Kromatografi adalah teknik pemisahan zat untuk analisis dan preparative dengan melarutkan campuran dalam fase gerak

(cairan atau gas), yang mengalir melalui fase diam atau stasioner, zat zat yang hendak dipisahkan harus berinteraksi dengan fase stasioner dengan kuat yang berbeda beda , interaksi ini dapat bersifat adsorbs, partisi, pertukaran ion, dan interaksi lainnya. A. KROMATOGRAFI PENUKAR ION Pertukaran ion adalah salah satu metode yang efektif untuk pemisahan secara kuantitatif. Pemisahannya berdasarkan prinsip yang sama sekali berbeda dan hanya diterapkan pada senyawa yang berion. Dua seri paralel dari prosedur yang ada, terfokus pada pertukaran anion dan kation. Istilah penukar ion secara umum diartikan orang sebagai pertukaran dari ion-ion yang bertanda muatan (listrik) sama, antara suatu larutan dan suatu bahan yang padat serta sangat tak dapat larut, dimana larutan itu bersentuhan. Zat padat itu (penukaran ion) harus mengandung ion-ion miliknya sendiri. Dan agar pertukaran dapat berlangsung dengan cukup cepat dan ekstensif, zat padat itu harus mempunyai struktur molekuler yang terbuka dan permeabel, sehingga ion-ion dan molekul-molekul pelarut dapat bergerak keluar masuk dengan bebas. Penukar kation terdiri dari suatu anion polimerik dan kation-kation aktif, sementara suatu penukar anion adalah suatu kation polimerik dengan anion-anion aktif.

Resin penukar kation sebagai suatu polimer berbobot molekul tinggi, yang terangkai silang yang mengandung gugus-gugus sulfonat, karboksilat, fenolat, dan sebagainya sebagai suatu bagian integral dari resin itu serta sejumlah kation yang

ekuivalen. Suatu resin penukar anion adalah suatu polimer yang mengandung gugus-gugus amino (ammonium kuartener) sebagai bagian-bagian integral dari kisi polimer itu dan sejumlah ekuivalen anion-anion seperti ion klorida, hidroksil atau sulfat. Syarat-syarat dasar bagi suatu resin yang berguna adalah: 1. Resin itu harus cukup terangkai silang, sehingga keterlarutannya yang dapat diabaikan. 2. Resin harus cukup hidrofilik untuk memungkinkan difusi ion-ion melalui strukturnya dengan laju yang terukur dan berguna. 3. Resin harus menggunakan cukup banyak gugus penukar ion yang dapat dicapai, dan harus stabil dalam hal kimiawinya. 4. Resin yang sedang mengembang, harus lebih besar rapatannya daripada air.
I. Aksi dari Resin Penukar Ion

Resin penukar kation mengandung kation – kation bebas yang dapat ditukar dengan kation – kation dalam larutan (lar). (Res. A)B+ + C+ (larutan) ↔ (Res. A)C+ + B+ (larutan) Jika kondisi – kondisi eksperimen adalah sedemikian, sehingga kesetimbangan telah sama sekali tergeser dari kiri ke kanan, ion C+ telah lengkap difiksasi (dilekatkan tetap) pada penukaran kation. Satu contoh khas adalah penukaran ion natrium pada suatu resin sufonat oleh ion kalsium:
2 (Res.SO3-)Na+ + Ca2+ (lar.) (Res. SO3-)2Ca2+ + 2 Na+ (lar.)

Reaksi ini reversibel, dengan mengalirkan suatu larutan yang mengandung ionion natrium melalui produk itu, ion-ion kalsium dapat dikeluarkan lagi dari resin, dan bentuk natrium yang semula, teregenerasi (pulih seperti keadaan semula). Sama halnya dengan mengalirkan suatu larutan garam netral melalui bentuk hidrogen suatu resin sulfonat, dihasilkan sejumlah asam padanannya yang ekuivalen oleh reaksi khas berikut:
(Res.SO3-)H+ + Na+Cl- (lar.) (Res.SO3-)Na+ + H+Cl- (lar.)

Ukuran resin penukar kation yang asam kuat, seperti resin polistirena sulfonat yang terangkai silang kapasitas tukar boleh dikatakan tak bergantung pada pH larutan. Untuk penukar kation asam lemah, seperti yang mengandung gugus karboksilat, ionisasi timbul samapi tingkat yang berarti hanya dalam larutan basa, yaitu dalam

+ H Cl (lar. Sebagai contoh.(lar.NMe3+)Cl. Resin penukar kation yang basa kuat. Beberapa reaksi khas mereka.) + (Res. yaitu polistirena terangkai silang yang mengandung gugus ammonium kuartener.(lar. Keseimbangan pertukaran ion . dalam larutan yang asam. maka resin karboksilat hanya mempunyai sangat sedikit aksi dalam larutan dibawah pH 7. kesetimbangan dari: (Res.(lar.+ Cl.) (Res. Penukaran-penukaran ion karboksilat ini dalam bentuk hidrogennya.NHMe2+)Cl- Mereka dapat digunakan dalam larutan asam untuk pertukaran anion.NMe3+)Cl.) (Res.) (Res. akan menyerap basa kuat dari larutan: (Res. misalnya NaCl. Ini dapat juga dinyatakan dengan kata-kata bahwa dalam larutan basa. basa bebas Res.) (Res.NH Me2)+OH- Terutama adalah ke sebelah kiri. terjadi hidrolisis pada bentuk garam dari resin itu sehingga basa tersebut mungkin tak dapat lengkap diserap.+ Cl (lar.) (Res.NMe3+)OH.bentuk garam-garam mereka. Namun. baik yang dalam bentuk hidroksida maupun yang dalam bentuk garamnya. Resin penukar ion yang basa lemah.NHMe2OH sangat sedikit terionisasi.NHMe2+)Cl.+ OH.COO-)H+ + Na+OH.NH Me2)+NO3.NMe3+)Cl. hanya mengandung sedikit bentuk hidroksida dalam larutan basa.+ NO3.) (Res.NMe2) + H2O (Res.(lar. mereka berperilaku sebagai resin penukar ion basa kuat.(lar. dapat dinyatakan sebagai: 2 (Res.NMe3+)2SO42.(lar.COO-)Na+ + H2O Tetapi hanya memiliki sedikit aksi terhadap. bahkan sekalipun terdapat resin dengan berlebihan. mudah diregenerasikan dengan alkali. sebagai contoh: (Res.+ 2 Cl.NMe3+)OH.) Resin yang bersifat basa.+ H2O Aktivitas resin-resin ini serupa dengan resin penukar kation sulfonat. dalam bentuk garamnya.) (Res.+ SO42. yang menghasilkan bentuk garam yang sangat terionisasi: (Res.NMe2) + H+Cl.(lar. dan aksinya sangat tak bergantung pada pH. dan resin ini sebagian besar berada dalam bentuk amina. sebagian besar akan terionisasi.

dan ion bervalensi lebih tinggi berada dalam larutan. Bila sebuah kation dalam larutan sedang bertukar dengan sebuah ion yang berbeda valensinya. pertukaran akan lebih baik dengan keenceran yang lebih tinggi. berbeda-beda menurut ukuran ion terhidrasinya dengan cara yang sama seperti untuk kation. dengan ion-ion yang bermuatan sama BS dari suatu larutan. Sifat ion-ion yang saling bertukaran a. untuk menukar suatu ion bervalensi lebih tinggi yang berada pada suatu penukar ion. anion polivalen umumnya lebih dipilih untuk diserap. dengan suatu ion bervalensi lebih rendah dalam larutan.Proses pertukaran ion yang melibatkan penggantian ion-ion AR yang tertukarkan dalam resin. pertukaran akan lebih baik dengan menaikkan konsentrasi. yaitu menentukan seberapa mudahnya dua atau lebih zat yang menghasilkan ion-ion dengan muatan serupa dapat dipisahkan dengan cara pertukaran ion dan juga menentukan seberapa mudahnya ion-ion tersebut dapat selanjutnya dikeluarkan dari resin. Pada konsentrasi-konsentrasi rendah dalam larutan air. meliputi: 1. Dengan resin penukar anion basa kuat. Sifat resin penukar ion Cd2+<Be2+<Mn2+<Mg2+=Zn2+<Cu2+ . tingkat pertukaran bagi anion-anion univalent. dibandingkan ion lain. sementara untuk ion divalen ukuran ion merupakan faktor yang penting. d. Dalam larutan encer. b. tetapi ketidak lengkapan disosiasi garam-garam logam bivalen (bervalensi 2) jugamemainkanperanan =Ni2+ <Co2+<Ca2+<Sr2+<Pb2+<Ba2+. Pada kondisi yang serupa dan valensi yang konstan. boleh ditulis: AR + B S BR + A S Proses ini reversibel. Sejauh mana satu ion lebih dipilih untuk diserap. Jadi. tingkat pertukaran bertambah dengan bertambahnya valensi ion yang bertukar itu. memiliki arti penting yang mendasar. Faktor-faktor yang menetapkan distribusi ion-ion antara suatu larutan. afinitasnya relatif dari ion yang bervalensi lebih tinggi (terhadap resin) bertambah dengan perbandingan lurus dengan bertambahnya keenceran. dan pada suhu biasa. yaitu: Na+<Ca2+<Al3+<Th4+. c. sedangkan jika ion bervalensi lebih rendah berada pada penukar ion. 2. untuk ion-ion univalen (bervalensi 1) tingkat pertukaran bertambah dengan berkurangnya ukuran kation terhidrasi: .

dimana ion dengan volume terhidrasi yang lebih kecil. II. dan sebagainya dialirkan melalui sebuah kolom penukar ion. Jika suatu campuran dan dua atau lebih dari kation yang berbeda A. 2002). dan jika kuantitas-kuantitas ion-ion ini lebih kecil dibanding kapasitas total kolom untuk ion. sedangkan yang basa lemah pada pH di bawah sekitar 5. Kapasitas penukar-ion yang asam lemah dan yang basa lemah. B. dimana yang asam lemah mencapai nilai-nilai agak konstan pada pH di atas sekitar 9. smeakin besarlah kapasitasnya. Dan juga bergantung pada derajat rangkaian silang dengan naiknya derajat rangkaian silang resin menjadi lebih selektif terhadap ion-ion yang berbeda-beda ukurannya (volume ion dianggap meliputi air hidrasi). Prinsip Kromatografi Pertukaran Ion Kromatografi penukar ion merupakan kromatografi yang berdasarkan penukaran ion-ion secara equivalen antara larutan dan gugusan fungsional resin yang mengandung ion-ion yang dapat ditukar (Pudjaatmaka. Kapasitas pertukaran-ion Kapasitas pertukaran ion total dari suatu resin bergantung pada jumlah total gugus ugus aktif-ion per satuan bobot bahan itu dan semakin banyak jumlah ion-ion itu. maka mungkin untuk memperoleh kembali ion-ion terserap itu. biasanya akan lebih dipilih untuk diserap.Absorpsi ion-ion akan bergantung pada sifat gugus fungsional dalam resin. sendiri-sendiri dan berturut-turut dengan . merupakan fungsi dari pH.

semua B yang terdapat akan mengalir keluar dari dasar kolom sebelum satupun A dibebaskan. kurva harus mendekati distribusi Gauss (distribusi normal). akan diperoleh sebuah kurva elusi seperti diperlihatkan pada gambar: Nampak. suatu pemisahan kuantitatif dimungkinkan jika kurva elusi itu saling tindih. Teknik pemisahan ini disebut kromatografi pertukaran ion. Jika konsentrasi A dalam porsi-porsi eluat yang berturutan. Penyimpangan yang terlalu besar dari distribusi ini. Jika suatu larutan berupa eluan yang sesuai. kurva-kurva elusi dapat diperoleh untuk masing-masing ion dengan menggunakan eluan-eluan yang sesuai. jalannya reaksi dapat diikuti dengan menganalisis larutan efluen dengan kontinu. Jika kolom pertukaran ion memuat berbagai ion B.menggunakan larutan regenerasi atau elusi yang sesuai. dialirkan melalui sebuah kolom yang dimuati oleh suatu ion A. dialirkan terhadap volume eluat. bahwa praktis semua A terkandung dalam volume cairan tertentu dan juga bahwa konsentrasi A melalui suatu batas maksimum. Jika kurva-kurva elusi ini cukup jauh terpisah seperti gambar dibawah. asalkan kolom cukup panjang dan faktor-faktor eksperimen lainnya menguntungkan bagi pemisahan khusus itu. hanya akan diperoleh pemisahan yang tak lengkap. mungkin menunjukkan teknik-teknik yang salah dan atau kondisi-kondisi operasi yang salah. Jika kation A ditahan lebih kuat oleh resin penukar dibandingkan kation B. Idealnya. C dan sebagainya yang bermuatan serupa. .

dan faktor ini sendiri saja dapat diharapkan akan mengubah selektivitas untuk resin. Seperti telah ditunjukkan. Dalam pelarut campuran air-organik. besarnya efek-efek demikian jelas bergantung pada proporsi pelarut organik yang ada. lingkup dari proses pertukaran ion telah diperluas selama sekitar dekade terakhir ini dengan menggunakan baik sistem pelarut organik. maupun sistem campuran pelarut air-organik. cenderung untuk secara dominan menyerap air ke dalam struktur resin. . keton. serta menghasilkan penetapan yang berguna. Pertukaran-Ion Dalam Pelarut-pelarut Organik dan Air Organik Penelitian-penelitian dalam sistem-sistem air telah menetapkan banyak prinsipprinsip dasar dari pertukaran ion.III. Selain mempengaruhi gayagaya yang murni elektrostatik ini. yang umunya mempunyai tetapan dielektrik di bawah 40. Namun. secara dominan adalah pelarut organik. Dimana sistem pelarut campuran digunakan. sedangkan larutan yang mengambang di antara resin-resin. resin-resin penukar ion merupakan sistem-sistem osmotik yang mengembang karena pelarut tertarik ke dalam resin. dan anion-anion tentunya akan berpasangan lebih kuat dalam sistem-sistem pelarut demikian dibandingkan dalam air. dan telah diperlihatkan bahwa fase resin-resin kation yang sangat asam dan fase resin anion yang sangat basa. dan karboksilat. Pelarut organik yang umum digunakan adalah senyawa-senyawa okso dari tipe alkohol. adanya pelarut-pelarut organik dapat meningkatkan kecenderungan suatu kation untuk membentuk kompleks dengan ligan lainnya. terjadi kemungkinan osmosis preferensial (osmosis yang lebih dipilih). Efek ini (sorpsi air yang lebih dipilih (preferensial) oleh resin) meningkat dengan menurunnya tetapan dielektrik dari pelarut organik itu. jadi memodifikasi perilaku pertukaran ionnya. Maka kation-kation.

sehingga selama sintesis (pembentukan) resin itu. Ini terutama perlu karena zat-zat penyepit yang membentuk komplek yang stabil. sendirian. yang akan dimasukkan sebagai gugus fungsional ke dalam suatu resin penukar-ion. menghasilkan ke dalam suatu gel resin yang cukup stabil. Afinitas suatu ion logam tertentu terhadap suatu resin-penyempit tertentu. dimana laju nampaknya dikendalikan oleh mekanisme difusi partikel. yang dapat memperbaiki faktor-faktor pemisahan pertukaran ion yang normal. 4. zat penyepit itu harus. struktur ruang (sterik) dari gugus penyepit itu harus kompak. Menurut Gregor et al. tata letak gugus-gugus ligan yang spesifik itu harus tetap terpelihara di dalam resin. bergantung terutama pada sifat gugus penyepit. Aspek ini telah dimanfaatkan oleh Korkisch untuk pemisahan ion-ion anorganik dengan apa yang disebut ’Metode Kombinasi Pertukaran Ion-Ekstraksi pelarut’ (CISE = Combined Ion Exchange-Solvent Extraction). Resin-resin Penukar-Ion Pembentuk Sepit Suatu sifat penting dari penukar ion penyempit adalah selektivitas mereka yang lebih besar dibandingkan penukar-ion jenis konvensional. gugus penyepit itu harus memiliki kestabilan kimia yang cukup.. Proses pertukaran ion dalam suatu resin-penyepit biasanya lebih lambat ketimbang dalam penukar jenis biasa.Suatu akibat yang menarik dari sorpsi selektif ini adalah bahwa kondisi-kondisi untuk kromatografi (partition chromatography) muncul. Dan perilaku selektif dari resin. atau bersama-sama sebuah zat perangkai-silang. struktur fungsionalnya tak berubah oleh polimerisasi atau reaksi apapun. 3. sifat-sifat berikut diperlukan untuk suatu zat penyepit. terutama didasarkan atas perbedaanperbedaan dalam kestabilan komplek-komplek logam yang berbentuk pada resin itu pada berbagai kondisi pH. sehingga pembentukan cincin sepit dengan kation. atau ia sanggup dimasukkan ke dalam suatu matriks polimer. 2. tak akan terintangi oleh matriks resin. 1. IV. biasanya paling sedikit tridentat .

tanpa kehilangan kemampuan-kemampun mereka untuk membentuk kompleks yang selektif. sekunder dan tersier. Penukar-Ion Cairan Proses penukaran ion yang melibatkan resin penukar. terjadi antara fase padat dengan fase cair. Bahan permulaan untuk sintesis resin penyepit ini adalah stirena-divinilbenzena terklorometilasi yang mengalami reaksi aminasi dan laku diolah dengan asam monoklorasetat. petroleum eter. dan ini penting diperhatikan agar dapat menggunakan penukar ion cairan secara efektif. Begitulah amina yang berbobot molekul tinggi. sementara dalam hal penukar ion cairan. Teknik yang digunakan untuk pemisahan dengan penukar ion cairan identik dengan teknik yang digunakan dalam pemisahan dengan ekstraksi pelarut. misalnya penukar ion Amberlite LA. dapat digunakan sebagai penukar anion. dan sebagainya. Penukar anion yang sekarang tersedia sebagian besar berdasarkan amino alifatik primer. yang memiliki kelarutan yang rendah dalam air.1 [N-dodesenil (trialkilmetil)amina] dan Amberlite LA. tetapi kelarutan yang tinggi dalam pelarut-pelarut yang tidak tercampurkan dengan air. Sama halnya dengan asam yang tidak terlarutkan dalam air. proses berlangsung antara 2 larutan yang tidak saling tercampurkan. Penukar ion cairan terdiri dari asam dan basa yang berbobot molekul tinggi. yang dapat diekstraksi. ada kesulitan dan kekurangan berkaitan dengan penggunaan mereka. dalam larutan asam menghasilkan kation-kation yang mampu membentuk spesi-spesi dengan berbagai anion. Cairan penukar anion paling baik digunakan sebagai larutan dan pelarut organik inert seperti benzena.Pertimbangan-pertimbangan ini menunjukkan bahwa banyak zat penyepit tak dapat dimasukkan ke dalam suatu resin. dapat bertindak sebagai penukar kation untuk ion-ion dalam larutan air. sikloheksena. yang keduanya adalah amin sekunder.2 [N-lauril (trialkilmetil)amina]. jadi penukar-penukar ini memberi banyak sifat-sifat yang menguntungkan baik dari pertukaran ion maupun ekstraksi pelarut. Kerja penukar ion cairan melibatkan perpindahan selektif suatu zat terlarut antara suatu fase air dan suatu fase organik yang tak tercampurkan yang mengandung penukar cairan. dalam pelarut yang tidak tercampurkan dalam air. larutan suatu basa yang tidak larut dalam air. Namun. . Begitulah. V. toluena.

Larutan yang dimasukkan biasa disebut sampel.5. Kromatografi digunakan dalam pemurnian protein. Pemurnian Protein Kromatografi pertukaran ion memisahkan protein berdasarkan pada muatan bersih protein dan pada kekuatan relatif dari muatan bersih protein tersebut. dekstran dan agarosa. Gugus penukar kation lemah CM. sedangkan penukar ion kuat dapat mempertahankan kondisi terionisasi pada rentang pH yang luas. Garam – garam yang efektif digunakan pada proses pengendapan protein adalah garam yang multi anonik seperti sulfat. Beberapa gugus penukar anion yaitu aminoetil (AE-) kuaternari aminoetil (QAE-) dan dietilaminoetil (DEAE-). Pengendapan ini dapat dilakukan dengan mengubah kekuatan ionic.B.(penukar kation kuat) dapat mempertahankan kondisi terionisasi pada rentang pH 1 – 10. komponen-komponen secara sendiri-sendiri disebut analit. dan kontrol penukar ion sering . dan asam amino. serta panjang rantai polipeptida yang tidak sama. APLIKASI KROMATOGRAFI PENUKAR ION Kromatografi penukar ion (atau kromatografi ion) adalah sebuah proses yang memberikan pemisahan ion-ion dan molekul polar berdasarkan their charge. analisis air. pH. Penukar ion lemah hanya dapat mempertahankan kondisi terionisasi pada rentang pH sempit dan kehilangan muatannya pada pH tertentu. dansitrat (Scopes.Dalam setiap molekul dari setiap jenis protein tertentu mempunyai komposisi dan deret asamamino. Misalnya gugus penukar anion lemah DEAEterionisasi sempurna dibawah pH 6.1994). Kromatografi ini dapat digunakan untuk hampir semua jenis of charge molecule termasuk protein besar. Salah satu tahap yang banyak digunakan untuk pemurnian protein adalah pengendapan protein. dan pemisahan kualitas. Protein merupakan makromolekul yang tersusun dari building blok asam-asam amino. pnambahan pelarut organik. polimer dan penambahan garam. Gugus penukar ion diimobilisasikan pada matrik. Kromatografi pertukaran ion memerlukan fase diam yang biasanya merupakan polimer terhidratasi yang bersifat tidak larut seperti selulosa.0 dan akan kehilangan muatannya pada pH 9.akan kehilangan muatannya dibawah pH 4. nukleotida kecil. sedangkan gugus penukar kation yaitu sulfopropil (SP-). metil sulfonat dan karboksimetil (CM-).0. fosfat. Gugus penukar ion kuat Q (penukar anion kuat) dan SP.

Mula-mula gugus fungsional matrik yang bermuatan negatif mengikat ion dari bufer (misalnya Na+). maka protein yang bermuatan positif akan menggantikan ion Na+ sedangkan protein yang bermuatan negatif atau netral tidak akan terikat. Jika protein stabil pada rentang 1 unit diatas dan dibawah pI maka kedua penukar ion dapat digunakan.Dasar dari kromatografi pertukaran ion adalah ion bermuatan dapat dengan bebas dipertukarkan dengan ion yang memiliki tipe muatan yang sama. Apabila protein stabil pada pH diatas titik isoelektriknya (pI) maka digunakan penukar anion (positif). Pada saat menentukan pH untuk kromatografi. Pada saat sampel dimasukkan ke dalam kolom. maka harus diperhatikan stabilitas protein target pada pH yang dipilih. . Proses selanjutnya adalah melepaskan ikatan protein yang terikat gugus fungsional matrik dengan cara membilas kolom menggunakan bufer yang mengandung NaCl atau KCl. Protein yang tidak terikat dibilas dengan menggunakan buffer (biasanya dengan konsentrasi 10-50 mM). Pemurnian protein dengan kromatrografi pertukaran ion Pemilihan penukar ion tergantung pada muatan protein target. tetapi bila protein stabil pada pH dibawah pI nya maka digunakan penukar kation (negatif). Muatan bersih protein tergantung pada pH (protein semakin bermuatan positif dengan menurunkan pH dan semakin negatif dengan menaikkan pH). Pembilasan dilakukan dengan meningkatkan konsentrasi NaCl atau KCl secara linier atau bertahap sehingga protein yang memiliki ikatan lemah dengan matrik akan lepas terlebih dahulu dan diikuti oleh protein yang memiliki ikatan lebih kuat. Protein yang memiliki muatan negatif dapat dipertukarkan dengan ion klorida.

nukleotida siklik. nukleotida. Matrik polidekstran dan agarosa (misalnya DEAE-Sephadex. stabilitas mekanik dan kimia. Keuntungan kromatografi penukar ion diantaranya adalah tidak merusak protein yang dimurnikan dan pada umumnya memiliki kapasitas pengikatan yang tinggi. yaitu : 1. polistiren. Selain itu larutan enzim hasil kromatografi penukar ion mengandung kadar garam cukup tinggi yang harus dihilangkan untuk proses pemurnian selanjutnya. Penukar ion lemah akan memberikan hasil pemisahan yang lebih baik untuk protein-protein yang memiliki muatan bersih yang berdekatan. ion yang dapat diikat. Matrik polistiren dan polifenolik lebih sering digunakan untuk memisahkan molekul-molekul kecil seperti asam-asam amino. Kelemahannya adalah protein-protein yang memiliki distribusi gugus bermuatan pada permukaannya atau memiliki pI yang sama atau mirip akan sulit dipisahkan dengan cara kromatografi penukar ion. CM-selulosa dan fosfoselulosa paling sering digunakan. Ada 3 kelompok matrik yang biasanya digunakan. selulosa. hormon.Matrik yang mengikat gugus fungsional menentukan sifat aliran. Pada pemurnian xilanase. Matrik selulosa biasanya digunakan untuk memisahkan protein (termasuk enzim). Molekul yang memerlukan pH sangat rendah atau sangat tinggi untuk dapat erionisasi atau apabila molekul stabil pada pH ekstrim maka penukar ion kuat harus digunakan. DEAE-selulosa. asam-asam organik. CMSephadex) digunakan untuk memisahkan protein. polisakarida dan asam nukleat. poliakrilik atau polifenol. peptida kecil. tRNA dan polisakarida. dan 3. 2. matrik selulosa biasanya tidak digunakan karena beberapa xilanase tertentu memiliki cellulose binding domain (Subramaniyan & Prema 2002) yang akan berinteraksi pada proses elusi normal. . Pemilihan penukar ion kuat atau lemah tergantung pada pH molekul target. Dekstran (Sephadex) atau agarosa (sepharose).

Proses penukar ion dapat dipisahkan menjadi 4 langkah yaitu: 1. . Equilibrasi Aplikasi sampel Elusi Regenerasi 2. 3. 4.

biomolekul dilepaskan dari penukar ion dengan mengubah komposisi buffer. Tujuan pada tahap ini adalah untuk mengikatkan molekul yang menjadi target dan mencuci semua material yang tidak terikat dengan sampel buffer yang mempunyai pH dan kekuatan ionik sama. ini untuk memastikan bahwa kapasitas penuh dari fase stasioner untuk dapat digunakan selanjutnya. Elusi Dalam tahap ketiga ini adalah elusi. Equilibrasi Tahap I adalah kesetimbangan terhadap fase stasioner atau fase diam untuk membuat kondisi awal yang diinginkan. . membuang semua molekul yang masih berikatan.1. 3. Ketika terjadi kesetimbangan. misalnya Ion Klorida (Cl-) atau Sodium (Na+). 4. 2. Deabsorbsi protein relatif terhadap jumlah gugus bermuatan pada permukaanya. semua bagian dari gugus muatan pada fase stasioner berikatan dengan counter ion penukar. seperti buffer awal agar supaya semua muatan protein berikatan dengan tepat. yang umum digunakan adalah peningkatan ionik dengan NaCl atau gram sederhana lainnya agar supaya terjadi penurunan ikatan protein. Regenerasi Tahap akhir adalah regenerasi. Aplikasi Sampel Tahap II adalah aplikasi sampel dan pencucian.

maka kami mengambil satu dari sekian banyak penelitian-penelitian yang telah dilakukan mengenai isolasi dan pemurnian protein yaitu salah satunya enzim xilanase. enzim diproduksi dan digunakan oleh sel hidup untuk mengkatalisis reaksi antara lain konversi energi dan metabolism pertahanan sel. Enzim memegang peranan penting dalam berbagai reaksi di dalam sel. Enzim mampu meningkatkan reaksi kimia tetapi tidak diubah oleh reaksi yang dikatalisnya serta tdak megubah kedudukan normal dari kesetimbangan kimia.Enzim Enzim adalah protein globular yang umumnya berfungsi sebagai biokatalis pada semua proses kimia dalam makhluk hidup. Aplikasi Kromatografi Penukar Ion Dalam Isolasi dan Karakterisasi Xilanase dari Bacillus circulans . Enzim mempunyai daya katalisisspesifik yang lebih besar dari katalisator lainnya. Aplikasi kromatografi penukar ion dalam pemurnian protein ini juga dapat dikembangkan dalam bidang industri. Sebagai protein. sehingga disebut life is enzyme. Untuk dapat memahami bagaimana aplikasi kromatografi penukar ion dalam pemurnian protein.

PENDAHULUAN Perkembangan teknologi industri terus mengalami kemajuan terutama teknologi yang berwawasan lingkungan. mengurangi kebutuhan bahan kimia dan meningkatkan kekuatan pulp dan kertas. tahan pH alkali. Xilanase dapat diproduksi oleh beberapa organisme seperti bakteri. Pengembangan proses hidrolisis secara enzimatis merupakan prospek baru untuk penanganan limbah hemiselulosa. . Pemakaian enzim memiliki banyak keunggulan seperti menghemat energi. proses pemutihan menjadi lebih ramah lingkungan. Penggunaan enzim xilanase diharapkan dapat mereduksi penggunaan bahan kimia klorin yang bersifat berbahaya pada bagi lingkungan sehingga dengan menggunakan enzim xilanase. pemutihan (bleaching) dan deinking.A. Saat ini telah dikembangkan proses bioteknologi dalam industri pulp dan kertas. Proses pemutihan adalah proses yang memisahkan serat kertas dari lignin (penyebab kertas berwarna kusam) . reduksi pitch. Salah satu upaya yang sedang dikembangkan adalah penggunaan enzim pada beberapa proses pembuatan pulp dan kertas seperti pada pemasakan (cooking). aktinomisetes. Proses pemutihan pulp tidak hanya membuat pulp menjadi lebih putih atau cerah. Xilanase yang dibutuhkan dalam proses prapemutihan pulp diharapkan memiliki beberapa karakteristik spesifik seperti tahan suhu tinggi (60-70oC). protozoa. alga. ragi. Salah satu enzim yang banyak dimanfaatkan dalam industri pulp dan kertas adalah xilanase. jamur. Beberapa jenis bakteri dan jamur diketahui mampu menghasilkan xilanase ekstraseluler yang dapat menghidrolisis hemiselulosa menjadi xilosa. sehingga pulp tersebut sesuai untuk dibuat kertas dengan jenis tertentu. Xilanase bisa digunakan untuk menghidrolisis xilan (hemiselulosa) menjadi gula xilosa. gastropoda dan artropoda.yang selama ini memakai pemutih kimia. Xilan banyak diperoleh dari limbah pertanian dan industri makanan. tetapi juga membuatnya stabil sehingga tidak menguning atau kehilangan kekuatan dan derajat putih selama penyimpanan. Xilanase digunakan untuk meningkatkan ekstraksi lignin dan melepaskan kromofor dari pulp dalam tahapan awal pemutihan pulp. berupa endoxilanase dan bebas dari aktivitas selulase. Selain itu beberapa mikroorganisme yang terdapat pada ruminansia diketahui berpotensial sebagai penghasil xilanase karena hewan ruminansia tersebut mengkonsumsi hemiselulosa dalam jumlah besar. Tujuan utama dari proses pemutihan adalah untuk meningkatkan derajat putih pulp.

diambil sampel sejumlah 3 mL setiap dua jam sekali sampai dengan jam ke-24. xilan oat spelt 0. Jepang). ITB. Bandung. asam asetat. refrigerated centrifuge. poliakriamida. circulans yang berasal dari laboratorium Mikrobiologi. K2HPO4 0.1%.5 dengan Na2CO3 1%. Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati.. Congo Red. Fraksi V. Medium xilan terdiri dari pepton 0. bromofenol biru. Bovine serum albumin (BSA. Pengembangan produksi dalam skala komersial diharapkan dapat menciptakan kewirausahaan baru dan juga mendukung perkembangan industri pulp dan kertas yang berwawasan lingkungan.02%. Tokyo. sehingga enzim dari bakteri ini diharapkan dapat diproduksi dan digunakan pada proses awal pemutihan pulp di industri pulp dan kertas. pengaduk magnetik. ekstrak ragi 0. Merck). K3FeCN6. NaCl. avometer. waterbath. circulans.9.5%. kemudian setiap enam jam sekali . Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah ammonium sulfat. Isolasi Xilanase Untuk mengetahui waktu bakteri menghasilkan xilanase dan umur inokulum kultur yang digunakan maka dilakukan pembuatan kurva tumbuh dan kurva aktivitas xilanase dari B. kantung dialisis berbahan dasar selulosa (SIGMA CHEMICAL) dengan ukuran pori yang dapat memisahkan protein minimal 12 kDa. Diharapkan dengan penelitian ini dapat mengatasi permasalahan ketersediaan enzim yang spesifik dan kendala yang dihadapi dalam aplikasinya di industri pulp dan kertas. spektrofotometer. maka perlu dilakukan penelitian mengenai isolasi dan karakterisasi xilanase dari Bacillus circulans. Tris base. Metoda 1. NaOH. BAHAN dan METODA Bahan dan Alat Peralatan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah rotary shaker. gliserol. kolom kromatografi.5% (Sigma Chemical). Isolat ditumbuhkan pada medium xilan kemudian diinkubasi selama 80 jam. pH medium diatur 10. Hasil penelitian terdahulu menunjukkan Bacillus circulans diketahui mampu menghasilkan xilanase dengan aktivitas selulase terendah.7H2O 0. glisin.5%. Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah B. elektroforesis Mini Protean IIxI. matriks DEAE-Toyopearl 650 M (Tosoh Corp. xilosa. Na2CO3. Untuk mengetahui pola pertumbuhan dan aktivitas xilanase. NaHCO 3. Berdasarkan hal tersebut. MgSO4.Genus Bacillus diketahui sebagai penghasil xilanase yang aktif pada suhu 50 °C – 60 °C. dengan pH 7 . B.

Endapan yang diperoleh dilarutkan dalam buffer NaHCO3-Na2CO3 25 mM pH 9. Inokulum yang digunakan adalah 10% (v/v). 40-60.000 rpm selama 25 menit. 20-40. Pemurnian Parsial Xilanase Seluruh tahapan pemurnian dilakukan pada suhu 4oC dengan diagram alir seperti dibawah ini: a. Seluruh sampel yang diperoleh dihitung jumlah koloninya dan aktivitas xilanasenya. Ekstrak kasar enzim diperoleh dengan mensentrifugasi kultur bakteri dengan kecepatan 8. Larutan kemudian diaduk dan disentrifugasi dengan kecepatan 12. .8 L buffer NaHCO3-Na2CO3 selama 24 jam. dilakukan produksi xilanase. dan 80-100. dan 12 jam sekali sampai kultur berumur 80 jam. Kultur B. 2. Fraksinasi Bertingkat dan Dialisis Ekstrak kasar enzim xilanase dari hasil isolasi difraksinasi bertingkat dengan menggunakan garam ammonium sulfat ((NH4)2SO4) sehingga diperoleh persen saturasi 020.000 rpmselama 10 menit pada suhu 4oC. circulans diinokulasikan ke dalam medium xilan kemudian diinkubasi pada suhu 37◦C dengan pengadukan 200 rpm selama 18 jam.sampai jam ke-60. Hasil fraksinasi kemudian didialisis dalam 4. 60-80.3. Berdasarkan kurva pertumbuhan dan kurva aktivitas xilanase yang telah dibuat.

Kromatografi Penukar Ion Filtrat hasil dialisis kemudian dimurnikan lebih lanjut dengan kromatografi kolom. Uji aktivitas xilanase dan pengukuran protein dilakukan menggunakan metode sebagai berikut: 3. Satu unit (U) aktivitas xilanase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat menghasilkan 1 μmol gula pereduksi (xilosa) per menit dengan xilan sebagai substrat. Filtrat hasil dialisis kemudian dialirkan ke dalam kolom dan dielusi secara bertahap dengan menggunakan larutan NaCl (0-450 mM) dalam buffer NaHCO3-Na2CO3 sehingga diperoleh fraksi-fraksi.5. 1996). Penentuan pH dan Suhu Optimum Penentuan pH optimum dilakukan dengan menguji aktivitas xilanase pada rentang pH 8–10 dengan rentang pH 0.5-10. 4. Untuk penentuan pH optimum xilanase digunakan dua jenis buffer yaitu buffer Tris-Cl untuk pH 8. Karakterisasi Xilanase a.b.5). Merck) sebagai standar. Penyesuaian pH enzim dilakukan dengan cara mengencerkan enzim sejumlah 10-100x pada berbagai pH sehingga konsentrasi akhir buffer pada reaksi 100 mM. 5.Fraksi V. Penentuan suhu optimum dilakukan dengan menguji aktivitas enzim xilanase pada rentang suhu 30-90oC selama 30 menit dengan rentang 10oC pada pH optimum yang diperoleh. Uji Aktivitas Xilanase Aktivitas xilanase diuji dengan mengukur jumlah gula pereduksi dari substrat xilan dengan menggunakan metode Ferisianida Alkali (Walker dan Harmon. Aktivitas enzim dihentikan dengan menambahkan ferisianida alkali sejumlah 600 μL dan dididihkan selama 10 menit. Setiap fraksi yang diperoleh diuji aktivitas xilanase dan kadar proteinnya. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 39oC selama 30 menit. dan buffer Glisin-NaOH untuk pH 8. Kromatografi dilakukan dengan menggunakan bahan pendukung DEAE-Toyopearl 650 M yang telah disetimbangkan dengan buffer NaHCO3-Na2CO3. Campuran ditambahkan air sejumlah 4 mL kemudian diukur pada A420. Mula-mula ekstrak enzim sejumlah 50 μL ditambahkan ke dalam substrat xilan oat spelt 1-3% sejumlah 150 μL dalam buffer Na2CO3-NaHCO3 25-100 mM (pH 10. Pengukuran Kadar Protein Kadar protein diukur dengan menggunakan metoda Bradford (1976) dengan menggunakan bovine serum albumin (BSA. .

232 U/mL yang lebih rendah jika dibandingkan dengan isolate Bacillus lainnya sehingga sesuai digunakan untuk industry pulp dan kertas.1% pada suhu 50oC selama 20-30 menit.378 U/mL enzim). gliserol 50% (v/v) dan Bromofenol biru 0. Gel tersebut kemudian dibilas dengan menggunakan larutan NaCl 1 M sampai kelebihan warna pada pita hilang. C. Gel dielektroforesis pada Mini Protean IixI (Bio Rad) dengan tanki elektroforesis vertikal.5 mM pH 6. Kondisi fermentasi yang digunakan untuk menghasilkan ilanase adalah suhu 37o C. Gel kemudian direndam di dalam buffer Glisin-NaOH 100 mM pH 8. pH medium 10. Ekstrak kasar enzim yang diperoleh dan fermentasi dengan menggunakan 100 mL medium adalah 100 mL berarti xilanase yang dihasilkan pada kondisi tersebut dapat mencapai rendemen 100%. Pemurnian parsial xilanase .5 dengan pengadukan 200 rpm selama 18 jam dengan jumlah inokulum bakteri yang digunakan adalah 10% (v/v).5 dengan substrat xilan 0.8. maka waktu bakteri yang digunakan untuk percobaan selanjutnya adalah 18 jam karena pada waktu tersebut xilanase mempunyai aktivitas tertinggi dan memiliki waktu fermentasi yang singkat. Isolasi B. Gel kemudian diwarnai menggunakan Congo Red 0. Sampel sejumlah 10-36 μL dimasukkan ke dalam sumur kemudian dielektroforesis dengan arus sebesar 24 mA pada double strength running buffer (pH 9). Gel lalu dibilas kembali menggunakan asam asetat 0. kurva aktivitas xilanase yang tertinggi diperoleh pada jam ke 18 dan jam ke 36 (0. Berdasarkan kurva tersebut. circulans Hasil skrining menunjukkan bahwa isolate B. Mula-mula enzim dicampur dengan sampel buffer 5x yang mengandung Tris-Cl 312.5% sehingga akan diperoleh zona bening yang menunjukkan adanya aktivitas enzim xilanase dengan latar belakang biru gelap. Analisis Zimogram Sampel enzim dielektroforesis dengan native gel poliakrilamida 10 % selama 4-5 jam dengan kondisi dingin (4-8oC).05%. circulans dapat menghasilkan xilanase dengan memiliki aktivitas selusase rendah yaitu 0.1% selama 15 menit pada suhu ruangan. PEMBAHASAN 1. 2.b.

Cara mengetahui aktifitas enzim dengan membagi aktifitas enzim hasil pemurnian dengan aktifitas enzim awal ekstrak kasar enzim. pH 9. Jika konsentrasi garam tinggi maka kelarutan protein akan menurun sehingga protein akan menurun sehingga protein dapat mengendap dengan sempurna. 3. Lalu fraksi tersebut didialisis untuk menghilangkan garam ammonium sulfat dan molekul kecil berberat molekul rendah. Enzim hasil fraksinasi 20 – 40 % yang telah didialisis dialirkan dalam kolom penukar ion lalu dielusi secara bertahap dengan menggunakan NaCl (0 – 450 mM) dalam buffer NaHCO3-Na2CO3 25 mM. Xilanase mulai dapat mengendap pada konsentrasi garam dengan persen saturasi 0 – 20%. Hasil pemisahan protein dengan kolom penukar anion menunjukkan puncak aktivitas xilanase tertinggi diperoleh pada fraksi ke 14 dengan aktivitas spesifik 805. Karakterisasi enzim xilanase .3 sehingga diperoleh 40 fraksi.48 U/mg. Berdasarkan hasil uji aktivitas spesifik. Hasil fraksinasi menunjukkan xilanase dapat mengendap pada seluruh tingkatan fraksinasi yang digunakan karena pada seluruh fraksi yang diperoleh menunjukkan adanya aktivitas xilanase. Hasil pemurnian enzim xilanase menggunakan kromatografi penukar anion menunjukkan peningkatan aktivitas enzim spesifik menjadi 805.Pemurnian dilakukan secara parsial karena pada penelitian ini tidak bisa didapat enzim yang benar2 murni. Pengendapan protein semakin meningkat dengan peningkatan jumlah garam yang ditambahkan dalam sampel protein yang ditandai dengan meningkatnya jumlah endapan. tetapi jika konsentrasi garam rendah maka akan terjadi sebaliknya. maka sampel fraksi 20 – 40% digunakan untuk proses pemurnian dengan kolom kromatografi. Dengan adanya garam ammonium sulfat pada konsentrasi tertentu berpengaruh terhadap kelarutan suatu protein.8 kali dibanding dengan ekstrak kasarnya. Prinsip kolom penukar ion adalah protein dengan ikatan elektrostatis yang lebih rendah dengan matriks akan dielusi terlebih dahulu dan diikuti protein dengan ikatan elektrostatik yang lebih tinggi.12 U/mg. aktivitas xilanase fraksi dengan saturasi 20– 40% menunjukkan peningkatan aktivitas spesifik tertinggi yaitu sebesar 585.48 U/mg dengan tingkat kemurnian 46. Tingkat kemurnian suatu enzim diketahui dari aktifitas enzim tersebut dan berdasarkan kelipatan pemurnian enzim yang diperoleh. Ekstrak kasar xilanase difraksinasi bertingkat sehingga didapat 5 fraksi.

Isoenzim dihasilkan oleh bakteri dengan tujuan agar bakteri tersebut dapat menghidrolisis substrat xilane dengan sempurna. Kedua xilanase ini kemungkinan adalah isoenzim.Karakterisasi enzim xilanase dilakukan menggunakan enzim hasil pemurnian parsial dengan parameter pH dan suhu. Dari hasil zimogram diatas diketahui bahwa terdapat dua jenis xilanase. Keragaman Xilanase Keragaman xilanase dapat dianalisis menggunakan metode zimogram. sehingga enzim tidak terdenaturasi.5 dan suhu 75o – 80o C. karena kedunya mengendapa pada fraksi yang sama yaitu fraksi . Xilanase memiliki aktivitas optimum pada pH 9. Adanya modifikasi pada protein tersebut dapat meningkatkan interaksi pada protein tersebut sehingga protein tersebut menjadi lebih rigid dan stabil pada suhu dan pH tinggi. Analisis ini perlu dilakukan untuk mengetahui keragaman xilanase pada saat tahap pemurnian. karena memiliki BM yang berbeda tetapi memiliki titik isoelektrik yang sama. karena dilihat dari BM yang berbeda tetapi memiliki titik isoelektrik yang sama. Keragaman enzim dapat terjadi karena adanya isoenzim. Juga menggunakan zimogram untuk mengetahui keragaman xilanase dari setiap tahapan pemurnian yang dilakukan. 4. interaksi kimia menyebabkan perubahan konformasi protein yang berpengaruh terhadap stabilitas dan aktivitas protein yang dipengaruhi oleh keadaan lingkungan mikro protein dan distribusi asam amino bermuatan pada permukaan protein. maka kita dapat menjelaskan adanya dua puncak aktivitas saat penentuan suhu optimum.

Sehingga jika kita hubungkan dengan pH optimum xilanase yang telah didapat (pH 9. yaitu dengan menurunkan konsumsi senyawa klorin sampai dengan 20% dan dapat diperoleh derajat putih yang sama dengan kontrol (tanpa menggunakan xilanase) pada tahapan pemutihan CEH (chlorinasi. • Penggunaan xilanase juga dapat meningkatkan kualitas kertas karena xilanase dapat meningkatkan viskositas pulp. circulans pada fraksi 14 mendekati nilai pI. Aspek Ekonomi • Enzim merupakan metode alternatif dengan biaya rendah sehingga dapat digunakan untuk mereduksi penggunaan klorin dan bahan bahan kimia pemutihan lainnya. meningkatkan derajat putih dan menurunkan bilangan kappa. meningkatkan derajat giling dari serat daur ulang. ada kemungkinan bahwa pH kedua xilanase B. . dan hipoklorit). a. • Penggunaan xilanase pada tahap pemutihan dapat meningkatkan fibrilasi pulp dan retensi air. Kemungkinan Penggunaan Xilanase di Industri Pulp dan Kertas Penggunaan xilanase dengan karateristik spesifik seperti tahan alkali dan suhu tinggi akan memiliki beberapa keunggulan jika dilihat dari sisi teknis.saturasi 20-40%. ekonomi dan lingkungan. 5. mereduksi waktu penggilingan pulp virgin. karena tidak perlu lagi dilakukan proses netralisasi dan pendinginan pulp. Penggunaan xilanase pada tahap pra-pemutihan ini dapat mereduksi penggunaan bahan kimia berbahan dasar klorin/ bahan pengoksidasi yang bersifat toksik sejumlah 20-40%. suatu protein sangat mudah diendapakan karena pada saat itu muatan listriknya nol. Aspek Teknis • Jika kita menggunakan xilanase yang tahan alkali dan suhu tinggi akan memudahkan penggunaan enzim pada tahapan pra-pemutihan. Selain itu terjadinya penurunan aktivitas enzim selama proses penyimpanan dapat dikurangi karena pengadaan enzim yang kontinyu. akibatnya kedua protein tersebut dapat mengendap pada fraksi yang sama. Titik isoelektrik (TI) adalah daerah pH tertentu dimana protein tidak mempunyai selisih muatan atau jumlah muatan positif dan negatifnya sama. • Digunakannya xilanase yang sesuai dengan karakteristik untuk proses pra pemutihan maka ketergantungan ketersediaan enzim untuk industri pulp dan kertas dari impor dapat berkurang. b.5). extraction. sehingga tidak bergerak ketika diletakkan dalam medan listrik pada pH isoelektrik (pI).

c. Aspek Lingkungan Telah kita ketahui bahwa penggunaan xilanase pada tahap pra-pemutihan pulp dapat mereduksi penggunaan bahan kimia berbahan dasar klorin atau bahan pengoksidasi yang bersifat toksik sejumlah 20-40%. . Dengan menurunnya senyawa klorin yang digunakan pada proses pemutihan maka secara teoritis diharapkan kandungan bahan berbahaya seperti senyara organik terklorinasi (AOX) dan dioksin pada air limbah industri pulp dan kertas dapat direduksi.

Alfabeta. Rekayasa & Efek Pemanfaatannya. Dasar-dasar Biokimia... 2002. Deoxyribo Nucleic Acid : Keanekaragaman.. 2007. H. Produksi dan Prospek Enzim Xilanase dalam Pengembangan Bioindustri di Indonesia. Jakarta Widhyastuti. 4. Nur.wikibooks. 1994..org/wiki/Proteomics/Protein_Separations__Chromatography/Ion_exchange . Jakarta Pudjaatmaka. SKKI-8 Asal Sukabumi. 2005. IPB Press. Ekspresi. A. 434 – 435.Erlangga. Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian. 1994. Protein Purification: Principles and Practice. N. Bogor Scopes. Kamus Kimia. Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik. Jakarta Richana.220-231. Bandung Vogel. Purifikasi dan Karakterisasi Xilanase Ekstraseluler Streptomyces sp. NewYork Toha. Springer Veriag. Balai Pustaka. 1994.L. 2002.A.K. H. R. Bogor http://en.. diterjemahkan oleh Maggy Thenawidjaya. ed. EGC.DAFTAR PUSTAKA Lehninger.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful