P. 1
JOURNAL

JOURNAL

|Views: 79|Likes:
Published by shasanah_11
JOURNAL KIMIA
JOURNAL KIMIA

More info:

Published by: shasanah_11 on Mar 13, 2013
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

09/23/2013

pdf

text

original

THE EFFECT OF Fe2+ DAN Mn2+ IONS TOWARD β-CAROTENE PRODUCTIVITY BY PHYTOPLANKTON Isochrysis aff galbana (T-iso

)
a

Erna mayasari, Indah Raya & Hasnah Natsir

Chemistry Department, Faculty of Mathematics & Natural Sciences Hasanuddin University Makassar 90245
a

E-mail : ernamayasari.unhas@yahoo.com

ABSTRACT The research aimed to find out the effect of Fe2+ and Mn2+ towards β-carotene productivity as result of oxidative stress from photosystem (PS II). The phytoplanton Isocrysis aff galbana (T-iso) were the microalgae species which had the high lipid content primarily and had potentiality to produce β-carotene as the β-carotene supplement. Analysis method was carried out by the sonication extraction for short and cheap in the lysis cell of phytoplankton biomassa, infra red (IR) to find out the interaction metal ion and UV/VIS spectrophotometer to determine β-carotene concentration. The research result indicateds that Fe2+ has higher impact than Mn2+ on the β-carotene productivity. The interaction of ions metal indicates as M-N, -O-M and M←OH-C complex in the phytoplankton amino acid. The β-carotene concentration is 4,97 µg/g DW in addition Fe2+ 0,30 ppm and 1,95 µg/g DW in Mn2+ 0,20 ppm. The dry weight concentrations of β-carotene indicates that I. aff galbana with Fe2+ addition has potential as β-carotene supplement. Key word: I. aff galbana; Fe2+; Mn2+; β-carotene

PENDAHULUAN Spesies-spesies mikroalga telah digunakan secara luas di negara-negara maju karena pertumbuhan yang lebih sederhana dibandingkan dengan tanaman tingkat tinggi (Guedes dkk, 2011). Karotenoid dari fitoplankton dapat berperan sebagai antioksidan (Wanasundara dan Shahidi, 2005), oleh karena fungsinya sebagai antioksidan maka terjadi peningkatan pemanfaatan secara komersial sebagai bahan pewarna dibidang farmasi, kosmetik dan makanan (Gouveia dkk, 2008). Aktivitas antioksidan yang kuat diketahui dari ekstrak kasar metanol Isochrysis aff galbana, Chlorella vulgaris, Nannochloropsis oculata, Tetraselmis tetrathele dan Chaetoceros calcitrans (Natrah dkk dalam Gouveia dkk, 2008). Isochrysis aff galbana adalah kloning Isochrysis galbana yang diambil dari Negara Tahiti. Selain memiliki kandungan protein yang tinggi, spesies ini juga mampu memproduksi asam lemak tidak jenuh berantai panjang (Long chain polyunsaturated fatty acid-LC PUFA), utamanya EPA (eicosapentaenoic acid) dan DHA (docosahexsaenoic acid). I. aff galbana (T-iso) sangat sesuai sebagai suatu sumber nutrisi dengan pertumbuhan yang cepat. Hal ini menyebabkan I. aff galbana (T-iso) berpotensi pada industri makanan sebagai sumber LC PUFA sebagai alternatif pengganti minyak ikan, menyediakan pula sterol, tokoferol dan pigmen perwarnaan (Gouveia dkk, 2008). Pada penelitian Fidalgo dkk (1998) I. aff galbana (T-iso) memiliki PUFA dengan konsentrasi tinggi yang terbagi atas EPA 27,66% dan DHA 14,13% dari total asam lemak. Suplemen β-karoten merupakan salah satu pilihan sumber antioksidan (Gouveia dkk, 2008) yang dapat dikonsumsi. Namun, suplemen β-karoten produk sintetik hanya mengandung isomer trans-β-karoten (all-trans-β-carotene) suatu provitamin A (Hess dkk, 2005) yang akan terkonversi menjadi vitamin A. Sedangkan isomer 9-cis-β-karoten (9-cis- β-carotene) yang memiliki aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan trans-β-karoten (all-trans-βcarotene), hanya terdapat pada produk alami (Interclinical Laboratories, 2010). Sehingga perlu diupayakan produk alami yang dapat menghasilkan 9-cis-β-karoten yang maksimal sehingga pada penelitian ini diberikan penambahan Fe2+ dan Mn2+ masing-masing pada kultur pertumbuhan I. aff galbana.

