UBI JALAR UNGU SEBAGAI STIMULATOR PENINGKATAN KEMAMPUAN ANGIOGENESIS PADA TIKUS YANG DIBERI LUKA

HALAMAN JUDUL Proposal Penelitian

diajukan guna melengkapi tugas akhir dan memenuhi salah satu syarat untuk menyelesaikan pendidikan di Fakultas Kedokteran (S1) dan mencapai gelar Sarjana Kedokteran Oleh Achmad Hariyanto NIM 092010101062

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS JEMBER 2012

1.1 Latar Belakang Diabetes melitus (DM) merupakan penyebab terpenting terjadinya penyakit vaskular dan berhubungan dengan peningkatan resiko aterosklerosis. Secara klinis, tingkat keparahan dari penyakit oklusi vaskular pada diabetes sebagian karena kegagalan perkembangan pembuluh darah kolateral. Ulkus kaki diabetes merupakan komplikasi DM yang berkaitan dengan morbiditas akibat dari komplikasi makrovaskuler dan mikrovaskuler. Ulkus kaki diabetes diperkirakan terjadi kurang lebih 15% dari semua pasien dengan diabetes, dengan resiko terjadinya kekambuhan dalam 5 tahun sebesar 70% dan 84% penyebab amputasi kaki penderita diabetes (Amos, et al., 1997, ADA 2000). Komplikasi epitelialisasi, DM menyebabkan kolagen munculnya proses gangguan mikroangiopati esensial lain pada dan

makroangiopati serta neuropati, yang menyebabkan gangguan pada proses angiogenesis, deposisi dan beberapa tahapan penyembuhan luka. Pada ulkus diabetes terdapat gambaran fungsi dasar sel yang mengalami kegagalan wound healing. Penyembuhan luka pada diabetes menunjukkan terhentinya proses perbaikan luka dan penurunan kekuatan regangan dari penyembuhan luka (Brownlee, 2005). Kegagalan penyembuhan ulkus diabetes terjadi akibat terganggunya sejumlah proses dalam tahapan penyembuhan luka yaitu inflamasi, proliferasi sel, migrasi sel, permeabilitas vaskuler dan angiogenesis akibat defisiensi growth factor dan sitokin proangiogenik, deposisi matriks dan remodeling jaringan (Sushil, et al., 2000). Hal ini akan mempengaruhi proses angiogenesis penyembuhan luka pada kasus diabetes. Angiogenesis memegang peranan penting dalam regenerasi jaringan, perbaikan jaringan pasca iskemia pada infark dan stroke, patogenesis kanker, rheumatoid arthritis, serta penyakit mikrovaskuler diabetik. Proses angiogenesis dikendalikan oleh growth factor angiogenik seperti VEGF, TGF, bFGF, PDGF dan beberapa growth factor lainnya (Ding, 2000). Dari berbagai growth factor proangiogenik, VEGF memegang peranan paling dominan. VEGF merupakan growth factor penting yang terlibat dalam pemacuan angiogenesis. VEGF mampu menstimulasi proliferasi dan migrasi sel endotel pada pembentukan tabung pembuluh darah. Pada mencit diabetik, aplikasi topikal VEGF menunjukkan progresi pada

penyembuhan luka dan berperan dalam mobilisasi serta perekrutan progenitor vaskuler (Ding, 2000; Thum, et al., 2007). Penurunan aktivitas VEGF pada ulkus diabetik, mengakibatkan terjadinya abnormalitas angiogenesis (Thum, et al., 2007). Di Indonesia, konsumsi ubi jalar di masyarakat cukup besar, 89% produksi ubi jalar digunakan sebagai bahan pangan dengan tingkat konsumsi 7,9 kg/kapita/tahun, sedangkan sisanya dimanfaatkan untuk bahan baku industri, terutama saus, dan pakan ternak. Penelitian sebelumnya menunjukan bahwa umbi jalar ungu mengandung antosianin dengan kadar yang cukup tinggi, yaitu 110-210 mg per 100 gram (Suprapta, 2004). Senyawa antosianin yang terdapat pada ubi jalar diketahui berfungsi sebagai antioksidan dan antihiperglisemik. Ubi jalar ungu dengan efek antioksidannya menghalangi reactive oxygen spesies (ROS) yang merusak DNA dan menyebabkan mutasi (Maheswari, 2000 ;Utami, 2003). Penelitian tentang efektifitas ubi jalar dalam meningkatkan kemampuan angiogenesis belum pernah dilakukan. Karena itu penelitian lebih lanjut untuk mengetahui efektifitas ubi jalar pada penyembuhan ulkus diabetik sangat diperlukan, sehingga akan dapat menambah nilai mutu dari ubi jalar ungu sebagai nutrisi yang kaya antioksidan. Dengan demikian pada penelitian ini akan dilakukan pengujian terhadap efek langsung dari ubi jalar ungu sebagai stimulator peningkatan kemampuan angiogenesis pada tikus model ulkus diabetes. Berdasarkan kemungkinan keterkaitan diabetes melitus dengan potensi ubi jalar ungu sebagai antioksidan dan pemicu angiogenesis serta kemudahan untuk didapatkan dan keamanan yang lebih tinggi, maka penelitian ini perlu dilakukan.

1.2. Rumusan Masalah: 1. Bagaimana pengaruh ubi jalar ungu terhadap kadar gula darah tikus model ulkus diabetes? 2. Bagaimana peranan ubi jalar ungu sebagai stimulator peningkatan rkspresi VEGF pada tikus model ulkus diabetes? 1.3. Tujuan dan Manfaat :

Tujuan: 1. Mengetahui pengaruh ubi jalar ungu terhadap kadar gula darah pada tikus model ulkus diabetes. 2. Mengetahui peranan ubi jalar ungu sebagai stimulator peningkatan ekspresi pada tikus model ulkus diabetes. Manfaat: 1. dapat mengungkap manfaat ubi jalar ungu bagi kesehatan terutama dalam meningkatkan kemampuan angiogenesis pada kasus ulkus diabetik sehingga ubi jalar ini mempunyai nilai tambah disamping sebagai bahan pokok makanan. 2. dapat memberikan pengetahuan kepada masyarakat tentang manfaat konsumsi ubi jalar ungu sehingga dapat memberikan dampak terhadap frekuensi konsumsi ubi jalar ungu. 3. dapat memberikan dorongan kepada para petani ubi jalar untuk meningkatkan mutu varietas ubi jalar.

II. Tinjauan Pustaka/Kemajuan yang telah dicapai dan Studi Pendahuluan yang telah dilaksanakan 2.1 Studi Pustaka 2.1.1 Diabetes dan Komplikasi Diabetes Mellitus Diabetes adalah penyakit kronis yang disebabkan karena kelainan metabolik oleh karena tingginya kadar gula darah (glukosa) di dalam darah. Gula darah di kontrol oleh insulin, suatu hormon yang dihasilkan oleh pankreas, dengan adanya insulin memungkinkan sel untuk menyerap gula di dalam darah, defisiensi insulin bisa diakibatkan oleh kekurangan sekresi insulin dan hambatan kerja insulin pada reseptornya. Kadar gula darah yang tinggi dapat mengakibatkan kerusakan organ dalam tubuh (ADA 2000; Suarez, et al., 2007). Hiperglikemia akan menimbulkan ROS (Reactive Oxygen Species) yang akan memicu komplikasi mikrovaskuler dan makrovaskuler, ROS terjadi melalui empat mekanisme utama akibat hiperglikemi dan peningkatan yaitu, peningkatan refluk polyol pathway; peningkatan pembentukan kinase C (PKC); hexosamine pathway. Pada konsentrasi rendah ROS bermanfaat untuk dari sel dan mikroorganisme. Peningkatan kadar ROS akan advanced glycation end product (AGEs); pengaktifan protein isoform stimulasi pertumbuhan

mempengaruhi aktivasi signaling pathway dan memicu apoptosis. Kenaikan ROS yang sangat tinggi akan mengakibatkan kematian sel melalui mekanisme nekrosis (Bonnefont-Rousselot, 2002; McAnuff, 2003).

2.1.2 Patogenesis Ulkus Diabetes Patogenesis ulkus diabetes sebagai akibat komplikasi mikrovaskular dan makrovaskuler sangat kompleks. Peran komplikasi mikrovaskuler dan makrovaskuler diabetes adalah timbulnya neuropati dan gangguan vaskuler pada ulkus kaki berupa arteriosklerosis.

Kombinasi peran dari neuropati (sensori, autonom, motorik), trauma oleh karena tekanan plantar yang meningkat dan deformitas sendi, gangguan vaskuler perifer, infeksi dan

kegagalan penyembuhan luka akan menimbulkan ulkus kaki diabetes (Singh, et al., 2001, Suarez, et al., 2007). Patofisiologi dan biomekanisme ulkus kaki diabetik pada umumnya disebabkan oleh kombinasi dari insufisiensi arteri pada tungkai bawah, neuropati tungkai bawah yang memicu terjadinya perubahan bentuk kaki dan juga pembentukan kalus oleh karena hypohidrosis atau anhidrosis. Abnormalitas stress biomekanik pada kaki lebih lanjut akan menjadi faktor yang berperan pada timbulnya ulkus kaki diabetes dan adanya trauma lokal. Dari 20 % pasien dengan ulkus kaki diabetik diakibatkan oleh aliran darah arteri yang tidak adekuat, 50% mempunyai diabetik neuropati, dan 30 % ditimbulkan oleh keduanya (Amos, 1997; Global Burden, 2000). Gangguan penyebuhan ulkus kaki diabetes disebabkan oleh sejumlah faktor, dan diperkirakan melibatkan kombinasi dari beberapa faktor tersebut. Gambaran faktor seluler yang terlibat pada lambatnya penutupan luka antara lain, lemahnya kontraksi yang kemungkinan akibat gangguan pada fenotip miofibroblas, efek pada granulosit, kerusakan kemotaksis yang berkaitan langsung dengan sintesis kolagen, efek pada sel darah merah, kerusakan kontrol apoptosis sel. Faktor seluler tidak hanya satu-satunya faktor yang bertanggung jawab untuk lemahnya healing ulkus kaki diabetes. Faktor lain yang juga terlibat adalah perubahan dalam metabolisme karbohidrat, lemak dan protein yang dihasilkan dari defisiensi atau tidak adanya insulin, dimana hiperglikemia memulai pada glikasi nonenzimatik (Hussain, 2002).

2.1.3 Peranan Angiogenesis pada Penyembuhan Luka Diabetes Angiogenesis merupakan proses perkembangan kapiler baru dari pembuluh darah sebelumnya, yang memfasilitasi proses fisiologi perkembangan embrio, reproduksi wanita dan penyembuhan luka. Proses angiogenesis merupakan mekanisme yang kompleks, yang terdiri dari degradasi enzimatik pada membran dasar, pergerakan endotel vaskuler kedalam ruang perivaskuler, proliferasi dan pencocokan pada bentuk struktur tabung vaskuler serta pembentukan pembuluh darah baru. Dalam proses angiogenesis distimulasi oleh beberapa faktor antara lain bFGF, VEGF, TNF, dan PDGF. Disamping itu

terdapat inhibitor endogen seperti trombospondin, cartilage derived inhibitor, dan tissue inhibitor dari metalloprotease in vivo (Krankel, et al., 2005). Dalam proses angiogenesis beberapa molekul pro angiogenik yang terlibat antara lain VEGF, FGF dan angiopoietin serta beberapa molekul anti angiogenik seperti platelet factor-4, angiostatin, endostatin dan vasostatin menjadi target dari aplikasi klinik untuk beberapa patologi penyakit tertentu yang terkait pembentukan pembuluh darah baru. Pada beberapa stadium perkembangan seperti pada perkembangan embrio, wound healing dan siklus menstruasi, angiogenesis diperlukan untuk suplai oksigen dan nutrient dan juga pemindahan produk sisa metabolisme. Angiogenesis merupakan proses pembentukan pembuluh darah baru dari pre-existing vasculature, yang memegang peranan penting dalam regenerasi jaringan, perbaikan jaringan post iskemia pada infark dan stroke, patogenesis kanker, Rheumatoid Arthritis serta penyakit mikrovaskuler diabetik (Evans, 2003). 2.1.4 Growth factor Proangiogenik dan Peranannya dalam Penyembuhan Luka Diabetes 2.1.4.1 Vascular Endothelial Growth factor (VEGF) Famili Vascular endothelial growth factor (VEGF) memiliki tujuh anggota antara lain VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F dan placental growth factor (PlGF), semuanya VEGF umumnya memiliki domain 8 area yang dikarakteristik oleh residu sistein. VEGF-A adalah molekul primer yang terlibat didalam angiogenesis dan vasculogenesis serta menyebabkan proliferation, sprouting, migrasi dan tube formation di sel endotel. VEGF disekresi oleh berbagai tipe sel berbeda seperti neutrofil, makrofag yang teraktivasi, keratinosit dan fibroblas. Ekspresi VEGF diinduksi kuat oleh kondisi hipoksia melalui transcription factor hypoxia inducible factor-1. Ekspresi VEGF diinduksi secara umum oleh growth factor lain serta sitokin seperti epidermal growth factor, TGF-, keratinocyte growth factor, IGF-I, FGF, PDGF, TNF-, IL-1B and IL-6. VEGF diketahui sebagai inducer penting proses angiogenesis selama penyembuhan luka dan terjadi gangguan pada penyembuhan luka diabetik. Aplikasi topikal VEGF memulai penutupan luka pada model hewan coba yang mengalami kegagalan penyembuhan luka. Pada mencit, perlakuan dengan inhibitor angiogenesis endostatin menunjukkan lemahnya Penyembuhan luka, tetapi kondisi tersebut

menjadi terbalik ketika dilakukan terapi topikal dengan VEGF. Pada mencit diabetik, aplikasi topikal VEGF proses menunjukkan penyembuhan akselerasi dengan perbaikan luka kulit serta ulkus diabetes melibatkan sejumlah aspek. memobilisasi dan merekrut progenitor vaskuler (Rehman, et al., 2003). Kegagalan Kegagalan angiogenesis luka diketahui akan melemahkan penyembuhan luka.VEGF-C memacu angiogenesis dan limpangiogenesis di daerah luka secara signifikan dibandingkan dengan kelompok tanpa VEGF-C. VEGF-C juga merekrut klinik sel dari inflamasi dan perfusi darah beberapa di proses mengekspresikan VEGFR-3. Kepentingan secara

Penyembuhan luka jaringan pada pasien diabetes adalah bukti bahwa terjadi iskemia lokal dan edema yang menghambat pengantaran suplai oksigen dan nutrien pada jaringan luka tersebut, menyebabkan kegagalan penyembuhan luka. Ketidakcukupan perfusi darah yang berpasangan dengan kegagalan angiogenesis menyebabkan komplikasi perbaikan jaringan di diabetes. Inflamasi diperlukan dalam proses penyembuhan luka, tetapi proses ini menjadi abnormal pada ulkus diabetes. Luka diabetik ditandai dengan kegagalan fungsi sel inflamasi, penurunan sekresi sitokin dan growth factor, dan terlalu lamanya fase inflamasi. Lingkungan mikro yang terlalu proteolitik akan memulai penurunan aktivitas VEGF di luka diabetik (Thum, et al., 2007). 2.1.6 Peran Ubi Jalar Ungu pada Penyembuhan Luka Diabetes Ubi jalar merupakan jenis ubi yang cukup populer di Indonesia. Senyawa antosianin yang terdapat pada ubi jalar berfungsi sebagai antioksidan dan penangkap radikal bebas, sehingga berperan dalam mencegah terjadinya penuaan, kanker, dan penyakit degeneratif seperti arteriosklerosis. Selain itu, antosianin juga memiliki kemampuan sebagai antimutagenik dan antikarsinogenik terhadap mutagen dan karsinogen yang terdapat pada bahan pangan dan produk olahannya, mencegah gangguan fungsi hati, antihipertensi, dan menurunkan kadar gula darah (antihiperglisemik) (Dalimartha, 2004). Antioksidan diketahui dapat mencegah dan menangkal terjadinya radikal bebas. Hiperglikemia merupakan kondisi yang potensial untuk terbentuknya radikal bebas. Secara umum antioksidan dibagi menjadi 2 golongan yaitu antioksidan enzimatik dan non enzimatik. Beberapa kelompok antioksidan enzimatik antara lain superoxide dismutase, catalase dan glutathion peroxidase. Sedangkan antioksidan non enzimatik meliputi vitamin C, vitamin E, dan

beta karoten (Utami, 2003; Dalimartha, 2004). Selain vitamin C dan vitamin E, beberapa flavonoid yang terdapat pada tumbuh-tumbuhan terbukti berkhasiat antioksidan (Miller, 1996). Salah satu komponen flavonoid dari tumbuh-tumbuhan yang dapat berfungsi sebagai antioksidan adalah zat warna alami yang disebut antosianin. Patomekanisme komplikasi mikrovaskuler dan makrovaskuler pada diabetes terjadi akibat peningkatan kadar ROS (Reactive Oxygen Species), pada konsentrasi rendah ROS bermanfaat untuk stimulasi pertumbuhan dari sel. Akan tetapi peningkatan kadar ROS yang berlebihan akan mempengaruhi aktivasi jalur sinyal transduksi intraseluler dan memicu apoptosis. Hal ini akan berdampak pada kegagalan neovaskularisasi di jaringan luka. Senyawa antosianin yang terdapat dalam ubi jalar ungu berperan sebagai antioksidan yang akan memutus rantai radikal bebas sehingga proses apoptosis sel dapat dicegah.

2.2 Kemajuan yang telah dicapai dan Studi Pendahuluan yang telah dilaksanakan (ROAD MAP PENELITIAN) Pada penelitian ini akan dilakukan pengujian ubi jalar ungu secara in vivo pada tikus model ulkus diabetes. Penelitian yang pernah kami lakukan adalah Optimalisasi pembuatan tikus model diabetes mellitus. Road map yang akan kami lakukan adalah sebagai berikut: 1. Pembuatan tikus model ulcus diabetik yang diinduksi alloxan monohidrat. 2. Pemberian ekstrak ubi jalar ungu pada tikus model ulcus diabetik yang diinduksi alloxan monohidrat 3. Pengukuran kadar glukosa darah & kemampuan angiogenesis/VEGF pada tikus model ulcus diabetik 4. Analisis data

BAB III. METODE PENELITIAN

3.1 DISAIN PENELITIAN Penelitian ini bersifat eksperimental secara in vivo menggunakan tikus putih (Rattus norvegicus strain Wistar) sebagai model. Kriteria tikus yang digunakan sebagai model: Tikus putih wistar jantan, untuk menghindari pengaruh hormone (estrogen) Tikus dewasa, yaitu berumur 8-12 minggu Berat badan kurang lebih antara 100 - 250 gr. Jumlah tikus yang digunakan sebagai sample adalah 30 ekor yang terbagi dalam 5 kelompok, dimana tiap kelompok terdiri dari 6 ekor. Kelompok 1: kontrol negatif (tanpa pemberian ekstrak ubi jalar ungu), kelompok 2: kontrol positif (ulkus diabetik tanpa pemberian ekstrak ubi jalar ungu), kelompok 3: tikus ulkus diabetik dengan pemberian ekstrak ubi jalar ungu 0,2 mg/hari/kg BB, kelompok 4: tikus ulkus diabetik dengan pemberian ekstrak ubi jalar ungu 0,5 mg/hari/kg BB, dan kelompok 5: tikus ulkus diabetik dengan pemberian ekstrak ubi jalar ungu 0,8 mg/hari/kg BB. Untuk memperoleh variabilitas dari tikus yang digunakan sebagai sample penelitian, maka tikus pada tiap kelompok diberi kesempatan untuk terpilih sebagai sample dengan cara randomisasi.

3.2 ALAT DAN BAHAN PENELITIAN Bahan makanan tikus (BR-1), ekstrak ubi jalar ungu, alloxan monohidrat, antibody (sENDO) CD133; antibody anti rat VEGF (Sigma), phosphate-buffered saline (PBS), eter timbangan, neraca analitik, waskom, pengaduk, hand scone, gelas ukur, penggiling pakan, nampan, kandang tikus, sonde, dan seperangkat alat bedah minor.

