Kromatografi adalah teknik pemisahan zat untuk analisis dan preparative dengan melarutkan campuran dalam fase gerak

(cairan atau gas), yang mengalir melalui fase diam atau stasioner, zat zat yang hendak dipisahkan harus berinteraksi dengan fase stasioner dengan kuat yang berbeda beda , interaksi ini dapat bersifat adsorbs, partisi, pertukaran ion, dan interaksi lainnya. A. KROMATOGRAFI PENUKAR ION Pertukaran ion adalah salah satu metode yang efektif untuk pemisahan secara kuantitatif. Pemisahannya berdasarkan prinsip yang sama sekali berbeda dan hanya diterapkan pada senyawa yang berion. Dua seri paralel dari prosedur yang ada, terfokus pada pertukaran anion dan kation. Istilah penukar ion secara umum diartikan orang sebagai pertukaran dari ion-ion yang bertanda muatan (listrik) sama, antara suatu larutan dan suatu bahan yang padat serta sangat tak dapat larut, dimana larutan itu bersentuhan. Zat padat itu (penukaran ion) harus mengandung ion-ion miliknya sendiri. Dan agar pertukaran dapat berlangsung dengan cukup cepat dan ekstensif, zat padat itu harus mempunyai struktur molekuler yang terbuka dan permeabel, sehingga ion-ion dan molekul-molekul pelarut dapat bergerak keluar masuk dengan bebas. Penukar kation terdiri dari suatu anion polimerik dan kation-kation aktif, sementara suatu penukar anion adalah suatu kation polimerik dengan anion-anion aktif.

Resin penukar kation sebagai suatu polimer berbobot molekul tinggi, yang terangkai silang yang mengandung gugus-gugus sulfonat, karboksilat, fenolat, dan sebagainya sebagai suatu bagian integral dari resin itu serta sejumlah kation yang

ekuivalen. Suatu resin penukar anion adalah suatu polimer yang mengandung gugus-gugus amino (ammonium kuartener) sebagai bagian-bagian integral dari kisi polimer itu dan sejumlah ekuivalen anion-anion seperti ion klorida, hidroksil atau sulfat. Syarat-syarat dasar bagi suatu resin yang berguna adalah: 1. Resin itu harus cukup terangkai silang, sehingga keterlarutannya yang dapat diabaikan. 2. Resin harus cukup hidrofilik untuk memungkinkan difusi ion-ion melalui strukturnya dengan laju yang terukur dan berguna. 3. Resin harus menggunakan cukup banyak gugus penukar ion yang dapat dicapai, dan harus stabil dalam hal kimiawinya. 4. Resin yang sedang mengembang, harus lebih besar rapatannya daripada air.
I. Aksi dari Resin Penukar Ion

Resin penukar kation mengandung kation – kation bebas yang dapat ditukar dengan kation – kation dalam larutan (lar). (Res. A)B+ + C+ (larutan) ↔ (Res. A)C+ + B+ (larutan) Jika kondisi – kondisi eksperimen adalah sedemikian, sehingga kesetimbangan telah sama sekali tergeser dari kiri ke kanan, ion C+ telah lengkap difiksasi (dilekatkan tetap) pada penukaran kation. Satu contoh khas adalah penukaran ion natrium pada suatu resin sufonat oleh ion kalsium:
2 (Res.SO3-)Na+ + Ca2+ (lar.) (Res. SO3-)2Ca2+ + 2 Na+ (lar.)

Reaksi ini reversibel, dengan mengalirkan suatu larutan yang mengandung ionion natrium melalui produk itu, ion-ion kalsium dapat dikeluarkan lagi dari resin, dan bentuk natrium yang semula, teregenerasi (pulih seperti keadaan semula). Sama halnya dengan mengalirkan suatu larutan garam netral melalui bentuk hidrogen suatu resin sulfonat, dihasilkan sejumlah asam padanannya yang ekuivalen oleh reaksi khas berikut:
(Res.SO3-)H+ + Na+Cl- (lar.) (Res.SO3-)Na+ + H+Cl- (lar.)

Ukuran resin penukar kation yang asam kuat, seperti resin polistirena sulfonat yang terangkai silang kapasitas tukar boleh dikatakan tak bergantung pada pH larutan. Untuk penukar kation asam lemah, seperti yang mengandung gugus karboksilat, ionisasi timbul samapi tingkat yang berarti hanya dalam larutan basa, yaitu dalam

Resin penukar ion yang basa lemah. kesetimbangan dari: (Res.(lar.+ SO42.(lar.NMe3+)2SO42.) (Res.(lar.(lar.+ 2 Cl.) (Res. basa bebas Res. terjadi hidrolisis pada bentuk garam dari resin itu sehingga basa tersebut mungkin tak dapat lengkap diserap.bentuk garam-garam mereka.) + (Res.NMe3+)OH.(lar.NMe2) + H2O (Res. sebagian besar akan terionisasi. mereka berperilaku sebagai resin penukar ion basa kuat.) (Res.COO-)H+ + Na+OH. maka resin karboksilat hanya mempunyai sangat sedikit aksi dalam larutan dibawah pH 7.NHMe2+)Cl- Mereka dapat digunakan dalam larutan asam untuk pertukaran anion. Resin penukar kation yang basa kuat. bahkan sekalipun terdapat resin dengan berlebihan.NMe3+)Cl. Sebagai contoh.NMe2) + H+Cl.NMe3+)OH.NMe3+)Cl.+ Cl.NMe3+)Cl.) (Res. yang menghasilkan bentuk garam yang sangat terionisasi: (Res.NH Me2)+NO3. dapat dinyatakan sebagai: 2 (Res. Penukaran-penukaran ion karboksilat ini dalam bentuk hidrogennya.) (Res. dan aksinya sangat tak bergantung pada pH.(lar. Namun. hanya mengandung sedikit bentuk hidroksida dalam larutan basa. baik yang dalam bentuk hidroksida maupun yang dalam bentuk garamnya.NHMe2OH sangat sedikit terionisasi.+ H2O Aktivitas resin-resin ini serupa dengan resin penukar kation sulfonat. mudah diregenerasikan dengan alkali.NH Me2)+OH- Terutama adalah ke sebelah kiri.) (Res.) (Res. sebagai contoh: (Res.(lar. Beberapa reaksi khas mereka.+ H Cl (lar.NHMe2+)Cl. Keseimbangan pertukaran ion . dan resin ini sebagian besar berada dalam bentuk amina. akan menyerap basa kuat dari larutan: (Res. dalam bentuk garamnya. Ini dapat juga dinyatakan dengan kata-kata bahwa dalam larutan basa. dalam larutan yang asam. yaitu polistirena terangkai silang yang mengandung gugus ammonium kuartener.) Resin yang bersifat basa.+ OH.+ Cl (lar. misalnya NaCl.COO-)Na+ + H2O Tetapi hanya memiliki sedikit aksi terhadap.+ NO3.