THE EFFECT OF Fe2+ DAN Mn2+ IONS TOWARD Spektrofotometer infra merah (IR) digunakan untuk mengetahui data awal gugus fungsi yang berinteraksi dengan ion logam Fe2+ dan Mn2+ pada mekanisme produktivitas pembentukan β-karoten oleh jenis fitoplankton I. Selanjutnya. oven SPNISOSFD. (NH4)6Mo7O24. 3. dimasukkan ke dalam tabung sentrifus dan dicampur dengan aseton sebanyak 3 mL. Penyiapan Medium Conwy Larutan nutrien stok A 1000 mL ditambahkan dengan larutan nutrien stok B 2 mL. Konsentrasi Fe2+ dan Mn2+ yang dapat Ditoleransi (MTC) I. NaNO3). Campuran larutan Conwy ini ditambahkan ke dalam air laut steril yang tidak mengandung fitoplankton dengan perbandingan 2 mL per 1000 mL air laut yang telah steril. digunakan rumus: V1 N1 = V2 N2 (1) melalui mikroskop dengan menggunakan haemocytometer.a. Contoh diambil dengan pipet tetes. HASIL DAN PEMBAHASAN Dengan V1 adalah volume stok. neraca digital Ohauss NO AP 110. N1 adalah kepadatan sel fitoplankton stok. Biomassa fitoplankton yang diperoleh. Stok C (Vitamin B12 dan Vitamin B1). Selanjutnya. campuran stok A dan B ditambahkan 1 tetes larutan vitamin stok C.6H2O. aff galbana (IG) Air laut disterilkan terlebih dahulu. FT-IR SHIMADZU 820 1PC. galbana.2H2O. Galbana (diperoleh dari pembudidayaan fitoplankton Jepara Jogyakarta). Salinometer. Ion logam Fe dan Mn merupakan logam essensial yang terlibat dalam proses fotosintesis dan sebagai kofaktor antioksidan enzim. aseton p. aff galbana (T-iso) Fitoplankton 8 . diteteskan sekitar 1-2 tetes pada haemocytometer. Kultur murni Isochrysis aff. Sampel kemudian disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 5000 rpm dan diambil supernatannya untuk analisis β-karoten yang dibandingkan dengan standar β-karoten pada penggunaan spektroskopi UV-VIS. pada kondisi tanpa dan masingmasing dengan penambahan logam Fe2+ dan Mn2+. Ektraksi β-karoten dengan Metode Sonikasi Pengerjaan ini dilakukan pada ruangan dengan pencahayaan berintensitas rendah dan ruangan dingin. V2 adalah volume 1. 200 mL kultur dipindahkan ke botol 500 mL dan dilakukan pengamatan setiap hari untuk panambahan Fe2+ dan Mn2+ pada I. 2 kultur dan N2 adalah kepadatan sel fitoplankton kultur. Handcounter. MnSO4. menggunakan rumus: sel mL Jumlah sel dalam 4 kotak x 10 Jumlah blok 4 Jumlah 2 4. Sentrifugasi. Vol. Oleh karena itu pada penelitian ini dilakukan penambahan logam Fe2+ dan Mn2+ untuk mengetahui efeknya terhadap produktivitas β-karoten dalam Isochrysis aff. Identifikasi dengan FT IR Identifikasi gugus fungsi yang berpotensi mengikat Fe2+ dan Mn2+. Sonikator Ultrasonik dan Spektrofotometer UVVIS. Kepadatan sel fitoplankton diamati METODE PENELITIAN Alat dan Bahan Alat gelas yang umum digunakan. CoCl2. kemudian diamati melalui mikroskop. Biomassa tanpa dan dengan paparan ion logam. Untuk memperoleh kepadatan fitoplankton yang diinginkan. dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer infra merah (IR). Perhitungan kepadatan sel. dilakukan serangkaian kultur fitoplankton uji. Pertumbuhan Sel I. Na2EDTA. tanpa dan dengan paparan ion logam pada konsentrasi MTC. Konsentrasi MTC (Maximum Tolerance Concentration) diperoleh dengan melihat pertumbuhan tertinggi pada variasi konsentrasi untuk masing-masing fitoplankton.7H2O. aff. dikeringkan lalu digerus dan disaring. galbana (T-iso). 2. Fitoplankton dipanen. β-karoten bubuk serta akuades. FeSO4. dengan tabung tertutup kemudian disonikasi selama 50 menit pada suhu 40 oC.6H2O. Stok B (ZnCl2.4H2O. Haemocytometer (Neubauerimproved). dilakukan dengan menghitung jumlah sel per milliliter medium setiap 1 hari. 13 No. CuSO4.5H2O. MnCl2. H3BO3. aff galbana. NaH2PO4. Setelah 3 hari. Mikroskop. Prosedur Kerja 1.4H2O. kemudian salinitasnya diukur dengan menggunakan salinometer dan disaring. pengenceran dilakukan untuk memperoleh salinitas air laut yang sesuai untuk spesies uji. Pertumbuhan Fitoplankton Penentuan pola pertumbuhan fitolankton. medium terdiri dari Stok A (FeCl3.H2O. 5.