3.3 PROSEDUR PENELITIAN 1. Persiapan Kandang (Dilakukan di Lab. Farmakologi Fak. Kedokteran Univ. Jember) - Menyiapkan rak besi untuk penempatan kandang tikus - Menyiapkan kandang dari kotak plastik dengan tutup terbuat dari ram kawat, dan didalamnya diberi sekam - Menyiapkan tempat minum tikus

2. Persiapan Hewan Coba Seleksi hewan yang akan digunakan sebagai model sesuai kriteria yang telah ditetapkan, dalam hal ini tikus putih (Rattus Norvegicus strain Wistar) Dilakukan adaptasi setelah tikus diseleksi, yaitu tikus dimasukkan dalam kandang yang sudah disiapkan dengan diberi pakan biasa dan minum selama 3 hari.

1. Induksi alloxan monohidrat dan Pembuatan Luka Diabetik Metode pembuatan tikus model diabetites dilakukan dengan menginduksi yang diinjeksikan secara intravena . Digunakan dosis 75 mg/kg BB sebanyak 1 Tikus dinyatakan diabetes bila telah mempunyai kadar glukosa lebih dari 110 mg/dl. Untuk pembuatan luka tikus kemudian dianestesi selama sebelum percobaan pembuatan luka. Proses pembedahan dikondisikan dibawah keadaan steril menggunakan anestesi ketamine (10 mg/kg body weight). Tikus dianestesi secara intravena dengan 1 ml ketamine hydrochloride (10 mg/kg body weight) dan bulu dicukur pada kedua sisi dengan pencukur elektrik. Untuk area luka dibuat dengan membuat garis luar pada bagian punggung tikus percobaan dengan methylene blue menggunakan sebuah penanda/pola berbentuk lingkaran. Diameter luka () dibuat dengan ukuran 2.5 cm dan kedalaman 0.2 cm dari permukaan dermal dengan menggunakan pinset, pisau bedah nomor 11, dan gunting ujung runcing. Luka dibiarkan tetap terbuka selama

penelitian dan dikompres dengan NaCl 0,9% (Ika, dkk, 2005). Potongan kulit dengan diameter luka () dibuat dengan ukuran 2.5 cm dan kedalaman 0.2 cm digunakan untuk sediaan pemeriksaan imunohistologi (Bancroft, 2002).

2. Perlakuan Ekstrak Ubi Jalar Ungu Ekstrak ubi jalar segar dibuat dengan mencuci dan mengupas ubi jalar ungu sampai bersih. Dalam 100 gr ubi jalar kemudian ditambahkan 1 liter aquades dan dihomogenisasi dengan blender selama 5 menit. Homogenat lalu disaring menggunakan 3 lapis kain kasa dan dipanaskan pada suhu mendidih selama 45 menit. Ekstrak kemudian didinginkan dan siap digunakan untuk penelitian.

3. 4.

Pengukuran Kadar Gula Darah Tikus Evaluasi VEGF menggunakan Imonohistokimia Jaringan luka difiksasi dengan formalin kemudian dideparafinisasi untuk dibuat preparat.

Jaringan dicuci dengan PBS-T 3 x 5 menit. Jaringan ditetesi dengan 0,1 % Triton-X 100 dan diinkubasi selama 5 menit. Sel dicuci dengan PBS-T 3 x 5 menit. Jaringan ditetesi dengan 3% H2O2 dan diinkubasi selama 20 menit. Jaringan dicuci dengan PBS-T 3 x 5 menit. Jaringan dibloking dengan 5% FBS selama 30 menit selama overnight pada suhu 4oC. Sel dicuci dengan PBS-T 3 x 5 menit. Sel ditetesi dengan first antibody yaitu Rabbit Anti-PI3-K Polyclonal Antibody (Sigma). Jaringan dicuci dengan PBS-T 3 x5 menit. Jaringan diberi dengan second antibody IgG Biotin dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 4 oC. Jaringan dicuci dengan PBS-T 3 x 5 menit, inkubasi dengan Streptavidine Peroxidase selama 30 menit suhu ruang. Jaringan dicuci dengan buffer dan inkubasi dengan kromogen DAB 10 menit. Jaringan kemudian dicuci dengan aquades dan counterstain, selanjutnya jaringan diamati secepatnya menggunakan mikroskop.

Analisis Data. Data disajikan dalam meanSD. Untuk mengetahui perbedaan dan interaksi antar kelompok perlakuan digunakan analisis One way Anova SPSS versi 14 dan korelasi Pearson. Sedangkan analisis jalur menggunakan Path analysis.