Liposom Sebagai Sistem Penghantaran(Marline Abdassah)

LIPOSOM SEBAGAI SISTEM PENGHANTARAN OBAT KANKER (Review Artikel) Marline Abdassah Jurusan Farmasi FMIPA UNPAD, Jatinangor-Sumedang

PENDAHULUAN Liposom mulai dikembangkan oleh Bangham pada tahun 1965 sebagai sistem penghantaran obat, sejak itu mulai banyak penelitian tentang liposom yang digunakan untuk drug targeted, karena sistem ini mudah dimodifikasi . Sistem penghantaran obat kanker dengan sistem liposom bertarget merupakan obyek utama dalam penelitian liposom karena melalui sistem sistemik tidak hanya bekerja di sel kanker tapi bekerja di sel lainnya. Pada artikel ini akan mulai dibahas dengan pemahaman tentang formulasi dan evaluasi dari sistem liposom itu sendiri.

FORMULASI LIPOSOM

Liposom adalah suatu vesikel berair yang dikelilingi oleh membran lipid lapis ganda uni lamelar atau multilamelar (gambar II.1), terbentuk secara spontan ketika fosfolipid dihidrasi dengan sejumlah air. Lipid lapis ganda terbentuk dengan stabil karena mempunyai tingkat energi yang minimal. Hal tersebut disebabkan bagian hidrofil fosfolipid menjauhi bagian lipofilik dan juga adanya interaksi van der Waals yang kuat antar rantai asil (Ostro,M.J., 1987).

= obat larut air = obat lipofilik Gambar .1 : Liposom (Waalkes M.B., 1990)

Liposom Sebagai Sistem Penghantaran(Marline Abdassah) FOSFOLIPID Fosfolipid adalah suatu senyawa ampifilik yang mempunyai struktur dasar gliserol (gambar .2), terdiri dari bagian kepala yang polar ( gugus fosfat) dan bagian hidrofobik ( satu atau dua molekul asam lemak). Senyawa ini bermuatan netral sampai sedikit negatif. Fosfatidil kolin adalah salah satu fosfolipid yang paling banyak digunakan dalam sistem liposom, terbuat dari telur atau kedelai dan sekarang tersedia dalam bentuk sintetisnya sehingga komposisi asam lemak dari fosfatidilkolin ini dapat diketahui dengan jelas. Struktur lamelar dalam keadaan gel padat

Struktur lamelar dalam keadaan gel cair Gambar .3 : Fasa Termodinamika Lapis Ganda Fosfolipid (Knight C.G., 1981) Pada fasa transisi , faktor penting yang berpengaruh terhadap struktur fosfolipid adalah faktor hidrasi dan temperatur. Proses hidrasi dimulai dengan formasi fasa serbuk dalam air dan setelah itu terbentuk fasa lipid yang stabil . Untuk memekatkan fasa lipid dalam air memerlukan temperatur rendah agar terbentuk fasa gel dan temperatur tinggi untuk berubah menjadi fasa kristal cair. Jadi dalam pembuatan liposom, fosfolipid di bawah temperatur transisinya akan membentuk suatu fasa gel atau fasa padat, dan pemanasan diatas temperatur transisinya maka fosfolipid akan melewati fasa kristal cair dan selanjutnya berubah menjadi fasa cair sehingga meningkatkan pergerakan molekulnya. Proses transisi ini terjadi karena adanya interaksi intramolekular (rotasi isomer dan efek anisotropik) pada fosfolipid dan antarmolekular fosfolipid (van der Waals) pada lipid lapis ganda (Knight C.G., 1981). Fase transisi dari lipid lapis ganda melibatkan titik leleh atau kerapihan deretan rantai hidrokarbon dari fosfolipid. Jadi ada hubungan antara temperatur transisi dan jumlah atom karbon per rantai hidrokarbon. Identifikasi fase transisi lipid memberikan kesimpulan bahwa konformasi hidrokarbon berperan penting untuk transisi. Pada prinsipnya transisi disebabkan oleh kebebasan rotasi dari ikatan tunggal karbon-karbon dan 2

R1 dan R2 : rantai asil lemak, R : asam amino Gambar ..2 : Struktur Umum Fosfolipid (Knight C.G.,1981)

Lipid lapis ganda terbentuk karena sifat termodinamika fosfolipid, terjadi transisi struktur lipid lapis ganda dari fasa gel (padat) menjadi fasa kristal cair karena pengaruh perubahan temperatur (gambar II.3). Hal ini berkaitan erat dengan penggunaan liposom sebagai penghantar obat dalam proses preparasi dan pemilihan jenis fosfolipid. Sifat termodinamika yang harus diperhatikan pada fosfolipid adalah fasa transisi dan interaksi molekular dari fosfolipid (Knight C.G.,1981).

Liposom Sebagai Sistem Penghantaran(Marline Abdassah) keadaan rotamerik. Rotari isomer berada dalam tiga bentuk yaitu trans, gauche dan antara trans gauche. Tidak hanya keadaan rotamerik yang mempengaruhi fase transisi tapi juga jumlah rotasi gauche per molekul. Efek anisotropik, pada molekul fosfolipid akan menuntun arah bagian kepala yang polar menghadap ke permukaan air , sedangkan bagian ekor yaitu hidrokarbon dari rantai asam lemak fosfolipid yang bersifat lipofilik memberikan efek anisotropik dan akibatnya terjadi pergerakan rantai hidrokarbon yang lebih besar dibandingkan dengan bagian kepala . Untuk interaksi antar molekul yang terjadi pada molekul fosfolipid diantaranya disebabkan oleh interaksi Van der Waals. Pengukuran temperatur transisi fosfolipid dapat dilakukan dengan Differential Scanning Calorimetri (DSC) (Knight C. G.,1981). Pada stabilitas liposom ada dua jenis utama penyebab dekomposisi lipid yang mungkin terjadi pada lipid lapis ganda adalah reaksi oksidasi dan reaksi hidrolisis. Reaksi oksidasi bisa terjadi pada rantai asam lemak tidak jenuh dari molekul fosfolipid Jadi harus diperhatikan pada saat preparasi dan cara penyimpanan liposom. Pada proses preparasi dan penyimpanan liposom harus selalu dialiri gas nitrogen atau argon diatasnya dan atau ditambahkan anti oksidan seperti alfa tokoferol ke dalam formulanya. Seleksi fosfolipid dapat dlakukan untuk meminimalisasi proses oksidasi. Reaksi hidrolisis bisa terjadi pada molekul fosfolipid di saat proses separasi, identifikasi dan analisis kuantitatif. Sebagai hasil reaksi hidrolisis adalah molekul lisofosfolipid, asam lemak dan gliserol. Untuk penetapan fosfolipid dapat dilakukan dengan cara penetapan kadar fosfor menurut Fiske dan Subbarow . Teknik analisis fosfolipid dapat dilakukan dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) (Ostro M.J.,1987). KOLESTEROL Kolesterol sering ditambahkan ke dalam komposisi liposom, terakomodasi diantara molekul fosfolipid pada membran lipid lapis ganda liposom dengan perbandingan 1:1. Pengaruh kolesterol terhadap stabilitas liposom adalah untuk pengepakan barisan molekul fosfolipid pada lipid lapis ganda liposom. Jadi molekul protein tidak mudah berpenetrasi ke permukaan liposom.( Gregoriadis et al., 1984). Kolesterol dan muatan tidak hanya mempengaruhi deret rantai asil fosfolipid tetapi juga difusi lateral dari lipid membran, hal ini terbukti dalam deretan struktur kristal cair dengan studi EPR (Electron Paramagnetic Resonance). Studi ini dilakukan dengan tujuan untuk memahami sifat fisik membran dan efeknya pada sel tumor. Hal ini penting untuk seleksi formula liposom yang optimal, misalnya penurunan rasio kolesterol terhadap OPP (obat kanker payudara) kurang dari satu cukup mempengaruhi karakteristik fluiditas membran dan sekaligus mampu memperbaiki aktivitas terapi obat (Koklic J. et al, 2002). MASUKNYA OBAT KE DALAM LIPOSOM (Drug Loading) Masuknya obat ke dalam liposom harus terukur dengan alat ukur. Bila pemasukan obat kurang maka rasio obat per lipid juga kurang. Hal ini akan berkaitan dengan pencapaian tingkat terapetik obat atau akan memerlukan sejumlah besar lipid untuk mecapai tingkat tersebut. Bila cara pemasukan obat tidak efisien maka akan kehilangan zat aktif selama proses tersebut sehingga penggunaan liposom sebagai penghantar obat menjadi tidak efisien dan tidak ekonomis (Barenholz,2003). 3

Liposom Sebagai Sistem Penghantaran(Marline Abdassah) Klasifikasi obat yang dapat dimasukan dalam liposom dilakukan berdasarkan koefisien partisi minyak/dapar dan oktanol /dapar yaitu 1) senyawa hidrofilik (larut air) dengan harga Kp rendah untuk minyak/dapar dan oktanol/dapar, 2) senyawa ampifatik, yaitu Kp rendah untuk minyak/dapar dan Kp medium sampai tinggi untuk Kp oktanol/dapar, 3) senyawa lipofilik mempunyai Kp tinggi untuk minyak/dapar. Metode pemasukan obat ke liposom dapat dilakukan dengan dua cara : 1) masuk ke membran liposom dan 2) fase air dalam liposom. Obat yang terjerat dalam membran liposom mempunyai berat molekul rendah dan tinggi. Obat terjerat karena terjadi interaksi hidrofobik atau interaksi elektrostatik dan atau campuran ke duanya. Obat masuk ke bagian air liposom melalui cara pasif untuk jenis obat yang berberat molekul rendah dan tinggi. Obat yang berberat molekul rendah dan terionisasi masuk secara aktif. Dengan mengetahui koefisien partisi dapat ditetapkan cara obat masuk ke dalam liposom. Setelah itu dapat ditetapkan jenis liposom yang digunakan. Contoh liposom yang telah disetujui untuk penggunan klinik yaitu : ampoterisin B masuk ke membran liposom (Ambisome), daunorubisin dan doksorubisin masuk ke liposom secara aktif ke dalam fasa air (DaunoXome dan Doxil). Setelah obat masuk, dapat dikombinasikan dengan struktur liposom dan tempat injeksinya sehingga dapat menentukan kecepatan pelepasan obat. Misalnya penghantaran liposom obat melalui intravena, apabila pelepasan obat lebih lambat dibanding eliminasi obat bebasnya maka liposom obat akan menentukan farmakokinetik dan biodistribusi obat. Bila proses eliminasi lebih cepat maka formulasi liposom gagal. Hal ini terjadi pada siprofloksasin yang dimasukkan dalam liposomes ( Barenholz, 2003). PREPARASI LIPOSOM Preparasi liposom selain menggunakan metode pembuatan khusus vesikel multi lamelar ( Multi Lamelar Vesicle, MLV), vesikel unilamelar (Single Uni lamelar Vesicle, SUV) dan vesikel uni lamelar besar (Large Unilamelar Vesicle, LUV), juga ada metode lainnya berdasarkan teknik pembuatan antara lain injeksi pelarut, detergen pemisah dan metode lainnya. a) Vesikel Multi Lamelar Liposom MLV dapat dikatakan sebagai bentuk awal liposom. Pertama kali diterangkan oleh Bangham pada tahun 1965. Preparasi MLV dapat dibuat dengan cara yang sederhana dengan peralatan laboratorium yang biasa. Lipid akan terdeposit dari pelarut organik dalam bentuk lapis tipis pada permukaan dinding labu dengan menggunakan alat rotari evaporator vakum. Sejumlah larutan dapar ditambahkan dan lipid akan terhidrasi pada temperatur diatas temperatur transisi lipidnya. Untuk meningkatkan ukuran MLV yang reprodusibel perlu dipertahankan waktu hidrasi dan agitasi. Faktor yang paling penting dalam preparasi MLV adalah waktu , proses hidrasi, ketebalan lipid lapis tipis , konsentrasi , komposisi lipid dan volume dapar. Untuk memperkecil dan menyeragamkan ukuran liposom dapat dilakukan dengan pengocokan suspensi liposom dengan vortex, sonikasi atau ekstrusi melalui membran filter polikarbonat. Teknik ekstrusi yang paling baik untuk menyeragamkan distribusi ukuran liposom ( Knight C.G.,1981). Liposom MLV sangat cocok untuk proses enkapsulasi dari berbagai substansi dan dapat dibuat dari berbagai macam komposisi lipid. Teknik pembuatan liposom MLV ini merupakan metode pilihan pada berbagai macam 4 stealth

