ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTITATIF VITAMIN A, D dan C

DISUSUN OLEH : 1. 2. 3. 4. 5. 6. MIKE TOBING YULIANA MANIK RIZKA SURYA PERMATA MERY GULTOM PALUPI DYAH ARUMSARI PUSPITA RINI (J2C006034) (J2C007055) (J2C009011) (J2C009027) (J2C009040) (J2C009057)

JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS DIPONEGORO 2011

BAB I PENDAHULUAN

I. Latar Belakang Vitamin merupakan suatu molekul organik yang sangat diperlukan tubuh untuk proses metabolisme,pertumbuhan yang normal,transportasi oksigen dan anti oksidan. Vitamin membantu tubuh menggunakan karbohidrat, protein, dan lemak. Vitamin-vitamin tidak dapat dibuat oleh tubuh manusia dalam jumlah yang cukup,oleh karena itu harus diperoleh dari bahan pangan yang

dikonsumsi. Vitamin pada umumnya dapat dikelompokkan ke dalam 2 kelompok yaitu vitamin yang larut dalm lemak seperti, vitamin A,D,E,dan vitamin K ; serta vitamin yang larut dalam air seperti, vitamin B dan vitamin C. Sejak vitamin pertama kali diteliti pada tahun 1897 karena adanya penyakit beri-beri,sekarang ini semakin banyak dilakukan analisa terhadap vitamin,baik analisa kualitatif maupun analisa kuantitatif pada vitamin.

II. Rumusan Masalah Pentingnya vitamin dalam melangsungkan pertumbuhan normal serta memelihara kesehatan pada tubuh makhluk hidup, namun kebanyakan vitamin tidak dapat disintesis oleh tubuh maka banyak dilakukan analisa terhadap vitamin, sehingga dari uraian tersebut timbul masalah sebagai berikut, 2.1.Bagaimana analisa kualitatif pada vitamin ? 2.2 Bagaimana analisa kuantitatif pada vitamin?

III. Pembatasan Masalah Dari rumusan masalah yang telah disebutkan diatas,dapat dibatasi suatu masalah dalam pembahasan,Bagaimana analisa kualitatif dan kuantitatif pada vitamin khususnya viatamin A,B,dan vitamin C?

IV. Tujuan Penulisan Tujuan dari penulisan tulisan ilmiah ini adalah : 4.1. Mengetahui metode analisa kualitatif vitamin A,B,dan vitamin C. 4.2. Mengetahui metode analisa kuantitatif vitamin A,B,dan vitamin C.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

I. Vitamin Vitamin dikenal sebagai suatu kelompok senyawa organic yang tidak termasuk dalam golongan protein, karbohidrat, maupun lemak, dan terdapat dalam jumlah yang kecil dalam bahan makanan tetapi sangat penting peranannya bagi beberapa fungsi tertentu tubuh untuk menjaga kelangsungan kehidupan serta pertumbuhan. Vitamin merupakan suatu molekul organik yang sangat diperlukan tubuh untuk proses metabolisme,pertumbuhan yang normal, transportasi oksigen dan anti oksidan.

II. Klasifikasi Vitamin Vitamin pada umumnya dapat dikelompokkan menjadi 2 golongan utama, yaitu vitamin yang larut dalam lemak dan vitamin yang larut dalam air. Vitamin yang larut dalam lemak yaitu vitamin A,D,E dan K, sedangkan vitamin yang larut dalam air yaitu vitamin B dan C. Vitamin yang larut dalam lemak akan disimpan oleh tubuh dalam hati, atau jaringan-jaringan lemak, karena bersifat tidak larut dalam air maka vitamin ini tidak dikeluarkan dari dalam tubuh, sehingga akan menumpuk daalm tubuh bila dikonsumsi dalam jumlah banyak. Vitamin yang larut dalam air bergerak bebas dalam badan, darah, dan limpa, karena bersifat larut dalam air maka vitamin ini mudah rusak oleh pengolahan dan mudah hilang karena tercuci atau terlarut oleh air dan akhirnya keluar dari bahannya.

III. Vitamin A Vitamin A merupakan vitamin yang larut dalam lemak. Merupakan jenis vitamin yang aktif dan terdapat dal beberapa bentuk : 1. Vitamin A alkohol (retinol)

2. 3. 4.

Vitamin A aldehida (retinal) Vitamin A asam (asam retinoat) Vitamin A ester (ester retinil)

Vitamin A pada umumnya stabil terhadap panas, asam, dan alkali, namun mudah teroksidasi oleh udara dan akan rusak bila dipanaskan pada suhu tinggi bersama udara, sinar, dan lemak yang sudah tengik. Vitamin A terdapat dalam bentuk provitamin yaitu karoten dalam tumbuhan. Vitamin A berfungsi dalam proses melihat, yaitu pada proses fotokimia pada retina, ekspresi gen, reproduksi, dan respon imun tubuh. Sayuran dan buah-buahan yang berwarna hijau atau kuning biasanya banyak mengandung karoten seperti wortel, ubu jalar, dan labu kuning. Kekurangan vitamin akan menyebabkan seseorang tidak dapat melihat dengan jelas dalam cahaya redup (rabun senja).

IV. Vitamin B Vitamin B termasuk dalam kelompok vitamin yang disebut vitamin B kompleks yang meliputi tiamin (vitamin B1), riboflavin (vitamin B2), niasin (asam nikotinat,niasinamida), piridoksin (vitamin B6), asam pantotenat, biotin, folasin (asam folat dan turunan aktifnya), serta vitamin B12(sianokobalmin). Tiamin (vitamin B1) merupakan vitamin yang larut dalam air yang merupakan kofaktor enzim yang berperan dalam metabolisme karbohidrat dan asam amino. Riboflavin (vitamin B2) yang berperan dalam membantu metabolisme tubuh. Niasin berperan untuk metabolisme energi. Asam pantotenat yang berperan dalam metabolisme asam lemak. Biotin berpartisipasi dalam proses karboksilasi, dekarboksilasi, dan reaksi deaminasi, sintesis asam lemak,dan dalam reaksi fiksasi CO2 pada proses perubahan perurat menjadi oksaloasetat, serta berperan pada siklus Krebs. Folasin berperan dalam biosintesis dan pemindahan satu satuan karbon seperti gugus metal, sehingga dapat terjadi sintesis metionin, kolina, dan penambahan gugus metil pada pirimidina sehingga terbentuk timin, selain itu juga berperan dalam proses oksidasi fenilanin menjadi tirosin. Vitamin B6 (piridoksin) berperan dalam

metabolisme protein dan glikogen. Vitamin B12 (sianokobalamin) yang berperan dalam metabolisme protein dan sel-sel darah.

V. Vitamin C Vitamin C dapat berbentuk sebagai asm L-askorbat dan asam Ldehidroaskorbat. Asam askorbat sangat mudah teroksidasi secara reversible menjadi asam L-dehidroaskorbat yang dapat mengalami perubahan lebih lanjut menjadi asam L-diketogulonat yang tidak memiliki keaktifan vitamin C lagi. Dari semua vitamin yang ada, vitamin C merupakan vitamin yang paling mudah rusak. Vitamin C mudah larut dalam air namun mudah teroksidasi dan proses tersebut dipercepat dengan adanya panas, sinar, alkali, enzim, oksidator, serta oleh katalis tembaga dan besi. Oksidasi akan terhambat bila vitamin C dibiarkan dalam keadaan asam, atau pada suhu rendah. Peranan vitamin C adalah dalam pembentukan kolagen interseluler, proses hidroksilasi dua asam amino prolin dan lisin menjadi hidroksi prolin dan hidroksilin, serta pada respirasi sel.

BAB III PEMBAHASAN

I. Analisis vitamin A 1.1 Analisis kualitatif Dalam uji kulaitatif sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan tetes demi tetes kloroform hingga larut. Kemudian ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrid (untuk menghilangkan air) dan 1 mL larutan SbCl3 (kondisi fresh). Apabila dianalisis menggunakan spektrometri panjang gelombang maksimum 325 sampai 328 nm 1.2 Analisis kuantitatif 1.2.1 Metode spektrofotometri Spektrum absorbsi ultraviolet vitamin A dan vitamin A secara asetat mempunyai absorbansi maksimal pada panjang gelombang antara 325 sampai 328 nm dalam berbagai pelarut. Larutan vitamin a dalam isopropanol absorbansinya diukur pada maks dan pada dua titik, yakni satu disebelah kanan maks dan satunya lagi pada sebelah kiri maks. Absorbansi pada maks dikoreksi terhadap senyawa penggangu dengan menggunakan formula koreksi karena senyawa-senyawa ini akan ikut menyerap pada daerah UV. Beberapa penggangu, terutama pada minyak ikan adalah vitamin A2, kitol, anhidro vitamin A, dan asma polien. Pada vitamin A sintetik senyawa penganggu adalah senyawa-senyawa antar ( intermediet). Dengan demikian senyawa penganggu ada vitamin A sintetik dengan minyak ikan yang berbeda. Prosedur penetapan vitamin A secara spektrofotometri: Penetapan dilakukan secepat mugkin, terlindung dari cahaya, dan terlindung dari senyawa oksidator. Sebelum dilakukan penetapan kadar, skala spektrofotometer diperiksa terlebih dahulu. Sebagai pedoman dapat digunakan garis raksa pada 313,16 nm dan 334,5 nm serta garis hidrogen pada 379,7 nm dan 486,1 nm.

Ketepatan absorbansi yang telah dikoreksi lebih rendah jika dibandingkan dengan absorbanasi yang diamati langsung dan digunakan dalma perhitungan. Karena itu pengukuran absorbansi membutuhkan perhatian khusus dan sekurang-kurangnya harus dilakukan dua kali penetapan. a. Akseroftol dalam bentuk ester Zat yang tidak larut dalam sikloheksan dimurnikan dengan cara penyaringan atau cara lain yang tidak menggunakan cara penyabunan. Jika cara pemurnian tersebut tidak dilakukan, maka penetapan dilakukan menurut cara yang tertera dalam akseforol lain. Cara penetapan akseroftol murni adalah sebagai berikut: Sejumlah sampel atau sampel yang sudah dimurnikan ditimbang secara saksama lalu dilarutkan dalam sikloheksan secukupnya hingga diperoleh larutan yang mengandung antara 9 SI sampai 15 SI tiap mL dan ditetapkan panjang gelombang maksimalnya. Absorbansi larutan diukur pada panjang

gelombang yang tertera dalam daftar berikut dan dihitung sebagai absorbansi relatif terhadap absorbansi pada 328 nm. Panjang gelombang 300 nm 316nm 328nm 340nm 360nm Absorbansi relatif 0,550 0,907 1,000 0,811 0,299

Jika panjang gelombang absorbansi maksimal terletak antara 326 nm dan 329 nm, tetapai absorbansi relatif yang terbaca lebih besar dari 0,002 dari harga yang tertera dalam daftar, maka dihitung absorbansi pada 328 nm yang dikoreksi dengan rumus: A328 nm (kor) = 3,52( 2A 328 nm A316 nm A340 nm) Jika harga absorbansi yang telah dikoreksi, [A328 nm (kor)]

terletak dalam batas 3 % dan harga absorbansi yang belum dikoreksi maka perhitungan dilakukan dengan menggunakan harga absorbansi yang belum dikoreksi. Jika harga absorbansi yang telah dikoreksi terletak antara

85% sampai 97% dari harga yang belum dikoreksi, maka perhitungan dilakukan dengan menggunakan harga absorbansi yang belum dikoreksi. Jika harga absorbansi yang telah dikoreksi terletak lebih

kecil dari 85% dan lebih besar daari 103% dari harga yang belum dikoreksi atu jika panjang gelombang absorbansi maksimal tidak terletak antara 326 nm sampai 329 nm, maka penetapan kadar dilakukan menurut cara yang tertera pada akseroftol lain. b. Akseroftol lain Cara penentuan afseroftol lain: sejumlah zat yang ditimbang secara saksama (mengandung tidak kurang dari 500 SI akseroftol dan tidak lebih dari 1 gram lemak), dicampur dengan 30 ml etanol mutlak dan m mL kalium hidroksida 50 %. Absorbansi larutan diukur pada 300 nm, 310 nm, 325 nm dan 334 nm. Selanjutnya dil;akukan penentuan panjang gelombang maksimal. Perhitungan potensi dilakukan sebagai berikut: Jika panjang gelombang maksimal terletak antar 323 nm

dan 327 nm dan perbandingan absorbansi pada 300 nm terhadap

absorbansi pada 327 nm tidak lebih dari 0,73, maka absorbanasi yang telah dikoreksi [A325 nm(kor)] dihitung dengan rumus: A325 nm (kor) = 6, 815 A325 nm - 2,555 A310 nm 4,26 A334 nm Potensi dalam SI tiap zat yang diperiksa dihitung dengan rumus: A325 nm (kor) x 18.000 Jika absorbansi yang telah dikoreksi terletak dalam batas

3 % dari harga absorbansi yang belum dikoreksi, perhitungan dilakukan dengan menggunakan harga absorbansi yang belum dikoreksi. Jika panjang gelombang absorbansi maksimal tidak terletak

antara 325 nm dan 327 nm atau jika perbandinganabsorbansi pada 300 nm terhadap absorbansi pada 327 nm lebih dari 0,73, maka yang tidak tersabunkan dari zat yang diperiksa harus dimurnukan dengan cara kromatorafi. 1.2.2 Metode Kolorimetri a. Metode Carr-price Metode ini berdasarkan atas reaksi akseroftol dengan antimon triklorida anhidrat dalam kloroform yang menghasilkan warna biru. Reaksi ini terjadi antar antimon triklorid dengan rantai tidak jenuh dari akseroftol. Karoten, asam poliena dan beberapa senyawa dalam minyak ikan mengahasilkan warna biru juga. Warna yang terjadi intensitasnya cepat maksimun tetapi juga cepat pucat. b. Pengubahan akseroftol menjadi anhidroakseroftol Akseroftol mudah diubah menjadi anhidroakseroftol dengan

bantuan sejumlah kecil asam mineral atau asam organik kuat. Pada metode Budowski dan bondi, akseroftol diubah menjadi anhidroakseroftol dalam pelarut benzen dengan katalisator asam

toluen p-sulfonat pada temperatur kamar. Kenaikan absorbansi pada 399nm merupakan hasil dehidrasi yang berbanding langsung dengan jumlah akseroftol yang terkandung.pengukuran

absorbansi pada 358 nm, 377 nm, dan 399 nm dalam benzen merupakan cara yang baik untuk mengetahui kemurnian akseroftol yakni dengan melihat bahwa A 0,868 dan A 358 nm / A 377 nm sebesar 0,692. 1.2.3 Metode Kromatografi Aktivis isomer vitamin A cukup berbeda sehingga untuk pemisahannya dikembangkan dengan kolom mikrobore. Sampel ( 1,0- 10,0 gram) dihomogenkan. Sebanayk 30 mL air ditambahkan ke dalam sampel (jika sampelnya padat). Saponifikasi dilakukan dengan mencampur 40 mL sampel yang telah dihomogenkan dengan 12 mL larutan KOH 60%; 80 mL etanol mutlak; 0,5 mL terbutilhidroksi toluen- etanolik 1%; dan 0,5 gram asam askorbat untuk menghindari terjadinya oksidasi. Sampel diaduk pada suhu kamar selama 16 jam. Setelah selesai saponifikasi, solut diencerkan samapi 250 mL dengan air etanol untuk memperoleh suatu rasio etanol:air(1:1 v/v). Sebanyak 20 mL aliquot ditambahkan ke dalam cartidge Kiselguhr dan setelah 20 menit diekstraksi dengan 50 mL petroleumeter ringan. Eluat selanjutnya diuapkan dan dilarutkan kembali dengan 2-50 mL isooktana (tergantung pada konsentrasi Vitamin A dalam sampel mula-mula).isomer gometri retinol
399 nm/

A377 nm sebesar

(vitamin A)dipisahkan dengan kolom pengaman ( 7 x 2 mm i.d) dan kolom analisis (100x 2mm i.d) yang keduanya berisi silika ggel dengan ukuran partikel 3 mikron. Sebagai eluen adalah heksan yang mengandung 1-oktanol dalam konsentrasi rendah. Karena panjang gelombang absorbsi maksimun isomer-isomer ini berbeda maka digunakan detektor photodiode array(PAD). Metode ini telah sukses memisahkan 7 isomer vitamin A yakni: 11- cis; 11,13-di-

cis: 13-cis;9,13-di-cis; 9-cis ;7-cis; dan semua trans-retinol dengan waktu retensi relatif terhadap trans-retinol masing-masing sebesar 0,510; 0,568; 0,672; 0,740; 0,877;0,924; dan 1,000.