4. 0. Hari ke tiga.0 ppm).5 dan 2. aff galbana ditampilkan pada Gambar 2. aff galbana tanpa dan dengan penambahan Mn2+ berbagai konsentrasi (0.6. Penambahan ion logam mulai dilakukan pada hari ketiga pengkulturan. dimana pertumbuhan fitoplankton tinggi terjadi pada hari ke-13 untuk konsentrasi Fe2+ 1. Pola pertumbuhan tanpa penambahan ion logam ditunjukkan pada Gambar 1.1. 0. 0. Pengamatan dan penghitungan kepadatan sel dilakukan setiap hari hingga diperoleh grafik pertumbuhan sel (Gambar 2).0 ppm (1620 x 104 sel/mL) dan pertumbuhan rendah pada hari yang sama adalah 0. 1. Kultur terhadap spesies uji dilakukan penambahan masing-masing dengan ion logam Fe2+ dan Mn2+ untuk berbagai variasi konsentrasi. pembelahan sel optimal mulai terjadi.2.aff galbana (T-iso) Pada grafik tersebut diketahui bahwa waktu pertumbuhan yang dibutuhkan I. 13 No. Gambar ini memperlihatkan pola pertumbuhan kepadatan sel I.Pengamatan dihentikan pada hari ke-14.2. 0.aff galbana untuk beradaptasi dalam medium kultur Conwy relatif singkat yaitu dua hari.0.3. Pola pertumbuhan untuk kontrol dan semua variasi konsentrasi memperlihatkan pola yang relatif sama. 0. Hasil Penentuan Konsentrasi Fe2+ dan Mn2+ yang dapat Ditoleransi (MTC) oleh Fitoplankton I. Vol.4. 1. aff galbana (a) tanpa dan Paparan Fe2+ dan (b) ) tanpa dan Paparan Mn2+ pada berbagai Konsentrasi Konsentrasi Fe2+ yang dapat ditoleransi oleh I. aff galbana (T-iso) (b) Gambar 2. 0. berikut ini. 0. aff galbana tanpa dan dengan penambahan Fe2+ untuk berbagai konsentrasi (0.1.0. belum mengalami kenaikan yang signifikan.8.0 ppm). Pada Gambar 2 (b) menunjukkan pola pertumbuhan kepadatan sel I.aff galbana. Pola Pertumbuhan Sel I.5 dan 2. Hal ini ditunjukkan dimana hingga hari kedua kepadatan sel. Grafik Kepadatan sel Fitoplankton I. 9 .6.3 ppm (695 x 104 sel/mL). 0. 1. 2. 2 (a) Gambar 1. 0. 0.3.THE EFFECT OF Fe2+ DAN Mn2+ IONS TOWARD Pada penelitian ini digunakan spesies I.8. 1.

