Prosiding PPI Standardisasi 2009 - Jakarta, 19 November 2009

VALIDASI METODE ANALISIS PENETAPAN KADAR SENYAWA SIKLAMAT DALAM MINUMAN RINGAN
Yus Maria Novelina S1, Sutanto2, Alia Fatimah2
Abstrak Penetapan kadar senyawa siklamat di dalam minuman ringan dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dipelajari untuk menentukan kelayakannya sebagai metode analisis uji standar. Pada penelitian ini digunakan contoh minuman ringan yang beredar di pasaran. Pemisahan senyawa dari matriksnya dilakukan dengan melarutkan contoh ke dalam fasa gerak yang digunakan, sedangkan pemisahannya dengan menggunakan kolom C18. Kolom distabilkan dengan menggunakan KH2PO4: methanol dengan perbandingan (7:3) dengan kecepatan alir 1 mL/menit, kemudian komposisi fase gerak yang tetap selama 10 menit. Pengamatan dilakukan dengan menggunakan HPLC detektor UV. Sebagai pembanding digunakan standar siklamat. Validasi menggunakan spike sample menunjukkan bawa metode ini teliti dalam menentukan kadar siklamat. Presisinya cukup tinggi dan nilai batas deteksinya adalah 154 mg/L . Penelitian menyimpulkan bahwa metode KCKT dapat dipakai sebagai metode uji penetapan kadar siklamat dalam minuman ringan. Kata kunci : siklamat, minuman ringan
Oleh

1 2

Peneliti di Balai Besar Industri Agro Bogor Jurusan Farmasi Universitas Pakuan - Bogor

Prosiding PPI Standardisasi 2009 - Jakarta, 19 November 2009

PENDAHULUAN

Penggunaan bahan sintetik semakin diminati di berbagai lapisan masyarakat, termasuk kalangan industri. Tingkat kemanisan serta harga yang ekonomis menjadi penyebab berbagai kalangan lebih tertarik menggunakan pemanis sintetik tersebut dibandingkan pemanis alami yang cenderung lebih mahal. Siklamat merupakan pemanis sintetis non-kalori yang paling besar jumlahnya dikonsumsi di Indonesia. Menurut Departemen Kesehatan Republik Indonesia, penggunaannya hanya diperbolehkan untuk pasien diabetes ataupun orang yang membutuhkan makanan berkalori rendah (Farida, 1989). Tetapi pada kenyataannya penggunaan siklamat semakin meluas pada berbagai kalangan dan beragam produk (Winarno dan Birowo, 1988). Penggunaan siklamat sempat dilarang dibeberapa Negara di dunia seperti Amerika Serikat, Kanada, Inggris pada tahun 1970an. Alasan pelarangan didasarkan atas dugaan adanya sifat karsinogenik yang disebabkan oleh hasil uraiannya berupa sikloheksamin. Namun demikian penelitian yang mendasari timbulnya larangan penggunaan siklamat tersebut mendapat banyak kritikan. Jumlah (konsentrasi) siklamat yang digunakan untuk uji toksisitas, karsinogen maupun mutagen dilakukan dengan menggunakan dosis yang sangat tinggi dan tidak mungkin terjadi pada praktek sehari-hari. Selain itu data-data pengujian siklamat pada Beberapa hewan percobaan tidak menunjukkan efek yang merugikan dalam dosis kecil setiap harinya (Mitchel, 2006). Oleh karena itu WHO masih memasukkan siklamat sebagai bahan tambahan pangan (BTP) yang diperbolehkan (Albiner S, 2002) selama penggunaannya sesuai dengan ketentuan acceptable daily intake (ADI). Pada akhirnya, Joint Expert Comitte on Food Additives (JECFA) menetapkan ADI untuk siklamat sebesar 11 mg/kg bb/hari (Watson, 2001). Di Indonesia penggunaan siklamat untuk dikonsumsi telah diatur oleh Badan POM dalam Peraturan Teknis Penggunaan Bahan Tambahan Pangan Pemanis Buatan dalam Produk Pangan (BPOM, 2004). Aturan ini membahas batas penggunaan maksimum siklamat untuk tiap katagori pangan dengan mendasarkan perhitungannya pada Acceptable Daily Intake (ADI). Sebagai lembaga yang berwenang dalam hal pengawasan obat dan makanan yang beredar dipasaran Indonesia, serta memperhatikan aspek keamanan terhadap penggunaan bahan pemanis sintetis, Badan POM menegaskan pada setiap industri yang akan menggunakan siklamat sebagai pemanis harus mencantumkan laporan hasil uji siklamat yang dilakukan oleh lembaga (Laboratorium pengujian) terakreditasi. Sampai saat ini analisis siklamat masih dilakukan menggunakan metode konvensional secara gravimetri. Akan tetapi teknik tersebut memerlukan waktu yang cukup lama dengan resiko analisis yang cukup tinggi, sehingga dilakukan teknik analisis yang lebih praktis dan mudah serta dalam waktu relative singkat dengan menggunakan teknik kromatografi cair. 2

Prosiding PPI Standardisasi 2009 - Jakarta, 19 November 2009

Metode analisis siklamat secara KCKT telah dilakukan oleh Inggris dan dibakukan dalam British Standard versi EN 1379 : 1996. Di Indonesia sendiri belum banyak industri maupun laboratorium uji yang menggunakan metode ini dalam menganalisis siklamat secara kualitatif maupun kuantitatif. Oleh sebab itu untuk menjamin keabsahan hasil analisis maka metode tersebut harus divalidasi terlebih dahulu. Validasi merupakan konfirmasi bahwa metode dapat memenuhi persyaratan tujuan penggunaannya melalui pengujian metode dan mengumpulkan bukti-bukti yang objektif (Harmita, 2004). Sebagai tindak lanjut fungsi pengawasan tersebut, maka diperlukan adanya suatu metode pengujian yang dapat menganalisis kandungan siklamat dalam berbagai produk terutama produk pangan. II METODE PENELITIAN

Penelitian ini dilakukan dua tahap pekerjaan, yaitu persiapan analisis dan validasi metode uji siklamat yang mengacu pada British Standard versi EN 1379 tahun 1996. Pada validasi ini dilakukan uji selektivitas, linieritas, limit deteksi metode, uji akurasi, uji presisi serta uji ketegaran. Bahan dan Peralatan Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah standar natrium siklamat, methanol HPLC grade, kalium dihidrogen fosfat (KH2PO4), akuades, akuabides, sample minuman ringan. Peralatan yang digunakan adalah KCKT UV, kolom C18, neraca analitik, peralatan gelas (labu ukur, gelas ukur, corong, pipet mohr, pipet volumetrik, pipet tetes, dan tabung reaksi), penyaring Millipore, kertas saring, vakum penyaring, bulp dan sudip. Prosedur Kondisi HPLC Kolom: 12 cm x 4.6 mm Nucleosil Detektor: UV set pada panjang gelombang 200 nm Volume injeksi: 20 uL Mobile phase: methanol-kalium dihidrogen fosfat 0.0125 mg/L (KH2PO4) (3:7) Preparasi standar Larutan baku diperoleh dengan menimbang sebanyak 100 mg standar Na siklamat, dimasukkan ke dalam labu 100 mL dan dilarutkan dengan fase gerak sampai tanda tera, dihomogenkan (larutan mengandung 1000 ppm). Persiapan standar yang akan digunakan dengan membuat deret standar yang memiliki konsentrasi 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700,800, 900 dan 1000 ppm. Konsentrasi tersebut diperoleh dengan memipet 0.1, 0.25, 0.5, 3

a.

b.

Prosiding PPI Standardisasi 2009 - Jakarta, 19 November 2009

c.

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, dan 10 mL larutan baku standar siklamat 1000 ppm masing-masing dilarutkan dengan menggunakan fasa gerak hingga batas tera dan dihomogenkan. Preparasi Sample Ditimbang kurang lebih 0.5 gram sample kemudian tambahkan larutan fase gerak hingga tanda batas, dihomogenkan dan disaring. Filtrat yang dihasilkan kemudian dimasukkan ke dalam vial. Larutan siap untuk diinjeksikan.

Validasi Metode Beberapa aspek yang diukur dalam validasi metode adalah selektivitas, linieritas, presisi, akurasi, limit deteksi dan uji ketegaran. Penetapan selektivitas dilakukan dengan membandingkan kromatogram standar yang dihasilkan dengan blanko. Sedangkan uji linieritas diperoleh dari data pengukuran larutan deret standar yang telah dibuat sehingga diperoleh kurva kalibrasi dan persamaan regresinya. Uji presisi dilakukan dengan cara pengulangan (repeatability) 7 kali larutan contoh yang di buat sesuai prosedur yang diinjekkan pada hari yang sama sehingga diperoleh data yang akan dinyatakan nilai presisinya sebagai simpangan baku relative (% SBR). Uji akurasi (uji perolehan kembali) dilakukan dengan membuat larutan sample sesuai prosedur diulangi sebanyak 7 kali dan masing-masing diinjekkan ke dalam alat KCKT. Nilai akurasi dinyatakan sebagai % recovery. Pengukuran limit deteksi dilakukan dengan mengolah data yang diperoleh dari hasil pengukuran linieritas standar sehingga diperoleh nilai Limit of Detection (LOD) dan Limit of Quantitation (LOQ). Nilai tersebut dijadikan dasar dalam menentukan limit deteksi metode (LDM). Kemudian dilakukan uji ketegaran yang dilakukan dengan memvariasikan komposisi fasa gerak yang digunakan yaitu 70:30 sebagai control, 60:40 dan 80 :20.

III

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pengujian zat aditif di dalam suatu produk, terutama pangan bersifat amat krusial, guna menjamin keamanan penggunaan produk. Anaisis ini harus menghasilkan data yang benar mengenai kandungan analit dalam produk. Selain itu metode yang digunakan dalam pengujian harus dapat diandalkan sehingga dapat menjamin kebenaran data yang diperoleh. Metode uji yang diadopsi berprinsipkan pada serapan molekuler siklamat terhadap cahaya UV pada daerah panjang gelombang 200 nm, pemisahan analitik melalui kolom C18 menggunakan fasa gerak (mobile phase) KH2PO4 0.0125 mg/L dan methanol HPLC grade dengan perbandingan (70:30) dengan laju alir 1 mL/menit. Dan alat yang digunakan adalah KCKT dengan detektor UV.

Prosiding PPI Standardisasi 2009 - Jakarta, 19 November 2009

IV

VALIDASI METODE

Kehandalan suatu metode yang digunakan dapat ditentukan dari Beberapa faktor antara lain, akurasi, presisi dan limit deteksi. Dalam penelitian ini dilakukan parameter-parameter yang meliputi, selektivitas, linieritas, limit deteksi metode presisi, akurasi dan uji ketegaran. Selektivitas Selektivitas dilakukan dengan membandingkan kromatogram standar dengan blanko. Hasil penelitian menunjukkan dari hasil penginjekkan standar muncul peak area pada retention time (RT)/waktu retensi 4 menit. Sedangkan pada larutan blanko tidak terdapat peak yang dihasilkan. Sehingga dapat disimpulkan bahwa peak yang diperoleh pada waktu retensi 4 menit tersebut merupakan senyawa siklamat. Gambar kromatogram uji selektivitas dapat dilihat pada Gambar 1 berikut ini.

Gambar 1 Kromatogram Uji Selektivitas Standar Siklamat Linieritas Standar Nilai koefisien korelasi (R) merupakan indikator kualitas dari parameter linieritas yang menggambarkan proposionalitas respon analitik (luas area) terhadap konsentrasi yang diukur. Berdasarkan data evaluasi kalibrasi deret standar siklamat pada level konsentrasi antara 10.8 mg/L sampai 1018 mg/L diperoleh persamaan regresi linier y = 150.59x 913.2 dengan nilai koefisien korelasi sebesar 0.9997. Nilai koefisien yang diperoleh menunjukkan hasil yang baik karena mendekati nilai 1. Hal ini menginformasikan bahwa terdapat hubungan yang proporsional antara respon analitik dengan konsentrasi yang diukur. Dari hasil uji linieritas dapat dilihat kurva deret standar pada Gambar 2 berikut ini.

Prosiding PPI Standardisasi 2009 - Jakarta, 19 November 2009

Gambar 2 Kurva Deret Standar Siklamat Limit Deteksi dan Limit Kuantitasi Pembahasan limit deteksi dan limit kuantitasi tidak dapat dipisahkan karena diantara keduanya terdapat hubungan yang sangat kuat. Secara praktis cara evaluasi keduanya dapat dikatakan tidak ada perbedaan yang signifikan. Perbedaan diantara keduanya hanya pada sifat kuantitatif data yang diperoleh. Jika pada limit deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi terkecil yang dapat dideteksi namun tidak perlu secara kuantitatif, sedangkan pada definisi limit kuantitasi dikatakan konsentrasi terkecil analit yang dapat diukur secara kuantitatif. Secara statistik perhitungan batas deteksi dan batas kuantitasi diperoleh melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi standar siklamat. Dari hasil perhitungan diperoleh nilai limit of detection (LOD) sebesar 24.8 mg/L dan limit of quantitation sebesar 82.5 mg/L. Presisi (Keterulangan) Uji presisi dilakukan untuk melihat kedekatan antara hasil uji yang dilakukan secara berulang pada sample. Pengujian dilakukan dengan metode ripitabilitas (pengulangan) sehingga diperoleh ketepatan system dalam memberikan respon terhadap analit yang dideteksi. Sebagai syarat keberterimaan digunakan persamaan koefisien variasi Horwitz sesuai AOAC (Association of Official Analytical Chemist, 2005) yang menjadi acuan dalam penelitian ini. Presisi suatu metode dikatakan memenuhi syarat keberterimaan jika nilai %RSD lebih kecil dari 2/3CVHorwitz. Uji presisi dilakukan dengan menginjekkan larutan sebanyak 7 kali. Berdasarkan hasil penelitian diperoleh nilai %RSD untuk uji presisi sebesar 3.03 %. Nilai tersebut memenuhi persyaratan AOAC 2/3 CVHorwitz 3.73 %. Hal ini menginformasikan bahwa system operasional alat dan analis memiliki nilai presisi yang baik terhadap metode dengan respon yang relative konstan, sehingga hasil pengukuran memiliki nilai presisi yang memenuhi persyaratan. Data uji presisi dapat dilihat pada Tabel 1 berikut ini

Prosiding PPI Standardisasi 2009 - Jakarta, 19 November 2009

Tabel 1 Data Hasil Uji Presisi

Jumlah Replikat 1 2 3 4 5 6 7 Rata-rata SD %RSD CVHorwitz 2/3CVHorwitz SIKLAMAT Area Sample 66222 69579 70889 70821 71159 72135 72842

Parameter uji

Hasil (mg/L) 1009.67 1071.98 1079.33 1087.92 1094.27 1100.73 1106.86 1078.68 32.70 3.03 5.59 3.73

Akurasi Berbeda halnya dengan presisi yang merujuk pada pengertian ketelitian, akurasi merujuk pada pengertian ketepatan (kecermatan). Hasil evaluasi menunjukkan bahwa metode terpilih memiliki kisaran % perolehan kembali (% recovery) yang menyatakan tingkat akurasi yang memenuhi syarat keberterimaan. Nilai recovery yang mendekati 100% menunjukkan bahwa metode tersebut memiliki ketepatan yang baik dalam menunjukkan tingkat kesesuaian dari rata-rata suatu pengukuran yang sebanding dengan nilai sebenarnya (true value). Hasil uji akurasi dapat dilihat pada Tabel 2 berikut. Tabel 2 Data Hasil Uji Akurasi
Replikat 1 2 3 4 5 6 Rata-rata Konsentrasi Praktis (x) 217.03 216.20 186.55 206.88 171.65 210.16 201.41 Konsentrasi teoritis ( ) 198.89 198.73 197.10 199.37 198.89 198.67 198.67 %Recovery 109 109 95 104 86 104 101

Pada Tabel 2 diperoleh % recovery berada pada rentang 86 109% dengan rata-rata % recovery 101%. Nilai recovery hasil pengujian menunjukkan kecenderungan terjadinya kesalahan acak, dimana nilai % recovery yang dihasilkan berada dibawah dan diatas 100%. Sumber kesalahan acak yang terjadi pada praktek disebabkan adanya senyawa lain yang ada pada matriks yang masih terbawa

Prosiding PPI Standardisasi 2009 - Jakarta, 19 November 2009

meskipun telah dilakukan penyaringan. Senyawa ini menyebabkan analisis terganggu, sehingga konsentrasi yang terukur oleh alat sebagian lebih tinggi dan sebagian lebih rendah dari 100%. Kesalahan acak tersebut dapat diminimalisasi dengan melakukan sonikasi terhadap larutan uji pada rentang waktu tertentu. V LIMIT DETEKSI METODE