II. Analisis Vitamin B Vitamin B komplek merupakan thiamin, riboflafin, pereduksi (vitamin B6), asam pantofenat, broflasin serta vitamin B12. Struktur dari vitamin B kompleks adalah sebagai berikut:

Vitamin B2

Vitamin B1

Vitamin B5

Vitamin B6 2.1 Analisis Vitamin B1 Dalam makanan, vitamin B1 (Tiamin HCl) dapat ditemukan dalam bentuk bebas atau dalam bentuk kompleks dengan protein atau kompleks protein-fosfat. Tiamin hidroklorid dalam keadaan kering cukup stabil dan pada pemanasan 100oC selama 1 jam tidak berkurang potensinya. Larutan

tiamin hidroklorid dalam air dan suasana basa dapat disterilisasi pada 110oC, akan tetapi jika pH larutannya diatas 5,5 maka akan cepat terhidrolisis. Satu gram tiamin hidroklorida kristal setara dengan 333,000 SI. Tiamin mononitrat padat lebih stabil daripada tiamin hidroklorida. 2.1.1 Uji kuantitatif Vitamin B1 : Metode ini dilakukan dengan cara memasukkan sedikit serbuk (sampel) ke dalam tabung reaksi. Kemudian tambhkan 3 tetes NaOH 30%, 3 tetes K3Fe(CN)6 0,6% dan 1 mL isobutanol. Kemudian dikocok hingga bercampur rata. Kemudian perhatikan larutan campuran tersebut di bawah lampu ultraviolet. Apabila hasil campuran tersebut menjadi berwarna biru maka uji positif pada sampel. 2.1.2 Uji Kualitatif Vitamin B1 : 1. Metode Spektrofluorometri Tiamin dalam makanan dan dalam sediaan farmasi harus disari lebih dahulu secara kuantitatif yang biasanya dengan mendidihkannya dalam asam encer kemudian tiamin dibebaskan dari persenyawaan kompleks dengan enzim fosfatase. Untuk sampel yang mengandung protein diperlukan enzim proteolitik seperti pepsin. Tiamin bebas perlu dimurnikan dari senyawa pengganggu dengan mengalirkannya melalui zeolit (suatu penukar ion anorganik) sehingga tiamin akan tertinggal dalam zeolit sedangkan senyawa lain seperti reduktor, asam, dan senyawa netral akan keluar dari kolom. Kemudian tiamin dielusi dari zeolit dengan kalium klorida yang diasamkan. Kandungan vitamin B1 dalam susu dilakukan dengan metode ini. Vitamin B1 dioksida dengan kalium ferisianida dalam suasana basa membentuk tiokrom, dan diukur fluoreseneinya. Intensitas fluoresensi sebanding dengan kadar vitamin B1.

Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis vitamin B1 dalam susu adalah sebagai berikut: Resin untuk kromatografi, disiapkan dengan menambah 50 gram BioRex dengan 300mL HCl 2 N, diaduk selama 15 menit, disaring, dan diulangi lagi dengan menambahkan 300 mL H2O, diaduk selama 1 menit, disaring, dan diulangi lagi sampai diperoleh pH H2O antara 4,5 7,0. Akuades (H2O) harus bebas dari suspensi resin ketika didiamkan selama 15 detik. Jika terbentuk suspensi resin, pencucian diulang hingga diperoleh H2O sampai jernih. Larutan natrium asetat 2 N, disiapkan dengan melarutkan 272 gram natrium asetat trihidrat dalam air secukupnya hingga 1 L. Indikator pH brom kresol hijau dibuat dengan melarutkan 100 mg indikator dalam 2,8 mL NaOH 0,05 N dengan penghangatan. Larutan indikator diencerkan dengan H2O sampai 200 mL. Kisaran warna indikator: hijau (4,0) biru (5,8). Indikator pH bromofenol biru dibuat dengan melarutkan 100 mg indikator dalam 3,0 mL NaOH 0,05 N dengan penghangatan. Larutan indikator diencerkan dengan H2O sampai 250 mL. Kisaran warna indikator: kuning (3,0) biru (4,6). Larutan enzim 10% (b/v) dibuat dengan melarutkan 10 gram enzim diastase dalam akuades dan mengencerkannya sampai 100,0 mL. Larutan ini dibuat baru setiap hari. Larutan kalium klorida netral 25% (b/v), dibuat dengan melarutkan 250 gram KCl dalam air secukupnya hingga 1 L. Larutan kalium klorida-asam, dibuat dengan menambahkan 8,5 mL HCl pada 1 L larutan kalium klorida di atas. Larutan kalium ferisianida 1%, dibuat dengan melarutkan 1 gram K3Fe(CN)6 dalam air secukupnya lalu mengencerkannya sampai 100 mL. Larutan ini dibuat baru tiap hari.

 Pereaksi pengoksidasi disiapkan dengan mencampur 4,0 mL larutan kalium ferisianida 1% dengan NaOH 15% secukupnya hingga 100 mL. Pereaksi ini digunakan dalam waktu 4 jam setelah pembuatan. Isobutil alkohol. Larutan stok kinin sulfat, dibuat dengan melarutkan 10 mg kinin sulfat dalam asam sulfat 0,1 N secukupnya hingga 1 L. Larutan stok ini disimpan dalam labu berwarna merah atau kuning. Larutan baku kinin sulfat dibuat dengan mengencerkan 5,0 mL larutan stok kinin sulfat di atas dengan H2SO4 0,1 N sampai 200 mL. Larutan baku ini disimpan dalam labu berwarna merah atau kuning. Alkohol yang diasamkan dibuat dengan mengencerkan 250 mL alkohol dengan H2O sampai 1 L. Larutan ini ditambah HCl tetes demi tetes untuk mengatur pH-nya antara 3,54,3. Larutan asam asetat 3%, dibuat dengan mengencerkan 3 mL asam asetat glasial dengan H2O sampai 100 mL. Prosedur penetapan kadar vitamin B1 secara spektrofluorometri: a. Penyiapan kolom Kromatografi Kolom kromatografi disiapkan dengan cara memasukkan glass wool dari atas kolom sampai ujung kolom. Dengan hati-hati, suspensi resin dimasukkan dalam H2O sampai ketinggian 10 cm. Cairan dijaga untuk tidak berada di bawah permukaan resin selama proses adsorbsi. b. Penyiapan larutan baku Tiamin HCl i. Larutan baku stok (induk)- 100 g/mL, dibuat dengan menimbang secara seksama 50,0 mg baku tiamin HCl yang telah dikeringkan dalam desikator (Tiamin HCl bersifat higroskopik, oleh karena itu berhati-hatilah selama menimbang untuk menghindari penyerapan lembab) lalu memindahkannya dalam labu takar 500 mL. Tiamin HCl dilarutkan dalam larutan alkohol 20% yang telah diasamkan dengan HCl untuk mengatur pH larutan 3,54,3 lalu

mengencerkannya sampai batas tanda dengan alkohol yang telah

diasamkan. Larutan disimpan dalam botol berwarna kuning atau merah dalam refigerator (Larutan ini stabil dalam beberapa bulan). ii. Larutan antara 10 g/mL, dibuat dengan mengencerkan 100,0 mL larutan stok (induk) 100 g/mL diatas sampai 1 L dengan alkohol 20% yang telah diasamkan dengan HCl untuk mengatur pH antara 3,54,3. Larutan disimpan dalam botol tertutup yang kedap terhadap cahaya pada suhu 10oC. iii. Larutan baku kerja- 1 g/mL, dibuat dengan mengambil 10,0 mL larutan baku antara lalu ditambah 50 mL HCl 0,1 N. Larutan selanjutnya didigesti selama 30 menit pada penangas uap pada suhu 95100oC atau dalam penangas air mendidih selama 30 menit dengan sesekali diaduk. Larutan didinginkan dan diencerkan sampai 100 mL dengan HCl 0,1 N. Larutan ini dibuat baru setiap kali pengujian. iv. Larutan baku kerja untuk sampel-sampel yang mengandung tiamin bebas, dibuat dengan mengencerkan 20,0 mL larutan kerja (iii) sampai 100 mL dengan HCl 0,1 N. Larutan ini ditandai sebagai larutan baku uji dan dilanjutkan secara langsung dengan proses oksidasi. v. Larutan baku kerja untuk sampel-sampel yang mengandung tiamin pirofosfat, dibuat dengan cara: mengambil 20,0 mL larutan baku kerja lalu dilanjutkan dengan proses hidrolisis enzim dimulai dengan larutan diencerkan dengan 65 mL. Setelah selesai dilanjutkan dengan pemurnian hingga diperoleh larutan 25,0 mL. Larutan ini ditandai sebagai larutan baku uji (mengandung tiamin HCl 5 g) dan dilanjutkan dengan proses oksidasi. c. Penyiapan sampel (ekstraksi) i. Untuk sampel-sampel yang mengandung tiamin bebas (tidak digunakan untuk sampel yang mengandung tiamin pirofosfat). Untuk sampel kering atau setengah kering yang mengandung senyawa basa dalam jumlah kecil, penyiapan sampelnya: ditimbang

sejumlah sampel secara seksama yang setara dengan 15 g tiamin HCl lalu dimasukkan dalam labu yang berukuran sesuai dan ditambah sejumlah mL HCl 0,1 N sebanyak 10 kali berat sampel kering dalam gram. Campuran diaduk hingga sampel terdispersi dalam cairan. Jika terjadi gumpalan, larutan digojog kuat hingga semua partikel padat bersentuhan dengan cairan. Tepi labu dicuci dengan HCl 0,1 N. Larutan selanjutnya didigesti selama 30 menit pada penangas uap pada suhu 95100oC dengan seringkali diaduk lalu didinginkan. Jika gumpalan masih terjadi, campuran digojog hingga partikel terdispersi. Larutan selanjutnya diencerkan dalam labu takar dengan HCl 0,1 N hingga mengandung 0,2 g/mL. Larutan ini ditandai sebagai larutan sampel uji. Untuk sampel kering atau setengah kering yang mengandung senyawa basa dalam jumlah cukup tinggi, penyiapan sampel dilakukan dengan cara: ditimbang sejumlah sampel secara seksama yang setara dengan 15 g tiamin HCl, dimasukkan dalam labu yang berukuran sesuai, ditambah HCl encer dalam sampel hingga pHnya 4, ditambah sejumlah volume H2O hingga volumenya 10 kali berat sampel kering dalam gram. Campuran ditambah 1 mL HCl 10 N tiap 100 mL cairan. Jika terjadi gumpalan, larutan digojog kuat hingga semua partikel padat bersentuhan dengan cairan. Tepi labu dicuci dengan HCl 0,1 N. Larutan selanjutnya didigesti selama 30 menit pada penangas uap pada suhu 95100oC dengan seringkali diaduk lalu didinginkan. Jika gumpalan masih terjadi, campuran digojog hingga semua partikel terdispersi. Larutan selanjutnya diencerkan dalam labu takar dengan HCl 0,1 N hingga mengandung 0,2 g/mL. Larutan ini ditandai sebagai larutan sampel uji. Untuk sampel cair, penyiapan sampel dilakukan dengan cara: diambil sejumlah tertentu sampel secara seksama yang setara dengan 15 g tiamin HCl, dimasukkan dalam labu yang berukuran

sesuai. pH larutan diatur dengan penambahan HCl atau NaOH hingga pH 4. Larutan selanjutnya ditambah sejumlah volume H2O hingga volumenya 10 kali berat sampel dalam gram. Larutan ditambah 1 mL HCl 10 N tiap 100 mL cairan lalu diaduk hingga sampel terdispersi dalam cairan. Jika terjadi gumpalan, larutan digojog kuat. Tepi labu dicuci dengan HCl 0,1 N. Larutan selanjutnya didigesti selama 30 menit pada penangas uap pada suhu 95100oC dengan seringkali diaduk lalu didinginkan, dan jika gumpalan masih terjadi campuran digojog. Larutan diencerkan dalam labu takar hingga mengandung 0,2 g/mL. Larutan ini ditandai sebagai larutan sampel uji. ii. Untuk sampel-sampel yang mengandung tiamin pirofosfat, penyiapan sampelnya dilakukan dengan cara: ditimbang sejumlah sampel secara seksama yang setara dengan 15 g tiamin HCl, dimasukkan ke dalam labu yang berukuran sesuai lalu ditambah sejumlah mL HCl 0,1 N sebanyak 10 kali berat sampel kering dalam gram. Larutan diaduk hingga sampel terdispersi dalam cairan. Jika terjadi gumpalan, larutan digojog kuat hingga semua partikel padat bersentuhan dengan cairan. Tepi labu dicuci dengan HCl 0,1 N. Larutan didigesti selama 30 menit pada penangas uap pada suhu 95100oC dengan seringkali diaduk lalu didinginkan. Jika gumpalan masih terjadi, campuran digojog hingga partikel terdipersi. Larutan diencerkan dalam labu takar dengan HCl 0,1 N hingga mengandung 0,20,5 g/mL. Larutan ini ditandai sebagai larutan sampel uji. Proses selanjutnya adalah dengan hidrolisis enzim dan dengan pemurnian. d. Hidrolisis dengan Enzim Sejumlah tertentu aliquot yang mengandung 1025 g tiamin diambil dan diencerkan dengan 65 mL HCl 0,1 N. pH masing-masing larutan diatur 4,0-4,5 dengan penambahan larutan natrium asetat 2 N menggunakan indikator bromkresol hijau. Titik akhir ditandai dengan

perubahan warna biru yang tetap. Larutan selanjutnya ditambah 5 mL larutan enzim, dicampur, diinkubasikan pada suhu 4550oC selama 3 jam, lalu didinginkan, dan pH-nya diatur 3,5 menggunakan indikator bromofenol biru. Larutan diencerkan dengan HCl 0,1 N sampai 100 mL dan disaring melalui kertas saring yang tidak menyerap tiamin. e. Pemurnian Sejumlah aliquot larutan sampel yang telah disaring yang mengandung 5 g tiamin dilewatkan pada kolom kromatografi yang telah dipersiapkan. Kolom kromatografi dicuci 3 kali masing-masing dengan 5 mL H2O yag hampir mendidih. Permukaan cairan jangan dibiarkan berada di bawah permukaan resin. Tiamin dielusi dari resin dengan melewatkan 5 kali masing-masing 4,04,5 mL larutan KClasam yang hampir mendidih (>60oC) melalui kolom. Permukaan cairan jangan dibiarkan berada di bawah permukaan resin. Eluat yang diperoleh dari hasil hidrolisis dan pemurnian larutan baku dikumpulkan dalam labu takar 25 mL, didinginkan, dan diencerkan dengan larutan KCl-asam sampai batas volume. Larutan ini ditandai sebagai larutan sampel uji. f. Oksidasi Tiamin menjadi Tiokrom i. Untuk larutan baku uji, oksidasi tiamin menjadi tiokrom dilakukan dengan cara: Pada masing-masing 2 tabung 40 ml, ditambah 1,5 gram NaCl dan 5 mL larutan baku uji (larutan dijaga dari cahaya karena akan merusak tiokrom). Larutan digoyangkan ringan hingga terbentuk gerakan memutar dalam cairan dan segera ditambah 3 mL pereaksi pengoksidasi dengan pipet (gunakan pipet yang mampu mengeluarkan 3 mL pereaksi pengoksidasi dalam waktu 1-2 detik). Pipet dipindahkan dan tabung sekali lagi digoyangkan supaya bercampur.