I. Millaleo dkk. dimana terjadi penurunan pada hari ke ke-14. 2010).5 ppm (1710 x 104 sel/mL) pada hari ke ke-13 dan pertumbuhan rendah (730 x 104 sel/mL) diberikan pada konsentrasi 0. Penambahan konsentrasi Fe2+ yang agak tinggi pada I. (IG). ion logam Fe memainkan peran sangat penting dalam regulasi metabolisme sel sebagai unsur essensial. 2004. aff galbana memberikan pertumbuhan yang berikan tinggi. ini menunjukkan pada proses fotosintesis lebih membutuhkan ion logam Mn untuk memproduksi O2 yang terletak pada proses fotosistem II (FS II) (Gambar 3).5 ppm untuk Mn2+. Identifikasi Gugus Fungsi I. 3.. yang menyiapkan elektron ang untuk transfer elektron fotosintesis. a) IG. 2 Peran penting ion logam Mn pada proses fotosintesis terletak pada sistem pemecahan air pada fotosistem II. 2011). Pada mikroalga.4 ppm pada hari yang sama.0 1. aff galbana ialah pada konsentrasi 1 dan 1. B. Allen dkk.0 ppm) dan semua variasi konsentrasi memperlihatkan pola pertumbuhan yang sama. (a) (b) Gambar 4. yang mana diketahui dalam Chrichton (2005) dan Millaleo dkk (2010) bahwa ion logam Mn berfungsi dalam proses fotosintesis dan struktur sel. Hal yang sangat menarik teramati dari penambahan Mn2+ pada konsentrasi tinggi 1. Pengamatan terakhir dilakukan pada hari ke ke-14 dengan merujuk kecenderungan pola pertumbuhan tersebut. b) IG + Fe2+ Gambar 3. Pertumbuhan tinggi pada fitoplankton dengan penambahan Mn2+ diberikan oleh 1. 2003) 10 . aff galbana .5 ppm. Berikut spektrumnya disajikan pada gambar ktrumnya 4 dan 5. aff galbana) membutuhk konsentrasi ) membutuhkan Mn2+ yang lebih tinggi untuk pembelahan dan perkembangan selnya. Pessarakli. Spektrum IR biomassa I. sebagai tambahan nutrisi dan membantu proses fotosintesis (Matsuzawa dkk. Vol. 13 No. 2010.0 ppm Fe2+ masih bersifat nutrien yang membantu perkembangan sel. 2005. aff galbana dengan Penambahan Fe2+ dan Mn2+ Identifikasi gugus dan identifikasi inte interaksi yang mungkin terjadi antara ion logam dan fitoplankton dilakukan dengan mengguna akan spektroskopi Infra merah. Dinding sel yang agak keras pada spesies ini ditengarai dapat menyebabkan absorbsi nutrien tidak begitu mudah sehingga dengan penambahan ngga 1.THE EFFECT OF Fe2+ DAN M 2+ IONS TOWARD Mn Kontrol (0. Konsentrasi maksimum Fe2+ yang dapat ditoleransi pada I. Pertumbuhan tinggi ditunjukkan pada penambahan Mn2+. Sementara pertumbuhan rendah berada pada mbuhan daerah konsentrasi yang rendah. Mekanisme Reaksi Tahapan Fotokimia yang Melibatkan Pelepasan Elektron (2H2O → O2 + 4H+ + 4 e-) pada PS II (Sumber: Miles. Kelompok yang terdiri dari empat Mn berasosiasi dengan kompleks oksigen (OEC_Oxygen Evolving Complex terikat _Oxygen Complex) pada protein fotosistem II (PSII) (Millaleo dkk.

aff galbana (gambar 4 dan 5) memperlihatkan interaksi M-N dengan penambahan Fe2+ serta N Mn2+. b) IG + Mn2+ Kemungkinan pengikatan untuk spesies I. Penelitian tentang pertu ertumbuhan rendah yang diikuti dengan penurunan jumlah biomassa terjadi pula pada jenis Haemotococcus pluvialis dengan penambahan Fe2+-EDTA oleh Cai dkk (2009). 2+ Penambahan Mn menunjukkan interaksi –O-M pada daerah 450 dan 493. 2003. Interaksi –O-M pada 408.THE EFFECT OF Fe2+ DAN M 2+ IONS TOWARD Mn Vol. Jika diamati. aff galbana . maka perbedaan yang sangat signifikan terjadi pada spesies I. Data Analisis β-Karoten pada I. dengan adanya Fe2+ sebagai katalis maka akan menghasilkan radikal hidroksil (OH ). masing baik dengan penambahan Fe2+ maupun dengan penambahan Mn2+ pada berbagai konsentrasi.5 kali berat kering kontrol. EDTA Pertumbuhan rendah tersebut. Enzim katalase inilah yang menyebabkan hidrogen peroksida memproduksi O2 dan H2O. Jika dibandingkan dengan kontrol. bahwa kosentrasi ini sama dengan penambahan konsentrasi Fe2+ yang memberikan pertumbuhan rendah. 11 .30 ppm Fe2+.78 cm-1. diberikan pada reaksi Haber Haber-Weiss (Manahan. dengan penambahan Fe2+ dibandingkan Mn2+. Pertumbuhan rendah pada produktifitas karotenoid juga dinyatakan oleh Hadi dkk (2008) dalam artikelnya.86 cm-1 menujukkan interaksi gugus fungsi (ikatan van der aksi Walls atau hidrogen). Pergeseran kecil pada daerah bilangan gelombang 3417. Spektrum IR biomassa I. aff galbana (IG) pada Penambahan Fe2+ atau Mn2+ pada berbagai Konsentrasi Pada penambahan Fe2+ (Gambar 6). menunjukkan konsentrasi β β-karoten yang tinggi pada spesies ini. aff galbana Karoten untuk Penambaan Fe2+ dan Mn2+ Biomassa masing-masing spesies diekstraksi. aff galbana yaitu 3. 13 No. kemungkinan disebabkan oleh Fe2+ merupakan katalis yang efektif dalam memecah H2O2 (Manahan. mendukung fungsi Fe2+ dan Mn2+ sebagai kofaktor enzim. 4. 2 (a) Gambar 6 . Analisis data IR yang menunjukkan adanya senyawa kompleks M M←OHC. Koolman dan Roehm. (IG). 2003): sehingga memicu peningkatan produktifitas β-karoten sebagai salah satu jenis antioksid karoten antioksidan dalam proses perlindungan sel dari senyawa radikal. terlihat ntrol. Grafik Analisis β β-karoten pada I.91 dan 493. Proses ekstraksi dilakukan dengan metode sonikasi untuk mengefisienkan waktu dan mendapatkan ekstrak yang lebih banyak serta digunakan volume gunakan pelarut yang lebih sedikit. dan juga pada reaksi Fenton (Manahan. Konsentrasi berat kering pada I. Puncak ini mendukung adanya senyawa kompleks M←OH-C yang terbentuk pada penambahan Fe2+ yang ditunjukkan pada daerah 3448.72 cm-1.97 µg/g untuk penambahan 0. Namun. aff galbana diperoleh 4. 2003): (b) Gambar 5. 2005) yang diproduksi dari anion radikal superoksida oleh aksi enzim dismutase superoksida.78 M cm-1 untuk penambahan Fe2+. a) IG. Metode ini memanfaatkan gelombang ultrasonik yang dapat menghancurkan sel sehingga mempercepat proses pemindahan massa senyawa dari dalam sel ke pelarut.

Prog.. L. aff galbana dengan penambahan Fe2+ berpotensi dikembangkan sebagai suplemen β-karoten.. Australia. John Wiley and Son’s: 431442. Food Chemistry 12 . 2008. Wanasundara. Mn2+ memiliki peran yang dominan sebagai kofaktor dari katalase. dan Kong. