) (ii) Larutan kerja pulasan darah Leishman Campur 80 ml larutan induk yang telah disaring dengan 100 ml dapar dengan pH 6.2 ml larutan hidrogen peroksida 3%.1 g kalsium asetat setiap 200 ml larutan untuk menjamin agar pH netral (7.5.I.0). (iii) Alfa-naftol: Larutkan 1 g alfa-naftol dalam 100 ml etilalkohol 40%. 2.VIII. . Jika perlu dapat dibubuhkan 0. 4 ml anilin.9% kemudian atur pH sehingga menjadi 7.

1 (Merk. 2. (2) IX. (3) 63 .3 (1) 1 2 . I (1) I'enyiapan apusan Apusan dibuatdari 20 (alsiapan (50-100 x 10*spcnnatozoa/ml)diatas kaca obyek bcrsih dan biarkan mcngcring. 220 ml Etanol 50%.1 5 cclupan 112-15 celupan 2 J mcnit 5 tcmpat masing-masing 5 mcnit 12-15 cclupan 5 mcnit 3 .0 ml Asam asetat glasial Larulkan bubuk dalam alkohol hangat dan biarkan rnendingiii Bubuhkan dengan asam asetat di dalam kap penguapan dan saring. IX. Reference 9275) atau bubuk BDH Shorr 4 gr. Germany.Lampiran IX Pulasan Shorr untuk aptisan morfologi sperma.5 mcnit 5 mcnit 5 mcnit Etanol (500 ctanol ctanol (750 (950 5 mcnit 2 tcmpat masing-masing 5 mcnit 2 tempat masing-masing 5 menit.2. Ref (2) Amonium alkohol 95 ml etanol 75% + 5 ml amonium hidroksid 25% (250 ml/1) Larutan Shoor (Merk. Rcagcnsia Hematoksilin erence 9253) Papanicolaou No. Darmstadt. Tatacara pcmulasau Air mcngalir Hcmatoksilin Air mcngalir Amonium alkoliol Air mcngaiir 50% ml/I) Pcmulas Shorr 50% ctanol 75% ml/1) 95% ml/1) Etanol jcnuh Xylol IX. Fiksasi apusan dcngan 75% ctanol (750 ml/1) untuk kira-kira 1 mcnit.

USA) (Katolog Nos. yang akan mengidentifikasi semua 'isot\pe'. butir-butir koinbinasi ant i-Ig (170 ./rer////(y and Sterility. CA 944806.& Rosenfcld.2 8.2 0. O.A. D.16 Larutan hams disaring dengan filter milipor (pori 22 inikroinetcr) scbelum dipakai.D.. & Rosenfcld. " (2) digunakan.1 8.N..1 0.( 1990) Detection ofantisperm . Archives of'Andrology.O 0.66 XI.7H.0 2. .W.2 0. -12:171-183. Richmond.0 PBS dulbecco (g/1) CaCI. R.2 0.A.'ion.05 0. 9:61.W.. dapat digunakan.HPO.0 1. Cooper.6H 2O NaCl NaHCO 3 Glukosa (g/1) 0.O. Masukkan butir imun kcdalam 10 ml dapar I (lihat bawali) dan simpan pada siilui + 4°C. Dapar induk: Lanitan Tyrode alau PBS Dulbecco dapat 15111 Larutan Tyrodc CaCl2 X KCI NaH 2PO4 MgCl.R... San Pablo Avenue.5114.(1982) Detection of sperm specificanlibod-ics on the spermatozoa surface by iinmunobcad binding.O NaCI Na. 1 (1) Lampiran XI Uji Butir intuna Rcagcnsia Butir Imun: Bulir imun anti-IgG. Bron. Coopcr.Clarke.1705100.(1984) Sperm antibodies: their use in infertility. Untuk tiijuan penapisan. "Bronson. Campuran ini dapat disimpan selama satu bulan. KCI KH2PO4 MgCI2. anti-IgA dan anti-IgM dapat diperolch dari Bio-Rad Laboratories (Bio Rad Chemical Division.5106).6H.2 0. _. dan -5 120sccara bcninitan).G.0 1.

Florida. CRC.a n t i b t > d i e s u s i n g i m m u n o b e a d s . .192. I n H a ndbook ofthe Laboratory Diagnosis Treatment of Infertility^. 177 . Webster. B A.W.Keel & B. pp. Boca Raton.

Jumlah semen yang dipcrhikan ditcntukan olch jumlah dan motilitas spemia scsuai tabcl bcrikut ini: Jumlah (106/ml) >50 20-50 20-50 20 20 Motilitas (katcgori (a)+(b). Letakkan kaca tutup berukuran 20 sampai 24 nun2 pada setiap campuran dan setelah dibiarkan selama 10 menit .(3) Dapar I: berisi 0. Resuspensi dengan hati hati pellet spenna dengan dapar II ke volume cairan scmula.1 0 inenit. (vii) Letakkan 5 fil tetesan setiap tipe but ir imun di atas satu atau lebih kaca obyek.4 g BSA ke da lain Iarutan dapar induk schingga volume meacapai 100 ml. Bubuhkan 5 yi\ suspensi spenna yang telah dicuci pada masing-masing tetesan butir dan aduk mcrata dengan menggunakan ujung pipet atau tepi kaca tutup. masukkan 0.2 (i) Untuk sctiap tipe butir iimin. (5) XI. (v) Tabling (tabling) butir imun: tuang dan buang cairan yang di atas. Resuspensi dengan hati hati pellet spenna dengan 10 ml dapar I yang barn dibuat dan sentrifugasi lagi dengan kecepatan 500 g selama 5 .0 (iii) Sctrifiigasi tabling tabling tersebut pada 500 g selamaS .4% (4 g/1) albumin seaun bovine (BSA: Cohn fraction V). masukkan 5.2 -' 0. (iv) Tabung(tabung) spenna : tuang dan buang cairan yang di atas (supernatant). Resuspensi dengan hati hati butir-butir tersebut dengan 0.0 g BSA ke dalam Iarutan dapar induk sehingga volume mencapai 100 ml.2 ml suspcnsi butir induk ke 10 ml (ii) Masukkan ke dalam tabling scntrifus tcrscbut jumlah semen yang dipcrkikan kemudinn bubuhkan dapar I schingga volume menjadi 10 ml. (4) Dapar II: berisi 5% (50 g/l) BSA.10 inenit.2 Semen yang dipcrhikan (ml) N 0. masukkan 0. Scimia lanilan hams disaring dengan filter milipor 0.0 2.45 (im sebcliiindipakai Tatacara dapar I dalam tabling sentrifus bagian dasarnya bcrbcntuk kcrucut yang terpisah. (vi) Tabling (tabling) spenna: tuang dan buang cairan yang di atas.2 ml dapar II.22 fim atau 0.%° > 40 <40 >40 <40 "Lihat bagian 2.4.8 1.4 0.

■ 67 .

atau ujung ekor). (iii) uji dcngan 40 (j. Kontrol positifdapat dibuat dengan memakai sennndari donor (misal. dan vi) di atas.1 dapar II dan kemudian campur dengan 50 y.akukan uji hams dilakukan kontrol positif dan negatif. amati mcnggunakan mikroskop beda-fase dcngan pcinbcsaran 400 x sampai 500 x. plasma semen. pria yang telnh vasektomi) dengan titer antibodi sperma serum yang tinggi yang ditentukan dengan uji butir imun tak langsung. (iii). Sennn ini dibuat sesuai dcngan XI.4 Kontrol Setiap kali me'. (iv) seperti pada XI.68 dalam ruangan yang lembab. Eram pada stihu 37°C sclama satu jam. (i) seperti yang dijelaskaii dalam XI. Cacah sekiirang-kurangnya 100 spenna motil per siapan.2 langkah (iii). (iv) dan (vi) dan ujrtlilakukan seperti pada langkah (vii) darw(viii). (viii) Skor secara tcrpisah pcrscnlase spcnna motil yang dilckati butir iinun dalajn siapan. XI.i klinis.2 langkah (ii). Spenna kemudian dicuci dua kali lagi Enccrkan 10 jjlcairan Spenna donor nonnal dicuci qua kali dengan dapar I . (iv). atau getah servik larut dalajn brornclin.] suspensi spenna yang telah dicuci.3 Uji butir imun tak lan^sunj^ Modifikasi ini dipakai untuk mcndctcksi apakah ada antibodi antispcnna dalam sennn. Uji dianggap posilifjika 20%alau lebih spcnna motil yang dilekati butir dan bcrmakna sccara klinis jika 50% atau lebih spenna motil disclubungi butir. ckor. Catat kclas (igG atau IgA) dan lctak pcrlekatan butir imun pada spenna (kcpala. bagian tcngali. XI.3 dan diperiksa bersamaan dengan pelaksa-naan tiap uji. Ikatan yangtcrbatas pada ujungekortidak dianggap bcrmakna sccar. (ii) Jumlah spenna yang telah dicuci kemudian disesuaikan sehingga dicapai jumlah 50 x lOVml dalam dapar II.

yang akan berlekatan satu sama lain dalam bentuk kelompok. Paling sedikit 100 spenna motil yang dicacah.1 antiserum terhadap IgG manusia (dari Hoechst Behring ORCM-0/05. atau Dakopatts A089. maka sebagai metode penapisan mtin culcup untuk melakukan uji terhadap IgG saja. Akhiniya gumpalan partikel akan menjadi sedemikian besarnya sehingga spenna yang dilekati partikel partikel hanya dapat bergerak di tempat saja. Jika ada antibodi spenna. maka spenna akan terlihat berenang bebas di antara partikei-partikel.) atau sel darah domba yang dilapisi IgG. Setelah 2 sampai 3 menit dan sekali lagi setelah 10 menit siapan basah tersebut kemudian diamati dengan mikroskop biasaatau beda-fase dengan pembesaran 400 x atau 600 x. Denmark) diletakkan di atas kaca obyek. Pada uji MAR (Ortlio spenna MAR kit dari Fertility Technologies Inc. dan kemudian tetes antiserum dicainpur dengan memakai suatu kaca tutup besar (40 mm x 24 mm) yang kemudian diletakkan di atas campuran. Natick. Pada pemuilaan sperraa motil akan tampak berenang dengan dilekati sedikit atau segumpal partikel. Tetesan semen dan partikel terlapis IgG dicampur tsrlebili dahulu. 10 \i\ partikel lateks yang dilapisi IgG (dari Fertility Teclmologies Inc.1 semen segar tidak dicuci. yangdilakukan sebagai berikut: 10 (j. Persentase spenna motil yang dilekati partikel dihitung. dan 10 p. maka partikel lateks akan tampak melekat pada spenna motil. 69 .Lampiran XII Uji MAR Karena aiitibodi IgA hainpir tidak pernah timbul taiipa antibodi IgG. suatu bukti bahwa siapan efektif. USA). MA. Jika tidak ada antibodi pelapis spenna.

Catatan: Langkah pengendapan protein dcngan asam triklor asetat (TCA) tidak perlu karcna plasma semen tclali diencerkan banyak sckali sebelum reagen wania dibubuhkan.ih dikcmbangkan imtuk pcncntuan scng dalam scnun. .). cairan otak dan urin. KM35-440.4 I'cmbuatan siapan Siaprn semen discntrifugasi sclama 20 menit pada 2000 g.2 ." XIII.99 ml akuades). plasma. R (1987) Evaluation of a commercially available kit for the colonmclric determination of zinc in human seminal plasma. <(>. " Johnson. Lanitan kromogen ini jikan stabil untuk sntu minggu pada sului 2 . <fc Eliassnn.Stabilitas rcagcnsiu Pada suhu di bawah 25"C kit reagcnsia stabil imtuk bcberapa taluin {kit dapat dibcli dari: WakoPurc Clicinical Industries Ltd. International Journal of Andralngy. XIII. Plasma semen kemudian dituang ke tempat lain dan diencerkan 1 : 200 (yaitu 10 (j. uilai kadar scng yang dipcrolch dcngan cara ini dan yang dipcrolch dengan cara spcklroskopi absorbsi atom mciuinjukkan ada suatu korclasi yang baik antara cara ini dan cara spcklroskopi absorbsi atom. Lampiran XIII Pengukuran seng dalam plasma semen Latar bclakang Assay kolorimctrik mi icl. Barn-barn ini.1 plasma semen dibubuhkan kepada 1.3 I'cmbuatan dan stabilitas larutan kromogen Campurreagcn wania A dan wania B dcngan pcrbandingan 4: I (yaitu 20 ml reagen wania A dan 5 ml reagen wania B). XIII.10"C atau dua hari pada suhu kamar. scliingga cara ini dapat dianjurkan iintiik digunakan di laboratorinin yang tidak mcmpunyai pcralatan spcktroskopi absorbsi atom.70 XIII. Campuran tcrsebut hams disimpan dalam Icmari pembeku (freezer) sampai saat akan dilakukan analisis.

S Seng baku Seng baku disediakan oleh penisahaan pembuat kit sebagai Ianitan yang mengandung seng 30.6 mikromol/1. XIII. (2) (3) Bubiihkan 2. Hubungan antara absorbansi {A) dan kadar seng dalam plasma semen akan menipakan garis liuiis sampai sedikitnya 7 mM (mmol/l).6 adalah kadar seng baku faktor pengenceran plasma semen.4 (iinol atau lebih setiap ejakulat.5 ml lanitan baku.5 ml lanitan kcrja kromogen ke dalam tiap tabling.5 ml air (sebagai blangko).7 Pcrhitungan Kadar seng dalam plasma semen dihitung berdasarkan nimus: A siapan Kadar seng (mmol/l) = —■—~~ A baku dimana 30.8 71 Nilai normal 2. XIII. 0. dan 0. Campiiryangrata. X 30.6 x 200 -—---1000 dalam mikromol/1 dan 200 adalah .XIII. kcmudian biarkan lanitan pada suhu kainarselama 5 menit. Ukur absorbansi dalam waktu satu jam pada 560 nm dcngan menggimakau nilai lanitan blangko sebagai acuan.5 ml plasma semen yang telah diencerkan. t XH1.6 Tatacara assay Panjang gelombang Kuvet Suhu pengeraman 560 urn Tapak jalan caluiya 1 cm 20°-25<>c (1) Isi ke dalam tiga tabling reaksi masing-masing 0.

(ii) ml 6M NaOH.20° C (stabi! selama 4 minggii). simpan pada suhu . jika perlu bubuhkan NaOH agar menjadi lebih lindi.2. . 1. AturpH scliingga menjadi 7. pH hams lcbili besar dari 7. U9706 (metnch ultraviolet) Satu kit cukup untuk 30 pcmcriksaan. i XIV.1 Persiapan plasma semen Bubuhkan lanitan Bubuhkan 0. Botol 2 (liase sitrat): Buat larutan 2 dcngan nicmbtibuhkan 0. Kit bcrisi: Botol 1 (scbagiajibcsarNADH):Bi:atlanitan 1 dcngan nieinbiibiihkan 12 ml akuadcs. Ekstrak hams tampak jeniih. (iii) ZP. Bubuhkan 0.2 Tatacara Sentrifugasi ejakulat pada 3000 g sclama 15 mcnit atau pada 2000 g sclama 20 mcnit.2 DaparTRA(pH7J) (i) Larutkan 14. simpan pada suhu .Lampiran XIV Penentuan asani sitrat dalant plasma semen XI V.I XIV I. (iv) XIV.2 Ekstraksi (i) BubulikanO. XIV.9 g tri-ctanolamin dalam 750 ml akuadcs. Paslikan balnva sclunih ZnCI.1 (1) (2) Roa«cnsia Boehritiger Kit No.95 ml asam triklorastctat (TCA) 15%(150ml/L).027 gZnCI2 dalam 250 ml akuadcs.5 g natrium azida.l ml plasma semen ke dalam 4. tclali lanit.3 ml akuadcs.CI2 kcpada lanitan tri-ctanolamin.20" C (stabiI sclama 4 minggu). 2.75 XIV.6 dcngan cara mcmbubuhkan HCI pckat (ii) Lanilkan 0.

Absorbansi Ar Ar (iii) XIV. (iv) Campur dan Ukur absorbansi. extinction' x 3.4 Nilai Normal 52 timol atau lebih setiap ejakulat.-^x139 t XIV.) 6. .3 = 04. (v) Pcrhitungan Kadarasain sitrnt dalam mM (mmol/1) =-----------------------------x Pcngenceran ekstrak Koefisien (A.2 ekstrak plasma semen (ii) Campurdan ukur absorbansi pada 340 nm.2 m l Pcngcnccran absorbansi =______'_ x 58 x _______ .XIV.3 73 tunggu tcpat 5 menit.A.\ lanitan 2. Absorbansi Bubuhkan 20 y.3 ml dapar TRA 0.3 Pengukuran (i) Bubuhkan stiatu kuvet pengukur dengan: 0. 2.5 ml lanitnn 1 2.02 m l 0.

pada suhu 4°C untuk beberapa hari. Jika siapan tidak diassay dengan segera.2.74 XV. yaitu untuk siapan yang distabilkan (sudah diencerkan 1 : 1). Larutan (substrat)/?-nitrofcnol fosfat. H g A. 5 mm (mmol/1). pipet 20 (al plasma semen ke dalam 20 ^1 lanitan sodiumbisulfat dalam sebuah tabling Eppendorf(pHcampuran harus diantara 5 dan 6) untuk menstabilkan asam fosfatase selama penyimpanan pada suhu kamar untuk beberapa jam. (4) /7-Nitrofcnol (PNP). XV.20° C untuk beberapa bulan. (2) (3) 0. Encerkan plasma semen 10.8. 11 : 1 1 3 . Wetterner. encerkan 10 u. W (1979) Acid Phospatase in seminal fluid: Method of estimation and diagnostic significance.73 g asam sitrat bcbas air dalam akuadcs.1 dalam 0. (5) Sodium bisulfat (NaHS04. Larutkan 1. larutan induk untuk kurva baku.0695 g PNP dalam akuadcs. contoh 8 mg dalam 2 ml lanitan untuk pengukuran duplikat dari 8 siapan dan satu blangko) atau gunakan tablet Sigma 5 mg jika penimbang jumlah kecil substrat yang akurat tidak ada. Larutkan 0. atau pada suhu . atur pH sampai4.1 M NaOH. (i) Tidak lebih dari 30 menit setelah pencairan. (1) Lampiran XV Pengukuran asamfosfatase dalam plasma semena Regcnsia Daparsitrat. panaskan lanitan jika pcrlu. Andrologia.000 kali untuk assay.il substrat per pengukuran. sentrifugasi ejakulat pada 300 (ii).09 m (mol/l) dcngan pH 4.8dengan 1 mNaOHdanbubuhkanairsainpai lOOmlsimpan pada suhu 4° C. 0. dan jadikan 100 ml dalam labu ukur simpan pada suhu 4° C.I. Dibuat setiap hari.0.H. Hitting volume substrat yang dipcrlukan dan larutkan jumlah garain disodium/>-nitrofenol fosfat yang dibutuhkan dalam dapar sitrat sampai kadar 4 ing/ml (100 f.5 "Modifikasi dari Heite.2 2 . 12 g/l air) Mctode g selama 10 menit untuk memisahkan spenna.

Bubuhkan siapan yang diencerkan dan eram pada suhu 37° C selama 30 menit tepat.10 + 30 x 10000 Aktifitas asam fosfatase daiam plasma semen = (A -r.3 Pcrhitungnn 1 unit asam fosfatase = I ftmol PNP yang dihasilkan per menit pada suhu 37°C. (v) Hcntikan rcaksi cnzim dengan membubuhkan 1 ml Ianitan NaOH dan baca absorbansi pada 405 nm tcrhadap assay blangko.V)x F+ 1000 U/ml = (A -filx 37 U/ml Total aktifitas = U/ml x volume ejakulan dalam ml = U per ejakulat.ml dapar sitrat dan selanjutnya encerkan 10 fil dari pengenceran ini ke da I am 1 ml dapar. 20. Absorbansi bersih siapan (A) = absorbansi yangdiukur-absorbansi blangko. (iii) Untuk mengontrol assay.iM dan baca absorbansinya. Siapkan dan baca PNP kurva baku tepat sebchun pembacaan siapan-siapan. .1 ml ianitan snbstrat pada masing-masing tabling assay-dan panaskan selama 5 mcnit pada suhu 37° C.volume siapan + 30 menit x faktor pengencer plasma semen = 1110-=.40. ambil dua campuran (pools) plasma semen yang distabilkan. 80 dan 100 f.60. satu berisi aktivitas fosfatase asam tinggi dan lairmya dengan aktivitas asam fosfatase rendah yang telah diassay sebelumnya. Slope kurva baku (S) = absorbansi unit per \iM. Tabung-tabung tanpa siapan juga dicram sebagai blangko. encerkan kedua campuran dan assay bcrsamaan dengan siapansiapan. simpan pada suhu . (iv) Masukkan 0. Nilai normal 75 = 200 U per ejakulat atau lebih.S)x FinU/ml = (A + . (Pcmakaian tartrai untuk membedakan asam fosfatase lairmya dari cnzim prostat secara uimim tidak perlu dikarenakan aktivitas yang sangat tinggi enzim tcrscbut).1 M (mol/l) NaOH (lanitan ini adalah 100 fiMyaitu umol/l). j Larulkan 100 mm lanitan ini dengan 0. Faktor (F) = totai volume pengeraman •*.20° C.1M NaOH untuk rnendapal-kan baku dari 0. Masukkan 400 ^15 mM (mmol/1) Ianitan induk ke dalam labu ukur dan buat menjadi 20-ml dengan 0. XV.