Dengan segera, larutan ditambah 13 mL isobutanol lalu ditutup tabungnya. Larutan selanjutnya digojog dengan kuat selama 2 menit. Pada salah satu tabung, dilakukan juga baku blanko dengan mengganti 3 mL pereaksi pengoksidasi dengan 3 mL larutan NaOH 15%. Tabung disentrifugasi dengan kecepatan rendah sampai diperoleh supernatan yang jernih dari masing-masing tabung.

Sebanyak 10,0 mL ekstrak isobutanol (lapisan atas) dipipet untuk selanjutnya diukur fluoresensinya.

ii. Untuk larutan sampel uji Pada masing-masing 2 tabung 40 mL, ditambah 1,5 gram NaCl dan 5 mL larutan sampel uji (larutan dijaga dari cahaya karena cahaya akan merusak tiokrom). Tabung digoyangkan ringan hingga terbentuk gerakan memutar dalam cairan dan dengan segera, larutan ditambah 3 mL pereaksi pengoksidasi dengan pipet (digunakan pipet yang mampu mengeluarkan 3 mL pereaksi pengoksidasi dalam waktu 1-2 detik). Pipet dipindahkan dan tabung digoyangkan sekali lagi supaya bercampur. Dengan segera, larutan ditambah 13 mL isobutanol lalu ditutup tabungnya dan digojog kuat selama 2 menit. Pada salah satu tabung, dilakukan juga sampel blanko dengan mengganti 3 mL pereaksi pengoksidasi dengan 3 mL larutan NaOH 15%. Tabung disentrifugasi dengan kecepatan rendah sampai diperoleh supernatan yang jernih dari masing-masing tabung. Sebanyak 10,0 mL ekstrak isobutanol (lapisan atas) dipipet untuk selanjutnya diukur fluoresensinya.

g. Pengukuran fluoresensi tiokrom Fluoresensi tiokrom diukur pada eksitasi 365 nm dan emisi 435 nm. Reprodusibilitas fluorometer diatur dengan menggunakan larutan baku kinin sulfat. Fluoresensi ekstrak isobutanol yang berasal dari larutan sampel uji yang ditambah pereaksi pengoksidasi (I) diukur, selanjutnya diukur juga fluoresensi ekstrak isobutanol yang berasal dari larutan sampel uji yang ditambah 3 mL larutan NaOH 15 % (b). Fluoresensi ekstrak isobutanol yang berasal dari larutan baku uji yang ditambah pereaksi pengoksidasi (S) diukur, selanjutnya diukur juga fluoresensi ekstrak isobutanol yang berasal dari larutan baku uji yang ditambah 3 mL larutan NaOH 15 % h. Perhitungan g Tiamin HCl tiap 5mL larutan uji = 2. Metode Kolorimetri Dasar metode ini adalah reaksi antara tiamin dengan 6-aminotimol yang telah didiazotasi. Hasil peruraian tiamin tidak menghasilkan warna dengan pereaksi ini. Dekstrosa, laktosa, maltosa, sukrosa, tepung, kasein, gelatin, pepton, urea, gliserofosfat dan logam berat, dengan kadar 100 kali lebih besar dari kadar tiamin tetap tidak mengganggu. Riboflavin, asam nikotinat, nikotinamid, piridoksin, asam pantotenat, guanin, adenin, triptopan, tirosin dan histidin yang terdapat dengan kadar 20 kali lebih besar daripada kadar tiamin juga tidak mengganggu. Pereaksi 6-aminotimol dibuat dengan melarutkan 50 mg 6aminotimol dalam 50 mL asam klorida 0,35% dan mengencerkannya dengan air secukupnya hingga 200 mL.
( )

Prosedur penetapan kadar tiamin murni dengan pereaksi 6aminotimol: Sejumlah 5,0 pereaksi 6-aminotimol didinginkan dengan es, ditambah 2,0 mL natrium nitrit 0,1%, lalu dicampur dan didiamkan selama 1 menit. Larutan selanjutnya ditambah 5,0 mL natrium hidroksida 20% dan diencerkan dengan air secukupnya sampai 20,9 mL. Sejumlah 1,0 pereaksi ini ditambah 1,0 larutan sampel. Setelah 5 menit larutan diencerkan dengan air untuk mendapatkan absorbansi yang sesuai. Digunakan larutan blanko. Jika larutan sampel telah berwarna atau keruh, dilakukan penetapan seperti diatas kemudian warna yang terjadi disari dengan campuran pelarut yang terdiri atas 90 mL toluen yang telah didestilasi ulang (redestilasi) dan 10 mL n-butanol. Lapisan pelarut organik dipisahkan dan ditambah 1 gram natrium sulfat anhidrat untuk mengeringkan pelarut lalu diukur absorbansinya. 3. Metode Alkalimetri Adanya hidroklorida pada tiamin hidroklorida dapat dititrasi dengan natrium hidroksida 0,1 N menggunakan indikator brom timol biru. Prosedur penetapan kadar tiamin hidroklorida dengan metode alkalimetri: Lebih kurang 500 mg tiamin hidroklorida yang ditimbang seksama, dilarutkan dalam 75 mL air bebas CO2 lalu dititrasi dengan NaOH 0,1 N menggunakan indikator brom timol biru. Tiap mL NaOH 0,1 N setara dengan 33,70 gram tiamin hidroklorida. Berat ekivalen (BE) tiamin hidroklorida pada penetapan secara alkalimetri adalah sama dengan berat molekulnya (BM). Hali ini

disebabkan karena tiap 1 mol tiamin hidroklorida bereaksi dengan 1 mol NaOH. Kadar Tiamin HCl = 4. Metode Titrasi Bebas Air (TBA) Tiamin hidroklorida dalam asam asetat glasial dapat dititrasi dengan asam perklorat dengan sebelumnya ditambah raksa (II) asetat berlebihan. Kedua atom nitrogen dalam tiamin hidroklorida tertitrasi sehingga berat ekivalennya setengah dari berat molekulnya. Sebagai indikator dapat digunakan p-naftol benzen, merah kuinaldin, atau dengan kristal violet. Prosedur penetapan kadar tiamin dengan metode TBA: Lebih kurang 250 mg tiamin hidroklorida yang ditimbang seksama ditambah 10 mL asam asetat glasial, 10 mL raksa (II) asetat 5% dalam asam asetat glasial, dan ditambah 20 mL dioksan. Selanjutnya larutan dititrasi dengan asam perklorat 0,1 N menggunakan indikator 3 tetes kristal violet sampai warna biru. Tiap mL asam perklorat 0,1 N setara dengan 16,86 mg tiamin hidroklorida. Berat ekivalen (BE) tiamin hidroklorida pada penetapan secara titrasi bebas air adalah setengah dari berat molekulnya (BM/2). Hali ini disebabkan karena tiap 1 mol tiamin hidroklorida bereaksi dengan 2 mol HClO4. Kadar Tiamin HCl = 5. Metode Argentometri Adanya klorida dalam tiamin hidroklorida dapat ditetapkan secara argentometri dengan menggunakan metode Volhard. Pada penetapan dengan metode Volhard suasananya harus asam sebab jika suasananya basa maka akan terjadi reaksi antara perak nitrat dengan basa

membentuk Ag(OH) yang pada tahap selanjutnya akan membentuk endapan putih Ag2O, akibatnya perak nitrat tidak hanya bereaksi dengan sampel tetapi juga bereaksi dengan basa. Prosedur penetapan kadar vitamin B1 secara argentometri: Lebih kurang 100 mg tiamin hidroklorida yang ditimbang secara seksama dilarutkan dalam 20 mL air. Larutan diasamkan dengan asam nitrat encer dan ditambah 10 mL perak nitrat 0,1 N. Endapan yang terjadi disaring dan dicuci dengan air sampai tidak mengandung

klorida. Filtrat selanjutnya dititrasi dengan larutan baku ammonium tiosianat 0,1 N menggunakan indikator besi (III) amonium sulfat. Tiap mL perak nitra 0,1 N setara dengan 16,86 mg tiamin hidorklorida. Berat ekivalen (BE) tiamin hidroklorida pada penetapan secara argentometri adalah setengah dari berat molekulnya (BM/2). Hal ini disebabkan karena tiap 1 mol tiamin hidroklorida (yang mengandung 2 Cl-) bereaksi dengan 2 mol AgNO3. 6. Metode Gravimetri Tiamin dalam tablet vitamin B1 dan dalam injeksi dapat ditetapkan secara gravimetri dengan cara mengendapkan larutan tiamin

menggunakn asam silikowolframat. Prosedur penetapan kadar tiamin dengan metode gravimetri: Sejumlah tertentu tablet yang telah ditimbang secara seksama dan setara dengan lebih kurang 50 mg tiamin hidroksida, diencerkan dengan air secukupnya hingga 50 mL lalu ditambah 2 mL asam klorida pekat dan dipanaskan hingga mendidih. Pada larutan yang telah mendidih ini selanjutnya ditambah dengan cepat tetes demi tetes 4 mL asam silikowolframat yang baru disaring lalu dididihkan selama 4 menit. Larutan disaring melalui penyaring kaca masir lalu dicuci dengan 50 mL campuran mendidih yang terdiri atas 1 bagian volume asam klorida

pekat dan 19 bagian air yang mengandung asam silikowolframat 0,2% (b/v), kemudian dicuci 2 kali tiap kali dengan 5 mL aseton. Sisa dikeringkan pada suhu 105oC selama satu jam lalu didinginkan selama 10 menit dan dibiarkan dalam eksikator di atas larutan asam sulfat 38% dan ditimbang. Tiap gram sisa setara dengan 192,9 mg tiamin hidroklorida. 2.2 Analisis Vitamin B2 2.3.1 Analisis kualitatif Ribofavin (Vitamin B2) Vitamin B2 disebut juga riboflavin karena strukturnya mirip dengan gula ribose dan juga karena ada hubungan dengan kelompok flavin. Riboflavin larut dalam air dan member warna fluorosen kuning-kehijauan. Riboflavin sangat mudah rusak oleh cahaya dan sinar ultraviolet, akan tetapi tahan terhadap panas, oksidator, dan asam. Kelarutan Riboflavin dalam air bervariasi dari 1 bagian riboflavin dalam 3000 bagian air sampai 1 bagian riboflavin dalam 15.000 bagian air. Variasi ini disebabkan oleh variasi bentuk kristalnya. Berdasarkan pada sifat-sifat di atas pada waktu penetapan kadar, riboflavin harus terhindar cahaya. Penyinaran dengan sinar ultraviolet atau cahaya tampak terhadap larutan riboflavin dalam basa menghasilkan lumiflavin sedangkan larutan riboflavin dalam suasana netral atau asam menghasilkan lumikrom yang berfluorsensi biru. 2.3.2 Analisis kuantitatif Ribofavin (Vitamin B2) A. Metode spektrofluorometri Cara penetapan langsung dapat digunakan terhadap campuran yang bebas dari senyawa berwarna yang mengganggu atau senyawa pengganggu lain yang mengandung riboflavin lebih besar dari 0,1 %.

Cara penetapan langsung dapat digunakan terhadap campuran yang tidak mengandung senyawa berfluorosensi atau senyawa berwarna yang larut dalam air atau dalam asam encer. Pengukuran harus dilakukan secepat mungkin karena riboflavin terurai oleh sinar ultraviolet. Larutan sampel : Sejumlah serbuk yang ditimbang seksama dan setara dengan lebih kurang 2,5 mg riboflavin dimasukkan ke dalam labu 250 mL lalu ditambah 1 mL asam asetat 32,5% dan air secukupnya hingga 200 mL. Lalu dipanaskan di atas penangas air sambil sering dikocok hingga riboflavin larut lalu didinginkan hingga suhu 20C. Larutan ditambah air secukupnya hingga 250 mL dan dicampur baik-baik. Larutan riboflavin baku persediaan I, dibuat dengan melarutkan 50 mg riboflavin yang telah dikeringkan pada suhu 105 C selama 2 jam dalam asetat 0,02 N secukupnya hingga 500 mL. Larutan riboflavin baku persediaan II, dibuat dengan cara menambah 10,0 mL larutan riboflavin baku persediaan I dengan asam asetat 0,02 N secukupnya hingga 100 mL. Larutan riboflavin baku, dibuat dengan mengencerkan 10,0 mL larutan riboflavin baku persediaan II dengan air secukupnya hingga 100 mL. Kadar dalam mg riboflavin dihitung dengan menggunakan rumus: 2,5 x B. Metode spektrometri Larutan riboflavin dalam pH 4,0 menunjukkan absorbs maksimum ( maks) pada 444 nm. Cara ini digunakan untuk menetapkan kemurnian riboflavin atau untuk penetapan

riboflavin dilakukan dengan cara terlindung dari cahaya.

Prosedur

penetapan

kadar

riboflavin

tunggal

secara

spektrofotometri: Sekitar 100 mg riboflavin yang ditimbang seksama dilarutkan dengan pemanasan dalam campuran 2 mL asam asetat glacial dan 150 mL air. Larutan selanjutnya diencerkan dengan air, didinginkan, ditambah air secukupnya hingga 1000 mL. pada 10,0 mL larutan ditambah 3,5 mL natrium asetat 0,1 M kemudian ditambah air secukupnya hingga 100 mL. kadarnya dihitung dengan menggunakan riboflavin baku sebagai pembanding.

2.4

Analisis Vitamin B6 2.4.1 Metode spektrofotometri Pada daerah ultraviolet, piridoksin, piridokamin dan

piridoksal menunjukkan daerah penyerapan yang karakteristik walaupun tidak ada maksimum untukketiganya. Kadar vitamin B6 jumlah dalam larutan buffer ph 6,75 dapat diterapkan pada panjang gelombag 325 nm. Pada panjang gelombang ini, piridoksin dan piridoksamin menunjukkan absorbansi maksimum. Prosedur penetapan dalam tablet tunggal secara spektrofotometri: Sebanyak 20 tablet ditimbang dan diserbuk. Pada sejumlah serbuk yang ditimbang seksama yang setara dengan lebih kurang 25 mg piridoksin hidroklorida ditambah 50 mL asam klorida 0,1 N sambil diaduk. Larutan diencerkan dengan asam klorida secukupnya hingga 100 mL. larutan diukur absorbansinya menggunakan kuvet dengan ketebalan 1 cm pada panjang gelombang maksimum (291 nm) 2.4.2 Metode kolorimetri Metode ini didasarkan pada reaksi fenol dengan 2,6-diklorop-benzokuin-4-kloromina dengan menghasilkan warna biru yang dapat disari dengan pelarut organik. Reaksi ini merupakan reaksi umum untuk senyawa fenol berkedudukan para terhadap gugus hidroksil fenol tidak tersubsitusi.

2.4.3 Metode titrasi bebas air Lebih kurang 300 mg piridoksin hidroklorida yang ditimbang seksama, dilarutkan dalam 40 mL asam asetat glacial lalu dititrasi dengan asam perklorat 0,1 N menggunakan indicator 3 tetes Kristal violet samapai biru hijau. Tiam mL asam perklorat 0,1 N setara dengan 20,56 mg piridoksin hidroklorida. 2.4.4 Metode kromatografi Kromatofrafi cair kinerja tinggi (KCKT) dengan detector fluorometri telah digunakan secara luas untuk analisis kuantitatif vitamin B6 dalam ayam dan bahan makanan lainnya. 2.5 Analisis Vitamin B12 (sianokobalamin) Sianokobalamin, C63H88O14N14Pco, merupakan senyawa kompleks dengan kordinat kobalt berberat molekul 1355,4. Kristal vitamin B12 cepat menyerab lembab udara. Sianokobalamin bersifat netral dan mengandung gugus sian. Gugus ini dapat diganti dengan berbagai ion untuk menghasilkan senyawa baru seperti klorokobalamin dan hidroksokobalamin. Bila sianokobalamin dihidrolisis dengan asam maka akan menghasilkan 5,6dimetilbenzimdazol. Metode penetapan kadar vitamin (sianokobalamin) 2.5.1 Metode spektrofotometri B12 Sianokobalamin dalam air menunjukkan absorbansi maksimun ( maks) pada 278 1nm, 361 nm dan 550 2 nm. Metode spektrofotometri tidak spesifik untuk sianokobalamina karena senyawa bewarna merah dan pseudosiokobalamin menunjukkan spektra absorbansi yang serupa. Metode yang paling sederhana adalah dengan menetapkan pada 550 nm, tetapi metode ini hanya dapat digunakan terhadap sianokobalamin yang bebas senyawa pengganggu. Metode yang lebih peka ialah dengan melakukan penetapan pada panjang gelombang 361 nm.

