LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UMUM PEWARNAAN SEL (BAKTERI DAN JAMUR) DAN PEWARNAAN ENDOSPORA

KELOMPOK I Ahmad Soni 0810910002

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2010

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Selain itu bakteri yang hidup akan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Sedangkan, untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitianpenelitian mikrobiologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu, bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan merah sedangkan yang positif berwarna ungu (Levine, 2000). Praktikum persiapan pembuatan apusan dan teknik pewarnaan gram sangat penting dilakukan karena untuk pengamatan biakan dari koloni mikroba dan biakan jamur dapat dilakukan dengan mudah dan baik. Pewarnaan ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospora yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Pelczar dan Chan, 2007).

3 Manfaat Manfaat yang diperoleh setelah mengikuti praktikum mengenai pewarnaan sel bakteri dan pewarnaan endospora ini adalah praktikan akan mempunyai keterampilan dan keahlian dalam hal pewarnaan sel bakteri dan pewarnaan endospora yang banyak dilakukan dalam laboratorium-laboratorium mikrobiologi dengan metode yang disesuaikan dengan alat dan biaya yang ada.1.2 Tujuan Tujuan dilakukannya praktikum mengenai pewarnaan sel (bakteri dan jamur) dan pewarnaan endospora ini antara lain : 1) Mempelajari teknik pembuatan sediaan apusan (preparat) 2) Mempelajari proses pewarnaan struktur sel bakteri 3) Mempelajari bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri 4) Memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur pewarnaan dan memahami reaksi kimiawi di dalam prosedur tersebut 5) Mempelajari proses pewarnaan struktur sel jamur (kapang) 6) Mempelajari bentuk-bentuk dan struktur sel jamur (kapang) 7) Memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur pewarnaan dan memahami reaksi kimiawi di dalam prosedur tersebut 1. .

Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. yang sudah difiksasi. 2004). Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0. bulat. Bentuk bakteri bermacam – macam yaitu elips. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Umumnya ukuran bakteri sangat kecil. batang dan spiral.000 X atau lebih (Waluyo. dinamakan pewarnaan sederhana. memperjelas ukuran dan bentuk bakteri. bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1. 2007). atau spiral (heliks) (Pelczar & Chan. batang (silindris). . Pemberian warna pada bakteri atau jasad. susunan dan keadaan struktur internal dan butiran.3 µm. untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola. serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. bentuk.1 sampai 0. Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop. sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Sel bakteri memiliki panjang yang beragam. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan. 2007). Sel sel individu bakteri dapat berbentuk seperti bola/elips.jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis. atau olesan.BAB II TINJAUAN PUSTAKA Bakteri merupakan organisme prokariot. pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran.

Na+). substrat. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. dan lainlain. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif. Jadi. Jadi. . mewarnai bakteri dengan zat pewarna asam akan menghasilkan hanya pewarnaan pada daerah latar belakang saja. Contoh zat warna basa adalah methylen blue. SO4-. Karena sel bakteri tak berwarna di atas latar belakang yang berwarna (Volk & Wheeler. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal. pewarnaan diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. safranin. Jika warna terdapat pada ion negatif. pewarnaan diferensial dan pewarnaan gram. Sebaliknya zat pewarna asam ditolak oleh muatan negatif bakteri menyeluruh. Terdapat tiga mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana. peluntur warna. maka disebut zat warna asam. muatan negatif dalam asam nukleat bakteri akan bereaksi dengan ion positif zat pewarna basa. COOHCOO?. Kristal violet. maka disebut zat warna basa. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pada zat warna yang bersifat basa. Hubungan antara bakteri dengan zat pewarna basa yang menonjol disebabkan terutama oleh adanya asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. warna akan terdapat pada ion negatif (zat pewarna. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi. salah satu di antaranya berwarna. 1991). Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna.Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Pewarnaan gram merupakan metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Umsl. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-. 2008). safranin dan metilin blue adalah beberapa zat pewarna basa yang biasa digunakan. 1993). netral red. warna terdapat pada ion positif (zat pewarna+ Cl-) dan pada pewarna asam. CH3COO-. jika bakteri itu diwarnai. intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo.