Limit deteksi metode (LDM) adalah konsentrasi terendah yang terbaca dari pengukuran suatu sample dengan mengasplikasikan secara lengkap metode pengukuran sample tersebut, sehingga nilai yang diperoleh memenuhi criteria cermat dan seksama. Nilai LDM diperoleh dari hasil percobaan dengan melakukan secara langsung konsentrasi analit terendah yang diperkirakan sebagai limit kuantitasi. Setelah dilakukan pengujian diperoleh hasil konsentrasi terendah yang terdeteksi oleh alat sebesar 154 ppm. Nilai konsentrasi praktis menyatakan nilai terendah yang dapat terkuantitasi serta memenuhi criteria cermat dan seksama oleh metode yang digunakan, dengan nilai SBR sebagai indikator kualitas presisi (cermat) sebesar 1.52% dan nilai recovery sebagai indicator kualitas akurasi (seksama) berkisar antara 94.16% 98.68%. Hasil pengukuran dapat dilihat pada Tabel 3 berikut ini Tabel 3 Data Hasil Uji Limit Deteksi Metode (LDM)
Jenis Sample Replikat 1 2 1 2 3 4 5 6 7 8 Luas Area 0 0 5567 5452 5344 5451 5428 5499 5471 5344 5445 Konsentrasi Praktis Analit dalam Contoh 0 0 157.67 154.71 150.32 154.25 153.99 155.66 155.29 151.45 154.17 Konsentrasi Teoritis Analit dalam Contoh 0 0 159.78 160.13 158.77 159.68 160.09 159.71 160.16 159.97 159.79 2.34 1.54 7.495 4.997 %Recovery 0 0 98.68 96.62 94.68 96.60 96.19 97.46 96.96 94.68 96.48

Sirup IC

Spike

Rata-rata SD SBR CVHorwitz 2/3CVHorwitz

Prosiding PPI Standardisasi 2009 - Jakarta, 19 November 2009

VI 1. 2. 3.

KESIMPULAN DAN SARAN Metode HPLC dapat digunakan untuk penetapan siklamat sebagai metode standar. Limit deteksi pada metode ini adalah 24.8 mg/L, sedangkan limit kuantitasi adalah 154 mg/L. Untuk mengantisipasi maksimum limit siklamat dalam produk pangan, dan mempermudah dalam analisis maka metode ini perlu terdaftar dalam Standar Nasional Indonesia. Metode standar yang digunakan dalam penelitian ini perlu disosialisasikan kepada laboratorium lain. DAFTAR PUSTAKA AOAC. 2005. Official Method of Analysis of the Association of Official Analytical Chemist. Benyamin Franklin Station. Washington, D.C Badan POM. 2004. Peraturan Teknis Penggunaan Bahan Tambahan Pangan Pemanis Buatan dalam Produk Pangan. Direktorat Standarisasi Produk Pangan, Deputi Bidang Pengawasan Keaman Pangan dan Bahan Berbahaya. p : 34-36 British Standard International. Foodstuffs-Determination of cyclamate and saccaharin in liquid table top sweetener preparations-Method by high performance liquid chromatography EN. 1379 : 1996. Europian comitte for standardization Chan, C.C. et al. 2004. Analytical Method Validation and Instrument Performance Verification. Willer Interscience. New Jersey Farida, I. 1989. Status Siklamat Dewasa Ini. Warta AKAB, Vol I (2). Akademi Kimia Analisis. Bogor. p : 49-50 Furia, T.E. 1980. CRC Handbook of Food Additives. 2nd Edition. Boca Raton : CRC Press Inc Harmita. 2004. Majalah Ilmu Kefarmasian UI. FMIPA UI. Jakarta Johnson, E.L dan Stevenson, R. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Penerjemah: Kosasih Padmawinata. Bandung. Penerbit ITB Leo M. L. Nollet, 1996. Handbook of Food Analysis. Marcell Decker. New York. Miller, J.C. dan J.N. Miller. 1991. Statistika Untuk Kimia Analisis. Diterjemahkan oleh Drs. Suroso M.Sc. Bandung. Penerbit ITB Mitchell, 2006. Sweeteners and Sugar Alternative in Food Technology. Victoria, Autralia. Blackwell Publishing. p : 32; 118; 122-123 Nabors, Lyn O. dan Robert C, Gelardi. 1991. Alternative Sweeteners. Marcel Dekker, Inc. New York Prosiding. 1997. Seminar Nasional Kimia II Peran Kimia Organik dalam Era Industri Kimia Indonesia. FMIPA UGM. Yogyakarta 9

4.

VII 1. 2.

3.

4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.

Prosiding PPI Standardisasi 2009 - Jakarta, 19 November 2009

14. 15. 16. 17. 18.

Siagian, Albiner. 2002. Bahan Tambahan Makanan. USU Digital Library. Medan Skoog, Douglas A. Dan James J, Leary. 1992. Principles of Instrumental Analysis. New York. Saunders College Publishing Sumardi. 2002. Validasi Metode Pengujian. Pusat Standardisasi dan Akreditasi Sekretariat Jenderal Pertanian. Jakarta USP. 1995. United States Pharmacopeia Convention, Inc. Twinbrook Park Way Rockville. USA Winarno, F.G. dan A.T. Birowo. 1988. Gula dan Pemanis Buatan di Indonesia. Sekretariat Dewan Gula Indonesia. Jakarta

10