Prosedur penetapan kadar sianokobalamin secara spekrofotometri: Lebih kurang 2 mg sianokobalamin yang ditimbang saksama, dilarutkan dalam akuades secukupnya dan diencerkan hingga 50,0 mL. Larutan diukur absorbansinya dengan kuvet 1 cm pada panjang gelombang 361 nm. Harga E1cm1% pada 361 nm adalah 207 2.5.2 Metode kromatografi Metode KCKT telah sukses digunakan untuk pemisahan dan analisis kuantitatif vitamin B1, B2, dan campuran-campurannya dalam bebagai macam bahan makanan. Berbagai macam isomer vitamin B12 (sianokobalamin) yang ada dalam berbagai macam susu juga telah dipisahkan dengan menggunakan metode KCKT fase terbalik. Sianokobalamin diekstraksi dari sampel dengan mencampur 25 mL susu dengan 2-4 mL HCL 0,1 M pH 4,6. Campuran dipanaskan pada suhu 1200C selama 10 menit dan selanjtnya disaring. pH filtrat diatur 5,5 dengan natrium hidroksida 0,1 M dan diencerkan dengan akuades sampai 50mL. Sianokobalamin selanjutnya dipekatkan pada cartridge oktadesil silan yang telah dikondisikan dengan 2 mL asetonitril dan dicuci dengan 6 mL akuades. Filtrat selanjutnya dilewatkan melalui cartridge dan selanjutnya cartridge dicuci dengan 12 mL air. Sianokobalamain dengan asetonitril: iar(1:1 v/v) dan dipisahkan dengan kolom oktil silika. Elusi gradien dimulai dengan asetonitril: larutan amonium fosfat pH 3,0 (5:95) lalu konsentrasi asetonitril ditingkatkan samapi 30% selama 16 menit. Konsentrasi vitamin B12 selanjutnya dengan metode radioassay.

III. Analisis Vitamin C 3.1 Analisis kualitatif Vitamin C Langkah awal yang dilakukan adalah dengan memasukkan sampel ke dalam tabung reaksi sebanyak 2 mL, kemudian ditambahkan 2 tetes NaOH 10% dan 2 mL larutan FeSO4 5%. Kemudian dicampurkan hingga

rata kemudian mengamati perubahan yang terjadi. Uji positif timbul warna kuning. 3.2 Analisis kuantitatif vitamin C 3.2.1 Metode iodimetri Dasar dari metode ini adalah sifat mereduksi asam askorbat. Metode iodometri (titrasi langsung dengan larutan baku 0,1 N) dapat digunakan terhadap asam askorbat murni atau larutannya. Prosedur penetapan kadar vitamin C secara iodometri: Sekitar 400 mg asam askorbat yang ditimbang seksama dilarutkan dalam campuran yang terdiri atas 100 mL air bebas oksigen dan 25 mL asam sulfat encer. Larutan dititrasi dengan iodium 0,1 N menggunakan indikator kanji sampai terbentuk warna biru. 3.2.2 Metode 2,6-diklorofenolindofenol (DCIP) Metode 2,6-diklorofenolindofenol (DCIP) ini

berdasarkan atas sifat mereduksi asam askorbat terhadap zat warna 2,6-diklorofenolindofenol membentuk larutan yang tidak berwarna. Pada titik akhir titrasi, kelebihab zat warna yang tidak tereduksi akan berwarna merah muda dalam larutan asam. Metode ini tidak spesifik karena beberapa senyawa mereduksi lainnya dapat mengganggu penetapan. Senyawa pengganggu tersebut riboflavin dll. Cara untuk menghilangkan pengaruh senyawa adalah senyawa sulfhidril, tiosulfat,

pengganggu adalah: 1. Asam askorbat diubah menjadi asam dehidroaskorbat 2. Jumlah senyawa mereduksi yang masih ada ditetapkan Bahan yang digunakan untuk metode ini adalah: a. Larutan pengekstraksi Larutan asam metafosfta-asam asetat dibuat dengan

melarutkan 15 g asam metafosfat dalam 40 mL asam asetat

dan 200 mL aquades dengan penggojogan lalu diencerkan sampai 500 mL. b. Larutan baku asam askorbat Dibuat dengan menimbang seksama 50 mg asam askorbat baku yang telah disimpan dalam desikator dan dihindarkan dari pengaruh cahaya lalu memindahkannya ke labu takar 50 mL, melarutkannya dan mengencerkannya sampai batas tanda dengan larutan asam metafosfat-asam asetat. c. Larutan baku diklorofenol-indofenol (DCIP) Dibuat dengan melarutkan 50 mg garam Na 2,6-

diklorofenolindofenol (DCIP) yang telah disimpan dalam desikator dalam 50 mL air yang telah ditambah 42 mg natrium bikarbonat, lalu digojog kuat. d. Indikator pH timol biru 0,04% dibuat dengan menggunakan 100 mg biru timol dengan 10,75 mL NaOH 0,02 N dengan penghangatan. Prosedur penetapan kadar vitamin C dalam minuman

menggunakan metode ini: a. Pembakuan larutan baku DCIP dengan larutan baku vitamin C b. Uji pendahuluan adanya senyawa basa dalam jumlah cukup besar c. Penyiapan larutan sampel d. Penetapan kadar e. Perhitungan Mg asam askorbat/g,tablet,mL= (X-B) x x X = volume rata-rata DCIP untuk titrasi sampel B = volume rata-rata DCIP untuk titrasi blanko F = kesetaraan mg asam askorbat/mL DCIP E : jumlah g sampel V : volume larutan uji awal yang diambil Y : volume aliquot

3.2.3 Metode kolorimetri 4-metoksi-2-nitroanilin Sebanyak 2 mL pereaksi 4-metoksi-2-nitroanilin

ditambah 2 mL natrium nitrit 0,2% diaduk hingga warna jingga hilang lalu ditambah 75 mL n-butil alcohol dan dicampur. Larutan ini selanjutnya ditambah 0,5-2mg asam askorbat 0,5% dan dipindahkan ke dalam corong pemisah. Selanjutnya larutan ditambah 25 mL natrium hidroksida 10% dan 150 mL dietil eter. Lapisan organic dicuci tiga kali dengan 15 mL natrium hidroksida 10%. Lapisan air dan cairan hasil cucian dengan air diencerkan dengan air hingga 200 mL. absorbansi larutan diukur terhadap blangko pada 570 nm. 3.2.4 Metode spektrofotometri Asam askorbat dalam larutan air netral menunjukkan absorbansi maksimum pada 264 nm. Panjang gelombang maksimum ini akan bergeser oleh adanya asam mineral. Asam askorbat dalam asam sulfat 0,01 N memiliki panjang gelombang maksimal 245 nm. 3.2.5 Metode spektrofluorometri Metode ini digunakan untuk analisis kuantitatif vitamin C yang linier pada kisaran konsentrasi asam askorbat 9,0 x 10-8 sampai 3,6 x 10-8. Suatu hubungan linier diperoleh antara penurunan intensitas fluoroensi MB dan konsentrasi AA pada kisaran 3,0 x 10-7 sampai 6,0 x 10-6 . batas deteksi metode ini 2,5 x 10-7 m. metode ini telah sukses digunakan untuk menetapkan kadar vitamin C dalam tablet suplemen vitamin. 3.2.6 Metode kromatografi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) telah dikembangkan untuk penentuan asam askorbat dalam minimum ringan dan jus apel menggunakan tris 2,2-bipiridin ruthenium II. Sampel disaring dan diencerkan sebelum dilakukan analisis

