Liposom Sebagai Sistem Penghantaran…(Marline Abdassah

)

LIPOSOM SEBAGAI SISTEM PENGHANTARAN OBAT KANKER (Review Artikel) Marline Abdassah Jurusan Farmasi FMIPA UNPAD, Jatinangor-Sumedang

PENDAHULUAN Liposom mulai dikembangkan oleh Bangham pada tahun 1965 sebagai sistem penghantaran obat, sejak itu mulai banyak penelitian tentang liposom yang digunakan untuk drug targeted, karena sistem ini mudah dimodifikasi . Sistem penghantaran obat kanker dengan sistem liposom bertarget merupakan obyek utama dalam penelitian liposom karena melalui sistem sistemik tidak hanya bekerja di sel kanker tapi bekerja di sel lainnya. Pada artikel ini akan mulai dibahas dengan pemahaman tentang formulasi dan evaluasi dari sistem liposom itu sendiri.

FORMULASI LIPOSOM

Liposom adalah suatu vesikel berair yang dikelilingi oleh membran lipid lapis ganda uni lamelar atau multilamelar (gambar II.1), terbentuk secara spontan ketika fosfolipid dihidrasi dengan sejumlah air. Lipid lapis ganda terbentuk dengan stabil karena mempunyai tingkat energi yang minimal. Hal tersebut disebabkan bagian hidrofil fosfolipid menjauhi bagian lipofilik dan juga adanya interaksi van der Waals yang kuat antar rantai asil (Ostro,M.J., 1987).

= obat larut air = obat lipofilik Gambar .1 : Liposom (Waalkes M.B., 1990)

1

Pada prinsipnya transisi disebabkan oleh kebebasan rotasi dari ikatan tunggal karbon-karbon dan 2 R1 dan R2 : rantai asil lemak. terbuat dari telur atau kedelai dan sekarang tersedia dalam bentuk sintetisnya sehingga komposisi asam lemak dari fosfatidilkolin ini dapat diketahui dengan jelas.G. Fosfatidil kolin adalah salah satu fosfolipid yang paling banyak digunakan dalam sistem liposom.. 1981) Pada fasa transisi . dan pemanasan diatas temperatur transisinya maka fosfolipid akan melewati fasa kristal cair dan selanjutnya berubah menjadi fasa cair sehingga meningkatkan pergerakan molekulnya. fosfolipid di bawah temperatur transisinya akan membentuk suatu fasa gel atau fasa padat. . faktor penting yang berpengaruh terhadap struktur fosfolipid adalah faktor hidrasi dan temperatur.. Jadi dalam pembuatan liposom. Untuk memekatkan fasa lipid dalam air memerlukan temperatur rendah agar terbentuk fasa gel dan temperatur tinggi untuk berubah menjadi fasa kristal cair. Proses transisi ini terjadi karena adanya interaksi intramolekular (rotasi isomer dan efek anisotropik) pada fosfolipid dan antarmolekular fosfolipid (van der Waals) pada lipid lapis ganda (Knight C.1981).G. Struktur lamelar dalam keadaan gel padat Struktur lamelar dalam keadaan gel cair Gambar . Sifat termodinamika yang harus diperhatikan pada fosfolipid adalah fasa transisi dan interaksi molekular dari fosfolipid (Knight C. Jadi ada hubungan antara temperatur transisi dan jumlah atom karbon per rantai hidrokarbon.. R : asam amino Gambar .1981) Lipid lapis ganda terbentuk karena sifat termodinamika fosfolipid.2 : Struktur Umum Fosfolipid (Knight C. terdiri dari bagian kepala yang polar ( gugus fosfat) dan bagian hidrofobik ( satu atau dua molekul asam lemak). Proses hidrasi dimulai dengan formasi fasa serbuk dalam air dan setelah itu terbentuk fasa lipid yang stabil .Liposom Sebagai Sistem Penghantaran…(Marline Abdassah) FOSFOLIPID Fosfolipid adalah suatu senyawa ampifilik yang mempunyai struktur dasar gliserol (gambar . 1981).3). terjadi transisi struktur lipid lapis ganda dari fasa gel (padat) menjadi fasa kristal cair karena pengaruh perubahan temperatur (gambar II.G... Hal ini berkaitan erat dengan penggunaan liposom sebagai penghantar obat dalam proses preparasi dan pemilihan jenis fosfolipid.G. Identifikasi fase transisi lipid memberikan kesimpulan bahwa konformasi hidrokarbon berperan penting untuk transisi.2).3 : Fasa Termodinamika Lapis Ganda Fosfolipid (Knight C. Fase transisi dari lipid lapis ganda melibatkan titik leleh atau kerapihan deretan rantai hidrokarbon dari fosfolipid. Senyawa ini bermuatan netral sampai sedikit negatif.