Biarkan tabling selama 15 menit kemudian scntrifugasi Gunakan 0. (vi) analisis.8 niM): 50.14 mM. (1955) Colorimetric determinalion of fructose with intlol.l'M (3) akuades.5 ml dari cairan supernatan jemih untuk (Total pengenceran plasma semen adalah 50 x (1 + 0. M. Dapat disimpan dalam keadaanbcku dalam siapan yang sesuai.O l. satu bagian laaitan induk dicnccrkan mcnjadi masing-masingO.3 + 0. dengan cara mcngocoknya dalam bak air 25 mg iudol. (5) Larutan kerja fruktosa haku: Pada hari akan dilakukan analisis. yaitu 75 kali). "Karvonen. Lanitan kcmudian disaring dan disimpan pada 4°C. MJ.2 (i) Pcrsiapan plasma semen Encerkan plasma semen menjadi 1 : 50dcngancara mcmbubuhkanO. kemudiaii laniikar. 100 ml bubuhkan (2) NaOH0. 1 ml semen kepada 4.7H. 7:305 -307 Bubulikan 0. (ii> Masukkan 1 ml plasma semen yang telah diencerkan ke dalam tabling sentrifus. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. Bubuhkan 200 mg asam benzoat kcpada panas(kira-kira60°C).2) ml -s.S%(l. (4) Larutan indukfruktosa bakti (2.8% ke dalam tabling di atas . (iii) kemudian diaduk.9 ml akuades.3 ml seng sulfat 1. Reagen lndol.28 mM dan 0.2 ml NaOH kemudian adtik yang rata.Lampiran XVI Penentuan fruktosa dalam plasma semen manusia0 XVI. (iv) Bubuhkan 0. XVI. I (1) Rcagcnsia ZnSO4.& Malm. Jikasclunih asam bciizoattclahlanit.1 ml. (v) pada 2000 g selama 20 meuit.4 mg fruktosa dilanitkan ke dalam 100 ml akuades.

XVI. Ke da lain tabling pertama masokkan 0.it ninius: j 0. 139106). .* (iii) Tiituplah tabling kemudian eram selaina 20 nienit pada temperatiir 50° C. ke dalam tabling ketiga masukkan 0. niciutn. .5 ml dari 0. (i) Ainbil 4 tabling gclas dengan penutup. Ke dalam tabling kedua masukkan 0.S'.) 0.14 mM dan 0. XVL5 Nilai normal 13 HJTIOI atau lebih setiap ejakulat. XVI.2).14mM lamtan fniktose baku. * jika penggunaan HCI pekat tidak menyenangkan. Faktor pengenceran ^dari plasma semen adalah 75 (lihat XVI. mcnipakan bacaan rata-rata absorbansi untuk fruktosa beiku. dan F adalah rata-rata fnktor baku fruktosa.14 F= •/. kemudian baca absorbansi pada 470 nm.5 (ii) Pada setiap tabling di auis bubuhkan 0.5 ml reagen indol dan 5. (iv) Dinginkan dalam air es schingga mencapai suhu kamar. ( ----. sebagai gantinya tetapi nicrupakan 77 assayenziniatikyanglcbilinialialmenggunakan spektrofotometerultraviolet(Boehringer Mannlieim kit No.s--.+ s.28 diiuaua Sl dan .0 ml HCI pekat. inasiiig-masing 0.4 Pcrhitungan Kadar fruktosa (nimol/l) di nuiiui: dalam plasma semen: AtxFx <p As adalah absorbansi siapnn plasma semen.28 inM lanilan kerja fniktose baku. f adalah pcngcnccran (fraksi volume) siapan.5 ml akuades (Reagensia blangko).28 mM. dan ke dalam tabling keempat inasukkaii 0.5 ml dari 0.3 Tatacara cksperi men ml cairan supernntan plasma semen yang telah dien-cerkan dan dideproteinasi.

2 in).8 atau lebih banyak K. XVII.1 ml induk 10 mM dalam 0.1 in) mengandung 1% sodium dodesjJsulfat (SDS) penghambat alfa-glucosidasc asam.O dalam 500 ml akuades.20 g Na. (2) /7-Nitrofenol glukopiranosid (PNPG.8 dengan lncnambahkan lebih banyak KH.. Dalam scbagian besar studi klinik tcrdaluilu. Atur pH sampai 6..8. (3) Kastanospcmtin (lmM. Larutan lmM: bubuhkan 0.CO. plasma sen ten jnga ntcngandung isoenzim asam yang berasal dari prostat dan dapat dihambat sccara seleklif (Pagnin dkk. Scbagai tambahan nntiik isocnzim netral yang bcrasat dari cpidid>mis.78 Lampiran XVII Penentuan alfa-glukosidase netral dalam plasma semen.2 M) dan 13 ml KH. Sisa larutan disimpan pada suhu -20° C. Tepat sebclum dipakai. Panaskan dan adtik di atas piringan panas pada suhu 50° C untuk kira-kira 10 menit supaya larut. 1990). Induk 10 mm: lamtkan 1 mg kastanospennin dalam 0. substrat.PO.COvH. total aktifitas enziin diukur pada pF5 6.HPO4 (0. volume yang diperlukan dibuat baru untuk setiap assay. (0. penghambat alfa-glukosidase). Campur 12 ml K. Assay berikut incningkalkan kekhususan peng-ukuran alfaglukosidase scbagai pctanda cpididymis (Cooper dkk. 1984).2 ml larutan tersebut pada suhu 4° C. 5g/l dapar).HPO Jika pH kurang dari 6.1 (1) Kcagcnsia Dapar fosfat pH 6. Tambahkan jumlah yang tepat dari PNPG ke volume yang diperlukan dari reagensia (contoh: 25 mg/5ml). .8 (0. jika pH Icbih dari 6.9 ml akuades dan simpan 0.53 ml akuades dan simpan pada suhu -20° C. dan jadikan 40 ml dengan akuades.1 M) Lamtkan 6. (4) Na.8. lanilkan SDS dalam volume dapar yang diperlukan (yaitu 50 mg untuk 5 ml).PO. Jadikan volume akhir 50 ml dan simpan pada suhu 4° C. (0.

XVir. 20. 40. 5 mM. Eiiccrkan lanitan 100 uM (\i mol/1) dcugan 0. Simpan pada suhu 4° C dalam botol benvama coklat.60.(5) p-Nitrofenol (PNP.3 Pcrhitungan I unitalfa-glukosidasc= 1 nmol PNPdihas!!kanpermenitpada37°C.il dari plasma semen yang incngandung glukosidase rendah dan masukkan masingmasing kc dalam 100 ul PNPG.1 M Na2CO3 untuk memberikan baku 0.1 M Vortex masing-masing tabling dan cram sclama 4 Scbagai blangko semen masukkan 10 ul Sebagai baku internal Lctakkan duplikat 10 ul plasma semen (menggunakan pipct pemindah Cairkan dan vortex sperma bebas plasma semen yang disimpan pada . (laaitan in i adalah 100 |iM . (iii) Siapkan lanitan PNPG (2 x 100 ul untuk setiap siapanatau blangko).2 Mctodc (i) Siapkan bak air pada suhu 37° C untuk pcngeramaii. (viii) jam dakjm bak air pada suiiu 37° C (suhu dan waktu pengcraman yang tepat adalah mencntukan). paiiaskaii larutan jika perlu dan jadikan 100 ml dalam labu ukur.80 dan 100 \\M dan baca absorbansi. (vii) plasma semen dari siapan dengau glukosidase tinggi dan rendah (atau siapan individu yang sama)masing-masing dalam |00ul PNPG. (ix) Na2CO3 pada masing-masing tabling dan vortex.CO. Bubuhkanmasing-masing 5 ul kastanospenuiu. (iv) posiliO ke dalam 100 ul PNPG dalam tabling Eppcndorf dan vortex. (x) tabling ke 96 piring suinur (96-wellplate) dan baca absorbansi pada 405 nmgunakan blangko air untuk diatur kc angka 0.0695 g PNP dalam akuades. (v) Scbagai blangko air: 10 f. (ii) suhu -20° C.il air dalam 100 ul PNPG. XVII.1 M Na. (vi) untuk kontrol interassay: 10 ul dari plasma semen yang incngandung glukosidase tinggi dan 10 f. untuk kurva baku). Slope dari Siapkan kurva PNP baku (kurang dari 1 jam Pindahkan 250 ul dari masing-masing Henlikan pengcraman dengan penambahan 1 ml 0. (xi) sebelum pembacaan absorbansi). Larutkan 0. buat I am tan bam setiap 3 bulan. Masukkan 400 ul 5mM lanitan induk ke dalam labu ukur 20 ml dan jadikan 20 ml dengan 0.

Faktor (F) = total volume -s.46 Aktifitas alfa-glukosidasc netral dalam siapan = (A + S) FmU/ml Aktifitas total = mU/ml x volume ejakulat = mU/ejakuIat.volume siapan H- 240 men it = 0.kurva baku (S) = absorbansi unit nM. 79 . Absorbansi bersih siapan (A) = absorbansi rata-rata blangko semen.

J. dan ko-reksi yang sesuai hams dilakukan untuk perhitungan hasil peme-riksaan.1 ml) adalah untuk pemakai pembaca 96-well plate dan tabling Eppendorf.. Dube. Journal of Andrology..4 Nilai normal 20 mil per ejakulat atau lebih.R.Y.4glucosidase.XVII.5:277-82.-volumeyangdigunakandalammetodediatas (volumetotal 1... R.. & Trcmblay.T.H. C. International Jaurnai ofAndrology . Catafa/i. F& Nieschlag. P.G. R. Chapdclaine. Jockcnliovel. Volume ini dapat ditakarkan sccara proporsional jika digunakan cuvettes spektrofotomcter dan tabling erain yang berbeda. Naslian. (1984) Similar biochemical properties of human seminal plasma and epididymal alfa-l. D. (1990) Improvement in the assessment of human epididymal ftinction by the use of inhibitors in the asssay of-alfa-glucosidase in semional plasma. 13:279-305 Paquin. . Rujukan Cooper. Ycung..

Simpan cairan larutan ini dalam keadaan bcku pada sului -20° C. Biarkan pada suhu 37° C paling sedikit 30 menit (tetapi tidak lebih lama dari 120 menit) dan periksa scl-sel spenna dengan mikroskop beda fase. sepcrti ditunjukkan pada gainbar. XVIII. Bubuhkan 0. Cairkan dan aduk dengan baik sebelum dipakai. 1. Ulangi dua kali skor spenna yangmembengkakdalain 100 spenna yangdicacah dan hitung skor rata-rata.l Larutan Pcmhcngkak Larutkan0.2 Mctodc Panaskan I ml larutan pcnibcngknk dalain tabling Eppendarf tertutup pada suhu 37° C selama kira-kira 5 menit.g bertMgai nucam perutiahan ekor. Penamptlan ikentalik perubahan morfologi khas akibat pengaruh hipoosnwxik a lidak berubah. XVIII.735g sodiumsilratNajCjHjOj.Lampiran XVIII Uji Bengkak hipo-osmotik (Hypo-osmotic swelling test) untuk spermcf XVIir.1 ml semen yaag tclah incncair dan aduk dengan pipct secara hati-hati.351gfmktosa ke dalain 100 ml akuadcs.ZHjOdan t. Bengkak dari spenna dibuktrkan scbagai penibahan dalain bentuk ckor. Daerah ekor ditandai yang membengkak ipfemi manusia arsinn (a) (e) (f) . b .

(b) .

. Crabo. I'crcz-Pclaez. B. Van der Ven.© J Jjyondra...J. II. (I 9S4) Development of an assay to asses the functional integrity of the human sperm membrane and its relationship to other semen characteristics.S. Journal of Reproduction MiJ Fenihiv. L.II. M.D. 70 -28 81 2 I 9 .G & Zaneveld. R.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->