dengan KCKT dan tidak ada pra-perlakuan lain yang dilakukan. Pemisajhan asam askorbat menggunakan kolom oktadesil silan (ODS, C18) menggunakan fase gerak larutan buffer NaH2PO4K2HPO4 (pH 6,5). Aliran fase gerak 0,3 mL/menit. Asam askorbat yang terelusi dicampur dengan (Ru(bpy)32+ 0,5 mM dan diosidasi pada 1,5 V (dengan elektroda Ag/AgCl). Dari sini dapat diketahui bahwa metode ini relative sederhana dengan batas deteksi asam askorbat 10pmol dan kurva kalibrasinya linier pada kisaran 0,06 80 nmol. Karena metode ini sensitive dan selektif maka metode ini diusulkan untuk digunakan dalam analisis kuantitatif asam askorbat dalam minuman ringan dan jus apel. IV. Analisa Folat 4.1 Uji kuantitatif folat Uji kuantitatif pada folat dapat dilakukan dengan menggunakan metode KCKT, berikut hal yang dilakukan untuk melakukan analisa kuantitatif folat : Sampel disiapkan kemudian ditambahkan natrium askorbat 1%, lalu memanaskannya mendinginkannya Sebanyak 3 mL supernatant dicampur dengan konjugase yang berasal dari plasma manusia dan buffer fosfat 0,1 M pH 6,0 yang mengandung natrium askorbat 0,5% Kemudian diinkubasi pada suhu 37 selama 1 jam di tempat gelap pada air mendidih selama 15 menit dan

Sampel disentrifuse, lalu dilewatkan dalam kolom penukar ion yang kuat yang telah dikondisikan dengan 1 volume yang terdiri atas methanol dan air

Kolom selanjutnya dicuci dengan 2 volume kolom yang terdiri atas air, kemudian folat dipindahkan dengan 1 mL larutan natrium klorida 10% yang mengandung natrium askorbat 1%

Folat dipisahkan dengan kolom pengaman 30 x 4,0 mm i.d dan dilanjutkan dengan kolom analitik (keduanya berisi oktadesil silan, ukuran partikel 5 mikron)

Kolom dijaga suhunya pada 27 , denagn eluennya asetonitril 8% dalam asam aseta pH 2,3

Folat dideteksi berdasaarkan flourensinya menggunakan panjang gelombang eksitasi 310 nm dan emisi 352 nm

V. Analisa Niasinamid 5.1 Uji kuantitatif niasinamid Uji kuantitatif pada niasinamid dilakukan dengan metode

spektrofotometri. Prosedur penetapan kadar niasinamid dengan metode spektrofotometri : 1. Penyiapan sampel Gerus sampai halus 5 tablet atau sejumlah volume tertentu sampel Sampel ditimbang, lalu dimasukkan dalam erlenmeyer, ditambah larutan KH2PO4 0,3% sejumlah 2 x mg niasinamid yang diperkirakan (jika

sampel tidak mudah larut, maka digojog supaya terdispersi dan dipanaskan selama 15 menit di penangas air mendidih) Dilakukan pengenceran hingga diperoleh kadar kuran lebih dengan KH2PO4 0,3%. Larutan disaring bila diperlukan. 2. Cara penetapan 5g/mL

Disiapkan secara terpisah sampel blanko untuk tiap sampel dengan mengganti CNBr dengan aquades Sebanyak 1,0 mL larutan uji dimasukkan dalam tabung, ditambah 0,5 mLlarutan CNBr, lalu dicampur dan dibiarkan selama 25 30 menit. Kemudian larutan ditambah 10 mL larutan asam barbiturate dan dicampur Dibuat juga pereaksi blanko dengan mengganti CNBr dengan aquades, dan absorbansinya dibaca pada gelombang 550 nm.

3. Perhitungan Kadar niasinamid dalam sampel (mg) :

A = Absorbansi larutan sampel A = Absorbansi larutan baku kerja 5 = g niasinamid/mL larutan baku uji Kadar niasinamid dilaporkan dalam mg niasinamid/ tablet, kapsul atau mL cairan. Metode KCKT juga digunakan untuk melakukan uji kuantitatif terhadap niasinamid. Sampel diperlakukan dengan SPE (solid phase extraction) untuk menghilangkan adanya gangguan dalam sampel yang mungkin akan mengganggu dalam analisis, berikut langkah kerja yang dilakukan melalui metode KCKT : Sebanyak 5 gram sampel ditambah dengan 20 gram air deionisasi. Campuran kemudian dihomogenkan dengan homogenizer pada kecepatan sedang selama 1 menit Sampel kemudian disentrifuse selama 10 menit dengan kecepatan 14.000 xg. Cartridge SPE dikondisiksn dengan mengalirinya menggunakan 10 mL methanol dan 10 mL air yang diatur pH nya 4,2 untuk mengaktifkan fasa diamnya.

Sebanyak 10 ml sampel dielusi dengan 5 mL air (pH 4,2) lalu dengan 10 mL etanol dengan kecepatan alir 1 mL/menit, Eluen dikumpulkan dalam botol, lalu diuapkan hingga kering, kemudian asampel disaring dengan penyaring 0,45 mikron, dan sebanyak 20 L sampel diinjeksikan dalam kolom KCKT. Kolom yang digunakan adalah kolom fase terbalik C18 (150 mm x 4,6 mm dengan ukuran partikel 5 mikron).

Detector yang digunakan adalah UV-Vis diode array Fase gerak disaring melalui membrane 0,45 mikron dan gas pada fase gerak dihilangkan dengan sonifikasi. Fase gerak terdiri atas, larutan KH2PO4 0,1 M (pH 7) methanol (90 10) dengan kecepatan alir fase gerak 0,7 mL/menit. Kolom dioperasikan pada suhu 25

Identifikasi sampel dengan membandingkan waktu retensi dan spectra UV dengan senyawa baku.

BAB IV PENUTUP

4.1

Simpulan Analisa kualitatif dan kuantitatif pada vitamin A,B dan C menggunakan berbagai metode yang disesuaikan dengan tujuan analisis.

4.2

Saran Perlu dilakukan penelaahan lanjut mengenai analisis vitamin lain dengan berbagai metode berbeda

DAFTAR PUSTAKA Darmajana, Doddy A. 2004. Kajian Analisa Kandungan Vitamin Dan Mineral Daintih.J, 1999, Kamus Kimia, Erlangga, Jakarta Poedjiadi, 1994, Dasar-dasar Biokimia, Universitas Indonesia, Jakarta Rohman, Abdul, Sumantri, 2007, Analisis Makanan, Gajah Mada University Press, Yogyakarta Winarno.F.G, 1982, Analisa Bahan Pangan, UI Press, Jakarta

KATA PENGANTAR

Segala puji bagi Allah SWT, Tuhan semesta alam, yang telah mencurahkan rahmat, taufik, dan hidayahnya sampai akhirnya penulis dapat menyelesaikan karya tulis imiah dengan judul Analisis Kualitatif dan Kuantitatif Vitamin A,B dan C dengan lancar. Penulis mengucapkan terima kasih kepada pihak-pihak yang telah membantu penulis dalam penyelesaian karya tulis ilmiah ini, karena tanpa adanya bantuan dari pihak-pihak tersebut penulis tidak akan dapat menyelesaikan karya tulis ilmiah ini lebih baik. Adapun pihak-pihak tersebut antara lain : 1. Bapak Khabibi selaku dosen mata kuliah Analisa Pangan di Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Diponegoro Semarang yang telah membimbing dengan sepenuh hati demi keberhasilan penulis menyelesaikan makalah ini. 2. Teman-teman yang telah bersedia memberikan masukan penuh manfaat yang dapat dijadikan acuan dalam menyempurnakan karya tulis ilmiah. 3. Para pembaca yang budiman. Penulis memohon maaf jika terdapat kesalahan, baik dalam penulisan maupun penyampaian kalimat dalam makalah ini. Penulis berharap agar makalah ini dapat memberikan manfaat berupa tambahan wawasan bagi para pembaca. Selain itu penulis juga mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari para pembaca untuk penyempurnaan karya makalah. Terima kasih.