Prosedur pertama dari pewarnaan gram ini adalah memberi pewarna kristal violet. dll (Cappuccino & Sherman. Proses pewarnaan gram ini memerlukan 4 jenis reagen.Pewarnaan gram ditemukan pada tahun 1884 oleh seorang dokter kebangsaan Denmark Christian Gram (membuat zat pewarna khusus) pewarna tersebut merupakan pewarna differensial karena dapat membagi bakteri menjadi dua kelompok fisiologi. bakteri terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian safranin akan memberikan warna merah pada bakteri Gram negatif. Contoh bakteri Gram negative adalah Neisseria. Contoh bakteri Gram positif adalah Streptococcus. Setelah itu ditambah alkohol. yaitu bakteri gram positif . Bacillus. Gram Peptococcus. Shigella. Klebesiella. Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan Gram dan Ziehl‐Nelsen. Clostridia. negatif akan Peptostreptococcus. Beberapa bakteri akan melepaskan zat pewarna dengan mudah apabila dicuci dan beberapa bakteri yang lain zat pewarna akan bertahan walaupun dicuci dengan alkohol 95%. Setelah di tambahkan safranin. dll. kemudian dibilas dan diberi pewarna safranin atau bismarck (untuk buta warna merah) selama 1 menit. Salmonella. Stapilococcus. Bakteri Gram positif membentuk kompleks Kristal iodine yang berwarna biru. dan karakteristik bakteri. setelah satu menit dibilas dan kemudian akan diberi laputan alkohol 95% selama 30 detik. Hemophillus. Corynebacterium Sedangkan dhypteriae. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini. yang akan memudahkan untuk identifikasi. bakteri Gram positif akan berwarna ungu. Bakteri gram positif akan terwarna ungu (kristal violet) dan bakteri gram negatif akan terwarna merah (safranin) (Umsl. setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri akan berwarna biru. Vellonella. Zat pewarna kristal violet dan yodium akan membentuk senyawa yang kompleks. struktur. setelah 1 menit dibilas dan kemudian akan diberikan pewarna yodium. Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi penyakit infeksi. Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian kristal violet. 2008). 1983).

dan bakteri gram negatif. Pewarnaan ZN digunakan untuk mengidentifikasi infeksi yang disebabkan oleh bakteri tahan asam. Hal ini menyebabkan bakteri menjadi tidak berwarna. maka pori‐pori akan membesar dan tidak mengikat pewarna. maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat mengikat warna dasar. Tsukamurella. Larutan yang biasa dipakai adalah ungu kristal. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam pemberian alcohol. Gram C (Aseton. conttohnya adalah Micobacteriom tuberculosis. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang kuat dan lapisan peptidoglikan sebanyak 30 lapisan sehingga permeabilitas dinding selnya menjadi berkurang. 2005). Kalium iodide. Hal ini akan mengecilkan pori‐pori sehingga menghasilkan kompleks kristal iodium. Rhodococcus. Sedangkan bakteri Gram negatif hanya memiliki 1‐2 lapisan peptidoglikan sehingga memiliki permeabilitas dinding sel yang lebih besar. Sedangkan bakteri Gram positif akan mengalami denaturasi selama pemberian alcohol. Mycobacterium marinum dan Mycobacterium ulcerans yang tumbuh pada 31C dan menginfeksi kulit. Reagen pertama disebut warna dasar. Aquades). yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar. Ammonium oksalat. maka warna akan tercuci. Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel. Gordonia / . Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Aquades). Aalkohol. Reagen terakhir adalah warna pembanding. Mycobacterium atypical seperti Mycobacterium avium intraseluler / Mycobacterium avium complex yang tumbuh pada 41C yang menyerang sistem imun. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). lartan iodium. Nocardia. bila komponen dinding sel kuat mengikat warna. Micobacterium leprae. bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat. Gram D (merah) (Safranin. berupa pewarna basa. Gram B (cokelat) (Iodium. Alcohol). Aquades). Legionella mycdatci. Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi pada dinding sel bakteri Gram negatif. Alcohol. Pewarnaan Gram terdiri atas Gram A (violet) (Kristal violet. alkohol dan safranin (Tracy.

Cryptosporidium. dan lipid (50%‐ nya tersusun atas asam mikolat). Etil alcohol). Hasilnya berwarna merah. Aquades). Tsukamurella. ZN‐B (tidak berwarna) (HCl. Hasil pewarnaan ZN akan mengidentifikasikan : 1. pewarnaan kapsul. 2003). Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut: pewarnaan sederhana. pewarnaan yodium (granula glikogen) dan pewarnaan negatif (Gozali. 2009) Gambar 2. pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel. pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri (pewarnaan Neisser (granula volutin). Bakteri tidak tahan asam Hasilnya adalah berwarna biru karena dekolorisasi pada pewarnaan pertama oleh asam‐alkohol. Contoh bakteri than asam yang tidak cocok pada pewarnaan ZN tetapi cocok pada Kinyoun adalah Nycordia. Cyclospora. dan ZN‐C (biru) (Methylen blue. dan Gordonia. Aquades) (Madigan. 2009) . Sifat tahan asam pada bakteri tahan asam disebabkan karena dinding selnya terdiri atas peptidoglikan. Bakteri tahan asam Bakteri tahan asam baru akan terkarakterisasi setelah pewarnaan setelah pemberian asam‐ alkohol. Isospora. 2.1 Pewarnaan Sederhana (Gozali. dll. pewarnaan differensial (pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam). Alcohol.Gordona. Pewarnaan ZN terdiri dari ZN‐ A (merah) (Basic fusion. arabinogalaktan. Sarcocytis. jadi perlu diberi pewarnaan kedua berupa counter stain. Fenol. pewarnaan spora. Asam mikolat merupakan asam lemak ranai panjang yang terdiri atas 34‐90 karbon. Rhodococcus.

maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat.2 Pewarnaan Negatif (Hadiotomo. 1990) Gambar 2.Pewarnaan negatif. Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. 1990) . Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina (Hadiotomo. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia.

Larutan ini merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. 2008). 2009). Bakteri yang menghasilkan spora pada umumnya tahan terhadap pewarnaan. sedangkan bakteri yang tidak memiliki spora dan hanya memiliki sel vegetatif tidak tahan terhadap pewarnaan (Partic. maka endospra berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop. Teknik ini akan . Endospora merupakan struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri. pemanasan dan keadaan asam. tetapi sekali diwarnai. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora. Karena kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan dengan sel vegetatifnya. Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarnaan biasa. endospora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses pemanasan. sehingga harus menggunakan pewarnaan spesifik. biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin.Gambar 2.3 Pewarnaan Gram (Jason. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan spora secara umum. Setelah perlakuan malachite green. Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya. Struktur endospora sangat bervariasi pada setiap spesies. Endospora merupakan struktur yang tahan terhadap keadaan lingkungan yang ekstrim misalnya kering. zat warna tersebut akan sulit hilang.

1990). Oleh karena itu. dan agent kimia lainnya sehingga diperlukan pewarnaan khusus secara mikrobiologi dan ketika kondisi lingkungan kembali normal. Sporogenesis dan germinasi tidak dimaksudkan untuk reproduksi tetapi hanya mekanisme yang menjamin ketahanan sel dibawah kondisi lingkungan (Suriawiria. Untuk pewarnaan selanjutnya. pengeringan. Bakteri . Kondisi yang terus memburuk membuat endospora dibebaskan dari degenerasi sel vegetatif dan menjadi sel independen yang disebut spora yang diakibatkan komposisi lapisan kimia spora bersifat tahan terhadap efek-efek merusak. akan mengikat kuat senyawa pewarna. pembekuan. Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarna biasa.menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya (Fardiaz. maka endospora berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop. Bakteri penghasil spora tahan terhadap pewarnaan. Akhirnya warna bakteri spora adalah hijau. vibrio. sehingga harus digunakan pewarna spesifik dan yang biasa digunakan adalah malachite green. Pewarnaan sederhana. merupakan pewarna yang paling umum digunakan. cat tersebut (misalnya safranin) sel spora tidak dapat menerimanya karena sudah terikat dengan cat pertama. 1992). radiasi. Karena kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan dengan sel vegetatifnya. Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri. Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromofornya bersifat positif). 2005). basillus. spora bebas kembali untuk aktif secara metabolik dan sel vegetatif berkurang resisten melalui germinasi. setelah diwarnai oleh suatu warna. Disebut demikian karena hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme. dsb) dari bahan-bahan lainnya yang ada pasa olesan yang diwarnai (Hadiotomo. misalnya malachite green. Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarnapewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofil (suka akan basa). misalnya pemanasan berkelebihan. Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacammacam tipe morfologi (coccus.

sel vegetatif mudah mengikat warna kembali. hasil pewarnaan akhir adalah merah muda dari safranin (Assani. Setelah pewarnaan selanjutnya dengan safranin. . Saat diwarnai oleh malachite. sel vegetatif dapat mengikat warna tetapi dapat luntur setelah dilunturkan karena ikatannya tidak kuat.yang tidak berspora cenderung tidak tahan pengecatan karena hanya memiliki sel vegetatif. 1994). Oleh karena itu.

2. apusan digenangi dengan cat gram B selama 1 menit. apusan digenangi dengan cat gram D selama 1 menit. apusan ditetesi dengan cat gram C selama 30 detik.1 Pembuatan Apusan Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70%. Kemudian di fiksasi secukupnya hingga kering. Setelah kering. 3. Universitas Brawijaya. cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. 3. sisa cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Preparat apusan siap diwarnai dan diamati. Setelah kering. bertempat di Laboratorium Mikrobiologi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Malang.2 Cara Kerja 3. kemudian bakteri hasil isolasi diambil menggunakan jarum ose sebanyak satu kali pengambilan yang telah di tehnik aseptis dan diletakkan di atas kaca obyek yang telah terdapat aquades steril sebanyak satu kali yang pengambilannya dengan jarum ose.2 Teknik Pewarnaan Gram Apusan dicat dan digenangi dengan cat gram A selama 1 menit.35 WIB.00 – 16.BAB III METODE PRAKTIKUM 3. Jurusan Biologi. cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Setelah kering.1 Waktu dan Tempat Praktikum mengenai “Pewarnaan Sel (Bakteri dan Jamur) dan Pewarnaan Endospora” dilaksanakan pada hari Kamis 15 April 2010 pada pukul 13. Kemudian preparat siap diamati dibawah mikroskop .2.

Preparat ditiriskan dengan kertas saring dan diamati di bawah mikroskop. kemudian B. kemudian bakteri yang akan dikonfirmasi diambil sebanyak satu ose dan diletakkan pada gelas obyek yang telah terdapat larutan KOH sebanyak satu jarum ose. Kemudian di fiksasi secukupnya hingga kering. Kemudian campurkan dengan mengaduknya.2.3 Konfirmasi Hasil Cat Gram Dengan KOH Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70%. Setelah itu dinginkan preparat sebentar. di cuci dengan air mengalir.2. Selanjutnya gelas obyek dipanaskan di atas air mendidih dengan menutup preparat dengan kertas saring dan ditetesi dengan malakit hijau selama 10 menit.4 Pewarnaan Endospora Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70%. Kemudian genangi preparat dengan pewarna safranin selama 1 menit. selanjutnya preparat di cuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan.3. subtilis diambil menggunakan jarum ose sebanyak satu kali pengambilan yang telah di tehnik aseptis dan diletakkan di atas kaca obyek yang telah terdapat aquades steril sebanyak satu kali pengambilan dengan jarum ose. 3. endospora akan tampak berwarna hijau dan sel vegetatif akan tampak berwarna merah. kemudian jarum ose diangkat beberapa sentimeter untuk mengetahui apakah cairan berlendir atau tidak. .

Cat gram B akan menguatkan ikatan antara pewarna dengan dinding sel bakteri. Setelah kering. maka preparat akan berwarna bening.1 Pembuatan Apusan Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70% agar tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat pembuatatn apusan. Setelah kering.1. Setelah kering. kemudian bakteri hasil isolasi diambil menggunakan jarum ose sebanyak satu kali pengambilan yang telah di tehnik aseptis. apusan ditetesi dengan cat gram C selama 30 detik. sisa cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Bakteri gram negative akan berwarna kemerahan. Kemudian di fiksasi secukupnya hingga kering. Cat gram C akan melarutkan warna sebelumnya. 2003). 2008).1. cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan.1 Analisa Prosedur 4. . apusan digenangi dengan cat gram D selama 1 menit. Kemudian preparat siap diamati dibawah mikroskop. apabila preparat bakteri merupakan gram negative. agar pewarna sebelumnya tidak bercampur dengan pewarna yang lain yang akan digunakan (Umsl.BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4. cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. sedangkan bakteri gram positif akan berwarna ungu. agar bakteri yang akan digunakan mati namun organ dan struktur tidak rusak (Madigan. agar tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat pembuatatn apusan dan diletakkan di atas kaca obyek yang telah terdapat aquades steril sebanyak satu kali pengambilan dengan jarum ose. apusan digenangi dengan cat gram B selama 1 menit.2 Teknik Pewarnaan Gram Apusan dicat dan digenangi dengan cat gram A selama 1 menit. 4. cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan.

kemudian jarum ose diangkat beberapa sentimeter untuk mengetahui apakah cairan berlendir atau tidak. Jika cairan tersebut berlendir maka bakteri tersebut merupakan bakteri gram negatif dan jika cairan tersebut tidak berlendir maka bakteri tersebut bakteri gram positif (Umsl.1. subtilis diambil menggunakan jarum ose sebanyak satu kali pengambilan yang telah di teknik aseptis dan diletakkan di atas kaca obyek yang telah terdapat aquades steril sebanyak satu kali pengambilan dengan jarum ose.4 Pewarnaan Endospora Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70% agar tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat perlakuan. Kemudian genangi preparat dengan pewarna safranin selama 1 menit. 4. .1. 2008). konfirmasi dilakukan untuk memastikan bakteri tersebut gram negatif atau positif. di cuci dengan air mengalir agar endospora dapat terwarna dengan baik.4. masuknya pewarna dalam endospora di bantu dengan. selanjutnya preparat di cuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. gelas obyek dipanaskan dengan diletakkan pada ram kawat di atas air mendidih hingga timbul uap air dengan menutup preparat dengan kertas saring dan ditetesi dengan malakit hijau agar endospora yang berkembang dapat terwarna hijau dan agar endospora tidak mati (menjaga agar tetap lembab (tidak kekeringan)) selama 10 menit. agar endospora dapat berkembang (memudahkan pengamatan). Selanjutnya apusan bakteri dengan pewarna malakit hijau. Kemudian campurkan dengan mengaduknya. kemudian bakteri yang akan dikonfirmasi diambil sebanyak satu ose dan diletakkan pada gelas obyek yang telah terdapat larutan KOH sebanyak satu jarum ose. Kemudian di fiksasi secukupnya hingga kering. kemudian B. agar bakteri yang akan digunakan mati namun organ dan struktur tidak rusak.3 Konfirmasi Hasil Cat Gram Dengan KOH 3% Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70% agar tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat perlakuan. Setelah itu dinginkan preparat sebentar.

subtilis 1 BP 1.1 1 Bentuk : Bulat Ada Tidak bersekat. 5 6 4 BP 8. cabang.Preparat ditiriskan dengan kertas saring dan diamati di bawah mikroskop. Data hasil pewarnaan kapang No Isolat Kelompok Spora Sporan gium 1 KNP 6. cabang. tidak rapat Ujung : Tumpul Ada Hifa Sporan giofor Ada . 2008).3 1 2 2 BNP 1. Data hasil pewarnaan bakteri dan endospora No Isolat kel Bentuk Gram Perbesaran Uji KOH 3% Endospora B.1 7 8 Basil Basil Basil Basil Basil Basil Basil Basil + + 1000x 1000x 1000x 1000x 1000x 1000x 1000x 1000x Ada Ada Tidak ada Tidak ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Tabel 2.2. tidak rapat Ujung : Tumpul Jenis : Satu 2 Bentuk : Bulat Ada Tidak bersekat.1 3 4 3 BNP 3.3 Data Hasil Pengamatan Tabel 1. 4. endospora akan tampak berwarna hijau dan sel vegetatif akan tampak berwarna merah (Scienceprofonline.

tidak rapat Ada Ada Bersekat.1.3 3 Bentuk : Bulat Tidak ada Tidak bersekat. cabang. tidak rapat Ujung : Tumpul Jenis : Satu 3 KP 4. cabang. rapat Tidak ada Bersekat. cabang. tidak rapat Ujung : Tumpul Jenis : Satu 4 Bentuk : Bulat Tidak ada Tidak bersekat. cabang. tidak rapat Ujung : Tumpul Jenis : Satu 8 Bentuk : Bulat Ada Tidak bersekat.1 5 Bentuk : Lonjong Tidak ada Ujung : Lancip Jenis : Dua : Besar dan Kecil 6 Bentuk : Lonjong Tidak ada Ujung : Lancip Jenis : Dua : Besar dan Kecil 4 KP 5. 7 Bentuk : Bulat Ada Tidak bersekat. cabang. rapat Tidak ada Tidak ada Tidak ada . cabang.Jenis : Satu 2 KP 5.

dan gram D. baik yang tercemar maupun yang tidak tercemar pestisida akan mempunyai karakteristik yang sama berdasarkan hasil pewarnaan yang telah dilakukan. Ada yang memiliki sporangium dan ada pula yang tidak mempunyai sporangium. namun terdapat bentuk yang berbeda yang dikarenakan kurang telitinya praktikan dalam mengamati bentuk bakteri. Ada yang memiliki sporangiofor dan ada pula yang tidak memiliki sporangiofor. Kristal violet merupakan bahan kimia dengan rumus kimia C18H15N3O3.2 dan BP 8.3 Analisa Hasil Data hasil pengamatan menunjukkan bahwa isolate BP 1. dan biasa digunakan dalam teknik pewarnaan microscopy Certistain (Merck. ammonium oksalat 0. Hal ini menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan morfologi yang berarti antara bakteri dan kapang yang tercemar maupun yang tidak tercemar. BNP 3. gram B.1 merupakan bakteri gram negatif dan berbentuk basil jika diamati pada mikroskop dengan perbesaran 1000x. Pada pewarnaan Gram yang dilakukan digunakan gram A. Pewarnaan endospora menggunakan bakteri Bacillus subtilis. Gram B merupakan merupakan cat yang terdiri dari campuran yodium 1 gram. 2007). aquades 80ml. Data hasil pengamatan pada pewarnaan kapang menunjukkan bahwa terdapat variasi bentuk pada kapang tersebut antara lain bentuk spora yang bulat dan lonjong.Ujung : Tumpul Jenis : Satu 4. ujung tumpul dan lancip. etil alkohol 95% 20 ml. Hifa ada yang bersekat dengan cabang yang tidak rapat.1 merupakan bakteri gram positif.8 gram.3. kalium yodida 2 gram. akuades 300ml. dimana bakteri ini mempunyai endospora yang ditandai dengan warna hijau. Gram A merupakan cat yang terdiri dari campuran kristal violet 2 gram. Preparat BNP 1. ada pula hifa yang bersekat dengan cabang rapat. bukan merupakan bahan kimia berbahaya. gram C. Gram B merupakan larutan mordan yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh . terdiri atas satu macam atau dua macam spora. Bakteri dan kapang.

Pada bakteri gram negatif penambahan safranin akan menyebabkan warna bakteri berubah menjadi merah karena warna ungu yang dihasilkan oleh kristal violet-yodium telah luntur dengan lisisnya membran sel sehingga safranin dapat terikat. 25 gram . etil alkohol 95% 10ml. Gram D merupakan cat yang terdiri dari campuran safranin 0. Perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif (Filzahazny. Gram C merupakan cat yang terdiri dari campuran aseton 50ml dan etil alkohol 95%50ml. Tabel 3. zat warna kristal violet akan larut saat penambahan larutan pemucat. 1994). Gram C merupakan larutan pemucat . 2008) No. memperjelas warna dari zat warna tersebut. dan akuades 90ml. larutan pemucat berfungsi untuk melarutkan lipida pada membrane bakteri gram negative yang akan menyebabkan pori-pori sel membesar sehingga meningkatkan daya larut persenyawaan kristal violet-yodium. Tanpa penambahan larutan mordan. penambahan larutan mordan menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks kristal violet-yodium. gram D atau zat pewarna kedua berfungsi sebagai pembeda terhadap zat warna kristal violet (Lay. Safranin pada gram D tidak akan menyebabkan perubahan warna pada bakteri positif karena persenyawaan kompleks kristal violet-yodium tetap terikat pada dinding sel.bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri lebih kuat. mempersulit pelarutan zat warna. Pada pewarnaan gram . Oleh sebab itu. 1 2 3 Perbedaan Dinding sel Kadar lipid Resistensi terhadap alkali (1% KOH) 4 Kepekaan terhadap Yodium Toksin yang dibentuk 5 Lebih peka Eksotoksin Kurang peka Endotoksin Bakteri Gram Positif (+) Lapian peptidoglikan tebal 1-4% (Lebih rendah) Lebih pekat Bakteri Gram Negarif (-) Lapian peptidoglikan lebih tipis 11-22% (Lebih tinggi) Larut .

6 Resistensi terhadap tellurit Lebih tahan Lebih peka 7 Sifat tahan asam Ada yang tahan asam Tidak ada yang tahan asam 8 Kepekaan terhadap penisilin Lebih peka Kurang peka 9 10 11 12 Kepekaan terhadap streptomisin Penghambatan warna Ketahanan terhadap fisik Kebutuhan nutrien Tidak peka Lebih dihambat Lebih tahan Kompleks Peka Kurang dihambat Kurang tahan Relatif Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi. Tipe sentral atau tengah merupakan lokasi dari sel vegetatif yang letaknya tepat di tengah. lokasi. yang terdiri dari cross-linked keratin. . Tipe subterminal berarti lokasi endosporanya diantara tengah dan pinggir dari sel vegetatif. yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik. Identifikasi dapat dilakukan dengan melihat morfologi. prosedur pewarnaan dengan malakit hijau adalah dengan pemanasan. subterminal dan sentral. Contohnya Bacillus subtilis memiliki endospora yang terletak di subterminal (Scienceprofonline. Letak endospora yang berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi. Endospora dapat berukuran lebih besar ataupunkecil dari sel vegetatif yang terdiri dari lapisan protein yang terbuat dari keratin. Tipe utama diantara terminal. dimana sel tersebut akan nampak menggembang pada letak endosporanya. Komponen endospora mempunyai resistan terhadap agen kimia yang kuat pada spore coat. dan ukuran endospora. Endospora merupakan metode pertahanan hidup yang bukan bertujuan untuk reproduksi. Spora ini memiliki resistensi yang tinggi terhadap pewarnaan. Beberapa endospora mempunyai diameter lebih besar daripada sel. 2008). Tipe terminal memiliki pengertian letak sel vegetatif diantara ujung dan pinggir dari sel vegetatif.

uretral.075 g berfungsi untuk memberi warna pada sel kapang. cotton blue 0. dan air suling 40 ml (Waluyo. Misalnya pada pemeriksaan gram ditemukan gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus (nana). Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal.Komposisi dari Lactophenol Cotton Blue yaitu kristal. kristal fenol + air panas 70oC untuk membunuh jamur. Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat gram mempunyai makna dignostik. maka memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi gonoro. Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis. asam laktat 20 ml yang berfungsi untuk menjernihkan latar belakang dan mempertajam struktur kapang. . memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. 2001): Kelebihannya adalah: pengecatan gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik. Kelebihan dan kekurangan pengecatan gram (Nirwati. Hal ini dikarenakan bakteri gram positif dan negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika. Kekurangannya adalah pengecatan gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari 104 ml per ml. sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan kepekaan bakteri terhadap antibiotik). 2007). gliserol 40 ml berfungsi menjaga fisiologi sel dan menjaga sel terhadap kekeringan.

2 Saran Diharapkan praktikan teliti dan hati-hati dalam pemurnian sebab dikhawatirkan dapat terjadi kontaminasi. kemudian difiksasi. bakteri Gram positif akan berwarna ungu. Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi penyakit infeksi. 5. Setelah di tambahkan safranin. Letak endospora yang berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi. dan karakteristik bakteri. Bakteri Gram positif membentuk kompleks Kristal iodine yang berwarna biru. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi. Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan Gram dan Ziehl‐Nelsen. subterminal dan sentral.1 Kesimpulan Teknik pembuatan sediaan apusan (preparat) dapat dilakukan dengan mensuspesikan biakan bakteri dengan aquades. setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri akan berwarna biru. struktur. Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian kristal violet.BAB V PENUTUP 5. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi. Setelah itu ditambah alkohol. tipe utama diantaranya ialah terminal. yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik. .

Diakses pada tanggal 26 April 2010 Lay.T. Diakses pada tanggal 26 April 2010 Hadiotomo. B. 1994.s1LZb0AAAEWZuEfVhTl.htm. United State of America. Pembuatan preparat dan pengecatan dalam petunjuk praktikum mikrobiologi Fakultas kedokteran Universitas Gadjah Mada. Mikrobiologi Pangan I. 2000. http:/wordpress. Hera. 2009. Mikrobiologi Kedokteran. Fardiaz. 1990. Gramedia. Diakses pada tanggal 26 April 2010 Gozali. .gozali. Levine. Universitas Gadjah Mada press. http://www. Jakarta. An Introduction to Laboratory Technique in Bacteriology. 2007. Merck .DAFTAR PUSTAKA Assani. inc..com/Penganta-tentang-bakteri. S.id/cresyl-violetacetate/MDA_CHEM105235/p_zyOb. 1992. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. http://www. Jason. Yogyakarta. PT Raja Grafindo Persada.edu/~jasoncg/ID/ microreporting. McMillan Company.htm. S. Cresyl Violet Acetate. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta : Pt Gramedia..co. pada tanggal 26 April 2010 Nirwati. Analisis Mikroba di Laboratorium.merckchemicals. Jakarta.html .si d=2XfBHZapUlXHHd9B9vTSj5pCnREAl69HlgSHhO2CnREAkWqXGgJCVGG. New York. M.temple. 2009.com/gram/pewarnaan-gram-prinsip. Addison-Wesley Publishing Company. Ratna Siri. Jakarta Filzahazny. 1994. 2008. Pewarnaan gram. http://astro. Pearson Education. 2003. diakses . G. M. J. The Gram Stainning. Amir.blogspot. New York.W. Brock Biology of Microorganism. & Natalie. 1983. Madigan. Microbiology A Laboratory Manual. 2001. Cappuccino. S.

Staining Bacteria. 2008. Papas Sinar Sinanti.S.us/thsadvbio/pdfs/gram %20stain. 1993. Pewarnaan endospora. Diakses pada tanggal 26 April 2010 Umsl. Mikrobiologi Dasar.dunia- mikro.pdf. E. Mikrobiologi Umum . Malang.umsl.Partic. Jakarta. Jakarta Waluyo. Sutedjo. Mikrobiologi Tanah. http://www. . 2005.blogspot. Chan.C.ca. Jakarta. Suriawiria.edu/~microbes/pdf/stainingbacteria.k12. J. Rineka Cipta. M. Mc Graw Hill Book Company.pdf. 1991. pada tanggal 26 April 2010 Volk & Wheeler. L . M. Diakses pada tanggal 26 April 2010 Pelczar.com/2008/08/pewarnaan endospora. Gram Staining. 2007 .tracy. Diakses www. U. Tracy. Elements of Microbiology. Penerbit Erlangga. New York. 2007.. 2005. Li. www. Mikrobiologi Dasar. 2008. Universitas Muhammadiyah Malang Press.