Liposom Sebagai Sistem Penghantaran(Marline Abdassah) eksperimen pada sistem penghantaran obat. Keterbatasan liposom MLV yaitu mempunyai kapasitas enkapsulasi relatif rendah dibandingkan dengan LUV ( Knight C.G.,1981). b) Vesikel Unilamelar Proses sonikasi dari dispersi fosfolipid akan menghasilkan sediaan yang jernih (Sanders et al.), adalah mikrovesikel yang mengandung lipid lapis ganda yang menutupi fasa berair dari liposom. Struktur hidrodinamik dari SUV telah dipelajari oleh Huang 1969, adalah struktur liposom yang mempunyai ukuran dengan diameter minimal 20 nm. Pengukuran sifat hidrodinamik ini seperti ukuran, bentuk, luas permukaan dan berat SUV dapat menggunakan NMR ( Nuclear Magnetic Resonance), Light scattering dan seterusnya ( Knight C.G.,1981). Preparasi SUV melalui Probe Sonicator menggunakan logam yang dicelup pada suspensi liposom dan akan menggetarkan dispersi. Namun logam kemungkinan akan mengkontaminasi dispersi liposom itu sendiri. Proses sonikasi juga harus dilakukan diatas temperatur transisi lipid yang digunakan. Bila dipanaskan di bawah temperatur tersebut akan menyebabkan agregasi dan terjadi kerusakan pada lipid lapis gandanya. Liposom hasil sonikasi yang berukuran 22 50 nm sangat tergantung dari komposisi lipid, waktu sonikasi dan jumlah kolesterol pada campuran lipid. Penambahan kolesterol dan lipid bermuatan akan meningkatkan volume enkapsulasi. (Knight C.G.,1981) c) Vesikel Unilamelar Besar Vesikel LUV dibentuk dari emulsi fosfolipid dalam dapar dengan kehadiran fase pelarut organik, diikuti dengan penguapan pelarut organik tersebut di bawah tekanan vakum. Proses ini disebut metode Evaporasi fasa Balik. Liposom LUV yang dihasilkan dengan cara ini disebut REV (Reverse Evaporation Vesicle). Vesikel ini mempunyai volume fasa air yang lebih besar dibanding SUV ( Knight C.G.,1981). Enkapsulasi maksimum dari fasa air liposom dapat mencapai 65 %. Vesikel LUV dapat dipisahkan dari material yang tidak terenkapsulasi dengan teknik flotasi berdasarkan perbedaan gradien zat. Kisaran ukuran LUV sangat sensitif dengan keberadaan kolesterol yang diinklusikan dalam lipid. Vesikel yang terbentuk dari kolesterol/fosfolipid ( 1:1,rasio molar), volume jeratannya 0,47 um dan berukuran 0,17 0,8 um. Preparasi REV/LUV mempunyai kelebihan dibanding vesikel lain yaitu mempunyai daya enkapsulasi yang tinggi dari fasa air liposom yaitu 20 60 %. Distribusi ukuran LUV. untuk kebanyakan fosfolipid adalah uniform ( Knight C.C.,1981). KARAKTERISASI LIPOSOM Dari aspek farmasetika, sifat fisika dan sifat kimia partikel liposom, parameter kritis yang mempengaruhi penampilan masuknya obat ke dalam liposom secara in vitro dan in vivo adalah ukuran, muatan dan komposisi liposom. Jadi karakterisasi liposom meliputi 1) kandungan total lipid liposom, 2) ukuran dan distribusi ukuran liposom, 3) muatan liposom, 4) kadar obat dalam liposom (Ozer A.Y. et al, 1989). KANDUNGAN TOTAL LIPID Penentuan kandungan total fosfolipid dalam dispersi liposom ditentukan dengan cara penetapan kadar fosfor dari fosfolipid yang digunakan , dengan cara mendestruksi lipid terlebih dahulu dengan asam perklorat 70 %. Selanjutnya fosfor dideteksi dengan penambahan reagen molibdat dan larutan vitamin C 10 % membentuk larutan berwarna selanjutnya diukur dengan spektrofotometer pada 812 nm.( Fiske & 5

Liposom Sebagai Sistem Penghantaran(Marline Abdassah) Subbarow). Reaksi yang terjadi setelah proses dekstruksi fosfolipid adalah sebagai berikut
7PO4 3- + 12 (NH4)6Mo7O24 .36 H2O --7(NH4)3PO4.12MoO3 + 51 NH4+ + 72 OH7(NH4)3PO4.12MoO3 + reduktor lemah -Mo 5+ Christian G.D,1994)

UKURAN DAN DISTRIBUSI UKURAN Ukuran liposom merupakan salah satu parameter kritis terhadap perlaku liposom in vivo karena yang berukuran kurang dari 100 nm dapat mencapai dan dapat dinternalisasi oleh sel parenkhim hati sedangkan untuk yang berukuran lebih dari 100 nm akan diambil oleh sel makrophag, akhirnya akan dieksresikan dari tubuh atau terakumulasi di organ lain.(Scherphop G.L et.al, 1987) Vesikel yang unilamelar dibagi dalam dua kelas ukuran yaitu vesikel yang berukuran dibawah 100 nm dikenal dengan vesikel unilamelar (SUV, Single Uni Vesicle ), sedang yang berukuran lebih dari 100 nm disebut dengan vesikel unilamelar besar(LUV, Large Uni Vesicle). Penentuan ukuran dan distribusi ukuran liposom dapat menggunakan peralatan sebagai berikut :a) mikroskop elektron, b) permeasi gel, c) sebaran cahaya , d) elektroforesis, e) sedimentasi dan f) cara ekstrusi ( Knight C.G.,1981). MUATAN Kolesterol, muatan dan stabilitas sterik PEG2000DSPE (polyetilenglikol 2000 disteroyl phosphatidyletanolamine) berpengaruh terhadap fluiditas membran liposom dan signifikan terhadap aktivitas anti tumor ( Koklic et .al.,2002). Sehingga faktor muatan liposom ini perlu diperhatikan pada formulasi liposom terutama pada saat pemilihan fosfolipid. Muatan liposom dapat diukur melalui harga

potensial zeta. Dalam Dynamic Light Scattering pengukuran potensial zeta selalu dikaitkan dengan analisis ukuran partikel . Tujuan pengukuran muatan sistem koloid pada umumnya adalah untuk memprediksi stabilitas sistem koloid, dengan hanya pengukuran distribusi ukuran partikel saja tidak akan mampu memprediksi kecepatan agregasi partikel dikemudian hari. Hal ini berlaku bagi sistem liposom agar dapat diprediksi terjadi tidaknya agregasi maupun fusi di kemudian hari . Proses agregasi disebabkan oleh gaya van der Waals (Philiphot J.R., Schuber F.,1995). Mekanisme fisika yang biasa digunakan untuk menstabilkan sistem koloid adalah repulsi elektrostatik. Partikel koloid tersebut akan menghasilkan repulsi masing masing pada jarak tertentu. Idealnya gaya repulsif adalah sangat kuat untuk mencegah agar tidak saling berdifusi dimana gaya atraktif dari van der Waals mendominasi terjadinya agregasi (Nicoli D.F.1997). PENGENDALIAN MUTU BENTUK SEDIAAN LIPOSOM Pengembangan formulasi liposom menghasilkan 10 produk komersial berupa liposom dalam bentuk sediaan parenteral dan bukan parenteral telah berhasil dipasarkan. Semua formulasi tersebut telah memenuhi kriteria farmasetika dalam memastikan penampilan liposom, reprodusibilitas dari bets ke bets dan stabilitas dispersi liposom telah ditetapkan. Definisi yang diperlukan untuk karakterisasi dispersi liposom adalah tahap praformulasi, uji klinis dan tahap akhir produk. Karakterisasi fisika dan kimia liposom sangat kompleks, misalnya ukuran liposom dan lamelaritas sering heterogen dan sulit dijadikan parameter (Crommelin D.J.A., 2003). Crommelin dan Barenholz telah membuat tabel 6

Liposom Sebagai Sistem Penghantaran(Marline Abdassah) ringkasan kontrol kualitas untuk ditunjukkan pada tabel .1 preparasi liposom seperti yang Tabel 1 : Ringkasan Pengendalian Mutu Formulasi Liposom ( Barenholz dan Crommelin, 2003)
---------------------------------------------------------------------------------------------- ------Jenis Pengukuran Metode ------------------------------------------------------------------ ----------------------------------Karakterisasi dasar pH pHmeter Osmolaritas Osmometer Volume jeratan Pengukuran fasa air dalam intraliposom Konsentrasi Fosfolipid Kandungan fosfor ( Barlett), KCKT, Enzimatis Komposisi Fosfolipid KLT,KCKT Komposisi rantai asil fosfolipid Kromatografi gas Konsentrasi kolesterol enzimatis, KCKT Konsentrasi senyawa aktif Residu pelarut organik dan logam berat NMR,Kromatografi gas, protokol farmakope Rasio zat aktif /fosfolipid Determinasi Zat aktif/konsentrasi Lipid (H+) atau ion sebelum dan sesudah indikator Fluoresen,ESR., 31P-NMR, 19 F-NMR masuk ---------------------------------------------------------------- ----------------------------------------Stabilitas Kimia Hidrolisis Fosfolipid HPTLC, KCKT Konsentrasi asam lemak yang tidak teresterifikasi KCKT, enzimatis Otooksidasi rantai asil fosfolipid konyugasi diena, lipid peroksid, TBARS dan komposisi asam lemak (Kromatografi gas) Autooksidasi kolesterol KLT, KCKT Degradasi Anti oksidan KLT, KCKT ------------------------------------------------------------- -----------------------------------Karakterisasi Fisik Penampilan Protokol (inspeksi visual) Distribusi ukuran vesikel - sub mikron Dynamic Light Scattering (DLS) Static light scattering(SLS) Mikroskop, kromatografi gel, Turbidimetri - mikron Coulter counter, mikroskop cahaya difraksi laser, SLS dan obkurasi cahaya -------------------------------------------------------------- -----------------------------------------Potensi Muatan Permukaan pH permukaan ikatan membran, field probe dan pH Field probe Potensial Zeta Mobilitas elektrophoretik Sifat thermotropik DSC, NMR, Metode Fluoresen FTIR, spektroskopi Raman, ESR, turbidimetri Persen obat bebas Gel ekslusion kromatografi, Ion exchange kromatografi, presipitasi dengan polielektrolit, ultra sentrifugasi ------------------------------------------------------- -----------------------------------------------Penetapan mikrobiologi Sterilitas Protokol farmakope Pirogenisitas Protokol Farmakope

Liposom Sebagai Sistem Penghantaran(Marline Abdassah) DAFTAR PUSTAKA Barenholz, Y., 2003, Relevancy of Drug Loading to Liposomal Formulation Therapeutic Efficacy, J. Liposomes Res., 13 ( 1), 1-8. Barenholz, Y., Crommelin D.J.A., 1994, Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, Liposomes as Pharmaceutical Dosages Forms, New York, Marcel dekker, 1-9. Crommelin, D.J.A., Gert Storm, 2003, Liposome: From the Bench to the Bed, J. Liposomes Res., 13 (1), 33-36. Christian G.D, 1994, Analytical Chemistry, University of Washington, John Wiley & Sons Inc. 5 th, 728. Greogoriadis, G., 1984, Liposome Technology Volume III, CRC Press, Florida, 216217. Knight, C.G., 1981, Liposomes : from Physical Structure to Therapeutic Applications, Bab 3, Szoka F., Papahadjopoulus D., Elsevier, North Holland, 51-69. Koklic, Sentjurc, M.M., Zeisig, R., 2002, The influence of Cholesterol and Charge on Membran Domein of Alkyl Phospholipid as studies by EPR, J. Liposomes Res., 12 (4), 335-352. Ostro, M.J., 1987, Liposomes from Biophysics to Therapeutics, Bab 9, Weinstein J.N., Marcel Dekker Inc., 279-306. Ozer, A.Y., Talsma, H., 1989, Preparation and Stability of Liposomes containing 5fluorouracil, Int. J. Pharm. , 55, 185-191. Philipot, J.R., Schuber, F., 1995, Liposomes as Tools in Basic Research and Industry, CRC Press, 6-10. Scherphop, G.L., Daemen, T., Spanjer, H.H., Roerdink, F.H., 1987, Liposomes in Chemo- and Immunotherapy of Cancer, Lipid, November, 22 (11), 896. Waalkes, M.B., Scherphop, G.L., 1990, Liposome-Incorporated 35-o-Dipalmitoyl5-Fluoro-2-Deoksyuridine as a Slow Release Anti Tumor Drug Depot in Rat Liver Macrophag, Selective Canc. Ther., 6 ( 1).