ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTITATIF VITAMIN A, D dan C

DISUSUN OLEH : 1. 2. 3. 4. 5. 6. MIKE TOBING YULIANA MANIK RIZKA SURYA PERMATA MERY GULTOM PALUPI DYAH ARUMSARI PUSPITA RINI (J2C006034) (J2C007055) (J2C009011) (J2C009027) (J2C009040) (J2C009057)

JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS DIPONEGORO 2011

BAB I PENDAHULUAN

I. Latar Belakang Vitamin merupakan suatu molekul organik yang sangat diperlukan tubuh untuk proses metabolisme,pertumbuhan yang normal,transportasi oksigen dan anti oksidan. Vitamin membantu tubuh menggunakan karbohidrat, protein, dan lemak. Vitamin-vitamin tidak dapat dibuat oleh tubuh manusia dalam jumlah yang cukup,oleh karena itu harus diperoleh dari bahan pangan yang

dikonsumsi. Vitamin pada umumnya dapat dikelompokkan ke dalam 2 kelompok yaitu vitamin yang larut dalm lemak seperti, vitamin A,D,E,dan vitamin K ; serta vitamin yang larut dalam air seperti, vitamin B dan vitamin C. Sejak vitamin pertama kali diteliti pada tahun 1897 karena adanya penyakit beri-beri,sekarang ini semakin banyak dilakukan analisa terhadap vitamin,baik analisa kualitatif maupun analisa kuantitatif pada vitamin.

II. Rumusan Masalah Pentingnya vitamin dalam melangsungkan pertumbuhan normal serta memelihara kesehatan pada tubuh makhluk hidup, namun kebanyakan vitamin tidak dapat disintesis oleh tubuh maka banyak dilakukan analisa terhadap vitamin, sehingga dari uraian tersebut timbul masalah sebagai berikut, 2.1.Bagaimana analisa kualitatif pada vitamin ? 2.2 Bagaimana analisa kuantitatif pada vitamin?

III. Pembatasan Masalah Dari rumusan masalah yang telah disebutkan diatas,dapat dibatasi suatu masalah dalam pembahasan,”Bagaimana analisa kualitatif dan kuantitatif pada vitamin khususnya viatamin A,B,dan vitamin C?”

IV. Tujuan Penulisan Tujuan dari penulisan tulisan ilmiah ini adalah : 4.1. Mengetahui metode analisa kualitatif vitamin A,B,dan vitamin C. 4.2. Mengetahui metode analisa kuantitatif vitamin A,B,dan vitamin C.

Vitamin merupakan suatu molekul organik yang sangat diperlukan tubuh untuk proses metabolisme. Vitamin A alkohol (retinol) . Vitamin yang larut dalam lemak akan disimpan oleh tubuh dalam hati.pertumbuhan yang normal. karbohidrat. Vitamin A Vitamin A merupakan vitamin yang larut dalam lemak. Vitamin yang larut dalam lemak yaitu vitamin A. sehingga akan menumpuk daalm tubuh bila dikonsumsi dalam jumlah banyak. dan limpa. darah. maupun lemak.D. Vitamin yang larut dalam air bergerak bebas dalam badan. Vitamin Vitamin dikenal sebagai suatu kelompok senyawa organic yang tidak termasuk dalam golongan protein. karena bersifat larut dalam air maka vitamin ini mudah rusak oleh pengolahan dan mudah hilang karena tercuci atau terlarut oleh air dan akhirnya keluar dari bahannya. atau jaringan-jaringan lemak. karena bersifat tidak larut dalam air maka vitamin ini tidak dikeluarkan dari dalam tubuh. II. dan terdapat dalam jumlah yang kecil dalam bahan makanan tetapi sangat penting peranannya bagi beberapa fungsi tertentu tubuh untuk menjaga kelangsungan kehidupan serta pertumbuhan.BAB II TINJAUAN PUSTAKA I.E dan K. sedangkan vitamin yang larut dalam air yaitu vitamin B dan C. III. Klasifikasi Vitamin Vitamin pada umumnya dapat dikelompokkan menjadi 2 golongan utama. transportasi oksigen dan anti oksidan. Merupakan jenis vitamin yang aktif dan terdapat dal beberapa bentuk : 1. yaitu vitamin yang larut dalam lemak dan vitamin yang larut dalam air.

sinar. dan labu kuning. kolina. biotin. dan reaksi deaminasi. selain itu juga berperan dalam proses oksidasi fenilanin menjadi tirosin.dan dalam reaksi fiksasi CO2 pada proses perubahan perurat menjadi oksaloasetat.2. yaitu pada proses fotokimia pada retina. Vitamin A berfungsi dalam proses melihat. Tiamin (vitamin B1) merupakan vitamin yang larut dalam air yang merupakan kofaktor enzim yang berperan dalam metabolisme karbohidrat dan asam amino. sehingga dapat terjadi sintesis metionin. dekarboksilasi. Biotin berpartisipasi dalam proses karboksilasi. 4. sintesis asam lemak. Kekurangan vitamin akan menyebabkan seseorang tidak dapat melihat dengan jelas dalam cahaya redup (rabun senja). Vitamin B6 (piridoksin) berperan dalam . dan lemak yang sudah tengik. dan alkali. Folasin berperan dalam biosintesis dan pemindahan satu satuan karbon seperti gugus metal. reproduksi. asam pantotenat. riboflavin (vitamin B2). dan penambahan gugus metil pada pirimidina sehingga terbentuk timin. serta vitamin B12(sianokobalmin). ekspresi gen. IV. Vitamin A aldehida (retinal) Vitamin A asam (asam retinoat) Vitamin A ester (ester retinil) Vitamin A pada umumnya stabil terhadap panas. ubu jalar. folasin (asam folat dan turunan aktifnya). Vitamin B Vitamin B termasuk dalam kelompok vitamin yang disebut vitamin B kompleks yang meliputi tiamin (vitamin B1). piridoksin (vitamin B6). Riboflavin (vitamin B2) yang berperan dalam membantu metabolisme tubuh. niasin (asam nikotinat. asam. namun mudah teroksidasi oleh udara dan akan rusak bila dipanaskan pada suhu tinggi bersama udara. serta berperan pada siklus Krebs. Sayuran dan buah-buahan yang berwarna hijau atau kuning biasanya banyak mengandung karoten seperti wortel. 3. Vitamin A terdapat dalam bentuk provitamin yaitu karoten dalam tumbuhan. dan respon imun tubuh.niasinamida). Asam pantotenat yang berperan dalam metabolisme asam lemak. Niasin berperan untuk metabolisme energi.

proses hidroksilasi dua asam amino prolin dan lisin menjadi hidroksi prolin dan hidroksilin. alkali. Oksidasi akan terhambat bila vitamin C dibiarkan dalam keadaan asam. Vitamin B12 (sianokobalamin) yang berperan dalam metabolisme protein dan sel-sel darah. . Dari semua vitamin yang ada. serta pada respirasi sel. Peranan vitamin C adalah dalam pembentukan kolagen interseluler. Vitamin C Vitamin C dapat berbentuk sebagai asm L-askorbat dan asam Ldehidroaskorbat. Vitamin C mudah larut dalam air namun mudah teroksidasi dan proses tersebut dipercepat dengan adanya panas.metabolisme protein dan glikogen. oksidator. sinar. Asam askorbat sangat mudah teroksidasi secara reversible menjadi asam L-dehidroaskorbat yang dapat mengalami perubahan lebih lanjut menjadi asam L-diketogulonat yang tidak memiliki keaktifan vitamin C lagi. serta oleh katalis tembaga dan besi. V. atau pada suhu rendah. enzim. vitamin C merupakan vitamin yang paling mudah rusak.

Sebagai pedoman dapat digunakan garis raksa pada 313. Analisis vitamin A 1. dan terlindung dari senyawa oksidator.1 nm. Beberapa penggangu. . Kemudian ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrid (untuk menghilangkan air) dan 1 mL larutan SbCl3 (kondisi fresh). kitol. Prosedur penetapan vitamin A secara spektrofotometri: Penetapan dilakukan secepat mugkin.7 nm dan 486. dan asma polien. terutama pada minyak ikan adalah vitamin A2.1 Analisis kualitatif Dalam uji kulaitatif sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan tetes demi tetes kloroform hingga larut.5 nm serta garis hidrogen pada 379. Dengan demikian senyawa penganggu ada vitamin A sintetik dengan minyak ikan yang berbeda.BAB III PEMBAHASAN I. Apabila dianalisis menggunakan spektrometri panjang gelombang maksimum 325 sampai 328 nm 1. Larutan vitamin a dalam isopropanol absorbansinya diukur pada λmaks dan pada dua titik.1 Metode spektrofotometri Spektrum absorbsi ultraviolet vitamin A dan vitamin A secara asetat mempunyai absorbansi maksimal pada panjang gelombang antara 325 sampai 328 nm dalam berbagai pelarut. terlindung dari cahaya. anhidro vitamin A.16 nm dan 334.2 Analisis kuantitatif 1. Absorbansi pada λmaks dikoreksi terhadap senyawa penggangu dengan menggunakan formula koreksi karena senyawa-senyawa ini akan ikut menyerap pada daerah UV. Sebelum dilakukan penetapan kadar. Pada vitamin A sintetik senyawa penganggu adalah senyawa-senyawa antar ( intermediet). skala spektrofotometer diperiksa terlebih dahulu. yakni satu disebelah kanan λmaks dan satunya lagi pada sebelah kiri λmaks.2.

a.Ketepatan absorbansi yang telah dikoreksi lebih rendah jika dibandingkan dengan absorbanasi yang diamati langsung dan digunakan dalma perhitungan.907 1.550 0. Absorbansi larutan diukur pada panjang gelombang yang tertera dalam daftar berikut dan dihitung sebagai absorbansi relatif terhadap absorbansi pada λ 328 nm.299 . Panjang gelombang 300 nm 316nm 328nm 340nm 360nm Absorbansi relatif 0. Cara penetapan akseroftol murni adalah sebagai berikut: Sejumlah sampel atau sampel yang sudah dimurnikan ditimbang secara saksama lalu dilarutkan dalam sikloheksan secukupnya hingga diperoleh larutan yang mengandung antara 9 SI sampai 15 SI tiap mL dan ditetapkan panjang gelombang maksimalnya. Akseroftol dalam bentuk ester Zat yang tidak larut dalam sikloheksan dimurnikan dengan cara penyaringan atau cara lain yang tidak menggunakan cara penyabunan. Karena itu pengukuran absorbansi membutuhkan perhatian khusus dan sekurang-kurangnya harus dilakukan dua kali penetapan. Jika cara pemurnian tersebut tidak dilakukan.811 0.000 0. maka penetapan dilakukan menurut cara yang tertera dalam akseforol lain.

002 dari harga yang tertera dalam daftar. b. 325 nm dan 334 nm. [A328 nm (kor)] terletak dalam batas ± 3 % dan harga absorbansi yang belum dikoreksi maka perhitungan dilakukan dengan menggunakan harga absorbansi yang belum dikoreksi.Jika panjang gelombang absorbansi maksimal terletak antara 326 nm dan 329 nm.akukan penentuan panjang gelombang maksimal. 310 nm.52( 2A 328 nm – A316 nm – A340 nm)  Jika harga absorbansi yang telah dikoreksi.  Jika harga absorbansi yang telah dikoreksi terletak lebih kecil dari 85% dan lebih besar daari 103% dari harga yang belum dikoreksi atu jika panjang gelombang absorbansi maksimal tidak terletak antara 326 nm sampai 329 nm. dicampur dengan 30 ml etanol mutlak dan m mL kalium hidroksida 50 %. maka penetapan kadar dilakukan menurut cara yang tertera pada akseroftol lain. tetapai absorbansi relatif yang terbaca lebih besar dari 0. Absorbansi larutan diukur pada λ 300 nm. maka perhitungan dilakukan dengan menggunakan harga absorbansi yang belum dikoreksi. Perhitungan potensi dilakukan sebagai berikut:  Jika panjang gelombang maksimal terletak antar 323 nm dan 327 nm dan perbandingan absorbansi pada 300 nm terhadap .  Jika harga absorbansi yang telah dikoreksi terletak antara 85% sampai 97% dari harga yang belum dikoreksi. maka dihitung absorbansi pada 328 nm yang dikoreksi dengan rumus: A328 nm (kor) = 3. Selanjutnya dil. Akseroftol lain Cara penentuan afseroftol lain: sejumlah zat yang ditimbang secara saksama (mengandung tidak kurang dari 500 SI akseroftol dan tidak lebih dari 1 gram lemak).

2 Metode Kolorimetri a.000  Jika absorbansi yang telah dikoreksi terletak dalam batas ± 3 % dari harga absorbansi yang belum dikoreksi.73. 815 A325 nm . Warna yang terjadi intensitasnya cepat maksimun tetapi juga cepat pucat.  Jika panjang gelombang absorbansi maksimal tidak terletak antara 325 nm dan 327 nm atau jika perbandinganabsorbansi pada 300 nm terhadap absorbansi pada 327 nm lebih dari 0. Pengubahan akseroftol menjadi anhidroakseroftol Akseroftol mudah diubah menjadi anhidroakseroftol dengan bantuan sejumlah kecil asam mineral atau asam organik kuat. b. perhitungan dilakukan dengan menggunakan harga absorbansi yang belum dikoreksi.26 A334 nm Potensi dalam SI tiap zat yang diperiksa dihitung dengan rumus: A325 nm (kor) x 18. Metode Carr-price Metode ini berdasarkan atas reaksi akseroftol dengan antimon triklorida anhidrat dalam kloroform yang menghasilkan warna biru.absorbansi pada 327 nm tidak lebih dari 0. maka absorbanasi yang telah dikoreksi [A325 nm(kor)] dihitung dengan rumus: A325 nm (kor) = 6.555 A310 nm – 4.2.2. maka yang tidak tersabunkan dari zat yang diperiksa harus dimurnukan dengan cara kromatorafi. akseroftol diubah menjadi anhidroakseroftol dalam pelarut benzen dengan katalisator asam . 1.73. Reaksi ini terjadi antar antimon triklorid dengan rantai tidak jenuh dari akseroftol. Pada metode Budowski dan bondi. Karoten. asam poliena dan beberapa senyawa dalam minyak ikan mengahasilkan warna biru juga.

Metode ini telah sukses memisahkan 7 isomer vitamin A yakni: 11. Setelah selesai saponifikasi.d) dan kolom analisis (100x 2mm i. Kenaikan absorbansi pada 399nm merupakan hasil dehidrasi yang berbanding langsung dengan jumlah akseroftol yang terkandung.pengukuran absorbansi pada 358 nm.13-di- .692.etanolik 1%. Sebanayk 30 mL air ditambahkan ke dalam sampel (jika sampelnya padat). Karena panjang gelombang absorbsi maksimun isomer-isomer ini berbeda maka digunakan detektor photodiode array(PAD). dan 399 nm dalam benzen merupakan cara yang baik untuk mengetahui kemurnian akseroftol yakni dengan melihat bahwa A 0. 377 nm.isomer gometri retinol 399 nm/ A377 nm sebesar (vitamin A)dipisahkan dengan kolom pengaman ( 7 x 2 mm i. Eluat selanjutnya diuapkan dan dilarutkan kembali dengan 2-50 mL isooktana (tergantung pada konsentrasi Vitamin A dalam sampel mula-mula).0 gram) dihomogenkan. Sebagai eluen adalah heksan yang mengandung 1-oktanol dalam konsentrasi rendah.10. dan 0.2. solut diencerkan samapi 250 mL dengan air etanol untuk memperoleh suatu rasio etanol:air(1:1 v/v). 80 mL etanol mutlak.5 gram asam askorbat untuk menghindari terjadinya oksidasi. Saponifikasi dilakukan dengan mencampur 40 mL sampel yang telah dihomogenkan dengan 12 mL larutan KOH 60%.d) yang keduanya berisi silika ggel dengan ukuran partikel 3 mikron. 11.3 Metode Kromatografi Aktivis isomer vitamin A cukup berbeda sehingga untuk pemisahannya dikembangkan dengan kolom mikrobore. 0. 1.toluen –p-sulfonat pada temperatur kamar.868 dan A 358 nm / A 377 nm sebesar 0. Sampel diaduk pada suhu kamar selama 16 jam. Sampel ( 1.cis.0. Sebanyak 20 mL aliquot ditambahkan ke dalam cartidge Kiselguhr dan setelah 20 menit diekstraksi dengan 50 mL petroleumeter ringan.5 mL terbutilhidroksi toluen.

Struktur dari vitamin B kompleks adalah sebagai berikut: Vitamin B2 Vitamin B1 Vitamin B5 Vitamin B6 2. Larutan . broflasin serta vitamin B12.672.0. Tiamin hidroklorid dalam keadaan kering cukup stabil dan pada pemanasan 100oC selama 1 jam tidak berkurang potensinya. 0.568. pereduksi (vitamin B6). II. dan semua trans-retinol dengan waktu retensi relatif terhadap trans-retinol masing-masing sebesar 0.7-cis. Analisis Vitamin B Vitamin B komplek merupakan thiamin. asam pantofenat. 0.510.740.13-di-cis.1 Analisis Vitamin B1 Dalam makanan. dan 1.924.9. 0.000.cis: 13-cis.877. riboflafin. 0. 9-cis . vitamin B1 (Tiamin HCl) dapat ditemukan dalam bentuk bebas atau dalam bentuk kompleks dengan protein atau kompleks protein-fosfat.

2. Satu gram tiamin hidroklorida kristal setara dengan 333. dan senyawa netral akan keluar dari kolom. Kandungan vitamin B1 dalam susu dilakukan dengan metode ini. Tiamin bebas perlu dimurnikan dari senyawa pengganggu dengan mengalirkannya melalui zeolit (suatu penukar ion anorganik) sehingga tiamin akan tertinggal dalam zeolit sedangkan senyawa lain seperti reduktor. Kemudian perhatikan larutan campuran tersebut di bawah lampu ultraviolet. 3 tetes K3Fe(CN)6 0. . Tiamin mononitrat padat lebih stabil daripada tiamin hidroklorida. Kemudian tambhkan 3 tetes NaOH 30%.2 Uji Kualitatif Vitamin B1 : 1. dan diukur fluoreseneinya.tiamin hidroklorid dalam air dan suasana basa dapat disterilisasi pada 110oC. Apabila hasil campuran tersebut menjadi berwarna biru maka uji positif pada sampel.1. akan tetapi jika pH larutannya diatas 5. asam. 2.1.1 Uji kuantitatif Vitamin B1 : Metode ini dilakukan dengan cara memasukkan sedikit serbuk (sampel) ke dalam tabung reaksi.000 SI.6% dan 1 mL isobutanol. Kemudian tiamin dielusi dari zeolit dengan kalium klorida yang diasamkan. Untuk sampel yang mengandung protein diperlukan enzim proteolitik seperti pepsin. Vitamin B1 dioksida dengan kalium ferisianida dalam suasana basa membentuk tiokrom. Metode Spektrofluorometri Tiamin dalam makanan dan dalam sediaan farmasi harus disari lebih dahulu secara kuantitatif yang biasanya dengan mendidihkannya dalam asam encer kemudian tiamin dibebaskan dari persenyawaan kompleks dengan enzim fosfatase.5 maka akan cepat terhidrolisis. Intensitas fluoresensi sebanding dengan kadar vitamin B1. Kemudian dikocok hingga bercampur rata.

dan diulangi lagi dengan menambahkan 300 mL H2O.8). Larutan ini dibuat baru setiap hari. Larutan indikator diencerkan dengan H2O sampai 200 mL. Larutan indikator diencerkan dengan H2O sampai 250 mL.  Larutan kalium klorida-asam.  Larutan enzim 10% (b/v) dibuat dengan melarutkan 10 gram enzim diastase dalam akuades dan mengencerkannya sampai 100. Larutan ini dibuat baru tiap hari. pencucian diulang hingga diperoleh H2O sampai jernih. diaduk selama 15 menit.0) – biru (5.5 mL HCl pada 1 L larutan kalium klorida di atas.8 mL NaOH 0. disiapkan dengan melarutkan 272 gram natrium asetat trihidrat dalam air secukupnya hingga 1 L. Jika terbentuk suspensi resin.  Indikator pH bromofenol biru dibuat dengan melarutkan 100 mg indikator dalam 3.6). Kisaran warna indikator: kuning (3. dibuat dengan menambahkan 8.  Larutan kalium ferisianida 1%. disaring.0) – biru (4.  Larutan natrium asetat 2 N.0.05 N dengan penghangatan.0 mL.05 N dengan penghangatan.  Indikator pH brom kresol hijau dibuat dengan melarutkan 100 mg indikator dalam 2.5– 7. Akuades (H2O) harus bebas dari suspensi resin ketika didiamkan selama 15 detik.  Larutan kalium klorida netral 25% (b/v). Kisaran warna indikator: hijau (4. diaduk selama 1 menit.0 mL NaOH 0. dibuat dengan melarutkan 250 gram KCl dalam air secukupnya hingga 1 L.Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis vitamin B1 dalam susu adalah sebagai berikut:  Resin untuk kromatografi. . dan diulangi lagi sampai diperoleh pH H2O antara 4. disaring. disiapkan dengan menambah 50 gram BioRex dengan 300mL HCl 2 N. dibuat dengan melarutkan 1 gram K3Fe(CN)6 dalam air secukupnya lalu mengencerkannya sampai 100 mL.

0 mL larutan kalium ferisianida 1% dengan NaOH 15% secukupnya hingga 100 mL.0 mg baku tiamin HCl yang telah dikeringkan dalam desikator (Tiamin HCl bersifat higroskopik. Prosedur penetapan kadar vitamin B1 secara spektrofluorometri: a. b.5–4.100 µg/mL. dibuat dengan melarutkan 10 mg kinin sulfat dalam asam sulfat 0.1 N sampai 200 mL.  Alkohol yang diasamkan dibuat dengan mengencerkan 250 mL alkohol dengan H2O sampai 1 L.  Larutan asam asetat 3%. Penyiapan larutan baku Tiamin HCl i. oleh karena itu berhati-hatilah selama menimbang untuk menghindari penyerapan lembab) lalu memindahkannya dalam labu takar 500 mL. Penyiapan kolom Kromatografi Kolom kromatografi disiapkan dengan cara memasukkan glass wool dari atas kolom sampai ujung kolom. Cairan dijaga untuk tidak berada di bawah permukaan resin selama proses adsorbsi. dibuat dengan mengencerkan 3 mL asam asetat glasial dengan H2O sampai 100 mL.5–4.0 mL larutan stok kinin sulfat di atas dengan H2SO4 0. Pereaksi pengoksidasi disiapkan dengan mencampur 4.  Larutan stok kinin sulfat. Larutan baku stok (induk).3 lalu mengencerkannya sampai batas tanda dengan alkohol yang telah .  Larutan baku kinin sulfat dibuat dengan mengencerkan 5. Larutan baku ini disimpan dalam labu berwarna merah atau kuning. suspensi resin dimasukkan dalam H2O sampai ketinggian 10 cm. Dengan hati-hati. dibuat dengan menimbang secara seksama 50. Pereaksi ini digunakan dalam waktu 4 jam setelah pembuatan.  Isobutil alkohol.1 N secukupnya hingga 1 L. Larutan ini ditambah HCl tetes demi tetes untuk mengatur pH-nya antara 3.3. Larutan stok ini disimpan dalam labu berwarna merah atau kuning. Tiamin HCl dilarutkan dalam larutan alkohol 20% yang telah diasamkan dengan HCl untuk mengatur pH larutan 3.

1 N. iii. dibuat dengan mengencerkan 100. Larutan selanjutnya didigesti selama 30 menit pada penangas uap pada suhu 95–100oC atau dalam penangas air mendidih selama 30 menit dengan sesekali diaduk. Larutan antara 10 µg/mL.1 µg/mL. v.diasamkan. c.1 N. Larutan didinginkan dan diencerkan sampai 100 mL dengan HCl 0.0 mL larutan baku antara lalu ditambah 50 mL HCl 0. ii. Larutan ini dibuat baru setiap kali pengujian.0 mL.  Untuk sampel-sampel yang mengandung tiamin bebas (tidak digunakan untuk sampel yang mengandung tiamin pirofosfat). Larutan baku kerja. Untuk sampel kering atau setengah kering yang mengandung senyawa basa dalam jumlah kecil.0 mL larutan baku kerja lalu dilanjutkan dengan proses hidrolisis enzim dimulai dengan “larutan diencerkan dengan 65 mL”.0 mL larutan kerja (iii) sampai 100 mL dengan HCl 0.1 N. dibuat dengan mengambil 10. penyiapan sampelnya: ditimbang . Larutan disimpan dalam botol berwarna kuning atau merah dalam refigerator (Larutan ini stabil dalam beberapa bulan).5–4. Larutan baku kerja untuk sampel-sampel yang mengandung tiamin bebas. Larutan disimpan dalam botol tertutup yang kedap terhadap cahaya pada suhu 10oC. iv. dibuat dengan mengencerkan 20. Larutan ini ditandai sebagai larutan baku uji (mengandung tiamin HCl 5 µg) dan dilanjutkan dengan proses oksidasi. dibuat dengan cara: mengambil 20.3. Penyiapan sampel (ekstraksi) i. Larutan baku kerja untuk sampel-sampel yang mengandung tiamin pirofosfat.0 mL larutan stok (induk) 100 µg/mL diatas sampai 1 L dengan alkohol 20% yang telah diasamkan dengan HCl untuk mengatur pH antara 3. Setelah selesai dilanjutkan dengan pemurnian hingga diperoleh larutan 25. Larutan ini ditandai sebagai larutan baku uji dan dilanjutkan secara langsung dengan proses oksidasi.

2 µg/mL. penyiapan sampel dilakukan dengan cara: diambil sejumlah tertentu sampel secara seksama yang setara dengan 15 µg tiamin HCl. ditambah HCl encer dalam sampel hingga pHnya ± 4.1 N hingga mengandung ± 0. larutan digojog kuat hingga semua partikel padat bersentuhan dengan cairan.1 N sebanyak 10 kali berat sampel kering dalam gram. ditambah sejumlah volume H2O hingga volumenya 10 kali berat sampel kering dalam gram.2 µg/mL. Jika terjadi gumpalan. Larutan selanjutnya diencerkan dalam labu takar dengan HCl 0. Tepi labu dicuci dengan HCl 0. larutan digojog kuat hingga semua partikel padat bersentuhan dengan cairan.sejumlah sampel secara seksama yang setara dengan 15 µg tiamin HCl lalu dimasukkan dalam labu yang berukuran sesuai dan ditambah sejumlah mL HCl 0. Campuran diaduk hingga sampel terdispersi dalam cairan. dimasukkan dalam labu yang berukuran . Tepi labu dicuci dengan HCl 0.  Untuk sampel kering atau setengah kering yang mengandung senyawa basa dalam jumlah cukup tinggi.  Untuk sampel cair. Larutan selanjutnya didigesti selama 30 menit pada penangas uap pada suhu 95–100oC dengan seringkali diaduk lalu didinginkan. Larutan ini ditandai sebagai larutan sampel uji. dimasukkan dalam labu yang berukuran sesuai. Larutan selanjutnya diencerkan dalam labu takar dengan HCl 0.1 N. Campuran ditambah 1 mL HCl 10 N tiap 100 mL cairan.1 N. Larutan selanjutnya didigesti selama 30 menit pada penangas uap pada suhu 95–100oC dengan seringkali diaduk lalu didinginkan. Jika gumpalan masih terjadi. Jika terjadi gumpalan. penyiapan sampel dilakukan dengan cara: ditimbang sejumlah sampel secara seksama yang setara dengan 15 µg tiamin HCl. campuran digojog hingga semua partikel terdispersi. Jika gumpalan masih terjadi.1 N hingga mengandung ± 0. campuran digojog hingga partikel terdispersi. Larutan ini ditandai sebagai larutan sampel uji.

Larutan selanjutnya ditambah sejumlah volume H2O hingga volumenya 10 kali berat sampel dalam gram.1 N. Titik akhir ditandai dengan . Tepi labu dicuci dengan HCl 0.2 µg/mL.1 N. Hidrolisis dengan Enzim Sejumlah tertentu aliquot yang mengandung 10–25 µg tiamin diambil dan diencerkan dengan 65 mL HCl 0.5 µg/mL. d. Larutan ini ditandai sebagai larutan sampel uji. Larutan diencerkan dalam labu takar hingga mengandung ± 0.sesuai. Jika terjadi gumpalan. Larutan selanjutnya didigesti selama 30 menit pada penangas uap pada suhu 95–100oC dengan seringkali diaduk lalu didinginkan.0-4. campuran digojog hingga partikel terdipersi. pH masing-masing larutan diatur 4. Larutan ini ditandai sebagai larutan sampel uji. Untuk sampel-sampel yang mengandung tiamin pirofosfat.2–0. Jika terjadi gumpalan. Proses selanjutnya adalah dengan hidrolisis enzim dan dengan pemurnian. larutan digojog kuat. Jika gumpalan masih terjadi. Larutan diencerkan dalam labu takar dengan HCl 0. Larutan didigesti selama 30 menit pada penangas uap pada suhu 95–100oC dengan seringkali diaduk lalu didinginkan. penyiapan sampelnya dilakukan dengan cara: ditimbang sejumlah sampel secara seksama yang setara dengan 15 µg tiamin HCl. dan jika gumpalan masih terjadi campuran digojog.5 dengan penambahan larutan natrium asetat 2 N menggunakan indikator bromkresol hijau. dimasukkan ke dalam labu yang berukuran sesuai lalu ditambah sejumlah mL HCl 0.1 N hingga mengandung ± 0. pH larutan diatur dengan penambahan HCl atau NaOH hingga pH ± 4.1 N. Tepi labu dicuci dengan HCl 0. larutan digojog kuat hingga semua partikel padat bersentuhan dengan cairan. Larutan diaduk hingga sampel terdispersi dalam cairan.1 N sebanyak 10 kali berat sampel kering dalam gram. ii. Larutan ditambah 1 mL HCl 10 N tiap 100 mL cairan lalu diaduk hingga sampel terdispersi dalam cairan.

5 gram NaCl dan 5 mL larutan baku uji (larutan dijaga dari cahaya karena akan merusak tiokrom). dan pH-nya diatur ± 3. e. dicampur. Larutan selanjutnya ditambah 5 mL larutan enzim. ditambah 1. f.0–4. diinkubasikan pada suhu 45–50oC selama 3 jam.5 mL larutan KClasam yang hampir mendidih (>60oC) melalui kolom. Eluat yang diperoleh dari hasil hidrolisis dan pemurnian larutan baku dikumpulkan dalam labu takar 25 mL.5 menggunakan indikator bromofenol biru. Oksidasi Tiamin menjadi Tiokrom i. Kolom kromatografi dicuci 3 kali masing-masing dengan 5 mL H2O yag hampir mendidih. didinginkan. Larutan ini ditandai sebagai larutan sampel uji.perubahan warna biru yang tetap.1 N sampai 100 mL dan disaring melalui kertas saring yang tidak menyerap tiamin. Pemurnian Sejumlah aliquot larutan sampel yang telah disaring yang mengandung ± 5 µg tiamin dilewatkan pada kolom kromatografi yang telah dipersiapkan.  Untuk larutan baku uji.  Larutan digoyangkan ringan hingga terbentuk gerakan memutar dalam cairan dan segera ditambah 3 mL pereaksi pengoksidasi dengan pipet (gunakan pipet yang mampu mengeluarkan 3 mL pereaksi pengoksidasi dalam waktu 1-2 detik). Tiamin dielusi dari resin dengan melewatkan 5 kali masing-masing 4. Larutan diencerkan dengan HCl 0. Permukaan cairan jangan dibiarkan berada di bawah permukaan resin. lalu didinginkan. . oksidasi tiamin menjadi tiokrom dilakukan dengan cara: Pada masing-masing 2 tabung 40 ml. dan diencerkan dengan larutan KCl-asam sampai batas volume.  Pipet dipindahkan dan tabung sekali lagi digoyangkan supaya bercampur. Permukaan cairan jangan dibiarkan berada di bawah permukaan resin.

Sebanyak 10.    Pipet dipindahkan dan tabung digoyangkan sekali lagi supaya bercampur. larutan ditambah 13 mL isobutanol lalu ditutup tabungnya. ii. dilakukan juga sampel blanko dengan mengganti 3 mL pereaksi pengoksidasi dengan 3 mL larutan NaOH 15%. . Larutan selanjutnya digojog dengan kuat selama 2 menit.0 mL ekstrak isobutanol (lapisan atas) dipipet untuk selanjutnya diukur fluoresensinya. Pada salah satu tabung. ditambah 1. Pada salah satu tabung. Tabung disentrifugasi dengan kecepatan rendah sampai diperoleh supernatan yang jernih dari masing-masing tabung. Dengan segera.0 mL ekstrak isobutanol (lapisan atas) dipipet untuk selanjutnya diukur fluoresensinya.  Sebanyak 10.  Tabung digoyangkan ringan hingga terbentuk gerakan memutar dalam cairan dan dengan segera. larutan ditambah 13 mL isobutanol lalu ditutup tabungnya dan digojog kuat selama 2 menit.5 gram NaCl dan 5 mL larutan sampel uji (larutan dijaga dari cahaya karena cahaya akan merusak tiokrom). Untuk larutan sampel uji  Pada masing-masing 2 tabung 40 mL. larutan ditambah 3 mL pereaksi pengoksidasi dengan pipet (digunakan pipet yang mampu mengeluarkan 3 mL pereaksi pengoksidasi dalam waktu 1-2 detik).   Dengan segera.   Tabung disentrifugasi dengan kecepatan rendah sampai diperoleh supernatan yang jernih dari masing-masing tabung. dilakukan juga baku blanko dengan mengganti 3 mL pereaksi pengoksidasi dengan 3 mL larutan NaOH 15%.

sukrosa. dengan kadar 100 kali lebih besar dari kadar tiamin tetap tidak mengganggu. tirosin dan histidin yang terdapat dengan kadar 20 kali lebih besar daripada kadar tiamin juga tidak mengganggu. guanin. tepung. Dekstrosa. piridoksin.  Fluoresensi ekstrak isobutanol yang berasal dari larutan baku uji yang ditambah pereaksi pengoksidasi (S) diukur. selanjutnya diukur juga fluoresensi ekstrak isobutanol yang berasal dari larutan baku uji yang ditambah 3 mL larutan NaOH 15 % h. urea.35% dan mengencerkannya dengan air secukupnya hingga 200 mL. gliserofosfat dan logam berat. asam pantotenat. maltosa. Reprodusibilitas fluorometer diatur dengan menggunakan larutan baku kinin sulfat.g. Metode Kolorimetri Dasar metode ini adalah reaksi antara tiamin dengan 6-aminotimol yang telah didiazotasi. triptopan. asam nikotinat. Pengukuran fluoresensi tiokrom Fluoresensi tiokrom diukur pada λ eksitasi 365 nm dan λ emisi 435 nm.  Fluoresensi ekstrak isobutanol yang berasal dari larutan sampel uji yang ditambah pereaksi pengoksidasi (I) diukur. laktosa. Hasil peruraian tiamin tidak menghasilkan warna dengan pereaksi ini. nikotinamid. pepton. Perhitungan µg Tiamin HCl tiap 5mL larutan uji = 2. gelatin. adenin. Riboflavin. selanjutnya diukur juga fluoresensi ekstrak isobutanol yang berasal dari larutan sampel uji yang ditambah 3 mL larutan NaOH 15 % (b). kasein. Pereaksi 6-aminotimol dibuat dengan melarutkan 50 mg 6aminotimol dalam 50 mL asam klorida 0. ( – ) .

Setelah 5 menit larutan diencerkan dengan air untuk mendapatkan absorbansi yang sesuai. Jika larutan sampel telah berwarna atau keruh. Lapisan pelarut organik dipisahkan dan ditambah ± 1 gram natrium sulfat anhidrat untuk mengeringkan pelarut lalu diukur absorbansinya. Digunakan larutan blanko.70 gram tiamin hidroklorida.0 pereaksi 6-aminotimol didinginkan dengan es. dilakukan penetapan seperti diatas kemudian warna yang terjadi disari dengan campuran pelarut yang terdiri atas 90 mL toluen yang telah didestilasi ulang (redestilasi) dan 10 mL n-butanol. Larutan selanjutnya ditambah 5. dilarutkan dalam 75 mL air bebas CO2 lalu dititrasi dengan NaOH 0. Prosedur penetapan kadar tiamin hidroklorida dengan metode alkalimetri: Lebih kurang 500 mg tiamin hidroklorida yang ditimbang seksama.0 mL natrium hidroksida 20% dan diencerkan dengan air secukupnya sampai 20. Tiap mL NaOH 0.1 N menggunakan indikator brom timol biru.Prosedur penetapan kadar tiamin murni dengan pereaksi 6aminotimol: Sejumlah 5. 3.1%.0 larutan sampel.1 N menggunakan indikator brom timol biru. Metode Alkalimetri Adanya hidroklorida pada tiamin hidroklorida dapat dititrasi dengan natrium hidroksida 0.0 pereaksi ini ditambah 1. Berat ekivalen (BE) tiamin hidroklorida pada penetapan secara alkalimetri adalah sama dengan berat molekulnya (BM).1 N setara dengan 33. ditambah 2.0 mL natrium nitrit 0.9 mL. Sejumlah 1. lalu dicampur dan didiamkan selama 1 menit. Hali ini .

Berat ekivalen (BE) tiamin hidroklorida pada penetapan secara titrasi bebas air adalah setengah dari berat molekulnya (BM/2). Metode Argentometri Adanya klorida dalam tiamin hidroklorida dapat ditetapkan secara argentometri dengan menggunakan metode Volhard. Kadar Tiamin HCl = 4. Kedua atom nitrogen dalam tiamin hidroklorida tertitrasi sehingga berat ekivalennya setengah dari berat molekulnya. Kadar Tiamin HCl = 5. Prosedur penetapan kadar tiamin dengan metode TBA: Lebih kurang 250 mg tiamin hidroklorida yang ditimbang seksama ditambah 10 mL asam asetat glasial.86 mg tiamin hidroklorida. Metode Titrasi Bebas Air (TBA) Tiamin hidroklorida dalam asam asetat glasial dapat dititrasi dengan asam perklorat dengan sebelumnya ditambah raksa (II) asetat berlebihan. Tiap mL asam perklorat 0. dan ditambah 20 mL dioksan. 10 mL raksa (II) asetat 5% dalam asam asetat glasial. Selanjutnya larutan dititrasi dengan asam perklorat 0. Sebagai indikator dapat digunakan p-naftol benzen. Hali ini disebabkan karena tiap 1 mol tiamin hidroklorida bereaksi dengan 2 mol HClO4. Pada penetapan dengan metode Volhard suasananya harus asam sebab jika suasananya basa maka akan terjadi reaksi antara perak nitrat dengan basa .disebabkan karena tiap 1 mol tiamin hidroklorida bereaksi dengan 1 mol NaOH. merah kuinaldin.1 N menggunakan indikator 3 tetes kristal violet sampai warna biru. atau dengan kristal violet.1 N setara dengan 16.

Pada larutan yang telah mendidih ini selanjutnya ditambah dengan cepat tetes demi tetes 4 mL asam silikowolframat yang baru disaring lalu dididihkan selama 4 menit. 6. Prosedur penetapan kadar vitamin B1 secara argentometri: Lebih kurang 100 mg tiamin hidroklorida yang ditimbang secara seksama dilarutkan dalam 20 mL air. Berat ekivalen (BE) tiamin hidroklorida pada penetapan secara argentometri adalah setengah dari berat molekulnya (BM/2). Larutan diasamkan dengan asam nitrat encer dan ditambah 10 mL perak nitrat 0.1 N setara dengan 16. Filtrat selanjutnya dititrasi dengan larutan baku ammonium tiosianat 0. Endapan yang terjadi disaring dan dicuci dengan air sampai tidak mengandung klorida. Metode Gravimetri Tiamin dalam tablet vitamin B1 dan dalam injeksi dapat ditetapkan secara gravimetri dengan cara mengendapkan larutan tiamin menggunakn asam silikowolframat.1 N menggunakan indikator besi (III) amonium sulfat. diencerkan dengan air secukupnya hingga 50 mL lalu ditambah 2 mL asam klorida pekat dan dipanaskan hingga mendidih. Hal ini disebabkan karena tiap 1 mol tiamin hidroklorida (yang mengandung 2 Cl-) bereaksi dengan 2 mol AgNO3.membentuk Ag(OH) yang pada tahap selanjutnya akan membentuk endapan putih Ag2O.86 mg tiamin hidorklorida.1 N. Larutan disaring melalui penyaring kaca masir lalu dicuci dengan 50 mL campuran mendidih yang terdiri atas 1 bagian volume asam klorida . akibatnya perak nitrat tidak hanya bereaksi dengan sampel tetapi juga bereaksi dengan basa. Tiap mL perak nitra 0. Prosedur penetapan kadar tiamin dengan metode gravimetri: Sejumlah tertentu tablet yang telah ditimbang secara seksama dan setara dengan lebih kurang 50 mg tiamin hidroksida.

1 Analisis kualitatif Ribofavin (Vitamin B2) Vitamin B2 disebut juga riboflavin karena strukturnya mirip dengan gula ribose dan juga karena ada hubungan dengan kelompok flavin.3. Kelarutan Riboflavin dalam air bervariasi dari 1 bagian riboflavin dalam 3000 bagian air sampai 1 bagian riboflavin dalam 15.1 %. akan tetapi tahan terhadap panas. riboflavin harus terhindar cahaya. Riboflavin sangat mudah rusak oleh cahaya dan sinar ultraviolet. Penyinaran dengan sinar ultraviolet atau cahaya tampak terhadap larutan riboflavin dalam basa menghasilkan lumiflavin sedangkan larutan riboflavin dalam suasana netral atau asam menghasilkan lumikrom yang berfluorsensi biru.2 Analisis Vitamin B2 2. Metode spektrofluorometri Cara penetapan langsung dapat digunakan terhadap campuran yang bebas dari senyawa berwarna yang mengganggu atau senyawa pengganggu lain yang mengandung riboflavin lebih besar dari 0. oksidator.000 bagian air. Variasi ini disebabkan oleh variasi bentuk kristalnya.2% (b/v).9 mg tiamin hidroklorida.2 Analisis kuantitatif Ribofavin (Vitamin B2) A.pekat dan 19 bagian air yang mengandung asam silikowolframat 0. Tiap gram sisa setara dengan 192. Riboflavin larut dalam air dan member warna fluorosen kuning-kehijauan. kemudian dicuci 2 kali tiap kali dengan 5 mL aseton. dan asam. Berdasarkan pada sifat-sifat di atas pada waktu penetapan kadar. . Sisa dikeringkan pada suhu 105oC selama satu jam lalu didinginkan selama 10 menit dan dibiarkan dalam eksikator di atas larutan asam sulfat 38% dan ditimbang. 2.3. 2.

. dibuat dengan melarutkan 50 mg riboflavin yang telah dikeringkan pada suhu 105 ºC selama 2 jam dalam asetat 0.02 N secukupnya hingga 100 mL.5% dan air secukupnya hingga 200 mL.5 mg riboflavin dimasukkan ke dalam labu 250 mL lalu ditambah 1 mL asam asetat 32.5 x B. Cara ini digunakan untuk menetapkan kemurnian riboflavin atau untuk penetapan riboflavin dilakukan dengan cara terlindung dari cahaya. Larutan sampel : Sejumlah serbuk yang ditimbang seksama dan setara dengan lebih kurang 2. Metode spektrometri Larutan riboflavin dalam pH 4. dibuat dengan mengencerkan 10.0 mL larutan riboflavin baku persediaan II dengan air secukupnya hingga 100 mL. dibuat dengan cara menambah 10. Kadar dalam mg riboflavin dihitung dengan menggunakan rumus: 2. Larutan riboflavin baku persediaan I.02 N secukupnya hingga 500 mL.0 mL larutan riboflavin baku persediaan I dengan asam asetat 0.0 menunjukkan absorbs maksimum (λ maks) pada 444 nm. Larutan riboflavin baku.Cara penetapan langsung dapat digunakan terhadap campuran yang tidak mengandung senyawa berfluorosensi atau senyawa berwarna yang larut dalam air atau dalam asam encer. Larutan ditambah air secukupnya hingga 250 mL dan dicampur baik-baik. Lalu dipanaskan di atas penangas air sambil sering dikocok hingga riboflavin larut lalu didinginkan hingga suhu 20ºC. Pengukuran harus dilakukan secepat mungkin karena riboflavin terurai oleh sinar ultraviolet. Larutan riboflavin baku persediaan II.

Pada sejumlah serbuk yang ditimbang seksama yang setara dengan lebih kurang 25 mg piridoksin hidroklorida ditambah 50 mL asam klorida 0.1 M kemudian ditambah air secukupnya hingga 100 mL. Larutan selanjutnya diencerkan dengan air.6-diklorop-benzokuin-4-kloromina dengan menghasilkan warna biru yang dapat disari dengan pelarut organik. Pada panjang gelombang ini.Prosedur penetapan kadar riboflavin tunggal secara spektrofotometri: Sekitar 100 mg riboflavin yang ditimbang seksama dilarutkan dengan pemanasan dalam campuran 2 mL asam asetat glacial dan 150 mL air. piridokamin dan piridoksal menunjukkan daerah penyerapan yang karakteristik walaupun tidak ada maksimum untukketiganya.4. Larutan diencerkan dengan asam klorida secukupnya hingga 100 mL. 2. pada 10. piridoksin.2 Metode kolorimetri Metode ini didasarkan pada reaksi fenol dengan 2. Kadar vitamin B6 jumlah dalam larutan buffer ph 6. Prosedur penetapan dalam tablet tunggal secara spektrofotometri: Sebanyak 20 tablet ditimbang dan diserbuk. larutan diukur absorbansinya menggunakan kuvet dengan ketebalan 1 cm pada panjang gelombang maksimum (291 nm) 2.4. Reaksi ini merupakan reaksi umum untuk senyawa fenol berkedudukan para terhadap gugus hidroksil fenol tidak tersubsitusi.5 mL natrium asetat 0. piridoksin dan piridoksamin menunjukkan absorbansi maksimum. kadarnya dihitung dengan menggunakan riboflavin baku sebagai pembanding.1 N sambil diaduk.75 dapat diterapkan pada panjang gelombag 325 nm. didinginkan.1 Metode spektrofotometri Pada daerah ultraviolet. ditambah air secukupnya hingga 1000 mL.0 mL larutan ditambah 3. .4 Analisis Vitamin B6 2.

Metode yang paling sederhana adalah dengan menetapkan pada 550 nm. 361 nm dan 550 ±2 nm. Tiam mL asam perklorat 0.1 N menggunakan indicator 3 tetes Kristal violet samapai biru hijau.5. Metode spektrofotometri tidak spesifik untuk sianokobalamina karena senyawa bewarna merah dan pseudosiokobalamin menunjukkan spektra absorbansi yang serupa. Metode penetapan kadar vitamin (sianokobalamin) 2. Gugus ini dapat diganti dengan berbagai ion untuk menghasilkan senyawa baru seperti klorokobalamin dan hidroksokobalamin.4.3 Metode titrasi bebas air Lebih kurang 300 mg piridoksin hidroklorida yang ditimbang seksama. dilarutkan dalam 40 mL asam asetat glacial lalu dititrasi dengan asam perklorat 0. Bila sianokobalamin dihidrolisis dengan asam maka akan menghasilkan 5. . Kristal vitamin B12 cepat menyerab lembab udara.56 mg piridoksin hidroklorida.2.5 Analisis Vitamin B12 (sianokobalamin) Sianokobalamin.1 N setara dengan 20.1 Metode spektrofotometri B12 Sianokobalamin dalam air menunjukkan absorbansi maksimun (λ maks) pada 278 ± 1nm. 2.4. 2.4 Metode kromatografi Kromatofrafi cair kinerja tinggi (KCKT) dengan detector fluorometri telah digunakan secara luas untuk analisis kuantitatif vitamin B6 dalam ayam dan bahan makanan lainnya. tetapi metode ini hanya dapat digunakan terhadap sianokobalamin yang bebas senyawa pengganggu.6dimetilbenzimdazol. merupakan senyawa kompleks dengan kordinat kobalt berberat molekul 1355. Sianokobalamin bersifat netral dan mengandung gugus sian. C63H88O14N14Pco. Metode yang lebih peka ialah dengan melakukan penetapan pada panjang gelombang 361 nm.4.

5 dengan natrium hidroksida 0. Kemudian dicampurkan hingga . kemudian ditambahkan 2 tetes NaOH 10% dan 2 mL larutan FeSO4 5%. Larutan diukur absorbansinya dengan kuvet 1 cm pada panjang gelombang 361 nm.6.2 Metode kromatografi Metode KCKT telah sukses digunakan untuk pemisahan dan analisis kuantitatif vitamin B1. dilarutkan dalam akuades secukupnya dan diencerkan hingga 50.0 mL.5.1 M dan diencerkan dengan akuades sampai 50mL.Prosedur penetapan kadar sianokobalamin secara spekrofotometri: Lebih kurang 2 mg sianokobalamin yang ditimbang saksama. Analisis Vitamin C 3. Campuran dipanaskan pada suhu 1200C selama 10 menit dan selanjtnya disaring. Konsentrasi vitamin B12 selanjutnya dengan metode radioassay.0 (5:95) lalu konsentrasi asetonitril ditingkatkan samapi 30% selama 16 menit. Sianokobalamin diekstraksi dari sampel dengan mencampur 25 mL susu dengan 2-4 mL HCL 0.1 Analisis kualitatif Vitamin C Langkah awal yang dilakukan adalah dengan memasukkan sampel ke dalam tabung reaksi sebanyak 2 mL.1 M pH 4. Berbagai macam isomer vitamin B12 (sianokobalamin) yang ada dalam berbagai macam susu juga telah dipisahkan dengan menggunakan metode KCKT fase terbalik. Elusi gradien dimulai dengan asetonitril: larutan amonium fosfat pH 3. Filtrat selanjutnya dilewatkan melalui cartridge dan selanjutnya cartridge dicuci dengan 12 mL air. III. Sianokobalamain dengan asetonitril: iar(1:1 v/v) dan dipisahkan dengan kolom oktil silika. pH filtrat diatur 5. Sianokobalamin selanjutnya dipekatkan pada cartridge oktadesil silan yang telah dikondisikan dengan 2 mL asetonitril dan dicuci dengan 6 mL akuades. dan campuran-campurannya dalam bebagai macam bahan makanan. Harga E1cm1% pada 361 nm adalah 207 2. B2.

1 N) dapat digunakan terhadap asam askorbat murni atau larutannya.2 Metode 2.2. Uji positif timbul warna kuning.rata kemudian mengamati perubahan yang terjadi.1 N menggunakan indikator kanji sampai terbentuk warna biru.1 Metode iodimetri Dasar dari metode ini adalah sifat mereduksi asam askorbat. Jumlah senyawa mereduksi yang masih ada ditetapkan Bahan yang digunakan untuk metode ini adalah: a. 3. Metode iodometri (titrasi langsung dengan larutan baku 0. Larutan dititrasi dengan iodium 0. Larutan pengekstraksi Larutan asam metafosfta-asam asetat dibuat dengan melarutkan 15 g asam metafosfat dalam 40 mL asam asetat .6-diklorofenolindofenol membentuk larutan yang tidak berwarna. Senyawa pengganggu tersebut riboflavin dll.6-diklorofenolindofenol (DCIP) Metode 2. 3. Prosedur penetapan kadar vitamin C secara iodometri: Sekitar 400 mg asam askorbat yang ditimbang seksama dilarutkan dalam campuran yang terdiri atas 100 mL air bebas oksigen dan 25 mL asam sulfat encer.6-diklorofenolindofenol (DCIP) ini berdasarkan atas sifat mereduksi asam askorbat terhadap zat warna 2. Pada titik akhir titrasi. pengganggu adalah: 1. tiosulfat.2 Analisis kuantitatif vitamin C 3.2. Asam askorbat diubah menjadi asam dehidroaskorbat 2. Cara untuk menghilangkan pengaruh senyawa adalah senyawa sulfhidril. Metode ini tidak spesifik karena beberapa senyawa mereduksi lainnya dapat mengganggu penetapan. kelebihab zat warna yang tidak tereduksi akan berwarna merah muda dalam larutan asam.

melarutkannya dan mengencerkannya sampai batas tanda dengan larutan asam metafosfat-asam asetat. Perhitungan Mg asam askorbat/g. d. Pembakuan larutan baku DCIP dengan larutan baku vitamin C b.mL= (X-B) x x X = volume rata-rata DCIP untuk titrasi sampel B = volume rata-rata DCIP untuk titrasi blanko F = kesetaraan mg asam askorbat/mL DCIP E : jumlah g sampel V : volume larutan uji awal yang diambil Y : volume aliquot . Larutan baku asam askorbat Dibuat dengan menimbang seksama 50 mg asam askorbat baku yang telah disimpan dalam desikator dan dihindarkan dari pengaruh cahaya lalu memindahkannya ke labu takar 50 mL. Prosedur penetapan kadar vitamin C dalam minuman menggunakan metode ini: a.02 N dengan penghangatan. c.dan 200 mL aquades dengan penggojogan lalu diencerkan sampai 500 mL. lalu digojog kuat.6- diklorofenolindofenol (DCIP) yang telah disimpan dalam desikator dalam 50 mL air yang telah ditambah 42 mg natrium bikarbonat. b.75 mL NaOH 0. Indikator pH timol biru 0. Larutan baku diklorofenol-indofenol (DCIP) Dibuat dengan melarutkan 50 mg garam Na 2. Penetapan kadar e. Penyiapan larutan sampel d.tablet.04% dibuat dengan menggunakan 100 mg biru timol dengan 10. Uji pendahuluan adanya senyawa basa dalam jumlah cukup besar c.

0 x 10-8 sampai 3.2.5 Metode spektrofluorometri Metode ini digunakan untuk analisis kuantitatif vitamin C yang linier pada kisaran konsentrasi asam askorbat 9. Selanjutnya larutan ditambah 25 mL natrium hidroksida 10% dan 150 mL dietil eter.2-bipiridin ruthenium II. Larutan ini selanjutnya ditambah 0.3.6 x 10-8.3 Metode kolorimetri 4-metoksi-2-nitroanilin Sebanyak 2 mL pereaksi 4-metoksi-2-nitroanilin ditambah 2 mL natrium nitrit 0. Asam askorbat dalam asam sulfat 0. Suatu hubungan linier diperoleh antara penurunan intensitas fluoroensi MB dan konsentrasi AA pada kisaran 3. 3.2.0 x 10-6 . 3.5 x 10-7 m.5-2mg asam askorbat 0.01 N memiliki panjang gelombang maksimal 245 nm. Sampel disaring dan diencerkan sebelum dilakukan analisis .6 Metode kromatografi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) telah dikembangkan untuk penentuan asam askorbat dalam minimum ringan dan jus apel menggunakan tris 2. 3. Lapisan organic dicuci tiga kali dengan 15 mL natrium hidroksida 10%. metode ini telah sukses digunakan untuk menetapkan kadar vitamin C dalam tablet suplemen vitamin.2% diaduk hingga warna jingga hilang lalu ditambah 75 mL n-butil alcohol dan dicampur.0 x 10-7 sampai 6.2.5% dan dipindahkan ke dalam corong pemisah. batas deteksi metode ini 2. Lapisan air dan cairan hasil cucian dengan air diencerkan dengan air hingga 200 mL.2. Panjang gelombang maksimum ini akan bergeser oleh adanya asam mineral.4 Metode spektrofotometri Asam askorbat dalam larutan air netral menunjukkan absorbansi maksimum pada 264 nm. absorbansi larutan diukur terhadap blangko pada 570 nm.

lalu memanaskannya mendinginkannya  Sebanyak 3 mL supernatant dicampur dengan konjugase yang berasal dari plasma manusia dan buffer fosfat 0. Dari sini dapat diketahui bahwa metode ini relative sederhana dengan batas deteksi asam askorbat 10pmol dan kurva kalibrasinya linier pada kisaran 0. IV.1 M pH 6. berikut hal yang dilakukan untuk melakukan analisa kuantitatif folat :  Sampel disiapkan kemudian ditambahkan natrium askorbat 1%.5 V (dengan elektroda Ag/AgCl). Asam askorbat yang terelusi dicampur dengan (Ru(bpy)32+ 0.1 Uji kuantitatif folat Uji kuantitatif pada folat dapat dilakukan dengan menggunakan metode KCKT. lalu dilewatkan dalam kolom penukar ion yang kuat yang telah dikondisikan dengan 1 volume yang terdiri atas methanol dan air .3 mL/menit. Karena metode ini sensitive dan selektif maka metode ini diusulkan untuk digunakan dalam analisis kuantitatif asam askorbat dalam minuman ringan dan jus apel.06 – 80 nmol.5%   Kemudian diinkubasi pada suhu 37 selama 1 jam di tempat gelap pada air mendidih selama 15 menit dan Sampel disentrifuse. C18) menggunakan fase gerak larutan buffer NaH2PO4K2HPO4 (pH 6.5).0 yang mengandung natrium askorbat 0. Analisa Folat 4.dengan KCKT dan tidak ada pra-perlakuan lain yang dilakukan.5 mM dan diosidasi pada 1. Aliran fase gerak 0. Pemisajhan asam askorbat menggunakan kolom oktadesil silan (ODS.

Analisa Niasinamid 5. lalu dimasukkan dalam erlenmeyer. denagn eluennya asetonitril 8% dalam asam aseta pH 2. 2. ditambah larutan KH2PO4 0.3% sejumlah 2 x mg niasinamid yang diperkirakan (jika sampel tidak mudah larut. maka digojog supaya terdispersi dan dipanaskan selama 15 menit di penangas air mendidih)  Dilakukan pengenceran hingga diperoleh kadar kuran lebih dengan KH2PO4 0. Prosedur penetapan kadar niasinamid dengan metode spektrofotometri : 1.1 Uji kuantitatif niasinamid Uji kuantitatif pada niasinamid dilakukan dengan metode spektrofotometri.3%. Larutan disaring bila diperlukan. Kolom selanjutnya dicuci dengan 2 volume kolom yang terdiri atas air. Cara penetapan 5µg/mL .3  Folat dideteksi berdasaarkan flourensinya menggunakan panjang gelombang eksitasi 310 nm dan emisi 352 nm V. kemudian folat dipindahkan dengan 1 mL larutan natrium klorida 10% yang mengandung natrium askorbat 1%  Folat dipisahkan dengan kolom pengaman 30 x 4.d dan dilanjutkan dengan kolom analitik (keduanya berisi oktadesil silan. ukuran partikel 5 mikron)  Kolom dijaga suhunya pada 27 . Penyiapan sampel   Gerus sampai halus 5 tablet atau sejumlah volume tertentu sampel Sampel ditimbang.0 mm i.

3. ditambah 0.000 xg. kapsul atau mL cairan. dan absorbansinya dibaca pada gelombang 550 nm.5 mLlarutan CNBr.    Disiapkan secara terpisah sampel blanko untuk tiap sampel dengan mengganti CNBr dengan aquades Sebanyak 1.2 untuk mengaktifkan fasa diamnya. Metode KCKT juga digunakan untuk melakukan uji kuantitatif terhadap niasinamid. Campuran kemudian dihomogenkan dengan homogenizer pada kecepatan sedang selama 1 menit  Sampel kemudian disentrifuse selama 10 menit dengan kecepatan 14.0 mL larutan uji dimasukkan dalam tabung. berikut langkah kerja yang dilakukan melalui metode KCKT :  Sebanyak 5 gram sampel ditambah dengan 20 gram air deionisasi. lalu dicampur dan dibiarkan selama 25 – 30 menit. . Sampel diperlakukan dengan SPE (solid phase extraction) untuk menghilangkan adanya gangguan dalam sampel yang mungkin akan mengganggu dalam analisis. Kemudian larutan ditambah 10 mL larutan asam barbiturate dan dicampur Dibuat juga pereaksi blanko dengan mengganti CNBr dengan aquades. Perhitungan  Kadar niasinamid dalam sampel (mg) : A = Absorbansi larutan sampel A’ = Absorbansi larutan baku kerja 5 = µg niasinamid/mL larutan baku uji Kadar niasinamid dilaporkan dalam mg niasinamid/ tablet. Cartridge SPE dikondisiksn dengan mengalirinya menggunakan 10 mL methanol dan 10 mL air yang diatur pH nya 4.

Eluen dikumpulkan dalam botol. larutan KH2PO4 0.  Sebanyak 10 ml sampel dielusi dengan 5 mL air (pH 4. Kolom yang digunakan adalah kolom fase terbalik C18 (150 mm x 4. .1 M (pH 7) methanol (90 – 10) dengan kecepatan alir fase gerak 0.45 mikron. dan sebanyak 20 µL sampel diinjeksikan dalam kolom KCKT.6 mm dengan ukuran partikel 5 mikron). Fase gerak terdiri atas. kemudian asampel disaring dengan penyaring 0.2) lalu dengan 10 mL etanol dengan kecepatan alir 1 mL/menit.7 mL/menit.45 mikron dan gas pada fase gerak dihilangkan dengan sonifikasi. Kolom dioperasikan pada suhu 25  Identifikasi sampel dengan membandingkan waktu retensi dan spectra UV dengan senyawa baku. lalu diuapkan hingga kering.   Detector yang digunakan adalah UV-Vis diode array Fase gerak disaring melalui membrane 0.

2 Saran Perlu dilakukan penelaahan lanjut mengenai analisis vitamin lain dengan berbagai metode berbeda . 4.BAB IV PENUTUP 4.B dan C menggunakan berbagai metode yang disesuaikan dengan tujuan analisis.1 Simpulan Analisa kualitatif dan kuantitatif pada vitamin A.

Analisa Bahan Pangan. Dasar-dasar Biokimia. Yogyakarta Winarno. Analisis Makanan. Gajah Mada University Press. Jakarta Poedjiadi. Kajian Analisa Kandungan Vitamin Dan Mineral Daintih. Doddy A. 1999. 1982.DAFTAR PUSTAKA Darmajana. Jakarta Rohman. Jakarta . 1994. Sumantri. Universitas Indonesia.J. 2004.G. 2007. Abdul.F. UI Press. Kamus Kimia. Erlangga.

yang telah mencurahkan rahmat. 3.KATA PENGANTAR Segala puji bagi Allah SWT. dan hidayahnya sampai akhirnya penulis dapat menyelesaikan karya tulis imiah dengan judul ”Analisis Kualitatif dan Kuantitatif Vitamin A. Penulis memohon maaf jika terdapat kesalahan.B dan C” dengan lancar. Teman-teman yang telah bersedia memberikan masukan penuh manfaat yang dapat dijadikan acuan dalam menyempurnakan karya tulis ilmiah. Penulis berharap agar makalah ini dapat memberikan manfaat berupa tambahan wawasan bagi para pembaca. Para pembaca yang budiman. Terima kasih. taufik. 2. karena tanpa adanya bantuan dari pihak-pihak tersebut penulis tidak akan dapat menyelesaikan karya tulis ilmiah ini lebih baik. baik dalam penulisan maupun penyampaian kalimat dalam makalah ini. Penulis mengucapkan terima kasih kepada pihak-pihak yang telah membantu penulis dalam penyelesaian karya tulis ilmiah ini. Adapun pihak-pihak tersebut antara lain : 1. Bapak Khabibi selaku dosen mata kuliah Analisa Pangan di Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Diponegoro Semarang yang telah membimbing dengan sepenuh hati demi keberhasilan penulis menyelesaikan makalah ini. Tuhan semesta alam. Selain itu penulis juga mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari para pembaca untuk penyempurnaan karya makalah. .