Kromatografi adalah teknik pemisahan zat untuk analisis dan preparative dengan melarutkan campuran dalam fase gerak

(cairan atau gas), yang mengalir melalui fase diam atau stasioner, zat zat yang hendak dipisahkan harus berinteraksi dengan fase stasioner dengan kuat yang berbeda beda , interaksi ini dapat bersifat adsorbs, partisi, pertukaran ion, dan interaksi lainnya. A. KROMATOGRAFI PENUKAR ION Pertukaran ion adalah salah satu metode yang efektif untuk pemisahan secara kuantitatif. Pemisahannya berdasarkan prinsip yang sama sekali berbeda dan hanya diterapkan pada senyawa yang berion. Dua seri paralel dari prosedur yang ada, terfokus pada pertukaran anion dan kation. Istilah penukar ion secara umum diartikan orang sebagai pertukaran dari ion-ion yang bertanda muatan (listrik) sama, antara suatu larutan dan suatu bahan yang padat serta sangat tak dapat larut, dimana larutan itu bersentuhan. Zat padat itu (penukaran ion) harus mengandung ion-ion miliknya sendiri. Dan agar pertukaran dapat berlangsung dengan cukup cepat dan ekstensif, zat padat itu harus mempunyai struktur molekuler yang terbuka dan permeabel, sehingga ion-ion dan molekul-molekul pelarut dapat bergerak keluar masuk dengan bebas. Penukar kation terdiri dari suatu anion polimerik dan kation-kation aktif, sementara suatu penukar anion adalah suatu kation polimerik dengan anion-anion aktif.

Resin penukar kation sebagai suatu polimer berbobot molekul tinggi, yang terangkai silang yang mengandung gugus-gugus sulfonat, karboksilat, fenolat, dan sebagainya sebagai suatu bagian integral dari resin itu serta sejumlah kation yang

ekuivalen. Suatu resin penukar anion adalah suatu polimer yang mengandung gugus-gugus amino (ammonium kuartener) sebagai bagian-bagian integral dari kisi polimer itu dan sejumlah ekuivalen anion-anion seperti ion klorida, hidroksil atau sulfat. Syarat-syarat dasar bagi suatu resin yang berguna adalah: 1. Resin itu harus cukup terangkai silang, sehingga keterlarutannya yang dapat diabaikan. 2. Resin harus cukup hidrofilik untuk memungkinkan difusi ion-ion melalui strukturnya dengan laju yang terukur dan berguna. 3. Resin harus menggunakan cukup banyak gugus penukar ion yang dapat dicapai, dan harus stabil dalam hal kimiawinya. 4. Resin yang sedang mengembang, harus lebih besar rapatannya daripada air.
I. Aksi dari Resin Penukar Ion

Resin penukar kation mengandung kation – kation bebas yang dapat ditukar dengan kation – kation dalam larutan (lar). (Res. A)B+ + C+ (larutan) ↔ (Res. A)C+ + B+ (larutan) Jika kondisi – kondisi eksperimen adalah sedemikian, sehingga kesetimbangan telah sama sekali tergeser dari kiri ke kanan, ion C+ telah lengkap difiksasi (dilekatkan tetap) pada penukaran kation. Satu contoh khas adalah penukaran ion natrium pada suatu resin sufonat oleh ion kalsium:
2 (Res.SO3-)Na+ + Ca2+ (lar.) (Res. SO3-)2Ca2+ + 2 Na+ (lar.)

Reaksi ini reversibel, dengan mengalirkan suatu larutan yang mengandung ionion natrium melalui produk itu, ion-ion kalsium dapat dikeluarkan lagi dari resin, dan bentuk natrium yang semula, teregenerasi (pulih seperti keadaan semula). Sama halnya dengan mengalirkan suatu larutan garam netral melalui bentuk hidrogen suatu resin sulfonat, dihasilkan sejumlah asam padanannya yang ekuivalen oleh reaksi khas berikut:
(Res.SO3-)H+ + Na+Cl- (lar.) (Res.SO3-)Na+ + H+Cl- (lar.)

Ukuran resin penukar kation yang asam kuat, seperti resin polistirena sulfonat yang terangkai silang kapasitas tukar boleh dikatakan tak bergantung pada pH larutan. Untuk penukar kation asam lemah, seperti yang mengandung gugus karboksilat, ionisasi timbul samapi tingkat yang berarti hanya dalam larutan basa, yaitu dalam

+ SO42.(lar.+ OH.) + (Res. Resin penukar ion yang basa lemah.(lar.) (Res.NMe3+)2SO42.) (Res. dalam larutan yang asam.NHMe2+)Cl. dan aksinya sangat tak bergantung pada pH.(lar.) (Res. yaitu polistirena terangkai silang yang mengandung gugus ammonium kuartener.+ H2O Aktivitas resin-resin ini serupa dengan resin penukar kation sulfonat. bahkan sekalipun terdapat resin dengan berlebihan.) (Res. kesetimbangan dari: (Res.(lar. Penukaran-penukaran ion karboksilat ini dalam bentuk hidrogennya. dan resin ini sebagian besar berada dalam bentuk amina. yang menghasilkan bentuk garam yang sangat terionisasi: (Res.+ H Cl (lar.NH Me2)+NO3. hanya mengandung sedikit bentuk hidroksida dalam larutan basa. Beberapa reaksi khas mereka.NMe3+)OH. sebagian besar akan terionisasi.NHMe2OH sangat sedikit terionisasi. Sebagai contoh.+ Cl (lar.+ NO3.COO-)Na+ + H2O Tetapi hanya memiliki sedikit aksi terhadap. dapat dinyatakan sebagai: 2 (Res.+ 2 Cl. misalnya NaCl. Ini dapat juga dinyatakan dengan kata-kata bahwa dalam larutan basa.(lar.NMe3+)Cl.(lar.) (Res.NMe3+)Cl. Namun. dalam bentuk garamnya.COO-)H+ + Na+OH.NMe2) + H+Cl. Resin penukar kation yang basa kuat. terjadi hidrolisis pada bentuk garam dari resin itu sehingga basa tersebut mungkin tak dapat lengkap diserap. baik yang dalam bentuk hidroksida maupun yang dalam bentuk garamnya.NMe3+)OH.) (Res. basa bebas Res. sebagai contoh: (Res.NH Me2)+OH- Terutama adalah ke sebelah kiri.(lar.NMe2) + H2O (Res. mereka berperilaku sebagai resin penukar ion basa kuat.bentuk garam-garam mereka. mudah diregenerasikan dengan alkali.NHMe2+)Cl- Mereka dapat digunakan dalam larutan asam untuk pertukaran anion. akan menyerap basa kuat dari larutan: (Res.NMe3+)Cl.) Resin yang bersifat basa.) (Res. maka resin karboksilat hanya mempunyai sangat sedikit aksi dalam larutan dibawah pH 7. Keseimbangan pertukaran ion .+ Cl.

