MAKALAH MIKROBIOLOGI DAN PARASITOLOGI TEKNIK PENGECATAN GRAM DAN PENGECATAN GIEMSA

DISUSUN OLEH : ASTITI MASLIKHAHSAFAATI (10613228) JUDISTIRA M.ARSYAD (10613229) POPPY PRATIWI (10613230) SILVIA DWI DAMAYANTI (10613231) ETRY ANGRIANUR (10613233)

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI DAN PARASITOLOGI PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA YOGYAKARTA

PERCOBAAN II A. IDENTIFIKASI MIKROBA DENGAN TEKNIK PENGECATAN GRAM

TUJUAN 1. Mampu memahami teknik pengecatan gram. 2. Mampu melakukan pengamatan bakteri secara mikroskopis dengan melihat warna, bentuk dan susunan bakteri. DASAR TEORI Ada tiga macam prosedur pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan differensial dan pewarnaan khusus. Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam pewarna dan bertujuan mewarnai seluruh sel mikroorganisme sehingga bentuk seluler dan struktur dasarnya terlihat. Pewarnaan differensial menggunakan lebih dari satu pewarna dan memiliki reaksi berbeda untuk setiap bakteri, sehingga digunakan untuk membedakan bakteri. Pewarnaan differensial yang sering digunakan adalah pewarnaan gram. Pewarnaan gram ini mampu membedakan dua kelompok besar yaitu gram positif dan gram negatif. Perbedaan warna antara bakteri gram positif dan gram negative disebabkan oleh adanya perbedaan struktur pada dinding selnya. Dinding bakteri gram positif banyak mengandung peptidoglikan, sedangkan dinding bakteri gram negative banyak mengandung lipopolisakarida. Pewarnaan khusus digunakan untuk mewarnai dan mengisolasi bagian spesifik dari mikroorganisme, misalnya endospore, kapsul dan flagella(1). Salah satu alat yang paling ampuh dalam taksonomi mikroba adalah pewarnaan gram (Gram stain), yang dapat digunakan untuk memisahkan anggota-anggota domain bakteribakteri ke dalam dua kelompok berdasarkan perbedaan dinding selnya. Bakteri gram-positif memiliki dinding sel yang lebih sederhana, dengan jumlah peptidoglikan yang lebih sedikit dan secara struktural lebih kompleks. Membran bagian luar pada dinding sel gram-negatif mengandung lipopolisakarida, yaitu karbohidrat yang terikat dengan lipid(2). Diantara bakteri patogen, yang menyebabkan penyakit, spesies gram-negatif umumnya lebih berbahaya dibandingkan dengan spesies gram-positif. Lipopolisakarida yang terdapat pada dinding sel bakteri gram negatif sering bersifat toksik (racun), dan membarn bagian luar membantu melindungi bakteri patogen melawan sistem pertahanan inangnya. Lebih jauh, bakteri gram negatif umumnya lebih resisten terhadap antibiotik dibandingkan dengan bakteri gram positif karena membran bagian luar itu menghalangi masuknya obatobatan(2).

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar,gram positif dan gram negative,berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka.Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan gram.Bakteri jenis ini akan brwarna biru atau ungu dibawah mikroskop,sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah atau merah muda.Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri.Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan gram.Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol,sementara bakteri gram negative tidak.Pada uji pewarnaan gram,suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu,yang membuat semua bakteri gram negative menjadi bewarna merah atau merah

muda.Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdassarakan perbedaan struktur dinding sel mereka.Banyak spesies bakteri gram negative yang bersifat patogn,yang berarti mereka berbahaya bagi orgnisme inang.Sifat pathogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel gram negative terutama lapisan lipopolisakarida(3).

ALAT DAN BAHAN Alat : Ose bulat Tabung reaksi Kaca arloji Bunzen Pipet tetes Mikroskop

Bahan : Kultur bakteri Larutan NaCl Cat gram A, cat gram B, cat gram C dan cat gram D Oil imersi

CARA KERJA

1. Pembuatan preparat untuk pengecatan

Diambil gelas objek yang bersih dan steril

Dibebaskan dari lemak dengan dipanaskan diatas nyala api spiritus

Dengan ose steril, diambil sedikit satu koloni bakteri, diratakan pada gelas objek dan ditipiskan

Ose sesudah dipakai harus disterilkan kembali dengan cara dibakar pada nyala api sampai membara dan disterilkan kembali sebelum dipakai lagi

Preparat kemudian dikeringkan diatas nyala api spiritus sambil digoyangkan ( jarak preparat sampai api spiritus kira-kira 20 cm). Setelah kering, preparat siap di cat

2. Cara melakukan pengecatan gram

Preparat yang siap di cat, digenangi dengan cat gram a selama 1-3 menit, kemudian cat dibuang tanpa dicuci

Preparat ditetesi dengan cat gram b sampai warna cat tepat dihilangkan atau dilunturkan (30 detik)

Preparat digenangi dengan cat gram c selama 1 menit, setelah itu cat dibuang

Setelah pemberian cat gram c, digenangi dengan cat gram d selama 1-2 menit

Setelah itu preparat dicuci dan dikeringkan dalam udara kamar dan setelah itu diperiksa dibawah mikroskop dengan menggunakan perbesaran kuat (100 x oby)

DATA DAN HASIL 1. Media cair (broth), bakteri S. aureus

2. Media agar miring (slant), bakteri S. aureus

PEMBAHASAN Pada percobaan kali ini dilakukan identifikasi bakteri dengan teknik pengecatan gram. Tujuan dilakukannya percobaan ini adalah agar praktikan dapat memahami teknik pengecatan Gram serta mampu melakukan pengamatan bakteri secara mikroskopis dengan melihat warna, bentuk dan susunan bakteri. Teknik pewarnaan Gram merupakan suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu Gram positif dan Gram negatif. Metode ini dikembangkan oleh seorang ilmuwan Denmark, Hans Christian Gram.

Bakteri Gram positif merupakan bakteri yang mempertahankan zat warna violet sewaktu proses pewarnaan Gram karena memiliki dinding sel yang lebih sederhana dengan jumlah peptidoglikan yang relatif banyak. Bakteri Gram negatif merupakan bakteri yang tidak dapat mempertahankan zat warna violet sewaktu proses pewarnaan Gram tetapi akan tetap menahan zat warna merah sehingga memberikan warna yang berbeda dengan bakteri Gram positif. Dinding sel bakteri Gram negatif memiliki peptidoglikan yang lebih sedikit dan secara struktural lebih kompleks. Pada percobaan yang telah dilakukan, digunakan bakteri S. aureus dengan dua macam media, yaitu media cair dan media padat. Teknik pewarnaan menggunakan cat Gram A yang mengandung kristal violet yang berfungsi untuk memberi warna violet pada bakteri. Setelah diberi cat Gram A, bakteri direndam dalam cat Gram B yang mengandung iodin tanpa dicuci terlebih dahulu untuk meningkatkan intensitas warna yang diikat oleh bakteri. Kemudian bakteri dicuci dan direndam dengan cat Gram C yang mengandung alkohol untuk membersihkan zat warna yang sebelumnya terikat pada bakteri. Dan yang terakhir, bakteri direndam dalam cat Gram D yang mengandung safranin yang berwarna merah yang berfungsi sebagai zat warna pembanding. Jika safranin diganti dengan methylen blue maka hasil yang didapat akan bias karena warna antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif menjadi sama. Gelas objek yang telah ditempeli bakteri dan telah direndam dalam zat warna ditetesi minyak imersi dan diamati melalui mikroskop. Minyak imersi atau immersion oil berfungsi untuk memperkuat fungsi lensa imersi dalam memperjelas tampilan gambar pada pengamatan dengan perbesaran paling kuat. Dari percobaan didapati hasil bahwa bakteri S. aureus memberikan warna biru. Hal ini sesuai jika dibandingkan dengan literatur karena bakteri S. aureus merupakan bakteri Gram positif. Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat warna dasar, yaitu zat warna violet dan penambahan zat warna pembanding, seperti safranin yang berwarna merah, akan membuat warnanya menjadi biru.

DAFTAR PUSTAKA 1) Pratiwi,Sylvia.,T, 2008, Mikrobiologi Farmasi, Erlangga, Jakarta, 17-19 2) Campbell, Neil A.,jane B. Reece, Lawrence G. Mitchell, Biologi, Jakarta, Erlangga 2003,107-108 3) Karmana,Oman, 2006, Biologi, Grafindo Media Pratama, Bandung , 56

B. IDENTIFIKASI PLASMODIUM DENGAN TEKNIK PENGECATAN GIEMSA

TUJUAN 1. Mampu memahami teknik pengecatan giemsa 2. Mampu melakukan pengamatan plasmodium serta membedakan bentuk shizon, tropozoit dan gamet dari masing-masing jenis plasmodium DASAR TEORI Teknik pemeriksaan protozoa parasitik ini dibahas beberapa pemeriksaan yaitu : 1) metode pemeriksaan teridiri atas pemeriksaan secara natif dan modifikasi metode mertiolat-iodine-formaldehyde (MIF). 2) Metode pemeriksaan protozoa darah terdiri atas preparat atau sediaan darah apus dengan pewarnaan giemsa dan preparat (tetes) darah tebal dengan pewarnaan giemsa. 3) Pemeriksaan Trichomonas vaginalis. 4) Cara pembuatan preparat permanen untuk parasit darah,Trichomonas vaginalis dan ameba,dengan pewarnaan menurut method Heidenhein. 5) Pembuatan larutan-larutan(1). Penyakit malaria disebabkan oleh parasite malaria yaitu suatu protozoa darah yang termasuk genus plasmodium)yang dibawa oleh nyamuk anopheles.Ada empat spesies plasmodium penyebab malaria pada manusia,yaitu Plasmodium malaria yang plasmodium vivax,plasmodium spesies vivax malaria

falciparum,Plasmodium plasmodium menyebabkan

malariae,dan infeksi

ovale.Masing-masing berbeda-bedaPlasmodium menyebabkan

menyebabkan malaria

vivax/tertian,Plasmodium

falciparum

falciparum/tropika,Plasmodium malariae menyebabkan malaria malariae/quartana,dan Plasmodium ovale menyebabkan malaria ovale(2). Morfologinya : 1) Bentuk trofozoit.Tropozoit muda berbentuk cincin,inti merah,sitoplasma biru,di dalamnya terdapat vakuola,plasma yang berhadapan dengan inti menebal,letak plasmodium sentral di dalam eritrosit,biasanya hanya satu dalam satu

eritrosit.Trofozoit tua berrbentuk ameboid,sitoplasma tampak tidak teratur,khas tampak titik-titik Schuffner.

2) Bentuk Skizon,Skizon muda berbentuk bulat,mengisi hampir separuh eritrosit,plasma padat tidak bervakuola,inti sudah membelah,antara inti ada titik-titik cokelat disebut butir-butir hematin (pigmen malaria) dan terdapat juga titik-titik Schuffner.Inti Skizon tua membelah menjadi 12-24,tiap-tiap pembelahan inti diikuti pembelahan sitoplasma (12-24 buah merozoit) dan mengisi penuh eritrosit,ditengah-tengah terdapat pigmen malaria,dan tetap ada titik-titik Schuffner. 3) Bentuk gametosit,Mikrogametosit bentuknya bulat besar,;ebih kecil dari

mikrogametosit,inti besar pucat,tidak kompak (menyebar) dan terletak sentral,plasma tampak pucat kelabu sampai merah muda,pigmen malaria tersebar.Mikrogametosit berbentuk lonjong atau bulat,;lebih besar dari mikogametosit,mengisi hampir seluruh eritrosit,inti tampak kecil kompak (padat),letak eksentris,plasma tampak biru,pigmen malaria tersebar(3).

ALAT DAN BAHAN Alat : Mikroskop

Bahan : Apus darah Preparat

CARA KERJA Dibuat sediaan apus darah tipis pada sebuah objek gelas

Sediaan apus darah tipis digenangi denganmengalirgiemsa yang diencerkan Dibilas dengan air larutan aquades dengan perbandingan 1:4 (1 bagian giemsa dengan 4 bagian air)

Dikeringkan sisa air dengan cara diangin-anginkan beberapa saat

Ditunggu selama 15 menit

Diamati dibawah mikroskop dan dibedakan bentuk-bentuk shizon, tropozoit dan gamet pada masing-masing preparat

DATA DAN HASIL 1. Plasmodium falciparum

std. gametosit

tropozoit tua

2. Plasmodium vivax

gametosit

shizon gametosit

skizon

PEMBAHASAN Percobaan kali ini adalah percobaan untuk mengidentifikasi plasmodium dengan teknik pengecatan Giemsa. Tujuan dilakukannya percobaan ini adalah agar praktikan mampu memahami teknik pengecatan Giemsa serta mampu melakukan pengamatan plasmodium serta membedakan bentuk shizon, tropozoit dan gamet dari masing-masing jenis plasmodium.

Teknik pewarnaan Giemsa adalah teknik pewarnaan untuk pemeriksaan mikroskopis yang namanya diambil dari seorang peneliti malaria, Gustav Giemsa. Teknik pewarnaan ini digunakan untuk pemeriksaan sitogenetik dan untuk diagnosis histopatologis parasit malaria. Prinsip pewarnaan Giemsa adalah presipitasi hitam yang terbentuk dari penambahan larutan metilen biru dan eosin yang dilarutkan dalam metanol. Plasmodium yang digunakan pada percobaan ini ada dua macam yaitu Plasmodium falciparum dan Plasmodium vivax. Plasmodium falciparum merupakan plasmodium yang dapat menyebabkan penyakit malaria tropica. Infeksi oleh spesies ini menyebabkan parasitemia yang meningkat jauh lebih cepat dibandingkan dengan spesies lain. Sedagkan, Plasmodium vivax dapat menyebabkan malaria tertian benigna dan memiliki kecenderungan menginfeksi sel darah merah yang masih muda.

DAFTAR PUSTAKA 1) Karmana,Oman., 2006, Biologi, Grafindo Media Pratama, Bandung, 56 2) Natadisastra,Djaenudin., 2005, Parasitologi kedokteran, EGC buku kedokteran, Jakarta, 394 3) Prabowo,Arlan., 2006, Malaria mencegah dan mengatasinya, Puspa Swara, Bandung, 5