UJI TETRAZOLIUM DAN UJI DAYA HANTAR LISTRIK, SALAH SATU METODE UJI CEPAT PENDUGA MUTU BENIH

Oleh: Bambang Priyo Utomo, S.P. PBT Ahli Pertama Balai Besar Perbenihan Dan Proteksi Tanaman Perkebunan (BBP2TP) Surabaya

Vigor benih merupakan fokus bagi insan perbenihan. Benih yang vigor adalah produk teknologi, yang telah melalui upaya pemuliaan genetik dan pemurnian fisik sehingga diperoleh sebuah lot benih berisi individu-individu benih yang prima, memiliki tingkat kemurnian genetik yang tinggi, bersih penampilan fisik, sehat pertumbuhan dan homogen. Vigor benih jelas mengait berbagai fungsi insan benih yang bergerak di sektor hulu maupun hilir. Hasil peneltian menunjukkan bahwa keadaan benih pasca tanam di lapang dapat disimulasikan dalam bentuk model-model tertentu, sehingga dapat diketahui mutu benih dengan melakukan simulasi yang mendekati keadaan sebenarnya. Dari simulasi atau uji tersebut dapat pula diketahui tingkat vigor benih. Metode pendugaan mutu, khususnya mutu fisiologis dilakukan melalui metode

langsung dan tidak langsung. Metode langsung menggunakan indikator pertumbuhan kecambah; benih dikecambahkan pada kondisi ideal untuk berkecambah dan tumbuh, dilakukan di germinator, rumah kaca atau areal persemaian selama jangka waktu tertentu. Metode tidak langsung didasarkan pada proses metabolisme benih serta kondisi fisik benih disebut pula uji cepat viabilitas. Secara umum uji cepat memiliki dua tujuan (Willan, 1985), yaitu: (a) menentukan secara cepat kualitas benih suatu jenis yang berkecambah lambat atau menunjukkan dormansi di bawah perkecambahan normal (b) menentukan viabilitas potensial dari suatu kelompok benih. Sebagai langkah awal untuk menduga dengan cepat viablitas benih, yang sebelumnya dapat diketahui dengan melakukan pengecambahan maka dilakukan uji cepat dengan berbagai metode. Diantaranya yaitu Uji Tetrazolium dan Uji Daya Hantar Listrik 1. Uji Tetrazolium Uji tetrazolium adalah uji yang dalam pelaksanaannya menggunakan zat indikator berupa 2.3.5 Trifenil tetrazolium. Uji tetrazolium disebut juga uji biokhemis benih. Karena dengan uji ini akan diketahui terjadinya proses biokimiawi yang berlangsung dalam sel, khususnya dalam embrio benih. Uji tetrazolium juga disebut uji cepat, karena indikator pada uji ini adalah pola-pola pewarnaan pada embrio, bukan proses perkecambahan yang umumnya memerlukan waktu yang lebih lama dalam menentukan final count.

Klorida/bromida yang larut dalam air digunakan untuk mengindikasikan adanya sel-sel yang hidup. Bila indikator diimbibisi oleh benih kedalam sel-sel benih yang hidup dengan bantuan enzim dehidrogenase akan terjadi proses reduksi sehingga terbentuk zat trifenil formazan, endapan yang berwarna merah. Pada sel-sel yang mati tidak terjadi reduksi, sehingga warnanya tetap. Adanya pola-pola warna merah pada bagianbagian penting pada embrio benih mengindikasikan benih mampu menumbuhkan embrio menjadi kecambah yang normal. Kegunaan uji tetrazolium cukup banyak yakni: untuk mengetahui viabilitas benih yang segera akan ditanam, untuk mengetahui viabilitas benih dorman dan untuk mengetahui hidup atau matinya benih segar tidak tumbuh dalam pengujian daya berkecambah benih. Uji tetrazolium sebagai uji vigor bisa dilakukan, dengan cara membuat penilaian benih lebih ketat untuk katagori benih vigor diantara benih viabel. Faktor-faktor yang perlu diperhatikan dalam uji tetrazolium ialah : penyiapan benih yang akan diuji dengan menghitung jumlahnya, pelembaban benih untuk aktivasi enzim dan pelunakan jeringan benih, pembukaan jaringan benih untuk pewarnaan ( penusukan, pemotongan, pengupasan testa, pengeluaran embrio), penyiapan larutan tetrazolium, suhu dan lama perendaman, penilaian benih vigor tinggi, vigor rendah dan benih non viabel, ketelitian analis. Prinsip metode TZ adalah bahwa setiap sel hidup akan berwarna merah oleh reduksi dari suatu pewarnaan garam tetrazolium dan membentuk endapan formazan merah, sedangkan sel-sel mati akan berwarna putih. Enzim yang mendorong terjadinya proses ini adalah dehidrogenase yang berkaitan dengan respirasi (Byrd, 1988). Kelebihan metode TZ meliputi waktu pengujian yang singkat, sangat tepat diaplikasikan pada benih yang mengalami dormansi serta benih yang mengalami pemasakan lanjutan (after ripening), tingkat ketelitian tinggi, sedangkan kelemahannya memerlukan keahlian dan pelatihan yang intensif, bersifat laboratoris, tidak dapat mendeteksi kerusakan akibat fungi atau mikroba lainnya dan bersifat merusak. Metode Uji Tetrazolium (Sumber:Panduan Praktikum Ilmu dan Teknologi Benih IPB, 2011) Benih dilembabkan selama 1 malam. Belah bagian embrio untuk mempercepat masuknya larutan tetrazolium ke dalam benih. Rendam benih tersebut dengan larutan Tetrazolium secukupnya sampai benih terendam seluruhnya. dipakai suhu 40oC selama 1 jam Evaluasi/Pengamatan Untuk mempercepat proses pewarnaan bisa

Gambar 1. Uji Benih dengan tetrazolium

Tabel 1. Pola Pewarnaan Embrio Benih Benih Bisa Tumbuh

Seluruh cemerlang Bagian berwarna Bagian dari ujung skutelum tidak Bagian tengah dari skutelum dan bagian dari tempat pertumbuhan akar seminal tidak terjadi pewarnaan. Plumula dan radikula tidak berwarna Bagian bawah plumula, radikula dan skutelum tidak berwarna Pewarnaan embrio merah muda yang sangat redup dari ujung skutelum tidak embrio berwarna merah

Benih Tidak Bisa Tumbuh

Bagian seminal dari akar tidak ada pewarnaan Plumula tidak ada pewarnaan

berwarna dan bagian dari radikula yang tidak kritis juga tidak berwarna

2. Uji Daya Hantar Listrik Pengukuran konduktivitas (daya hantar) listrik didasari pemikiran bahwa benih yang bermutu rendah akan membocorkan bahan-bahan yang dikandungnya lebih banyak daripada benih yang bermutu lebih baik. Kebocoran pada membran sel juga merupakan tempat kerusakan yang utama dari peristiwa deteriorasi benih. Bahan-bahan yang dikeluarkan benih pada peristiwa tersebut antara lain K, Cl, gula, dan asam amino. Nilai daya hantar yang tinggi menunjukkan kebocoran metabolit benih yang tinggi, yang berarti benih tersebut memiliki kualitas yang telah menurun. Benih dengan vigor rendah

telah diketahui mengalami penurunan integritas membran sebagai hasil dari deteriorasi masa penyimpanan dan kerusakan mekanik. Selama imbibisi, benih yang memiliki struktur membran lemah melepaskan koloidal sitoplasmik ke medium imbibisi. Koloidal dengan sifat elektrolitik membawa sebuah muatan elektrik yang dapat dideteksi dengan conduktivity meter. Keuntungan menggunakan uji DHL ini disebabkan karena cepat, tepat, tidak mahal, dan prosedurnya sederhana. Namun, kadar air awal dan ukuran benih dapat mempengaruhi rata-rata kebocoran benih. Apalagi, perlakuan benih dengan antibiotik mungkin mempengaruhi pengukuran konduktivitas, mengharuskan antibiotik tersebut dihilangkan sebelum penentuan konduktivitas. Salah satu kelemahan dari metode DHL adalah hasil akhir yang ditunjukkan adalah ratarata dari semua benih yang diuji. Padahal secara anatomis benih dalam satu lot akan memiliki perbedaan dari tiap individunya. Disamping struktur kulit benih yang berbeda, terjadi pula perbedaan kemunduran plasmalema akibat dari tingkat deteriorasi yang berbeda antar individu benih. Metode Uji DHL (Sumber: Panduan Praktikum Ilmu Dan Teknologi Benih IPB, 2011) Tiga lot benih 50 butir, setiap ulangan ditimbang. Kemudian dimasukkan kedalam glassjar dan ditambahkan 250 ml air bebas ion. Buat 3 ulangan juga untuk glassjar yang hanya berisi air untuk blanko. Tutup glassjar untuk mencegah kontaminasi dan letakkan pada suhu konstan 202 0C selama 24 jam. Siapkan konduktometer yang telah dibersihkan dan dilakukan pemanasan secara manual. Air bebas ion sebanyak 400-600 ml disiapkan dalam glassjar untuk membilas dip cell pada setiap pengukuran. Kalibrasi alat selalu dilakukan menggunakan larutan KCl 0.01 M (pembacaan larutan ini harus menunjukkan nilai antara 1273-1278 S.cm 1). Setelah 24 jam, glassjar berisi benih diguncang selama 10-15 detik untuk memastikan pencampuran yang merata dengan larutan rendaman. Air rendaman benih selanjutnya dipindahkan kedalam glassjar lain yang bersih dengan menuangkan benih dan air menggunakan saringan. Masukkan dip cell ke dalam air rendaman serta ukur/baca nilai konduktivitasnya. Setiap kali pengukuran dip cell harus selalu dibilas dan dikeringkan. Penghitungan konduktivitas per gram benih untuk masing-masing ulangan menggunakan rumus sebagai berikut : Konduktivitas (S.cm 1g-1) = Konduktivitas sampel-blanko (S.cm -1) Berat benih per ulangan (g)

Gambar 1. Konduktometer

Penutup Uji Tetrazolium dan Uji Daya Hantar Llistrik merupakan uji cepat untuk menduga mutu benih. Uji tetrazolium menggunakan teknik pewarnaan untuk mendeteksi sel yang hidup maupun yang mati, sehingga dengan cepat akan diketahui tingkat vigor benih yang diuji. Benih yang vigor dicirikan struktur tumbuh benih yang meliputi plumula, radikula, kotiledon dan embrio berwarna merah cemerlang atau merah. Sedangkan benih yang tidak vigor tidak mengalami pewarnaan pada struktur tumbuhnya. Uji daya hantar listrik (DHL) akan menunjukkan benih yang bervigor tinggi mempunyai integritas membran yang baik, sehingga akan menunjukkan nilai kebocoran membran (nilai DHL) yang rendah. Sebaliknya benih yang bervigor rendah akan menunjukkan nilai DHL yang tinggi. Sejak tahun 1996 ISTA telah menetapkan uji DHL sebagai uji vigor yang divalidasi untuk benih Pisum sativum, dan selanjutnya ISTA (2010) telah melakukan validasi untuk digunakan pada benih Phaseolus vulgaris. Melihat perkembangan penggunaan metode uji cepat ini maka teknik uji cepat ini sangat berpeluang untuk menjadi metode pengujian yang valid di laboratorium penguji benih tanaman, termasuk benih tanaman perkebunan.