b. tingkat pertukaran bagi anion-anion univalent. memiliki arti penting yang mendasar. dengan ion-ion yang bermuatan sama BS dari suatu larutan. tingkat pertukaran bertambah dengan bertambahnya valensi ion yang bertukar itu. d. c. Pada konsentrasi-konsentrasi rendah dalam larutan air. untuk ion-ion univalen (bervalensi 1) tingkat pertukaran bertambah dengan berkurangnya ukuran kation terhidrasi: . Jadi. tetapi ketidak lengkapan disosiasi garam-garam logam bivalen (bervalensi 2) jugamemainkanperanan =Ni2+ <Co2+<Ca2+<Sr2+<Pb2+<Ba2+. afinitasnya relatif dari ion yang bervalensi lebih tinggi (terhadap resin) bertambah dengan perbandingan lurus dengan bertambahnya keenceran. Dengan resin penukar anion basa kuat. anion polivalen umumnya lebih dipilih untuk diserap. sedangkan jika ion bervalensi lebih rendah berada pada penukar ion. boleh ditulis: AR + B S BR + A S Proses ini reversibel. Sifat resin penukar ion Cd2+<Be2+<Mn2+<Mg2+=Zn2+<Cu2+ . Bila sebuah kation dalam larutan sedang bertukar dengan sebuah ion yang berbeda valensinya. dengan suatu ion bervalensi lebih rendah dalam larutan. yaitu menentukan seberapa mudahnya dua atau lebih zat yang menghasilkan ion-ion dengan muatan serupa dapat dipisahkan dengan cara pertukaran ion dan juga menentukan seberapa mudahnya ion-ion tersebut dapat selanjutnya dikeluarkan dari resin. dibandingkan ion lain. sementara untuk ion divalen ukuran ion merupakan faktor yang penting. yaitu: Na+<Ca2+<Al3+<Th4+. Sejauh mana satu ion lebih dipilih untuk diserap. Faktor-faktor yang menetapkan distribusi ion-ion antara suatu larutan. berbeda-beda menurut ukuran ion terhidrasinya dengan cara yang sama seperti untuk kation. 2.Proses pertukaran ion yang melibatkan penggantian ion-ion AR yang tertukarkan dalam resin. pertukaran akan lebih baik dengan keenceran yang lebih tinggi. dan pada suhu biasa. Dalam larutan encer. Sifat ion-ion yang saling bertukaran a. meliputi: 1. Pada kondisi yang serupa dan valensi yang konstan. pertukaran akan lebih baik dengan menaikkan konsentrasi. untuk menukar suatu ion bervalensi lebih tinggi yang berada pada suatu penukar ion. dan ion bervalensi lebih tinggi berada dalam larutan.

dan jika kuantitas-kuantitas ion-ion ini lebih kecil dibanding kapasitas total kolom untuk ion. II.Absorpsi ion-ion akan bergantung pada sifat gugus fungsional dalam resin. maka mungkin untuk memperoleh kembali ion-ion terserap itu. Kapasitas pertukaran-ion Kapasitas pertukaran ion total dari suatu resin bergantung pada jumlah total gugus ugus aktif-ion per satuan bobot bahan itu dan semakin banyak jumlah ion-ion itu. smeakin besarlah kapasitasnya. Dan juga bergantung pada derajat rangkaian silang dengan naiknya derajat rangkaian silang resin menjadi lebih selektif terhadap ion-ion yang berbeda-beda ukurannya (volume ion dianggap meliputi air hidrasi). dan sebagainya dialirkan melalui sebuah kolom penukar ion. Prinsip Kromatografi Pertukaran Ion Kromatografi penukar ion merupakan kromatografi yang berdasarkan penukaran ion-ion secara equivalen antara larutan dan gugusan fungsional resin yang mengandung ion-ion yang dapat ditukar (Pudjaatmaka. Kapasitas penukar-ion yang asam lemah dan yang basa lemah. dimana yang asam lemah mencapai nilai-nilai agak konstan pada pH di atas sekitar 9. sendiri-sendiri dan berturut-turut dengan . 2002). dimana ion dengan volume terhidrasi yang lebih kecil. B. biasanya akan lebih dipilih untuk diserap. sedangkan yang basa lemah pada pH di bawah sekitar 5. Jika suatu campuran dan dua atau lebih dari kation yang berbeda A. merupakan fungsi dari pH.

hanya akan diperoleh pemisahan yang tak lengkap. Idealnya.menggunakan larutan regenerasi atau elusi yang sesuai. Jika suatu larutan berupa eluan yang sesuai. mungkin menunjukkan teknik-teknik yang salah dan atau kondisi-kondisi operasi yang salah. Jika konsentrasi A dalam porsi-porsi eluat yang berturutan. dialirkan melalui sebuah kolom yang dimuati oleh suatu ion A. . dialirkan terhadap volume eluat. kurva harus mendekati distribusi Gauss (distribusi normal). Penyimpangan yang terlalu besar dari distribusi ini. Jika kurva-kurva elusi ini cukup jauh terpisah seperti gambar dibawah. akan diperoleh sebuah kurva elusi seperti diperlihatkan pada gambar: Nampak. bahwa praktis semua A terkandung dalam volume cairan tertentu dan juga bahwa konsentrasi A melalui suatu batas maksimum. C dan sebagainya yang bermuatan serupa. Jika kolom pertukaran ion memuat berbagai ion B. Jika kation A ditahan lebih kuat oleh resin penukar dibandingkan kation B. kurva-kurva elusi dapat diperoleh untuk masing-masing ion dengan menggunakan eluan-eluan yang sesuai. asalkan kolom cukup panjang dan faktor-faktor eksperimen lainnya menguntungkan bagi pemisahan khusus itu. semua B yang terdapat akan mengalir keluar dari dasar kolom sebelum satupun A dibebaskan. suatu pemisahan kuantitatif dimungkinkan jika kurva elusi itu saling tindih. Teknik pemisahan ini disebut kromatografi pertukaran ion. jalannya reaksi dapat diikuti dengan menganalisis larutan efluen dengan kontinu.

III. terjadi kemungkinan osmosis preferensial (osmosis yang lebih dipilih). besarnya efek-efek demikian jelas bergantung pada proporsi pelarut organik yang ada. yang umunya mempunyai tetapan dielektrik di bawah 40. serta menghasilkan penetapan yang berguna. keton. . cenderung untuk secara dominan menyerap air ke dalam struktur resin. Dimana sistem pelarut campuran digunakan. sedangkan larutan yang mengambang di antara resin-resin. dan telah diperlihatkan bahwa fase resin-resin kation yang sangat asam dan fase resin anion yang sangat basa. Dalam pelarut campuran air-organik. adanya pelarut-pelarut organik dapat meningkatkan kecenderungan suatu kation untuk membentuk kompleks dengan ligan lainnya. jadi memodifikasi perilaku pertukaran ionnya. maupun sistem campuran pelarut air-organik. resin-resin penukar ion merupakan sistem-sistem osmotik yang mengembang karena pelarut tertarik ke dalam resin. Efek ini (sorpsi air yang lebih dipilih (preferensial) oleh resin) meningkat dengan menurunnya tetapan dielektrik dari pelarut organik itu. dan karboksilat. Pertukaran-Ion Dalam Pelarut-pelarut Organik dan Air Organik Penelitian-penelitian dalam sistem-sistem air telah menetapkan banyak prinsipprinsip dasar dari pertukaran ion. dan faktor ini sendiri saja dapat diharapkan akan mengubah selektivitas untuk resin. Selain mempengaruhi gayagaya yang murni elektrostatik ini. Pelarut organik yang umum digunakan adalah senyawa-senyawa okso dari tipe alkohol. Namun. secara dominan adalah pelarut organik. Seperti telah ditunjukkan. lingkup dari proses pertukaran ion telah diperluas selama sekitar dekade terakhir ini dengan menggunakan baik sistem pelarut organik. Maka kation-kation. dan anion-anion tentunya akan berpasangan lebih kuat dalam sistem-sistem pelarut demikian dibandingkan dalam air.

yang akan dimasukkan sebagai gugus fungsional ke dalam suatu resin penukar-ion. dimana laju nampaknya dikendalikan oleh mekanisme difusi partikel. Resin-resin Penukar-Ion Pembentuk Sepit Suatu sifat penting dari penukar ion penyempit adalah selektivitas mereka yang lebih besar dibandingkan penukar-ion jenis konvensional. atau bersama-sama sebuah zat perangkai-silang. bergantung terutama pada sifat gugus penyepit. 2. Ini terutama perlu karena zat-zat penyepit yang membentuk komplek yang stabil. tak akan terintangi oleh matriks resin. sehingga selama sintesis (pembentukan) resin itu. biasanya paling sedikit tridentat . 3. Aspek ini telah dimanfaatkan oleh Korkisch untuk pemisahan ion-ion anorganik dengan apa yang disebut ’Metode Kombinasi Pertukaran Ion-Ekstraksi pelarut’ (CISE = Combined Ion Exchange-Solvent Extraction). Dan perilaku selektif dari resin. atau ia sanggup dimasukkan ke dalam suatu matriks polimer. menghasilkan ke dalam suatu gel resin yang cukup stabil. struktur fungsionalnya tak berubah oleh polimerisasi atau reaksi apapun. Menurut Gregor et al. 1. gugus penyepit itu harus memiliki kestabilan kimia yang cukup. sendirian.. Proses pertukaran ion dalam suatu resin-penyepit biasanya lebih lambat ketimbang dalam penukar jenis biasa. yang dapat memperbaiki faktor-faktor pemisahan pertukaran ion yang normal. 4. tata letak gugus-gugus ligan yang spesifik itu harus tetap terpelihara di dalam resin. zat penyepit itu harus. struktur ruang (sterik) dari gugus penyepit itu harus kompak. terutama didasarkan atas perbedaanperbedaan dalam kestabilan komplek-komplek logam yang berbentuk pada resin itu pada berbagai kondisi pH.Suatu akibat yang menarik dari sorpsi selektif ini adalah bahwa kondisi-kondisi untuk kromatografi (partition chromatography) muncul. IV. sehingga pembentukan cincin sepit dengan kation. Afinitas suatu ion logam tertentu terhadap suatu resin-penyempit tertentu. sifat-sifat berikut diperlukan untuk suatu zat penyepit.

dalam larutan asam menghasilkan kation-kation yang mampu membentuk spesi-spesi dengan berbagai anion. Begitulah. Bahan permulaan untuk sintesis resin penyepit ini adalah stirena-divinilbenzena terklorometilasi yang mengalami reaksi aminasi dan laku diolah dengan asam monoklorasetat.2 [N-lauril (trialkilmetil)amina]. dan sebagainya. Penukar-Ion Cairan Proses penukaran ion yang melibatkan resin penukar. jadi penukar-penukar ini memberi banyak sifat-sifat yang menguntungkan baik dari pertukaran ion maupun ekstraksi pelarut. Sama halnya dengan asam yang tidak terlarutkan dalam air. dalam pelarut yang tidak tercampurkan dalam air. proses berlangsung antara 2 larutan yang tidak saling tercampurkan. Namun. ada kesulitan dan kekurangan berkaitan dengan penggunaan mereka. yang memiliki kelarutan yang rendah dalam air.1 [N-dodesenil (trialkilmetil)amina] dan Amberlite LA. yang dapat diekstraksi. Penukar anion yang sekarang tersedia sebagian besar berdasarkan amino alifatik primer. . sementara dalam hal penukar ion cairan. yang keduanya adalah amin sekunder. terjadi antara fase padat dengan fase cair. Begitulah amina yang berbobot molekul tinggi. tetapi kelarutan yang tinggi dalam pelarut-pelarut yang tidak tercampurkan dengan air. toluena. dan ini penting diperhatikan agar dapat menggunakan penukar ion cairan secara efektif. Kerja penukar ion cairan melibatkan perpindahan selektif suatu zat terlarut antara suatu fase air dan suatu fase organik yang tak tercampurkan yang mengandung penukar cairan. sekunder dan tersier. tanpa kehilangan kemampuan-kemampun mereka untuk membentuk kompleks yang selektif. dapat bertindak sebagai penukar kation untuk ion-ion dalam larutan air. sikloheksena. V. petroleum eter. Teknik yang digunakan untuk pemisahan dengan penukar ion cairan identik dengan teknik yang digunakan dalam pemisahan dengan ekstraksi pelarut. misalnya penukar ion Amberlite LA. dapat digunakan sebagai penukar anion. Cairan penukar anion paling baik digunakan sebagai larutan dan pelarut organik inert seperti benzena.Pertimbangan-pertimbangan ini menunjukkan bahwa banyak zat penyepit tak dapat dimasukkan ke dalam suatu resin. Penukar ion cairan terdiri dari asam dan basa yang berbobot molekul tinggi. larutan suatu basa yang tidak larut dalam air.