KOLESTEROL Kolesterol sering ditambahkan ke dalam komposisi liposom. Reaksi oksidasi bisa terjadi pada rantai asam lemak tidak jenuh dari molekul fosfolipid Jadi harus diperhatikan pada saat preparasi dan cara penyimpanan liposom. 2002). Sebagai hasil reaksi hidrolisis adalah molekul lisofosfolipid. Bila cara pemasukan obat tidak efisien maka akan kehilangan zat aktif selama proses tersebut sehingga penggunaan liposom sebagai penghantar obat menjadi tidak efisien dan tidak ekonomis (Barenholz.Liposom Sebagai Sistem Penghantaran…(Marline Abdassah) keadaan rotamerik. 1984). 3 . Pada stabilitas liposom ada dua jenis utama penyebab dekomposisi lipid yang mungkin terjadi pada lipid lapis ganda adalah reaksi oksidasi dan reaksi hidrolisis. sedangkan bagian ekor yaitu hidrokarbon dari rantai asam lemak fosfolipid yang bersifat lipofilik memberikan efek anisotropik dan akibatnya terjadi pergerakan rantai hidrokarbon yang lebih besar dibandingkan dengan bagian kepala .( Gregoriadis et al. Pengukuran temperatur transisi fosfolipid dapat dilakukan dengan Differential Scanning Calorimetri (DSC) (Knight C.1981). identifikasi dan analisis kuantitatif. G.. Efek anisotropik.J. Jadi molekul protein tidak mudah berpenetrasi ke permukaan liposom.1987). MASUKNYA OBAT KE DALAM LIPOSOM (Drug Loading) Masuknya obat ke dalam liposom harus terukur dengan alat ukur. Kolesterol dan muatan tidak hanya mempengaruhi deret rantai asil fosfolipid tetapi juga difusi lateral dari lipid membran.2003). Tidak hanya keadaan rotamerik yang mempengaruhi fase transisi tapi juga jumlah rotasi gauche per molekul. misalnya penurunan rasio kolesterol terhadap OPP (obat kanker payudara) kurang dari satu cukup mempengaruhi karakteristik fluiditas membran dan sekaligus mampu memperbaiki aktivitas terapi obat (Koklic J. Hal ini penting untuk seleksi formula liposom yang optimal. Hal ini akan berkaitan dengan pencapaian tingkat terapetik obat atau akan memerlukan sejumlah besar lipid untuk mecapai tingkat tersebut. Untuk interaksi antar molekul yang terjadi pada molekul fosfolipid diantaranya disebabkan oleh interaksi Van der Waals. pada molekul fosfolipid akan menuntun arah bagian kepala yang polar menghadap ke permukaan air . Untuk penetapan fosfolipid dapat dilakukan dengan cara penetapan kadar fosfor menurut Fiske dan Subbarow . hal ini terbukti dalam deretan struktur kristal cair dengan studi EPR (Electron Paramagnetic Resonance). Teknik analisis fosfolipid dapat dilakukan dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) (Ostro M. Studi ini dilakukan dengan tujuan untuk memahami sifat fisik membran dan efeknya pada sel tumor. asam lemak dan gliserol. terakomodasi diantara molekul fosfolipid pada membran lipid lapis ganda liposom dengan perbandingan 1:1. Reaksi hidrolisis bisa terjadi pada molekul fosfolipid di saat proses separasi. Seleksi fosfolipid dapat dlakukan untuk meminimalisasi proses oksidasi. Bila pemasukan obat kurang maka rasio obat per lipid juga kurang. Pada proses preparasi dan penyimpanan liposom harus selalu dialiri gas nitrogen atau argon diatasnya dan atau ditambahkan anti oksidan seperti alfa tokoferol ke dalam formulanya.. Rotari isomer berada dalam tiga bentuk yaitu trans. gauche dan antara trans gauche. et al. Pengaruh kolesterol terhadap stabilitas liposom adalah untuk pengepakan barisan molekul fosfolipid pada lipid lapis ganda liposom..

daunorubisin dan doksorubisin masuk ke liposom secara aktif ke dalam fasa air (DaunoXome dan Doxil). Obat masuk ke bagian air liposom melalui cara pasif untuk jenis obat yang berberat molekul rendah dan tinggi. 2003). Untuk memperkecil dan menyeragamkan ukuran liposom dapat dilakukan dengan pengocokan suspensi liposom dengan vortex. Teknik ekstrusi yang paling baik untuk menyeragamkan distribusi ukuran liposom ( Knight C. Setelah obat masuk. dapat dikombinasikan dengan struktur liposom dan tempat injeksinya sehingga dapat menentukan kecepatan pelepasan obat. Obat yang terjerat dalam membran liposom mempunyai berat molekul rendah dan tinggi. Contoh liposom yang telah disetujui untuk penggunan klinik yaitu : ampoterisin B masuk ke membran liposom (Ambisome). yaitu Kp rendah untuk minyak/dapar dan Kp medium sampai tinggi untuk Kp oktanol/dapar.1981). apabila pelepasan obat lebih lambat dibanding eliminasi obat bebasnya maka liposom obat akan menentukan farmakokinetik dan biodistribusi obat. Bila proses eliminasi lebih cepat maka formulasi liposom gagal. 2) senyawa ampifatik. LUV).G.. komposisi lipid dan volume dapar. konsentrasi . juga ada metode lainnya berdasarkan teknik pembuatan antara lain injeksi pelarut. Dengan mengetahui koefisien partisi dapat ditetapkan cara obat masuk ke dalam liposom. Misalnya penghantaran liposom obat melalui intravena. Untuk meningkatkan ukuran MLV yang reprodusibel perlu dipertahankan waktu hidrasi dan agitasi. Lipid akan terdeposit dari pelarut organik dalam bentuk lapis tipis pada permukaan dinding labu dengan menggunakan alat rotari evaporator vakum. sonikasi atau ekstrusi melalui membran filter polikarbonat. Preparasi MLV dapat dibuat dengan cara yang sederhana dengan peralatan laboratorium yang biasa. Obat terjerat karena terjadi interaksi hidrofobik atau interaksi elektrostatik dan atau campuran ke duanya. Obat yang berberat molekul rendah dan terionisasi masuk secara aktif. detergen pemisah dan metode lainnya. SUV) dan vesikel uni lamelar besar (Large Unilamelar Vesicle. vesikel unilamelar (Single Uni lamelar Vesicle. Setelah itu dapat ditetapkan jenis liposom yang digunakan. MLV). proses hidrasi. Pertama kali diterangkan oleh Bangham pada tahun 1965. PREPARASI LIPOSOM Preparasi liposom selain menggunakan metode pembuatan khusus vesikel multi lamelar ( Multi Lamelar Vesicle.Liposom Sebagai Sistem Penghantaran…(Marline Abdassah) Klasifikasi obat yang dapat dimasukan dalam liposom dilakukan berdasarkan koefisien partisi minyak/dapar dan oktanol /dapar yaitu 1) senyawa hidrofilik (larut air) dengan harga Kp rendah untuk minyak/dapar dan oktanol/dapar. 3) senyawa lipofilik mempunyai Kp tinggi untuk minyak/dapar. Metode pemasukan obat ke liposom dapat dilakukan dengan dua cara : 1) masuk ke membran liposom dan 2) fase air dalam liposom. Sejumlah larutan dapar ditambahkan dan lipid akan terhidrasi pada temperatur diatas temperatur transisi lipidnya. ketebalan lipid lapis tipis . Hal ini terjadi pada siprofloksasin yang dimasukkan dalam liposomes ( Barenholz. Liposom MLV sangat cocok untuk proses enkapsulasi dari berbagai substansi dan dapat dibuat dari berbagai macam komposisi lipid. a) Vesikel Multi Lamelar Liposom MLV dapat dikatakan sebagai bentuk awal liposom. Faktor yang paling penting dalam preparasi MLV adalah waktu . Teknik pembuatan liposom MLV ini merupakan metode pilihan pada berbagai macam 4 stealth .

3) muatan liposom. Vesikel LUV dapat dipisahkan dari material yang tidak terenkapsulasi dengan teknik flotasi berdasarkan perbedaan gradien zat. Distribusi ukuran LUV. Vesikel ini mempunyai volume fasa air yang lebih besar dibanding SUV ( Knight C.( Fiske & 5 .G. KANDUNGAN TOTAL LIPID Penentuan kandungan total fosfolipid dalam dispersi liposom ditentukan dengan cara penetapan kadar fosfor dari fosfolipid yang digunakan .G. Liposom LUV yang dihasilkan dengan cara ini disebut REV (Reverse Evaporation Vesicle). Bila dipanaskan di bawah temperatur tersebut akan menyebabkan agregasi dan terjadi kerusakan pada lipid lapis gandanya..G. Proses sonikasi juga harus dilakukan diatas temperatur transisi lipid yang digunakan. adalah mikrovesikel yang mengandung lipid lapis ganda yang menutupi fasa berair dari liposom. sifat fisika dan sifat kimia partikel liposom.C. (Knight C. dengan cara mendestruksi lipid terlebih dahulu dengan asam perklorat 70 %. KARAKTERISASI LIPOSOM Dari aspek farmasetika. Penambahan kolesterol dan lipid bermuatan akan meningkatkan volume enkapsulasi. et al. Pengukuran sifat hidrodinamik ini seperti ukuran.1981). untuk kebanyakan fosfolipid adalah uniform ( Knight C.rasio molar).1981). Kisaran ukuran LUV sangat sensitif dengan keberadaan kolesterol yang diinklusikan dalam lipid. volume jeratannya 0.). diikuti dengan penguapan pelarut organik tersebut di bawah tekanan vakum. 2) ukuran dan distribusi ukuran liposom. Liposom hasil sonikasi yang berukuran 22 – 50 nm sangat tergantung dari komposisi lipid. Preparasi SUV melalui Probe Sonicator menggunakan logam yang dicelup pada suspensi liposom dan akan menggetarkan dispersi.1981).17 – 0.. bentuk. Selanjutnya fosfor dideteksi dengan penambahan reagen molibdat dan larutan vitamin C 10 % membentuk larutan berwarna selanjutnya diukur dengan spektrofotometer pada 812 nm.Y. Enkapsulasi maksimum dari fasa air liposom dapat mencapai 65 %.8 um.1981). Jadi karakterisasi liposom meliputi 1) kandungan total lipid liposom. 1989). Light scattering dan seterusnya ( Knight C.47 um dan berukuran 0. muatan dan komposisi liposom. luas permukaan dan berat SUV dapat menggunakan NMR ( Nuclear Magnetic Resonance). 4) kadar obat dalam liposom (Ozer A.1981) c) Vesikel Unilamelar Besar Vesikel LUV dibentuk dari emulsi fosfolipid dalam dapar dengan kehadiran fase pelarut organik.. Preparasi REV/LUV mempunyai kelebihan dibanding vesikel lain yaitu mempunyai daya enkapsulasi yang tinggi dari fasa air liposom yaitu 20 – 60 %. Struktur hidrodinamik dari SUV telah dipelajari oleh Huang 1969. Vesikel yang terbentuk dari kolesterol/fosfolipid ( 1:1. waktu sonikasi dan jumlah kolesterol pada campuran lipid. Proses ini disebut metode Evaporasi fasa Balik. Keterbatasan liposom MLV yaitu mempunyai kapasitas enkapsulasi relatif rendah dibandingkan dengan LUV ( Knight C. b) Vesikel Unilamelar Proses sonikasi dari dispersi fosfolipid akan menghasilkan sediaan yang jernih (Sanders et al. Namun logam kemungkinan akan mengkontaminasi dispersi liposom itu sendiri.G..Liposom Sebagai Sistem Penghantaran…(Marline Abdassah) eksperimen pada sistem penghantaran obat. parameter kritis yang mempengaruhi penampilan masuknya obat ke dalam liposom secara in vitro dan in vivo adalah ukuran.. adalah struktur liposom yang mempunyai ukuran dengan diameter minimal 20 nm.

1995).12MoO3 + 51 NH4+ + 72 OH7(NH4)3PO4. Crommelin dan Barenholz telah membuat tabel 6 .36 H2O --7(NH4)3PO4. e) sedimentasi dan f) cara ekstrusi ( Knight C.D. Idealnya gaya repulsif adalah sangat kuat untuk mencegah agar tidak saling berdifusi dimana gaya atraktif dari van der Waals mendominasi terjadinya agregasi (Nicoli D. akhirnya akan dieksresikan dari tubuh atau terakumulasi di organ lain. uji klinis dan tahap akhir produk. 2003). Partikel koloid tersebut akan menghasilkan repulsi masing masing pada jarak tertentu.al. Reaksi yang terjadi setelah proses dekstruksi fosfolipid adalah sebagai berikut 7PO4 3. Single Uni Vesicle ).. reprodusibilitas dari bets ke bets dan stabilitas dispersi liposom telah ditetapkan. Muatan liposom dapat diukur melalui harga potensial zeta. Hal ini berlaku bagi sistem liposom agar dapat diprediksi terjadi tidaknya agregasi maupun fusi di kemudian hari . 1987) Vesikel yang unilamelar dibagi dalam dua kelas ukuran yaitu vesikel yang berukuran dibawah 100 nm dikenal dengan vesikel unilamelar (SUV. Mekanisme fisika yang biasa digunakan untuk menstabilkan sistem koloid adalah repulsi elektrostatik.G. PENGENDALIAN MUTU BENTUK SEDIAAN LIPOSOM Pengembangan formulasi liposom menghasilkan 10 produk komersial berupa liposom dalam bentuk sediaan parenteral dan bukan parenteral telah berhasil dipasarkan.. d) elektroforesis. misalnya ukuran liposom dan lamelaritas sering heterogen dan sulit dijadikan parameter (Crommelin D.1981).Liposom Sebagai Sistem Penghantaran…(Marline Abdassah) Subbarow).1997).J. sedang yang berukuran lebih dari 100 nm disebut dengan vesikel unilamelar besar(LUV. Large Uni Vesicle).al. Dalam Dynamic Light Scattering pengukuran potensial zeta selalu dikaitkan dengan analisis ukuran partikel . Tujuan pengukuran muatan sistem koloid pada umumnya adalah untuk memprediksi stabilitas sistem koloid.+ 12 (NH4)6Mo7O24 . Semua formulasi tersebut telah memenuhi kriteria farmasetika dalam memastikan penampilan liposom. Schuber F. Karakterisasi fisika dan kimia liposom sangat kompleks. b) permeasi gel. Proses agregasi disebabkan oleh gaya van der Waals (Philiphot J.A.F.. muatan dan stabilitas sterik PEG2000DSPE (polyetilenglikol 2000 disteroyl phosphatidyletanolamine) berpengaruh terhadap fluiditas membran liposom dan signifikan terhadap aktivitas anti tumor ( Koklic et . c) sebaran cahaya . Definisi yang diperlukan untuk karakterisasi dispersi liposom adalah tahap praformulasi. dengan hanya pengukuran distribusi ukuran partikel saja tidak akan mampu memprediksi kecepatan agregasi partikel dikemudian hari.L et. MUATAN Kolesterol.12MoO3 + reduktor lemah -Mo 5+ Christian G.(Scherphop G.. Sehingga faktor muatan liposom ini perlu diperhatikan pada formulasi liposom terutama pada saat pemilihan fosfolipid. Penentuan ukuran dan distribusi ukuran liposom dapat menggunakan peralatan sebagai berikut :a) mikroskop elektron.2002).R..1994) UKURAN DAN DISTRIBUSI UKURAN Ukuran liposom merupakan salah satu parameter kritis terhadap perlaku liposom in vivo karena yang berukuran kurang dari 100 nm dapat mencapai dan dapat dinternalisasi oleh sel parenkhim hati sedangkan untuk yang berukuran lebih dari 100 nm akan diambil oleh sel makrophag.

Ion exchange kromatografi.----------------------------------Karakterisasi dasar pH pHmeter Osmolaritas Osmometer Volume jeratan Pengukuran fasa air dalam intraliposom Konsentrasi Fosfolipid Kandungan fosfor ( Barlett). KCKT. field probe dan pH Field probe Potensial Zeta Mobilitas elektrophoretik Sifat thermotropik DSC.sub mikron Dynamic Light Scattering (DLS) Static light scattering(SLS) Mikroskop.mikron Coulter counter.1 preparasi liposom seperti yang Tabel 1 : Ringkasan Pengendalian Mutu Formulasi Liposom ( Barenholz dan Crommelin. enzimatis Otooksidasi rantai asil fosfolipid konyugasi diena.------Jenis Pengukuran Metode -----------------------------------------------------------------. Turbidimetri .ESR.-----------------------------------Karakterisasi Fisik Penampilan Protokol (inspeksi visual) Distribusi ukuran vesikel . 2003) ---------------------------------------------------------------------------------------------. mikroskop cahaya difraksi laser. KCKT Konsentrasi asam lemak yang tidak teresterifikasi KCKT. 19 F-NMR masuk ---------------------------------------------------------------. protokol farmakope Rasio zat aktif /fosfolipid Determinasi Zat aktif/konsentrasi Lipid (H+) atau ion sebelum dan sesudah indikator Fluoresen. presipitasi dengan polielektrolit. KCKT ------------------------------------------------------------. spektroskopi Raman.Kromatografi gas. ESR. KCKT Konsentrasi senyawa aktif Residu pelarut organik dan logam berat NMR..KCKT Komposisi rantai asil fosfolipid Kromatografi gas Konsentrasi kolesterol enzimatis. NMR. KCKT Degradasi Anti oksidan KLT.-----------------------------------------Potensi Muatan Permukaan pH permukaan ikatan membran. kromatografi gel. 31P-NMR. SLS dan obkurasi cahaya -------------------------------------------------------------.Liposom Sebagai Sistem Penghantaran…(Marline Abdassah) ringkasan kontrol kualitas untuk ditunjukkan pada tabel . ultra sentrifugasi ------------------------------------------------------. lipid peroksid.-----------------------------------------------Penetapan mikrobiologi Sterilitas Protokol farmakope Pirogenisitas Protokol Farmakope 7 . Metode Fluoresen FTIR. turbidimetri Persen obat bebas Gel ekslusion kromatografi. Enzimatis Komposisi Fosfolipid KLT.----------------------------------------Stabilitas Kimia Hidrolisis Fosfolipid HPTLC. TBARS dan komposisi asam lemak (Kromatografi gas) Autooksidasi kolesterol KLT.

1987. Liposomes Res. F.. Liposome-Incorporated 3’5’-o-Dipalmitoyl5-Fluoro-2’-Deoksyuridine as a Slow Release Anti Tumor Drug Depot in Rat Liver Macrophag. Int.. Crommelin. 6 ( 1). C. G. Schuber.B. J. Weinstein J. Waalkes. 2002. Szoka F. Analytical Chemistry. 185-191. Barenholz. Liposomes Res. 1994.. Christian G. D. Ther. Gert Storm.. H..D.M. Spanjer. 1-9. M... Ostro. J.. M. 13 ( 1). Talsma. 1990. J. J.J. 55. 13 (1).H. Marcel dekker.A. November. Sentjurc. CRC Press.and Immunotherapy of Cancer. 728.G... Liposomes : from Physical Structure to Therapeutic Applications. North Holland. G. Papahadjopoulus D. Lipid. CRC Press. 2003. 33-36. Liposomes as Tools in Basic Research and Industry. 51-69. 8 . 216217. 1987. Liposomes in Chemo. . Greogoriadis..Y.. Ozer.. Florida. Y. Liposomes Res. 896.A.N. Scherphop. Y. 1995.. 2003. 1-8. F. Bab 3. Roerdink. 1984. G. Preparation and Stability of Liposomes containing 5fluorouracil. 1989.R.H. A.. Liposomes as Pharmaceutical Dosages Forms. T. Koklic. Scherphop... H. Crommelin D. University of Washington.Liposom Sebagai Sistem Penghantaran…(Marline Abdassah) DAFTAR PUSTAKA Barenholz. 335-352.. John Wiley & Sons Inc. Knight. R. Daemen.. ”Liposome: From the Bench to the Bed”. Bab 9. M... Marcel Dekker Inc.. Pharm. J. Liposome Technology Volume III. Relevancy of Drug Loading to Liposomal Formulation Therapeutic Efficacy. Zeisig.. 6-10.J..L. 279-306. The influence of Cholesterol and Charge on Membran Domein of Alkyl Phospholipid as studies by EPR. 1981. 12 (4). New York.J. Selective Canc. Elsevier. 1994. Liposomes from Biophysics to Therapeutics.. Encyclopedia of Pharmaceutical Technology. 5 th. Philipot. 22 (11)..L..