P. 1
Hight Performance Liquid Chromatography Hplc Dan Gas Kromatografi Gc

Hight Performance Liquid Chromatography Hplc Dan Gas Kromatografi Gc

|Views: 4|Likes:
Published by baron33t

More info:

Published by: baron33t on Dec 17, 2012
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOC, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

06/09/2014

pdf

text

original

TUGAS KIMIA ANALITIK Hight performance liquid chromatography (HPLC) dan gas Kromatografi (GC

)

Oleh:

Kelompok VII Afrianti Ramadhani Dekna Aswita Gusnilawati Reviana ervita Rezki Pratama

JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI PADANG 2010

KROMATOGRAFI A. Pendahuluan Kromatografi adalah suatu metode pemisahan fisik, dimana komponenkomponen yang dipisahkan didistribusikan diantara dua fasa, salah satu fasa fasa tersebut adalah suatu lapisan stasioner dengan permukaan yang luas, yang lainnya sebagai fluida yang mengalir lembut di sepanjang landasan stasioner. Fasa stasioner bisa berupa padatan maupum cairan, sedangkan fasa bergerak bisa berupa cairan maupun gas. Jadi semua jenis kromatografi yang diketahui diorganisir jadi satu dalam empat kategori yang ditunjukakan dalam tabel sebagai berikut: Fasa stasioner Fasa bergerak Contoh-contoh padat Cair gas Kromatografi Kromatografi asli gas-padat, Tswett,dengan atau GSC larutan petroleumeter dan kolom CaCO3, Kromatografi pertukaran ion Seluruh bentuk kromatografi terdiri dari fase diam dan fase gerak. Dalam seluruh bentuk kromatografi yang lain, anda akan menemui fase gerak adalah cairan. Dalam kromatografi gas-cair, fase gerak adalah gas seperti helium dan fase diam adalah cairan yang mempunyai titik didih yang tinggi diserap pada padatan. Bagaimana kecepatan suatu senyawa tertentu bergerak melalui mesin, akan tergantung pada seberapa lama waktu yang dihabiskan untuk bergerak dengan gas dan sebaliknya melekat pada cairan dengan jalan yang sama. Dalam semua teknik kromatografi, zat-zat terlaryt yang dipisahkan bermigrasi sepanjang kolom (seperti dalam kromatografi kertas atau lapisan tipis, ekivalen fisik kolom), dasar pemisahan terletak dalam laju perpindahan yang berbeda untuk larutan berbeda. Laju perpindahan sebuah zat terlarut sebagai hasil dari dua faktor, yang satu cenderung menggerakkan zat terlarut itu, dan yang lain menahannya. Perbedaan kecil antara dua zat terlarut dalam kekuatan adsorbsi dan dalam interaksinya dalam pelarut Cair cair Gas Kromatograf Kromatogra i partisi pada fi gas-cair kolom silika atau GLC gel Kromatograf i kertas

yang bergerak menjadi dasar pemisahan bila zat molekul-molekul zat terlarut itu berulangkali menyebar diantara dua fasa keseluruh panjang kolom. Ada beberapa cara untuk mengklasifikasi teknik kromatografi didasarkan atas tipe penamaan dari fasa (fasa tetap dan fasa bergerak) seperti gas-cairan(GLC), gas-padat (GSC), cairancairan(LLC), dan cairan-padat(LSC). Klasifikasi lain didasarkan pada teknik penggunaan contohnya. Teori kromatografi didasarkan pada kesetimbangn distribusi sampel antara fasa yang ditetapkan oleh konstanta kesetimbangan K, disebut dengan koefisien distribusi. Rata-rata konsentrasi mengikuti hukum distribusi :

Dimana Cs adalah konsentrasi fasa stasioner dan Cm konsentrasi fasa bergerak. Laju rata-rata perpindahan molekul ditentukan oleh : 1. Kecepatan molekul pembawa 2. Perbandingan volume fasa stasioner dengan fasa bergerak 3. Koefisien distribusu dari zat terlarut

1. Kromatografi Gas Kromatografi gas-cair (GLC), atau kromatografi gas (GC), merupakan jenis kromatografi yang digunakan dalam kimia organik untuk pemisahan dan analisis. GC dapat digunakan untuk menguji kemurnian dari bahan tertentu, atau memisahkan berbagai komponen dari campuran. Dalam beberapa situasi, GC dapat membantu dalam mengidentifikasi sebuah kompleks. Dalam kromatografi gas, fase yang bergerak (atau "mobile phase") adalah sebuah operator gas, yang biasanya gas murni seperti helium atau yang tidak reactive seperti gas nitrogen. Stationary atau fasa diam merupakan tahap mikroskopis lapisan cair atau polimer yang mendukung gas murni, di dalam bagian dari sistem pipa-pipa kaca atau logam yang disebut kolom. Instrumen yang digunakan untuk melakukan kromatografi gas disebut gas chromatograph (atau "aerograph", "gas pemisah").

senyawa gas yang sedang dianalisis berinteraksi dengan dinding kolom yang dilapisi dengan berbagai tahapan stationary. Ini menyebabkan setiap kompleks ke elute di waktu yang berbeda, yang dikenal sebagai ingatan waktu yang kompleks. Perbandingan dari ingatan kali yang memberikan kegunaan analisis GC-nya. Kromatografi gas yang pada prinsipnya sama dengan kromatografi kolom (serta yang lainnya bentuk kromatografi, seperti HPLC, TLC), tapi memiliki beberapa perbedaan penting. Pertama, proses memisahkan compounds dalam campuran dilakukan antara stationary fase cair dan gas fase bergerak, sedangkan pada kromatografi kolom yang seimbang adalah tahap yang solid dan bergerak adalah fase cair. (Jadi, nama lengkap prosedur adalah "kromatografi gas-cair", merujuk ke ponsel dan stationary tahapan, masing-masing.) Kedua, melalui kolom yang lolos tahap gas terletak di sebuah oven dimana temperatur gas yang dapat dikontrol, sedangkan kromatografi kolom (biasanya) tidak memiliki kontrol seperti suhu. Ketiga, konsentrasi yang majemuk dalam fase gas adalah hanya salah satu fungsi dari tekanan uap dari gas. Kromatografi gas juga mirip dengan pecahan penyulingan, karena kedua proses memisahkan komponen dari campuran terutama berdasarkan titik didih (atau tekanan uap) perbedaan. Namun, pecahan penyulingan biasanya digunakan untuk memisahkan komponen campuran pada skala besar, sedangkan GC dapat digunakan pada skala yang lebih kecil (yakni microscale). Kromatografi gas terkadang juga dikenal sebagai uap-tahap kromatografi (VPC), atau gas-cair kromatografi partisi (GLPC). Alternatif nama ini, serta masingmasing singkatan, sering ditemukan dalam literatur ilmiah. Diagram alir kromatografi gas-cair

Mekanisme kerja GC Injeksi sampel Sejumlah kecil sampel yang akan dianalisis diinjeksikan pada mesin menggunakan semprit kecil. Jarum semprit menembus lempengan karet tebal (Lempengan karet ini disebut septum) yang mana akan mengubah bentuknya kembali secara otomatis ketika semprit ditarik keluar dari lempengan karet tersebut. Injektor berada dalam oven yang mana temperaturnya dapat dikontrol. Oven tersebut cukup panas sehingga sampel dapat mendidih dan diangkut ke kolom oleh gas pembawa misalnya helium atau gas lainnya. Ada dua tipe utama kolom dalam kromatografi gas-cair. Tipe pertama, tube panjang dan tipis berisi material padatan; Tipe kedua, lebih tipis dan memiliki fase diam yang berikatan dengan pada bagian terdalam permukaannya. Kolom biasanya dibuat dari baja tak berkarat dengan panjang antara 1 sampai 4 meter, dengan diameter internal sampai 4 mm. Kolom digulung sehingga dapat disesuakan dengan oven yang terkontrol secara termostatis.Kolom dipadatkan dengan tanah diatomae, yang merupakan batu yang sangat berpori. Tanah ini dilapisis dengan cairan bertitik didih tinggi, biasanya polimer lilin. Komponen dalam kromatografi gas : 1. Gas pembawa dan pemasukan sampel Fase bergerak dalam kromatografi ini adalah gas, yang paling lazim adalah helium, hidrogen, atau nitrogen. Kompenen pilihan gas spembawa terutama tergantung pada karakteristik detektor. Kromatografi gas komersial biasanya menyediakan katup pengatur tambahan untuk pengendalian tekanan yang baik pada inlet kolom. Dekat inlet kolom ada suatu alat dimana sampel-sampel dapat dimasuukan kedalam aliran gas

pembawa. Sampel-sampel tersebut bisa berupa gas atau cairan yang mudah menguap. Lubang injeksi dipanaskan agar sampel cair teruapkan dengan cepat. 2. Kolom Aliran gas selanjutnya menemui kolom yang diletakkan dalam oven bertemperatur konstan. Ini adalah jantung instrumen tesebut, tempat dimana proses kromartgrafi dasar berlangsung. Kolom memilki variasi dalam hal ukuran dan bahan isian. Tabung diisi dengan bahan padat halus dengan luas permukaan besar yang relatif inert. Padatan iitu sebenarnya hanya sebuah penyangga mekanik untuk cairan, sebelum diisi kedalam kolom, padatan tersebut diimpregnasi dengan cairan yang diinginkan yang berpareran sebagai fasa stasioner sesungguhnya. Cairan ini harus stabil dan nonfolatil pada temperatur kolom, pemisahan tertentu. 3. Detektor Setelah muncul dari kolom itu, aliran gas lewat melalui sis lain detektor. Maka elusi zat terlarut dari kolom itu mengatur ketidakseimbangan antaradua sisi detektor yang direkam secara elektrik. Laju aliran gas pembawa adalah hal yang sangat penting, dan biasanya pengukur aliran untuk itu tersedia. Secara normal gas-gas yang muncul dialirkan keluar pada tekanan atmosfir. Karena pekerja laboratorium secara terus menerus terpapar oleh uap senyawa-senyawa yang terkromatogafi yang mungkin tak baik walaupun kadarnya biasanya kecil maka ventilasi pada keluaran instrumen harus diperhatikan. Ketentuan bisa dibuat untuk menjebak zat terlarut yang dipisahkan setelah muncul dari kolom jika hal ini dibutuhkan untuk penyelidikan lebih lanjut. Penerapan kromatografi gas 1. Untuk identifikasi senyawa Dengan suatu kolom tertentu dan dengan semua fariabelnya seperti temperatur dan laju alir, dikendalikan secara cermat, waktu retensi atau volume retensi suatu zat terlarut merupakan suatu besaran dari zat terlarut tersebut, seperti halnya titk didih atau halnya indek bias adalah besaran. Ini pemisahan dan harus sesuai untuk

menunjukkan bahwa sifat retensi dapat digunakan untuk mengetahui suatu senyawa. 2. Analisis kuantitatif Dengan GC tergantung pada hubungan antara jumlah suatu zat terlarut dan ukuran dari pita elusi yang dihasilkan. Secara umum dengan detektor diferensial, ukuran jumlah zat terlarut yang paling baik adalah luas dibawah pita elusi. Jumlah zat terlarut = faktor kalibrasi x luas dibawah pita elusi. Keterbasan GC adalah volatilitas sampel itu harus mempunyai tekanan uap yang cukup pada temperatur kolom tersebut, dan ini segera menghilangkan banyak jenis sampel. Suatu perhitungan yang aktual tidak mungkin dilakukan tetapi harus diperkirakan bahwa sekitar 20% senyawa kimia yang diketahui kurang cukup volatil.kebanyakan sampel organik tidak cukup volatil untuk memungkinkan penerapan langsung dari GC.

Temperatur kolom Temperatur kolom dapat bervariasi antara 50 oC sampai 250 oC. Temperatur kolom lebih rendah daripada gerbang injeksi pada oven, sehingga beberapa komponen campuran dapat berkondensasi pada awal kolom. Kolom memulai pada temperatur rendah dan kemudian terus menerus menjadi lebih panas dibawah pengawasan komputer saat analisis berlangsung. Proses pemisahan pada kolom Ada tiga hal yang dapat berlangsung pada molekul tertentu dalam campuran yang diinjeksikan pada kolom: • • • Molekul dapat berkondensasi pada fase diam. Molekul dapat larut dalam cairan pada permukaan fase diam Molekul dapat tetap pada fase gas

Dari ketiga kemungkinan itu, tak satupun yang bersifat permanen.Senyawa yang mempunyai titik didih yang lebih tinggi dari temperatur kolom secara jelas cenderung akan berkondensasi pada bagian awal kolom. Namun, beberapa bagian dari senyawa tersebut akan menguap kembali dengan dengan jalan yang sama seperti air yang menguap saat udara panas, meskipun temperatur dibawah 1000C. Peluangnya akan berkondensasi lebih sedikit selama berada didalam kolom. Sama halnya untuk beberapa molekul dapat larut dalam fase diam cair. Beberapa senyawa akan lebih mudah larut dalam cairan dibanding yang lainnya. Senyawa yang lebih mudah larut akan menghabiskan waktunya untuk diserap pada fase diam: sedangkan senyawa yang suka larut akan menghabiskan waktunya lebih banyak dalam fase gas. Proses dimana zat membagi dirinya menjadi dua pelarut yang tidak bercampurkan karena perbedaan kelarutan, dimana kelarutan dalam satu pelarut satu lebih mudah dibanding dengan pelarut lainnya disebut sebagai partisi. Sekarang, anda bisa beralasan untuk memperdebatkan bahwa gas seperti helium tidak dapat dijelaskan sebagai pelarut. Tetapi, istilah partisi masih dapat digunakan dalam kromatografi gas-cair. Substansi antara fase diam cair dan gas. Beberapa molekul dalam substansi menghabiskan waktu untuk larut dalam cairan dan beberapa lainnya menghabiskan waktu untuk bergerak bersama-sama dengan gas. Waktu retensi Waktu yang digunakan oleh senyawa tertentu untuk bergerak melalui kolom menuju ke detektor disebut sebagi waktu retensi. Waktu ini diukur berdasarkan waktu dari saat sampel diinjeksikan pada titik dimana tampilan menunujukkan tinggi puncak maksimum untuk senyawa itu. Setiap senyawa memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk senyawa tertentu, waktu retensi sangat bervariasi dan bergantung pada: Titik didih senyawa. Senyawa yang mendidih pada temperatur yang lebih tinggi daripada temperatur kolom, akan menghabiskan hampir seluruh waktunya untuk berkondensasi sebagai cairan pada awal kolom. Dengan demikian, titik didih yang tinggi akan memiliki waktu retensi yang lama. Kelarutan dalam fase cair. Senyawa yang lebih mudah larut dalam fase cair, akan mempunyai waktu lebih singkat untuk dibawa oleh gas pembawa.. Kelarutan yang tinggi dalam fase cair berarti memiiki waktu retensi yang lama.

Temperatur kolom. Temperatur tinggi menyebakan pergerakan molekulmolekul dalam fase gas; baik karena molekul-molekul lebih mudah menguap, atau karena energi atraksi yang tinggi cairan dan oleh karena itu tidak lama tertambatkan. Temperatur kolom yang tinggi mempersingkat waktu retensi untuk segala sesuatunya di dalam kolom. Untuk memberikan sampel dan kolom, tidak ada banyak yang bisa dikerjakan menggunakan titik didih senyawa atau kelarutannya dalam fase cair, tetapi anda dapat mempunyai pengatur temperatur. Semakin rendah temperatur kolom semakin baik pemisahan yang akan anda dapatkan, tetapi akan memakan waktu yang lama untuk mendapatkan senyawa karena kondensasi yang lama pada bagian awal kolom. Dengan kata lain, menggunakan temperatur tinggi, segala sesuatunya akan melalui kolom lebih cepat, tetapi pemisihannya kurang baik. Jika segala sesuatunya melalui kolom dalam waktu yang sangat singkat, tidak akan terdapat jarak antara puncak-puncak dalam kromatogram. Jawabannya dimulai dengan kolom dengan suhu yang rendah kemudian perlahan-lahan secara teratur temperaturnya dinaikkan. Pada awalnya, senyawa yang menghabiskan lebih banyak waktunya dalam fase gas akan melalui kolom secara cepat dan dapat dideteksi. Dengan adanya sedikit pertambahan temperatur akan memperjelas perlekatan ン Detektor Ada beberapa tipe detektor yang biasa digunakan. Detektor ionisasi nyala dijelaskan pada bagian bawah penjelasan ini, merupakan detektor yang umum dan lebih mudah untuk dijelaskan daripada detektor alternatif lainnya. Detektor ionisasi nyala senyawa. Peningkatan temperatur masih dapat lebih `melekatan` molekul-molekul fase diam melalui kolom.

Dalam mekanisme reaksi, pembakaran senyawa organik merupakan hal yang sangat kompleks. Selama proses, sejumlah ion-ion dan elektron-elektron dihasilkan dalam nyala. Kehadiran ion dan elektron dapat dideteksi. Seluruh detektor ditutup dalam oven yang lebih panas dibanding dengan temperatur kolom. Hal itu menghentikan kondensasi dalam detektor. Jika tidak terdapat senyawa organik datang dari kolom, anda hanya memiliki nyala hidrogen yang terbakar dalam air. Sekarang, anggaplah bahwa satu senyawa dalam campuran anda analisa mulai masuk ke dalam detektor. Ketika dibakar, itu akan menghasilkan sejumlah ion-ion dan elektron-elektron dalam nyala. Ion positif akan beratraksi pada katoda silinder. Ion-ion negatif dan elektron-elektron akan beratraksi pancarannya masing-masing yang mana merupakan anoda.Hal ini serupa dengan apa yang terjadi selama elektrolisis normal. Pada katoda, ion positif akan mendatangi elektron-elektron dari katoda dan menjadi netral. Pada anoda, beberapa elektron dalam nyala akan dipindahkan pada elektroda positif; ion-ion negatif akan memberikan elektron-elektronnya pada elektroda dan menjadi netral. Kehilangam elektron-elektron dari satu elektroda dan perolehan dari elektroda lain, akan menghasilkan aliran elektron-elektron dalam sirkuit eksternal dari anoda ke katoda. Dengan kata lain, anda akan memperoleh arus listrik.

Arus yang diperoleh tidak besar, tetapi dapat diperkuat. Jika senyawa-senyawa organik lebih banyak dalam nyala, maka akan banyak juga dihasilkan ion-ion, dan dengan demikian akan terjadi arus listrik yang lebih kuat. Ini adalah pendekatan yang beralasan, khususnya jka anda berbicara tentang senyawa-senyawa yang serupa, arus yang anda ukur sebanding dengan jumlah senyawa dalam nyala. Kekurangan utama dari detektor ini adalah pengrusakan setiap hasil yang keluar dari kolom sebagaimana yang terdeteksi. Jika anda akan mengrimkan hasil ke spektrometer massa, misalnya untuk analisa lanjut, anda tidak dapat menggunakan detektor tipe ini. Penerjemahan hasil dari detektor Hasil akan direkam sebagai urutan puncak-puncak; setiap puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor. Sepanjang anda mengontrol secara hati-hati kondisi dalam kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang tampak-tentu saja anda atau seseorang lain telah menganalisa senyawa murni dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

Area dibawah puncak sebanding dengan jumlah setiap senyawa yang telah melewati detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui komputer yang dihubungkan dengan monitor. Area yang akan diukur tampak sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar yang disederhanakan. Perlu dicatat bahwa tinggi puncak tidak merupakan masalah, tetapi total area dibawah puncak. Dalam beberapa contoh tertentu, bagian kiri gambar adalah puncak tertinggi dan memiliki area yang paling luas. Hal ini tidak selalu merupakan hal seharusnya..

Mungkin saja sejumlah besar satu senyawa dapat tampak, tetapi dapat terbukti dari kolom dalam jumlah relatif sedikit melalui jumlah yang lama. Pengukuran area selain tinggi puncak dapat dipergunakan dalam hal ini. Perangkaian kromatogram gas pada spektrometer massa Hal ini tidak dapat dillakukan menggunakan detektor ionisasi nyala, karena detektor dapat merusak senyawa yang melaluinya. Anggaplah anda menggunakan detektor yang tidak merusak. Senyawa, Ketika detektor menunjukkan puncak, beberapa diantaranya melalui detektor dan pada waktu itu dapat dibelokkan pada spektrometer massa. Hal ini akan memberikan pola fragmentasi yang dapat dibandingkan dengan data dasar senyawa yang telah diketahui sebelumnya pada komputer. Itu berarti bahwa identitas senyawasenyawa dalam jumlah besar dapat dihasilkan tanpa harus mengetahui waktu retensinya. 2. HPLC( Hight Performance Liquid Chromatography) HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat. HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponenkomponen dalam campuran. Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat peka. Ada dua fase HPLC: Fase normal HPLC Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.

Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom. Fase balik HPLC Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol. Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut. Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawasenyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom.Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom. Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC.Melihat seluruh proses

Diagram alir HPLC

Injeksi sampel Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan bagaimana mengetahui apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas (jika anda telah mempelajarinya). Waktu retensi Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada: • • • • Tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut) Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel) Komposisi yang tepat dari pelarut Temperatur pada kolom

Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika anda menggunakan waktu retensi sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa. Detektor

Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet. Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV. Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, anda sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut. Interpretasi output dari detektor Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masingmasing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

Anda juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuantitas dari senyawa yang dihasilkan. Mari beranggapan bahwa tertarik dalam senyawa tertentu, X. Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana). Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahu berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil. Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika anda mempunyai dua substansi yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y), dapatkah anda mengatakan jumlah relatifnya? Anda tidak dapat mengatakannya jika anda menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya. Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit

dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak yang kecil.

An HPLC. From left to right: A pumping device generating a gradient of two different solvents, a steel enforced column and an apparatus for measuring the absorbance.

Picture of an HPLC instrument

Gambar peralatan HPLC

DAFTAR PUSTAKA R.A.Day dan Underwood.2002. Analisis kimia kuantitatif. Jakarta: Erlangga Pecsok and LD Shields.1976. Modern Methods of Chemical Analysis.USA www.wikipedia.org , diakses 1 maret 2010 Http://www.edu2000.org/portal/index. diakses 1 maret 2010 http://www.oc-praktikum.de/id/arKromatografi (HPLC).diakses 10 maret 2010

http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromat.diakses 10 maret 2010

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->