Gugus penukar kation lemah CM. dekstran dan agarosa.0. Garam – garam yang efektif digunakan pada proses pengendapan protein adalah garam yang multi anonik seperti sulfat.B.0 dan akan kehilangan muatannya pada pH 9.akan kehilangan muatannya dibawah pH 4. metil sulfonat dan karboksimetil (CM-). sedangkan gugus penukar kation yaitu sulfopropil (SP-). dan kontrol penukar ion sering . APLIKASI KROMATOGRAFI PENUKAR ION Kromatografi penukar ion (atau kromatografi ion) adalah sebuah proses yang memberikan pemisahan ion-ion dan molekul polar berdasarkan their charge. Kromatografi ini dapat digunakan untuk hampir semua jenis of charge molecule termasuk protein besar. polimer dan penambahan garam.5. komponen-komponen secara sendiri-sendiri disebut analit. Pemurnian Protein Kromatografi pertukaran ion memisahkan protein berdasarkan pada muatan bersih protein dan pada kekuatan relatif dari muatan bersih protein tersebut. dan asam amino. dansitrat (Scopes. Beberapa gugus penukar anion yaitu aminoetil (AE-) kuaternari aminoetil (QAE-) dan dietilaminoetil (DEAE-). dan pemisahan kualitas. serta panjang rantai polipeptida yang tidak sama.1994). Penukar ion lemah hanya dapat mempertahankan kondisi terionisasi pada rentang pH sempit dan kehilangan muatannya pada pH tertentu. Gugus penukar ion kuat Q (penukar anion kuat) dan SP.(penukar kation kuat) dapat mempertahankan kondisi terionisasi pada rentang pH 1 – 10. Misalnya gugus penukar anion lemah DEAEterionisasi sempurna dibawah pH 6. Kromatografi pertukaran ion memerlukan fase diam yang biasanya merupakan polimer terhidratasi yang bersifat tidak larut seperti selulosa. analisis air. Protein merupakan makromolekul yang tersusun dari building blok asam-asam amino. pH. Gugus penukar ion diimobilisasikan pada matrik. Larutan yang dimasukkan biasa disebut sampel. Pengendapan ini dapat dilakukan dengan mengubah kekuatan ionic. fosfat. pnambahan pelarut organik. Kromatografi digunakan dalam pemurnian protein. Salah satu tahap yang banyak digunakan untuk pemurnian protein adalah pengendapan protein. sedangkan penukar ion kuat dapat mempertahankan kondisi terionisasi pada rentang pH yang luas.Dalam setiap molekul dari setiap jenis protein tertentu mempunyai komposisi dan deret asamamino. nukleotida kecil.

Proses selanjutnya adalah melepaskan ikatan protein yang terikat gugus fungsional matrik dengan cara membilas kolom menggunakan bufer yang mengandung NaCl atau KCl. maka harus diperhatikan stabilitas protein target pada pH yang dipilih.Dasar dari kromatografi pertukaran ion adalah ion bermuatan dapat dengan bebas dipertukarkan dengan ion yang memiliki tipe muatan yang sama. tetapi bila protein stabil pada pH dibawah pI nya maka digunakan penukar kation (negatif). Protein yang tidak terikat dibilas dengan menggunakan buffer (biasanya dengan konsentrasi 10-50 mM). Protein yang memiliki muatan negatif dapat dipertukarkan dengan ion klorida. . Pada saat menentukan pH untuk kromatografi. Apabila protein stabil pada pH diatas titik isoelektriknya (pI) maka digunakan penukar anion (positif). maka protein yang bermuatan positif akan menggantikan ion Na+ sedangkan protein yang bermuatan negatif atau netral tidak akan terikat. Jika protein stabil pada rentang 1 unit diatas dan dibawah pI maka kedua penukar ion dapat digunakan. Pembilasan dilakukan dengan meningkatkan konsentrasi NaCl atau KCl secara linier atau bertahap sehingga protein yang memiliki ikatan lemah dengan matrik akan lepas terlebih dahulu dan diikuti oleh protein yang memiliki ikatan lebih kuat. Mula-mula gugus fungsional matrik yang bermuatan negatif mengikat ion dari bufer (misalnya Na+). Pada saat sampel dimasukkan ke dalam kolom. Muatan bersih protein tergantung pada pH (protein semakin bermuatan positif dengan menurunkan pH dan semakin negatif dengan menaikkan pH). Pemurnian protein dengan kromatrografi pertukaran ion Pemilihan penukar ion tergantung pada muatan protein target.

matrik selulosa biasanya tidak digunakan karena beberapa xilanase tertentu memiliki cellulose binding domain (Subramaniyan & Prema 2002) yang akan berinteraksi pada proses elusi normal. Penukar ion lemah akan memberikan hasil pemisahan yang lebih baik untuk protein-protein yang memiliki muatan bersih yang berdekatan. yaitu : 1. peptida kecil. Pemilihan penukar ion kuat atau lemah tergantung pada pH molekul target. polistiren. polisakarida dan asam nukleat. nukleotida. . hormon. Dekstran (Sephadex) atau agarosa (sepharose). Matrik polistiren dan polifenolik lebih sering digunakan untuk memisahkan molekul-molekul kecil seperti asam-asam amino. ion yang dapat diikat. Kelemahannya adalah protein-protein yang memiliki distribusi gugus bermuatan pada permukaannya atau memiliki pI yang sama atau mirip akan sulit dipisahkan dengan cara kromatografi penukar ion. CMSephadex) digunakan untuk memisahkan protein. Matrik polidekstran dan agarosa (misalnya DEAE-Sephadex. Keuntungan kromatografi penukar ion diantaranya adalah tidak merusak protein yang dimurnikan dan pada umumnya memiliki kapasitas pengikatan yang tinggi. Matrik selulosa biasanya digunakan untuk memisahkan protein (termasuk enzim). poliakrilik atau polifenol. Ada 3 kelompok matrik yang biasanya digunakan. dan 3. Selain itu larutan enzim hasil kromatografi penukar ion mengandung kadar garam cukup tinggi yang harus dihilangkan untuk proses pemurnian selanjutnya. Pada pemurnian xilanase.Matrik yang mengikat gugus fungsional menentukan sifat aliran. nukleotida siklik. tRNA dan polisakarida. Molekul yang memerlukan pH sangat rendah atau sangat tinggi untuk dapat erionisasi atau apabila molekul stabil pada pH ekstrim maka penukar ion kuat harus digunakan. stabilitas mekanik dan kimia. DEAE-selulosa. selulosa. 2. CM-selulosa dan fosfoselulosa paling sering digunakan. asam-asam organik.

. 4. 3. Equilibrasi Aplikasi sampel Elusi Regenerasi 2.Proses penukar ion dapat dipisahkan menjadi 4 langkah yaitu: 1.

seperti buffer awal agar supaya semua muatan protein berikatan dengan tepat. semua bagian dari gugus muatan pada fase stasioner berikatan dengan counter ion penukar. . Tujuan pada tahap ini adalah untuk mengikatkan molekul yang menjadi target dan mencuci semua material yang tidak terikat dengan sampel buffer yang mempunyai pH dan kekuatan ionik sama. Deabsorbsi protein relatif terhadap jumlah gugus bermuatan pada permukaanya. Equilibrasi Tahap I adalah kesetimbangan terhadap fase stasioner atau fase diam untuk membuat kondisi awal yang diinginkan. 3. ini untuk memastikan bahwa kapasitas penuh dari fase stasioner untuk dapat digunakan selanjutnya. 2.1. yang umum digunakan adalah peningkatan ionik dengan NaCl atau gram sederhana lainnya agar supaya terjadi penurunan ikatan protein. membuang semua molekul yang masih berikatan. Aplikasi Sampel Tahap II adalah aplikasi sampel dan pencucian. biomolekul dilepaskan dari penukar ion dengan mengubah komposisi buffer. Regenerasi Tahap akhir adalah regenerasi. misalnya Ion Klorida (Cl-) atau Sodium (Na+). Elusi Dalam tahap ketiga ini adalah elusi. Ketika terjadi kesetimbangan. 4.

maka kami mengambil satu dari sekian banyak penelitian-penelitian yang telah dilakukan mengenai isolasi dan pemurnian protein yaitu salah satunya enzim xilanase. Enzim mempunyai daya katalisisspesifik yang lebih besar dari katalisator lainnya. Untuk dapat memahami bagaimana aplikasi kromatografi penukar ion dalam pemurnian protein. Enzim mampu meningkatkan reaksi kimia tetapi tidak diubah oleh reaksi yang dikatalisnya serta tdak megubah kedudukan normal dari kesetimbangan kimia. Enzim memegang peranan penting dalam berbagai reaksi di dalam sel. Aplikasi kromatografi penukar ion dalam pemurnian protein ini juga dapat dikembangkan dalam bidang industri. sehingga disebut life is enzyme. enzim diproduksi dan digunakan oleh sel hidup untuk mengkatalisis reaksi antara lain konversi energi dan metabolism pertahanan sel. Sebagai protein. Aplikasi Kromatografi Penukar Ion Dalam Isolasi dan Karakterisasi Xilanase dari Bacillus circulans .Enzim Enzim adalah protein globular yang umumnya berfungsi sebagai biokatalis pada semua proses kimia dalam makhluk hidup.

tahan pH alkali. Xilanase dapat diproduksi oleh beberapa organisme seperti bakteri. Proses pemutihan pulp tidak hanya membuat pulp menjadi lebih putih atau cerah. Xilanase bisa digunakan untuk menghidrolisis xilan (hemiselulosa) menjadi gula xilosa. Salah satu upaya yang sedang dikembangkan adalah penggunaan enzim pada beberapa proses pembuatan pulp dan kertas seperti pada pemasakan (cooking). aktinomisetes. gastropoda dan artropoda. jamur. berupa endoxilanase dan bebas dari aktivitas selulase. pemutihan (bleaching) dan deinking. tetapi juga membuatnya stabil sehingga tidak menguning atau kehilangan kekuatan dan derajat putih selama penyimpanan. Xilanase yang dibutuhkan dalam proses prapemutihan pulp diharapkan memiliki beberapa karakteristik spesifik seperti tahan suhu tinggi (60-70oC). Pemakaian enzim memiliki banyak keunggulan seperti menghemat energi. Proses pemutihan adalah proses yang memisahkan serat kertas dari lignin (penyebab kertas berwarna kusam) . ragi. Xilan banyak diperoleh dari limbah pertanian dan industri makanan. proses pemutihan menjadi lebih ramah lingkungan. protozoa. PENDAHULUAN Perkembangan teknologi industri terus mengalami kemajuan terutama teknologi yang berwawasan lingkungan. alga. Penggunaan enzim xilanase diharapkan dapat mereduksi penggunaan bahan kimia klorin yang bersifat berbahaya pada bagi lingkungan sehingga dengan menggunakan enzim xilanase. Beberapa jenis bakteri dan jamur diketahui mampu menghasilkan xilanase ekstraseluler yang dapat menghidrolisis hemiselulosa menjadi xilosa. Tujuan utama dari proses pemutihan adalah untuk meningkatkan derajat putih pulp. Salah satu enzim yang banyak dimanfaatkan dalam industri pulp dan kertas adalah xilanase. Saat ini telah dikembangkan proses bioteknologi dalam industri pulp dan kertas. reduksi pitch. .A. Selain itu beberapa mikroorganisme yang terdapat pada ruminansia diketahui berpotensial sebagai penghasil xilanase karena hewan ruminansia tersebut mengkonsumsi hemiselulosa dalam jumlah besar.yang selama ini memakai pemutih kimia. Xilanase digunakan untuk meningkatkan ekstraksi lignin dan melepaskan kromofor dari pulp dalam tahapan awal pemutihan pulp. mengurangi kebutuhan bahan kimia dan meningkatkan kekuatan pulp dan kertas. Pengembangan proses hidrolisis secara enzimatis merupakan prospek baru untuk penanganan limbah hemiselulosa. sehingga pulp tersebut sesuai untuk dibuat kertas dengan jenis tertentu.

pengaduk magnetik. Bandung.5%. avometer.9. ekstrak ragi 0. Merck). glisin. Isolasi Xilanase Untuk mengetahui waktu bakteri menghasilkan xilanase dan umur inokulum kultur yang digunakan maka dilakukan pembuatan kurva tumbuh dan kurva aktivitas xilanase dari B. poliakriamida. Tokyo. B. xilosa. Tris base. Congo Red. Hasil penelitian terdahulu menunjukkan Bacillus circulans diketahui mampu menghasilkan xilanase dengan aktivitas selulase terendah. BAHAN dan METODA Bahan dan Alat Peralatan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah rotary shaker. Isolat ditumbuhkan pada medium xilan kemudian diinkubasi selama 80 jam. maka perlu dilakukan penelitian mengenai isolasi dan karakterisasi xilanase dari Bacillus circulans.7H2O 0. sehingga enzim dari bakteri ini diharapkan dapat diproduksi dan digunakan pada proses awal pemutihan pulp di industri pulp dan kertas. kemudian setiap enam jam sekali .. elektroforesis Mini Protean IIxI. xilan oat spelt 0. NaCl.1%. bromofenol biru. pH medium diatur 10. circulans. Medium xilan terdiri dari pepton 0. Berdasarkan hal tersebut. Metoda 1. ITB. asam asetat. matriks DEAE-Toyopearl 650 M (Tosoh Corp. kantung dialisis berbahan dasar selulosa (SIGMA CHEMICAL) dengan ukuran pori yang dapat memisahkan protein minimal 12 kDa.5 dengan Na2CO3 1%. gliserol. Na2CO3.02%. Bovine serum albumin (BSA. Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah B. K2HPO4 0. waterbath. kolom kromatografi. K3FeCN6. refrigerated centrifuge.5% (Sigma Chemical).Genus Bacillus diketahui sebagai penghasil xilanase yang aktif pada suhu 50 °C – 60 °C. spektrofotometer. Pengembangan produksi dalam skala komersial diharapkan dapat menciptakan kewirausahaan baru dan juga mendukung perkembangan industri pulp dan kertas yang berwawasan lingkungan. NaOH. NaHCO 3. dengan pH 7 . Untuk mengetahui pola pertumbuhan dan aktivitas xilanase. diambil sampel sejumlah 3 mL setiap dua jam sekali sampai dengan jam ke-24. Jepang). Diharapkan dengan penelitian ini dapat mengatasi permasalahan ketersediaan enzim yang spesifik dan kendala yang dihadapi dalam aplikasinya di industri pulp dan kertas. MgSO4.5%. Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah ammonium sulfat. circulans yang berasal dari laboratorium Mikrobiologi. Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati. Fraksi V.

. Endapan yang diperoleh dilarutkan dalam buffer NaHCO3-Na2CO3 25 mM pH 9. dan 80-100. 2. dilakukan produksi xilanase. Larutan kemudian diaduk dan disentrifugasi dengan kecepatan 12. Pemurnian Parsial Xilanase Seluruh tahapan pemurnian dilakukan pada suhu 4oC dengan diagram alir seperti dibawah ini: a. Fraksinasi Bertingkat dan Dialisis Ekstrak kasar enzim xilanase dari hasil isolasi difraksinasi bertingkat dengan menggunakan garam ammonium sulfat ((NH4)2SO4) sehingga diperoleh persen saturasi 020.sampai jam ke-60. Ekstrak kasar enzim diperoleh dengan mensentrifugasi kultur bakteri dengan kecepatan 8. Berdasarkan kurva pertumbuhan dan kurva aktivitas xilanase yang telah dibuat. 20-40.3. Inokulum yang digunakan adalah 10% (v/v). Seluruh sampel yang diperoleh dihitung jumlah koloninya dan aktivitas xilanasenya. Kultur B.000 rpm selama 25 menit.000 rpmselama 10 menit pada suhu 4oC. 60-80. 40-60. dan 12 jam sekali sampai kultur berumur 80 jam.8 L buffer NaHCO3-Na2CO3 selama 24 jam. circulans diinokulasikan ke dalam medium xilan kemudian diinkubasi pada suhu 37◦C dengan pengadukan 200 rpm selama 18 jam. Hasil fraksinasi kemudian didialisis dalam 4.

Uji Aktivitas Xilanase Aktivitas xilanase diuji dengan mengukur jumlah gula pereduksi dari substrat xilan dengan menggunakan metode Ferisianida Alkali (Walker dan Harmon. 5. Satu unit (U) aktivitas xilanase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat menghasilkan 1 μmol gula pereduksi (xilosa) per menit dengan xilan sebagai substrat. Untuk penentuan pH optimum xilanase digunakan dua jenis buffer yaitu buffer Tris-Cl untuk pH 8. Uji aktivitas xilanase dan pengukuran protein dilakukan menggunakan metode sebagai berikut: 3. Kromatografi dilakukan dengan menggunakan bahan pendukung DEAE-Toyopearl 650 M yang telah disetimbangkan dengan buffer NaHCO3-Na2CO3.5. Merck) sebagai standar. Mula-mula ekstrak enzim sejumlah 50 μL ditambahkan ke dalam substrat xilan oat spelt 1-3% sejumlah 150 μL dalam buffer Na2CO3-NaHCO3 25-100 mM (pH 10. Karakterisasi Xilanase a. Kromatografi Penukar Ion Filtrat hasil dialisis kemudian dimurnikan lebih lanjut dengan kromatografi kolom.Fraksi V. 1996). dan buffer Glisin-NaOH untuk pH 8. . Penentuan pH dan Suhu Optimum Penentuan pH optimum dilakukan dengan menguji aktivitas xilanase pada rentang pH 8–10 dengan rentang pH 0.5-10. Pengukuran Kadar Protein Kadar protein diukur dengan menggunakan metoda Bradford (1976) dengan menggunakan bovine serum albumin (BSA.5). Filtrat hasil dialisis kemudian dialirkan ke dalam kolom dan dielusi secara bertahap dengan menggunakan larutan NaCl (0-450 mM) dalam buffer NaHCO3-Na2CO3 sehingga diperoleh fraksi-fraksi. Aktivitas enzim dihentikan dengan menambahkan ferisianida alkali sejumlah 600 μL dan dididihkan selama 10 menit. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 39oC selama 30 menit. Setiap fraksi yang diperoleh diuji aktivitas xilanase dan kadar proteinnya. 4. Penentuan suhu optimum dilakukan dengan menguji aktivitas enzim xilanase pada rentang suhu 30-90oC selama 30 menit dengan rentang 10oC pada pH optimum yang diperoleh. Penyesuaian pH enzim dilakukan dengan cara mengencerkan enzim sejumlah 10-100x pada berbagai pH sehingga konsentrasi akhir buffer pada reaksi 100 mM. Campuran ditambahkan air sejumlah 4 mL kemudian diukur pada A420.b.

Analisis Zimogram Sampel enzim dielektroforesis dengan native gel poliakrilamida 10 % selama 4-5 jam dengan kondisi dingin (4-8oC).5 dengan pengadukan 200 rpm selama 18 jam dengan jumlah inokulum bakteri yang digunakan adalah 10% (v/v).5 dengan substrat xilan 0. circulans Hasil skrining menunjukkan bahwa isolate B.b. Sampel sejumlah 10-36 μL dimasukkan ke dalam sumur kemudian dielektroforesis dengan arus sebesar 24 mA pada double strength running buffer (pH 9). Gel dielektroforesis pada Mini Protean IixI (Bio Rad) dengan tanki elektroforesis vertikal.232 U/mL yang lebih rendah jika dibandingkan dengan isolate Bacillus lainnya sehingga sesuai digunakan untuk industry pulp dan kertas. C. maka waktu bakteri yang digunakan untuk percobaan selanjutnya adalah 18 jam karena pada waktu tersebut xilanase mempunyai aktivitas tertinggi dan memiliki waktu fermentasi yang singkat.1% selama 15 menit pada suhu ruangan. Gel kemudian direndam di dalam buffer Glisin-NaOH 100 mM pH 8.5 mM pH 6. Isolasi B. Mula-mula enzim dicampur dengan sampel buffer 5x yang mengandung Tris-Cl 312.8. circulans dapat menghasilkan xilanase dengan memiliki aktivitas selusase rendah yaitu 0. Gel lalu dibilas kembali menggunakan asam asetat 0.5% sehingga akan diperoleh zona bening yang menunjukkan adanya aktivitas enzim xilanase dengan latar belakang biru gelap. gliserol 50% (v/v) dan Bromofenol biru 0. pH medium 10. Pemurnian parsial xilanase . Berdasarkan kurva tersebut. Kondisi fermentasi yang digunakan untuk menghasilkan ilanase adalah suhu 37o C.1% pada suhu 50oC selama 20-30 menit. Gel kemudian diwarnai menggunakan Congo Red 0.05%. Ekstrak kasar enzim yang diperoleh dan fermentasi dengan menggunakan 100 mL medium adalah 100 mL berarti xilanase yang dihasilkan pada kondisi tersebut dapat mencapai rendemen 100%. kurva aktivitas xilanase yang tertinggi diperoleh pada jam ke 18 dan jam ke 36 (0. Gel tersebut kemudian dibilas dengan menggunakan larutan NaCl 1 M sampai kelebihan warna pada pita hilang.378 U/mL enzim). 2. PEMBAHASAN 1.

maka sampel fraksi 20 – 40% digunakan untuk proses pemurnian dengan kolom kromatografi.48 U/mg. Prinsip kolom penukar ion adalah protein dengan ikatan elektrostatis yang lebih rendah dengan matriks akan dielusi terlebih dahulu dan diikuti protein dengan ikatan elektrostatik yang lebih tinggi. Hasil pemurnian enzim xilanase menggunakan kromatografi penukar anion menunjukkan peningkatan aktivitas enzim spesifik menjadi 805. Berdasarkan hasil uji aktivitas spesifik. Tingkat kemurnian suatu enzim diketahui dari aktifitas enzim tersebut dan berdasarkan kelipatan pemurnian enzim yang diperoleh. Hasil fraksinasi menunjukkan xilanase dapat mengendap pada seluruh tingkatan fraksinasi yang digunakan karena pada seluruh fraksi yang diperoleh menunjukkan adanya aktivitas xilanase. Hasil pemisahan protein dengan kolom penukar anion menunjukkan puncak aktivitas xilanase tertinggi diperoleh pada fraksi ke 14 dengan aktivitas spesifik 805. Cara mengetahui aktifitas enzim dengan membagi aktifitas enzim hasil pemurnian dengan aktifitas enzim awal ekstrak kasar enzim.8 kali dibanding dengan ekstrak kasarnya. Jika konsentrasi garam tinggi maka kelarutan protein akan menurun sehingga protein akan menurun sehingga protein dapat mengendap dengan sempurna. Pengendapan protein semakin meningkat dengan peningkatan jumlah garam yang ditambahkan dalam sampel protein yang ditandai dengan meningkatnya jumlah endapan. Lalu fraksi tersebut didialisis untuk menghilangkan garam ammonium sulfat dan molekul kecil berberat molekul rendah. Dengan adanya garam ammonium sulfat pada konsentrasi tertentu berpengaruh terhadap kelarutan suatu protein.12 U/mg. pH 9. aktivitas xilanase fraksi dengan saturasi 20– 40% menunjukkan peningkatan aktivitas spesifik tertinggi yaitu sebesar 585. tetapi jika konsentrasi garam rendah maka akan terjadi sebaliknya. Enzim hasil fraksinasi 20 – 40 % yang telah didialisis dialirkan dalam kolom penukar ion lalu dielusi secara bertahap dengan menggunakan NaCl (0 – 450 mM) dalam buffer NaHCO3-Na2CO3 25 mM. Ekstrak kasar xilanase difraksinasi bertingkat sehingga didapat 5 fraksi.48 U/mg dengan tingkat kemurnian 46. Karakterisasi enzim xilanase . 3.Pemurnian dilakukan secara parsial karena pada penelitian ini tidak bisa didapat enzim yang benar2 murni. Xilanase mulai dapat mengendap pada konsentrasi garam dengan persen saturasi 0 – 20%.3 sehingga diperoleh 40 fraksi.

4. Xilanase memiliki aktivitas optimum pada pH 9. Dari hasil zimogram diatas diketahui bahwa terdapat dua jenis xilanase. Analisis ini perlu dilakukan untuk mengetahui keragaman xilanase pada saat tahap pemurnian. Adanya modifikasi pada protein tersebut dapat meningkatkan interaksi pada protein tersebut sehingga protein tersebut menjadi lebih rigid dan stabil pada suhu dan pH tinggi. Keragaman enzim dapat terjadi karena adanya isoenzim. Juga menggunakan zimogram untuk mengetahui keragaman xilanase dari setiap tahapan pemurnian yang dilakukan. Isoenzim dihasilkan oleh bakteri dengan tujuan agar bakteri tersebut dapat menghidrolisis substrat xilane dengan sempurna. karena memiliki BM yang berbeda tetapi memiliki titik isoelektrik yang sama. Keragaman Xilanase Keragaman xilanase dapat dianalisis menggunakan metode zimogram. sehingga enzim tidak terdenaturasi.5 dan suhu 75o – 80o C. maka kita dapat menjelaskan adanya dua puncak aktivitas saat penentuan suhu optimum. karena dilihat dari BM yang berbeda tetapi memiliki titik isoelektrik yang sama. Kedua xilanase ini kemungkinan adalah isoenzim. interaksi kimia menyebabkan perubahan konformasi protein yang berpengaruh terhadap stabilitas dan aktivitas protein yang dipengaruhi oleh keadaan lingkungan mikro protein dan distribusi asam amino bermuatan pada permukaan protein.Karakterisasi enzim xilanase dilakukan menggunakan enzim hasil pemurnian parsial dengan parameter pH dan suhu. karena kedunya mengendapa pada fraksi yang sama yaitu fraksi .

ada kemungkinan bahwa pH kedua xilanase B. yaitu dengan menurunkan konsumsi senyawa klorin sampai dengan 20% dan dapat diperoleh derajat putih yang sama dengan kontrol (tanpa menggunakan xilanase) pada tahapan pemutihan CEH (chlorinasi. Aspek Ekonomi • Enzim merupakan metode alternatif dengan biaya rendah sehingga dapat digunakan untuk mereduksi penggunaan klorin dan bahan bahan kimia pemutihan lainnya. • Digunakannya xilanase yang sesuai dengan karakteristik untuk proses pra pemutihan maka ketergantungan ketersediaan enzim untuk industri pulp dan kertas dari impor dapat berkurang. b. • Penggunaan xilanase juga dapat meningkatkan kualitas kertas karena xilanase dapat meningkatkan viskositas pulp. meningkatkan derajat putih dan menurunkan bilangan kappa.5). meningkatkan derajat giling dari serat daur ulang. karena tidak perlu lagi dilakukan proses netralisasi dan pendinginan pulp. 5.saturasi 20-40%. a. Selain itu terjadinya penurunan aktivitas enzim selama proses penyimpanan dapat dikurangi karena pengadaan enzim yang kontinyu. Aspek Teknis • Jika kita menggunakan xilanase yang tahan alkali dan suhu tinggi akan memudahkan penggunaan enzim pada tahapan pra-pemutihan. Titik isoelektrik (TI) adalah daerah pH tertentu dimana protein tidak mempunyai selisih muatan atau jumlah muatan positif dan negatifnya sama. dan hipoklorit). suatu protein sangat mudah diendapakan karena pada saat itu muatan listriknya nol. mereduksi waktu penggilingan pulp virgin. Kemungkinan Penggunaan Xilanase di Industri Pulp dan Kertas Penggunaan xilanase dengan karateristik spesifik seperti tahan alkali dan suhu tinggi akan memiliki beberapa keunggulan jika dilihat dari sisi teknis. • Penggunaan xilanase pada tahap pemutihan dapat meningkatkan fibrilasi pulp dan retensi air. akibatnya kedua protein tersebut dapat mengendap pada fraksi yang sama. circulans pada fraksi 14 mendekati nilai pI. ekonomi dan lingkungan. . sehingga tidak bergerak ketika diletakkan dalam medan listrik pada pH isoelektrik (pI). Sehingga jika kita hubungkan dengan pH optimum xilanase yang telah didapat (pH 9. extraction. Penggunaan xilanase pada tahap pra-pemutihan ini dapat mereduksi penggunaan bahan kimia berbahan dasar klorin/ bahan pengoksidasi yang bersifat toksik sejumlah 20-40%.

c. Aspek Lingkungan Telah kita ketahui bahwa penggunaan xilanase pada tahap pra-pemutihan pulp dapat mereduksi penggunaan bahan kimia berbahan dasar klorin atau bahan pengoksidasi yang bersifat toksik sejumlah 20-40%. . Dengan menurunnya senyawa klorin yang digunakan pada proses pemutihan maka secara teoritis diharapkan kandungan bahan berbahaya seperti senyara organik terklorinasi (AOX) dan dioksin pada air limbah industri pulp dan kertas dapat direduksi.

2007.220-231. 2002. NewYork Toha. Jakarta Richana.org/wiki/Proteomics/Protein_Separations__Chromatography/Ion_exchange .. Jakarta Pudjaatmaka. diterjemahkan oleh Maggy Thenawidjaya. H.DAFTAR PUSTAKA Lehninger. A..A. Produksi dan Prospek Enzim Xilanase dalam Pengembangan Bioindustri di Indonesia. SKKI-8 Asal Sukabumi. Rekayasa & Efek Pemanfaatannya. Alfabeta. ed. Jakarta Widhyastuti. 4. Purifikasi dan Karakterisasi Xilanase Ekstraseluler Streptomyces sp. Deoxyribo Nucleic Acid : Keanekaragaman. Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian.. Dasar-dasar Biokimia. R. 1994. 2005. 2002. Ekspresi.. Balai Pustaka. 1994. H. EGC.Erlangga. Protein Purification: Principles and Practice. Bogor Scopes.L.wikibooks. 434 – 435.. Kamus Kimia. Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik. 1994. Springer Veriag. Bandung Vogel.K. Nur. IPB Press. N. Bogor http://en.