untuk menukar suatu ion bervalensi lebih tinggi yang berada pada suatu penukar ion. afinitasnya relatif dari ion yang bervalensi lebih tinggi (terhadap resin) bertambah dengan perbandingan lurus dengan bertambahnya keenceran. tingkat pertukaran bertambah dengan bertambahnya valensi ion yang bertukar itu. b. memiliki arti penting yang mendasar. pertukaran akan lebih baik dengan keenceran yang lebih tinggi. Sejauh mana satu ion lebih dipilih untuk diserap. Pada kondisi yang serupa dan valensi yang konstan. Faktor-faktor yang menetapkan distribusi ion-ion antara suatu larutan. dengan suatu ion bervalensi lebih rendah dalam larutan. dibandingkan ion lain. c. berbeda-beda menurut ukuran ion terhidrasinya dengan cara yang sama seperti untuk kation. anion polivalen umumnya lebih dipilih untuk diserap. yaitu menentukan seberapa mudahnya dua atau lebih zat yang menghasilkan ion-ion dengan muatan serupa dapat dipisahkan dengan cara pertukaran ion dan juga menentukan seberapa mudahnya ion-ion tersebut dapat selanjutnya dikeluarkan dari resin. Jadi. Pada konsentrasi-konsentrasi rendah dalam larutan air. Sifat ion-ion yang saling bertukaran a. dengan ion-ion yang bermuatan sama BS dari suatu larutan. pertukaran akan lebih baik dengan menaikkan konsentrasi. Dengan resin penukar anion basa kuat. 2.Proses pertukaran ion yang melibatkan penggantian ion-ion AR yang tertukarkan dalam resin. sedangkan jika ion bervalensi lebih rendah berada pada penukar ion. sementara untuk ion divalen ukuran ion merupakan faktor yang penting. Dalam larutan encer. tetapi ketidak lengkapan disosiasi garam-garam logam bivalen (bervalensi 2) jugamemainkanperanan =Ni2+ <Co2+<Ca2+<Sr2+<Pb2+<Ba2+. boleh ditulis: AR + B S BR + A S Proses ini reversibel. dan ion bervalensi lebih tinggi berada dalam larutan. dan pada suhu biasa. tingkat pertukaran bagi anion-anion univalent. yaitu: Na+<Ca2+<Al3+<Th4+. meliputi: 1. d. Sifat resin penukar ion Cd2+<Be2+<Mn2+<Mg2+=Zn2+<Cu2+ . Bila sebuah kation dalam larutan sedang bertukar dengan sebuah ion yang berbeda valensinya. untuk ion-ion univalen (bervalensi 1) tingkat pertukaran bertambah dengan berkurangnya ukuran kation terhidrasi: .

2002). dan jika kuantitas-kuantitas ion-ion ini lebih kecil dibanding kapasitas total kolom untuk ion. II. Kapasitas penukar-ion yang asam lemah dan yang basa lemah. dimana yang asam lemah mencapai nilai-nilai agak konstan pada pH di atas sekitar 9. biasanya akan lebih dipilih untuk diserap. sedangkan yang basa lemah pada pH di bawah sekitar 5. Prinsip Kromatografi Pertukaran Ion Kromatografi penukar ion merupakan kromatografi yang berdasarkan penukaran ion-ion secara equivalen antara larutan dan gugusan fungsional resin yang mengandung ion-ion yang dapat ditukar (Pudjaatmaka. sendiri-sendiri dan berturut-turut dengan . merupakan fungsi dari pH. B. Kapasitas pertukaran-ion Kapasitas pertukaran ion total dari suatu resin bergantung pada jumlah total gugus ugus aktif-ion per satuan bobot bahan itu dan semakin banyak jumlah ion-ion itu. smeakin besarlah kapasitasnya. Jika suatu campuran dan dua atau lebih dari kation yang berbeda A. maka mungkin untuk memperoleh kembali ion-ion terserap itu. Dan juga bergantung pada derajat rangkaian silang dengan naiknya derajat rangkaian silang resin menjadi lebih selektif terhadap ion-ion yang berbeda-beda ukurannya (volume ion dianggap meliputi air hidrasi).Absorpsi ion-ion akan bergantung pada sifat gugus fungsional dalam resin. dan sebagainya dialirkan melalui sebuah kolom penukar ion. dimana ion dengan volume terhidrasi yang lebih kecil.

asalkan kolom cukup panjang dan faktor-faktor eksperimen lainnya menguntungkan bagi pemisahan khusus itu. . bahwa praktis semua A terkandung dalam volume cairan tertentu dan juga bahwa konsentrasi A melalui suatu batas maksimum. Jika kation A ditahan lebih kuat oleh resin penukar dibandingkan kation B. Jika suatu larutan berupa eluan yang sesuai. dialirkan melalui sebuah kolom yang dimuati oleh suatu ion A. akan diperoleh sebuah kurva elusi seperti diperlihatkan pada gambar: Nampak. Teknik pemisahan ini disebut kromatografi pertukaran ion. mungkin menunjukkan teknik-teknik yang salah dan atau kondisi-kondisi operasi yang salah. Jika kurva-kurva elusi ini cukup jauh terpisah seperti gambar dibawah. jalannya reaksi dapat diikuti dengan menganalisis larutan efluen dengan kontinu. kurva-kurva elusi dapat diperoleh untuk masing-masing ion dengan menggunakan eluan-eluan yang sesuai. suatu pemisahan kuantitatif dimungkinkan jika kurva elusi itu saling tindih. C dan sebagainya yang bermuatan serupa. semua B yang terdapat akan mengalir keluar dari dasar kolom sebelum satupun A dibebaskan. dialirkan terhadap volume eluat. Jika kolom pertukaran ion memuat berbagai ion B.menggunakan larutan regenerasi atau elusi yang sesuai. Jika konsentrasi A dalam porsi-porsi eluat yang berturutan. Penyimpangan yang terlalu besar dari distribusi ini. Idealnya. hanya akan diperoleh pemisahan yang tak lengkap. kurva harus mendekati distribusi Gauss (distribusi normal).

secara dominan adalah pelarut organik. Namun. keton. Maka kation-kation. Selain mempengaruhi gayagaya yang murni elektrostatik ini. dan anion-anion tentunya akan berpasangan lebih kuat dalam sistem-sistem pelarut demikian dibandingkan dalam air. dan faktor ini sendiri saja dapat diharapkan akan mengubah selektivitas untuk resin. serta menghasilkan penetapan yang berguna. sedangkan larutan yang mengambang di antara resin-resin. besarnya efek-efek demikian jelas bergantung pada proporsi pelarut organik yang ada. cenderung untuk secara dominan menyerap air ke dalam struktur resin. . Dimana sistem pelarut campuran digunakan. lingkup dari proses pertukaran ion telah diperluas selama sekitar dekade terakhir ini dengan menggunakan baik sistem pelarut organik. Pelarut organik yang umum digunakan adalah senyawa-senyawa okso dari tipe alkohol. dan karboksilat. Pertukaran-Ion Dalam Pelarut-pelarut Organik dan Air Organik Penelitian-penelitian dalam sistem-sistem air telah menetapkan banyak prinsipprinsip dasar dari pertukaran ion.III. terjadi kemungkinan osmosis preferensial (osmosis yang lebih dipilih). adanya pelarut-pelarut organik dapat meningkatkan kecenderungan suatu kation untuk membentuk kompleks dengan ligan lainnya. Efek ini (sorpsi air yang lebih dipilih (preferensial) oleh resin) meningkat dengan menurunnya tetapan dielektrik dari pelarut organik itu. Dalam pelarut campuran air-organik. yang umunya mempunyai tetapan dielektrik di bawah 40. dan telah diperlihatkan bahwa fase resin-resin kation yang sangat asam dan fase resin anion yang sangat basa. Seperti telah ditunjukkan. resin-resin penukar ion merupakan sistem-sistem osmotik yang mengembang karena pelarut tertarik ke dalam resin. jadi memodifikasi perilaku pertukaran ionnya. maupun sistem campuran pelarut air-organik.

struktur fungsionalnya tak berubah oleh polimerisasi atau reaksi apapun. IV. tata letak gugus-gugus ligan yang spesifik itu harus tetap terpelihara di dalam resin. sehingga pembentukan cincin sepit dengan kation. atau bersama-sama sebuah zat perangkai-silang.. struktur ruang (sterik) dari gugus penyepit itu harus kompak. 2. bergantung terutama pada sifat gugus penyepit. Afinitas suatu ion logam tertentu terhadap suatu resin-penyempit tertentu. Menurut Gregor et al. biasanya paling sedikit tridentat . tak akan terintangi oleh matriks resin. Resin-resin Penukar-Ion Pembentuk Sepit Suatu sifat penting dari penukar ion penyempit adalah selektivitas mereka yang lebih besar dibandingkan penukar-ion jenis konvensional.Suatu akibat yang menarik dari sorpsi selektif ini adalah bahwa kondisi-kondisi untuk kromatografi (partition chromatography) muncul. Aspek ini telah dimanfaatkan oleh Korkisch untuk pemisahan ion-ion anorganik dengan apa yang disebut ’Metode Kombinasi Pertukaran Ion-Ekstraksi pelarut’ (CISE = Combined Ion Exchange-Solvent Extraction). sehingga selama sintesis (pembentukan) resin itu. zat penyepit itu harus. Dan perilaku selektif dari resin. 4. Proses pertukaran ion dalam suatu resin-penyepit biasanya lebih lambat ketimbang dalam penukar jenis biasa. yang dapat memperbaiki faktor-faktor pemisahan pertukaran ion yang normal. 3. atau ia sanggup dimasukkan ke dalam suatu matriks polimer. gugus penyepit itu harus memiliki kestabilan kimia yang cukup. terutama didasarkan atas perbedaanperbedaan dalam kestabilan komplek-komplek logam yang berbentuk pada resin itu pada berbagai kondisi pH. sifat-sifat berikut diperlukan untuk suatu zat penyepit. menghasilkan ke dalam suatu gel resin yang cukup stabil. Ini terutama perlu karena zat-zat penyepit yang membentuk komplek yang stabil. sendirian. dimana laju nampaknya dikendalikan oleh mekanisme difusi partikel. 1. yang akan dimasukkan sebagai gugus fungsional ke dalam suatu resin penukar-ion.

Bahan permulaan untuk sintesis resin penyepit ini adalah stirena-divinilbenzena terklorometilasi yang mengalami reaksi aminasi dan laku diolah dengan asam monoklorasetat. petroleum eter. dalam larutan asam menghasilkan kation-kation yang mampu membentuk spesi-spesi dengan berbagai anion. ada kesulitan dan kekurangan berkaitan dengan penggunaan mereka. Penukar anion yang sekarang tersedia sebagian besar berdasarkan amino alifatik primer. dan sebagainya. Penukar-Ion Cairan Proses penukaran ion yang melibatkan resin penukar.2 [N-lauril (trialkilmetil)amina]. dalam pelarut yang tidak tercampurkan dalam air. dapat digunakan sebagai penukar anion. Namun. dapat bertindak sebagai penukar kation untuk ion-ion dalam larutan air. Teknik yang digunakan untuk pemisahan dengan penukar ion cairan identik dengan teknik yang digunakan dalam pemisahan dengan ekstraksi pelarut. toluena. yang keduanya adalah amin sekunder. proses berlangsung antara 2 larutan yang tidak saling tercampurkan. Cairan penukar anion paling baik digunakan sebagai larutan dan pelarut organik inert seperti benzena. Begitulah. jadi penukar-penukar ini memberi banyak sifat-sifat yang menguntungkan baik dari pertukaran ion maupun ekstraksi pelarut. . V. dan ini penting diperhatikan agar dapat menggunakan penukar ion cairan secara efektif. yang memiliki kelarutan yang rendah dalam air. sementara dalam hal penukar ion cairan. tanpa kehilangan kemampuan-kemampun mereka untuk membentuk kompleks yang selektif. larutan suatu basa yang tidak larut dalam air.1 [N-dodesenil (trialkilmetil)amina] dan Amberlite LA. tetapi kelarutan yang tinggi dalam pelarut-pelarut yang tidak tercampurkan dengan air. sekunder dan tersier. misalnya penukar ion Amberlite LA. yang dapat diekstraksi. terjadi antara fase padat dengan fase cair.Pertimbangan-pertimbangan ini menunjukkan bahwa banyak zat penyepit tak dapat dimasukkan ke dalam suatu resin. sikloheksena. Kerja penukar ion cairan melibatkan perpindahan selektif suatu zat terlarut antara suatu fase air dan suatu fase organik yang tak tercampurkan yang mengandung penukar cairan. Penukar ion cairan terdiri dari asam dan basa yang berbobot molekul tinggi. Sama halnya dengan asam yang tidak terlarutkan dalam air. Begitulah amina yang berbobot molekul tinggi.

Pengendapan ini dapat dilakukan dengan mengubah kekuatan ionic. dekstran dan agarosa. Gugus penukar ion diimobilisasikan pada matrik. sedangkan gugus penukar kation yaitu sulfopropil (SP-). Kromatografi pertukaran ion memerlukan fase diam yang biasanya merupakan polimer terhidratasi yang bersifat tidak larut seperti selulosa. Beberapa gugus penukar anion yaitu aminoetil (AE-) kuaternari aminoetil (QAE-) dan dietilaminoetil (DEAE-). dan pemisahan kualitas. Protein merupakan makromolekul yang tersusun dari building blok asam-asam amino. Garam – garam yang efektif digunakan pada proses pengendapan protein adalah garam yang multi anonik seperti sulfat. Pemurnian Protein Kromatografi pertukaran ion memisahkan protein berdasarkan pada muatan bersih protein dan pada kekuatan relatif dari muatan bersih protein tersebut.5. dan kontrol penukar ion sering .1994). Gugus penukar ion kuat Q (penukar anion kuat) dan SP. Larutan yang dimasukkan biasa disebut sampel. analisis air. pH. nukleotida kecil. dan asam amino. komponen-komponen secara sendiri-sendiri disebut analit. pnambahan pelarut organik. Penukar ion lemah hanya dapat mempertahankan kondisi terionisasi pada rentang pH sempit dan kehilangan muatannya pada pH tertentu. polimer dan penambahan garam.0.akan kehilangan muatannya dibawah pH 4.0 dan akan kehilangan muatannya pada pH 9. Kromatografi digunakan dalam pemurnian protein. serta panjang rantai polipeptida yang tidak sama. Gugus penukar kation lemah CM.B.(penukar kation kuat) dapat mempertahankan kondisi terionisasi pada rentang pH 1 – 10. APLIKASI KROMATOGRAFI PENUKAR ION Kromatografi penukar ion (atau kromatografi ion) adalah sebuah proses yang memberikan pemisahan ion-ion dan molekul polar berdasarkan their charge.Dalam setiap molekul dari setiap jenis protein tertentu mempunyai komposisi dan deret asamamino. fosfat. dansitrat (Scopes. Salah satu tahap yang banyak digunakan untuk pemurnian protein adalah pengendapan protein. Misalnya gugus penukar anion lemah DEAEterionisasi sempurna dibawah pH 6. metil sulfonat dan karboksimetil (CM-). sedangkan penukar ion kuat dapat mempertahankan kondisi terionisasi pada rentang pH yang luas. Kromatografi ini dapat digunakan untuk hampir semua jenis of charge molecule termasuk protein besar.

Pada saat sampel dimasukkan ke dalam kolom. Proses selanjutnya adalah melepaskan ikatan protein yang terikat gugus fungsional matrik dengan cara membilas kolom menggunakan bufer yang mengandung NaCl atau KCl. Apabila protein stabil pada pH diatas titik isoelektriknya (pI) maka digunakan penukar anion (positif). . maka harus diperhatikan stabilitas protein target pada pH yang dipilih. maka protein yang bermuatan positif akan menggantikan ion Na+ sedangkan protein yang bermuatan negatif atau netral tidak akan terikat. Pemurnian protein dengan kromatrografi pertukaran ion Pemilihan penukar ion tergantung pada muatan protein target. Mula-mula gugus fungsional matrik yang bermuatan negatif mengikat ion dari bufer (misalnya Na+). Jika protein stabil pada rentang 1 unit diatas dan dibawah pI maka kedua penukar ion dapat digunakan. Protein yang memiliki muatan negatif dapat dipertukarkan dengan ion klorida. Pada saat menentukan pH untuk kromatografi. Pembilasan dilakukan dengan meningkatkan konsentrasi NaCl atau KCl secara linier atau bertahap sehingga protein yang memiliki ikatan lemah dengan matrik akan lepas terlebih dahulu dan diikuti oleh protein yang memiliki ikatan lebih kuat.Dasar dari kromatografi pertukaran ion adalah ion bermuatan dapat dengan bebas dipertukarkan dengan ion yang memiliki tipe muatan yang sama. tetapi bila protein stabil pada pH dibawah pI nya maka digunakan penukar kation (negatif). Muatan bersih protein tergantung pada pH (protein semakin bermuatan positif dengan menurunkan pH dan semakin negatif dengan menaikkan pH). Protein yang tidak terikat dibilas dengan menggunakan buffer (biasanya dengan konsentrasi 10-50 mM).

Matrik polidekstran dan agarosa (misalnya DEAE-Sephadex. Molekul yang memerlukan pH sangat rendah atau sangat tinggi untuk dapat erionisasi atau apabila molekul stabil pada pH ekstrim maka penukar ion kuat harus digunakan. asam-asam organik. dan 3. Pada pemurnian xilanase.Matrik yang mengikat gugus fungsional menentukan sifat aliran. matrik selulosa biasanya tidak digunakan karena beberapa xilanase tertentu memiliki cellulose binding domain (Subramaniyan & Prema 2002) yang akan berinteraksi pada proses elusi normal. peptida kecil. Keuntungan kromatografi penukar ion diantaranya adalah tidak merusak protein yang dimurnikan dan pada umumnya memiliki kapasitas pengikatan yang tinggi. Matrik polistiren dan polifenolik lebih sering digunakan untuk memisahkan molekul-molekul kecil seperti asam-asam amino. hormon. polistiren. tRNA dan polisakarida. yaitu : 1. ion yang dapat diikat. nukleotida siklik. CM-selulosa dan fosfoselulosa paling sering digunakan. Matrik selulosa biasanya digunakan untuk memisahkan protein (termasuk enzim). . DEAE-selulosa. 2. CMSephadex) digunakan untuk memisahkan protein. Dekstran (Sephadex) atau agarosa (sepharose). nukleotida. Penukar ion lemah akan memberikan hasil pemisahan yang lebih baik untuk protein-protein yang memiliki muatan bersih yang berdekatan. poliakrilik atau polifenol. selulosa. Pemilihan penukar ion kuat atau lemah tergantung pada pH molekul target. Selain itu larutan enzim hasil kromatografi penukar ion mengandung kadar garam cukup tinggi yang harus dihilangkan untuk proses pemurnian selanjutnya. polisakarida dan asam nukleat. stabilitas mekanik dan kimia. Ada 3 kelompok matrik yang biasanya digunakan. Kelemahannya adalah protein-protein yang memiliki distribusi gugus bermuatan pada permukaannya atau memiliki pI yang sama atau mirip akan sulit dipisahkan dengan cara kromatografi penukar ion.

Proses penukar ion dapat dipisahkan menjadi 4 langkah yaitu: 1. Equilibrasi Aplikasi sampel Elusi Regenerasi 2. 4. . 3.

.1. Elusi Dalam tahap ketiga ini adalah elusi. Equilibrasi Tahap I adalah kesetimbangan terhadap fase stasioner atau fase diam untuk membuat kondisi awal yang diinginkan. yang umum digunakan adalah peningkatan ionik dengan NaCl atau gram sederhana lainnya agar supaya terjadi penurunan ikatan protein. 2. Regenerasi Tahap akhir adalah regenerasi. biomolekul dilepaskan dari penukar ion dengan mengubah komposisi buffer. semua bagian dari gugus muatan pada fase stasioner berikatan dengan counter ion penukar. misalnya Ion Klorida (Cl-) atau Sodium (Na+). Ketika terjadi kesetimbangan. membuang semua molekul yang masih berikatan. ini untuk memastikan bahwa kapasitas penuh dari fase stasioner untuk dapat digunakan selanjutnya. Deabsorbsi protein relatif terhadap jumlah gugus bermuatan pada permukaanya. 4. Tujuan pada tahap ini adalah untuk mengikatkan molekul yang menjadi target dan mencuci semua material yang tidak terikat dengan sampel buffer yang mempunyai pH dan kekuatan ionik sama. 3. Aplikasi Sampel Tahap II adalah aplikasi sampel dan pencucian. seperti buffer awal agar supaya semua muatan protein berikatan dengan tepat.

Enzim Enzim adalah protein globular yang umumnya berfungsi sebagai biokatalis pada semua proses kimia dalam makhluk hidup. Aplikasi Kromatografi Penukar Ion Dalam Isolasi dan Karakterisasi Xilanase dari Bacillus circulans . Enzim mampu meningkatkan reaksi kimia tetapi tidak diubah oleh reaksi yang dikatalisnya serta tdak megubah kedudukan normal dari kesetimbangan kimia. maka kami mengambil satu dari sekian banyak penelitian-penelitian yang telah dilakukan mengenai isolasi dan pemurnian protein yaitu salah satunya enzim xilanase. Untuk dapat memahami bagaimana aplikasi kromatografi penukar ion dalam pemurnian protein. Enzim mempunyai daya katalisisspesifik yang lebih besar dari katalisator lainnya. sehingga disebut life is enzyme. Aplikasi kromatografi penukar ion dalam pemurnian protein ini juga dapat dikembangkan dalam bidang industri. Sebagai protein. Enzim memegang peranan penting dalam berbagai reaksi di dalam sel. enzim diproduksi dan digunakan oleh sel hidup untuk mengkatalisis reaksi antara lain konversi energi dan metabolism pertahanan sel.

Proses pemutihan pulp tidak hanya membuat pulp menjadi lebih putih atau cerah. Xilanase yang dibutuhkan dalam proses prapemutihan pulp diharapkan memiliki beberapa karakteristik spesifik seperti tahan suhu tinggi (60-70oC). sehingga pulp tersebut sesuai untuk dibuat kertas dengan jenis tertentu. Xilanase bisa digunakan untuk menghidrolisis xilan (hemiselulosa) menjadi gula xilosa. aktinomisetes. Saat ini telah dikembangkan proses bioteknologi dalam industri pulp dan kertas. ragi. reduksi pitch. . Selain itu beberapa mikroorganisme yang terdapat pada ruminansia diketahui berpotensial sebagai penghasil xilanase karena hewan ruminansia tersebut mengkonsumsi hemiselulosa dalam jumlah besar. PENDAHULUAN Perkembangan teknologi industri terus mengalami kemajuan terutama teknologi yang berwawasan lingkungan. Salah satu enzim yang banyak dimanfaatkan dalam industri pulp dan kertas adalah xilanase. tahan pH alkali. Pemakaian enzim memiliki banyak keunggulan seperti menghemat energi. Penggunaan enzim xilanase diharapkan dapat mereduksi penggunaan bahan kimia klorin yang bersifat berbahaya pada bagi lingkungan sehingga dengan menggunakan enzim xilanase. Beberapa jenis bakteri dan jamur diketahui mampu menghasilkan xilanase ekstraseluler yang dapat menghidrolisis hemiselulosa menjadi xilosa. Xilanase dapat diproduksi oleh beberapa organisme seperti bakteri.A. Xilanase digunakan untuk meningkatkan ekstraksi lignin dan melepaskan kromofor dari pulp dalam tahapan awal pemutihan pulp. Tujuan utama dari proses pemutihan adalah untuk meningkatkan derajat putih pulp. mengurangi kebutuhan bahan kimia dan meningkatkan kekuatan pulp dan kertas. Xilan banyak diperoleh dari limbah pertanian dan industri makanan. Pengembangan proses hidrolisis secara enzimatis merupakan prospek baru untuk penanganan limbah hemiselulosa. protozoa. Proses pemutihan adalah proses yang memisahkan serat kertas dari lignin (penyebab kertas berwarna kusam) . proses pemutihan menjadi lebih ramah lingkungan. pemutihan (bleaching) dan deinking. alga. Salah satu upaya yang sedang dikembangkan adalah penggunaan enzim pada beberapa proses pembuatan pulp dan kertas seperti pada pemasakan (cooking). jamur. tetapi juga membuatnya stabil sehingga tidak menguning atau kehilangan kekuatan dan derajat putih selama penyimpanan. berupa endoxilanase dan bebas dari aktivitas selulase. gastropoda dan artropoda.yang selama ini memakai pemutih kimia.

Jepang). Bandung. gliserol. kolom kromatografi. BAHAN dan METODA Bahan dan Alat Peralatan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah rotary shaker. Merck). MgSO4. sehingga enzim dari bakteri ini diharapkan dapat diproduksi dan digunakan pada proses awal pemutihan pulp di industri pulp dan kertas. Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah B.1%. ITB. Tokyo. kantung dialisis berbahan dasar selulosa (SIGMA CHEMICAL) dengan ukuran pori yang dapat memisahkan protein minimal 12 kDa. pH medium diatur 10..5%. spektrofotometer. Tris base.5% (Sigma Chemical). kemudian setiap enam jam sekali .7H2O 0. Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah ammonium sulfat. elektroforesis Mini Protean IIxI. Metoda 1. xilosa. K2HPO4 0. dengan pH 7 . NaOH. bromofenol biru. maka perlu dilakukan penelitian mengenai isolasi dan karakterisasi xilanase dari Bacillus circulans. xilan oat spelt 0. Berdasarkan hal tersebut. avometer.5 dengan Na2CO3 1%. Congo Red. matriks DEAE-Toyopearl 650 M (Tosoh Corp. Hasil penelitian terdahulu menunjukkan Bacillus circulans diketahui mampu menghasilkan xilanase dengan aktivitas selulase terendah. refrigerated centrifuge. NaCl. circulans. Bovine serum albumin (BSA.9.02%. K3FeCN6. Isolasi Xilanase Untuk mengetahui waktu bakteri menghasilkan xilanase dan umur inokulum kultur yang digunakan maka dilakukan pembuatan kurva tumbuh dan kurva aktivitas xilanase dari B. Fraksi V. waterbath. Na2CO3.5%. B.Genus Bacillus diketahui sebagai penghasil xilanase yang aktif pada suhu 50 °C – 60 °C. Medium xilan terdiri dari pepton 0. pengaduk magnetik. Untuk mengetahui pola pertumbuhan dan aktivitas xilanase. ekstrak ragi 0. NaHCO 3. Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati. poliakriamida. Diharapkan dengan penelitian ini dapat mengatasi permasalahan ketersediaan enzim yang spesifik dan kendala yang dihadapi dalam aplikasinya di industri pulp dan kertas. asam asetat. diambil sampel sejumlah 3 mL setiap dua jam sekali sampai dengan jam ke-24. circulans yang berasal dari laboratorium Mikrobiologi. Isolat ditumbuhkan pada medium xilan kemudian diinkubasi selama 80 jam. Pengembangan produksi dalam skala komersial diharapkan dapat menciptakan kewirausahaan baru dan juga mendukung perkembangan industri pulp dan kertas yang berwawasan lingkungan. glisin.

sampai jam ke-60. circulans diinokulasikan ke dalam medium xilan kemudian diinkubasi pada suhu 37◦C dengan pengadukan 200 rpm selama 18 jam. dan 12 jam sekali sampai kultur berumur 80 jam. Inokulum yang digunakan adalah 10% (v/v). . Ekstrak kasar enzim diperoleh dengan mensentrifugasi kultur bakteri dengan kecepatan 8. dilakukan produksi xilanase. 60-80. Pemurnian Parsial Xilanase Seluruh tahapan pemurnian dilakukan pada suhu 4oC dengan diagram alir seperti dibawah ini: a. Hasil fraksinasi kemudian didialisis dalam 4. Endapan yang diperoleh dilarutkan dalam buffer NaHCO3-Na2CO3 25 mM pH 9. Seluruh sampel yang diperoleh dihitung jumlah koloninya dan aktivitas xilanasenya. Berdasarkan kurva pertumbuhan dan kurva aktivitas xilanase yang telah dibuat. 40-60.000 rpmselama 10 menit pada suhu 4oC.8 L buffer NaHCO3-Na2CO3 selama 24 jam. Fraksinasi Bertingkat dan Dialisis Ekstrak kasar enzim xilanase dari hasil isolasi difraksinasi bertingkat dengan menggunakan garam ammonium sulfat ((NH4)2SO4) sehingga diperoleh persen saturasi 020. 2. Kultur B. dan 80-100.000 rpm selama 25 menit. 20-40.3. Larutan kemudian diaduk dan disentrifugasi dengan kecepatan 12.

. Filtrat hasil dialisis kemudian dialirkan ke dalam kolom dan dielusi secara bertahap dengan menggunakan larutan NaCl (0-450 mM) dalam buffer NaHCO3-Na2CO3 sehingga diperoleh fraksi-fraksi. Karakterisasi Xilanase a.b. Penentuan suhu optimum dilakukan dengan menguji aktivitas enzim xilanase pada rentang suhu 30-90oC selama 30 menit dengan rentang 10oC pada pH optimum yang diperoleh.5). Pengukuran Kadar Protein Kadar protein diukur dengan menggunakan metoda Bradford (1976) dengan menggunakan bovine serum albumin (BSA.5-10. Kromatografi Penukar Ion Filtrat hasil dialisis kemudian dimurnikan lebih lanjut dengan kromatografi kolom. Uji Aktivitas Xilanase Aktivitas xilanase diuji dengan mengukur jumlah gula pereduksi dari substrat xilan dengan menggunakan metode Ferisianida Alkali (Walker dan Harmon. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 39oC selama 30 menit. Satu unit (U) aktivitas xilanase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat menghasilkan 1 μmol gula pereduksi (xilosa) per menit dengan xilan sebagai substrat. 5. Campuran ditambahkan air sejumlah 4 mL kemudian diukur pada A420. Mula-mula ekstrak enzim sejumlah 50 μL ditambahkan ke dalam substrat xilan oat spelt 1-3% sejumlah 150 μL dalam buffer Na2CO3-NaHCO3 25-100 mM (pH 10. Setiap fraksi yang diperoleh diuji aktivitas xilanase dan kadar proteinnya. Merck) sebagai standar. 1996). Penyesuaian pH enzim dilakukan dengan cara mengencerkan enzim sejumlah 10-100x pada berbagai pH sehingga konsentrasi akhir buffer pada reaksi 100 mM.5. Untuk penentuan pH optimum xilanase digunakan dua jenis buffer yaitu buffer Tris-Cl untuk pH 8. dan buffer Glisin-NaOH untuk pH 8. Uji aktivitas xilanase dan pengukuran protein dilakukan menggunakan metode sebagai berikut: 3. Kromatografi dilakukan dengan menggunakan bahan pendukung DEAE-Toyopearl 650 M yang telah disetimbangkan dengan buffer NaHCO3-Na2CO3. Aktivitas enzim dihentikan dengan menambahkan ferisianida alkali sejumlah 600 μL dan dididihkan selama 10 menit.Fraksi V. 4. Penentuan pH dan Suhu Optimum Penentuan pH optimum dilakukan dengan menguji aktivitas xilanase pada rentang pH 8–10 dengan rentang pH 0.

PEMBAHASAN 1.5 dengan substrat xilan 0. Gel dielektroforesis pada Mini Protean IixI (Bio Rad) dengan tanki elektroforesis vertikal.b. Gel kemudian diwarnai menggunakan Congo Red 0.1% pada suhu 50oC selama 20-30 menit. 2. Sampel sejumlah 10-36 μL dimasukkan ke dalam sumur kemudian dielektroforesis dengan arus sebesar 24 mA pada double strength running buffer (pH 9). Isolasi B.1% selama 15 menit pada suhu ruangan.378 U/mL enzim). gliserol 50% (v/v) dan Bromofenol biru 0.232 U/mL yang lebih rendah jika dibandingkan dengan isolate Bacillus lainnya sehingga sesuai digunakan untuk industry pulp dan kertas. pH medium 10. Mula-mula enzim dicampur dengan sampel buffer 5x yang mengandung Tris-Cl 312. Gel tersebut kemudian dibilas dengan menggunakan larutan NaCl 1 M sampai kelebihan warna pada pita hilang. Gel lalu dibilas kembali menggunakan asam asetat 0.5 dengan pengadukan 200 rpm selama 18 jam dengan jumlah inokulum bakteri yang digunakan adalah 10% (v/v). Berdasarkan kurva tersebut.05%. Analisis Zimogram Sampel enzim dielektroforesis dengan native gel poliakrilamida 10 % selama 4-5 jam dengan kondisi dingin (4-8oC). kurva aktivitas xilanase yang tertinggi diperoleh pada jam ke 18 dan jam ke 36 (0. C. maka waktu bakteri yang digunakan untuk percobaan selanjutnya adalah 18 jam karena pada waktu tersebut xilanase mempunyai aktivitas tertinggi dan memiliki waktu fermentasi yang singkat. Gel kemudian direndam di dalam buffer Glisin-NaOH 100 mM pH 8.8. circulans dapat menghasilkan xilanase dengan memiliki aktivitas selusase rendah yaitu 0. Pemurnian parsial xilanase . Kondisi fermentasi yang digunakan untuk menghasilkan ilanase adalah suhu 37o C.5% sehingga akan diperoleh zona bening yang menunjukkan adanya aktivitas enzim xilanase dengan latar belakang biru gelap.5 mM pH 6. circulans Hasil skrining menunjukkan bahwa isolate B. Ekstrak kasar enzim yang diperoleh dan fermentasi dengan menggunakan 100 mL medium adalah 100 mL berarti xilanase yang dihasilkan pada kondisi tersebut dapat mencapai rendemen 100%.

48 U/mg. Hasil pemurnian enzim xilanase menggunakan kromatografi penukar anion menunjukkan peningkatan aktivitas enzim spesifik menjadi 805. Prinsip kolom penukar ion adalah protein dengan ikatan elektrostatis yang lebih rendah dengan matriks akan dielusi terlebih dahulu dan diikuti protein dengan ikatan elektrostatik yang lebih tinggi.3 sehingga diperoleh 40 fraksi. Enzim hasil fraksinasi 20 – 40 % yang telah didialisis dialirkan dalam kolom penukar ion lalu dielusi secara bertahap dengan menggunakan NaCl (0 – 450 mM) dalam buffer NaHCO3-Na2CO3 25 mM. Hasil fraksinasi menunjukkan xilanase dapat mengendap pada seluruh tingkatan fraksinasi yang digunakan karena pada seluruh fraksi yang diperoleh menunjukkan adanya aktivitas xilanase. Xilanase mulai dapat mengendap pada konsentrasi garam dengan persen saturasi 0 – 20%. maka sampel fraksi 20 – 40% digunakan untuk proses pemurnian dengan kolom kromatografi. Dengan adanya garam ammonium sulfat pada konsentrasi tertentu berpengaruh terhadap kelarutan suatu protein. Jika konsentrasi garam tinggi maka kelarutan protein akan menurun sehingga protein akan menurun sehingga protein dapat mengendap dengan sempurna. Hasil pemisahan protein dengan kolom penukar anion menunjukkan puncak aktivitas xilanase tertinggi diperoleh pada fraksi ke 14 dengan aktivitas spesifik 805. aktivitas xilanase fraksi dengan saturasi 20– 40% menunjukkan peningkatan aktivitas spesifik tertinggi yaitu sebesar 585. Lalu fraksi tersebut didialisis untuk menghilangkan garam ammonium sulfat dan molekul kecil berberat molekul rendah.48 U/mg dengan tingkat kemurnian 46. Ekstrak kasar xilanase difraksinasi bertingkat sehingga didapat 5 fraksi. 3. Pengendapan protein semakin meningkat dengan peningkatan jumlah garam yang ditambahkan dalam sampel protein yang ditandai dengan meningkatnya jumlah endapan. Tingkat kemurnian suatu enzim diketahui dari aktifitas enzim tersebut dan berdasarkan kelipatan pemurnian enzim yang diperoleh. Berdasarkan hasil uji aktivitas spesifik.12 U/mg. Cara mengetahui aktifitas enzim dengan membagi aktifitas enzim hasil pemurnian dengan aktifitas enzim awal ekstrak kasar enzim. Karakterisasi enzim xilanase . pH 9.8 kali dibanding dengan ekstrak kasarnya.Pemurnian dilakukan secara parsial karena pada penelitian ini tidak bisa didapat enzim yang benar2 murni. tetapi jika konsentrasi garam rendah maka akan terjadi sebaliknya.

Karakterisasi enzim xilanase dilakukan menggunakan enzim hasil pemurnian parsial dengan parameter pH dan suhu. maka kita dapat menjelaskan adanya dua puncak aktivitas saat penentuan suhu optimum. Kedua xilanase ini kemungkinan adalah isoenzim. sehingga enzim tidak terdenaturasi. Dari hasil zimogram diatas diketahui bahwa terdapat dua jenis xilanase. interaksi kimia menyebabkan perubahan konformasi protein yang berpengaruh terhadap stabilitas dan aktivitas protein yang dipengaruhi oleh keadaan lingkungan mikro protein dan distribusi asam amino bermuatan pada permukaan protein. Keragaman Xilanase Keragaman xilanase dapat dianalisis menggunakan metode zimogram. 4. Adanya modifikasi pada protein tersebut dapat meningkatkan interaksi pada protein tersebut sehingga protein tersebut menjadi lebih rigid dan stabil pada suhu dan pH tinggi. Xilanase memiliki aktivitas optimum pada pH 9. Keragaman enzim dapat terjadi karena adanya isoenzim. karena memiliki BM yang berbeda tetapi memiliki titik isoelektrik yang sama. Juga menggunakan zimogram untuk mengetahui keragaman xilanase dari setiap tahapan pemurnian yang dilakukan. karena dilihat dari BM yang berbeda tetapi memiliki titik isoelektrik yang sama. Analisis ini perlu dilakukan untuk mengetahui keragaman xilanase pada saat tahap pemurnian. Isoenzim dihasilkan oleh bakteri dengan tujuan agar bakteri tersebut dapat menghidrolisis substrat xilane dengan sempurna. karena kedunya mengendapa pada fraksi yang sama yaitu fraksi .5 dan suhu 75o – 80o C.

Titik isoelektrik (TI) adalah daerah pH tertentu dimana protein tidak mempunyai selisih muatan atau jumlah muatan positif dan negatifnya sama. sehingga tidak bergerak ketika diletakkan dalam medan listrik pada pH isoelektrik (pI). • Penggunaan xilanase pada tahap pemutihan dapat meningkatkan fibrilasi pulp dan retensi air. a. mereduksi waktu penggilingan pulp virgin. • Penggunaan xilanase juga dapat meningkatkan kualitas kertas karena xilanase dapat meningkatkan viskositas pulp. dan hipoklorit). Sehingga jika kita hubungkan dengan pH optimum xilanase yang telah didapat (pH 9. circulans pada fraksi 14 mendekati nilai pI. meningkatkan derajat giling dari serat daur ulang. Aspek Ekonomi • Enzim merupakan metode alternatif dengan biaya rendah sehingga dapat digunakan untuk mereduksi penggunaan klorin dan bahan bahan kimia pemutihan lainnya. .saturasi 20-40%. Selain itu terjadinya penurunan aktivitas enzim selama proses penyimpanan dapat dikurangi karena pengadaan enzim yang kontinyu. b.5). Aspek Teknis • Jika kita menggunakan xilanase yang tahan alkali dan suhu tinggi akan memudahkan penggunaan enzim pada tahapan pra-pemutihan. suatu protein sangat mudah diendapakan karena pada saat itu muatan listriknya nol. 5. ada kemungkinan bahwa pH kedua xilanase B. • Digunakannya xilanase yang sesuai dengan karakteristik untuk proses pra pemutihan maka ketergantungan ketersediaan enzim untuk industri pulp dan kertas dari impor dapat berkurang. meningkatkan derajat putih dan menurunkan bilangan kappa. akibatnya kedua protein tersebut dapat mengendap pada fraksi yang sama. ekonomi dan lingkungan. Kemungkinan Penggunaan Xilanase di Industri Pulp dan Kertas Penggunaan xilanase dengan karateristik spesifik seperti tahan alkali dan suhu tinggi akan memiliki beberapa keunggulan jika dilihat dari sisi teknis. extraction. karena tidak perlu lagi dilakukan proses netralisasi dan pendinginan pulp. Penggunaan xilanase pada tahap pra-pemutihan ini dapat mereduksi penggunaan bahan kimia berbahan dasar klorin/ bahan pengoksidasi yang bersifat toksik sejumlah 20-40%. yaitu dengan menurunkan konsumsi senyawa klorin sampai dengan 20% dan dapat diperoleh derajat putih yang sama dengan kontrol (tanpa menggunakan xilanase) pada tahapan pemutihan CEH (chlorinasi.

Dengan menurunnya senyawa klorin yang digunakan pada proses pemutihan maka secara teoritis diharapkan kandungan bahan berbahaya seperti senyara organik terklorinasi (AOX) dan dioksin pada air limbah industri pulp dan kertas dapat direduksi.c. Aspek Lingkungan Telah kita ketahui bahwa penggunaan xilanase pada tahap pra-pemutihan pulp dapat mereduksi penggunaan bahan kimia berbahan dasar klorin atau bahan pengoksidasi yang bersifat toksik sejumlah 20-40%. .

1994. 2002.. Bogor Scopes. diterjemahkan oleh Maggy Thenawidjaya. Nur. Dasar-dasar Biokimia. 2007. R.wikibooks.. IPB Press. Protein Purification: Principles and Practice. Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik. Springer Veriag. Purifikasi dan Karakterisasi Xilanase Ekstraseluler Streptomyces sp.Erlangga. Bogor http://en.L. Deoxyribo Nucleic Acid : Keanekaragaman. H. Jakarta Pudjaatmaka. 2002.220-231. Jakarta Richana. Ekspresi. Bandung Vogel.A. ed..K. 4.. 1994. A. Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian. Balai Pustaka. H. 2005. Jakarta Widhyastuti. Rekayasa & Efek Pemanfaatannya. 434 – 435. SKKI-8 Asal Sukabumi. NewYork Toha. EGC. N.. Alfabeta. Produksi dan Prospek Enzim Xilanase dalam Pengembangan Bioindustri di Indonesia.DAFTAR PUSTAKA Lehninger.org/wiki/Proteomics/Protein_Separations__Chromatography/Ion_exchange . 1994. Kamus Kimia.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful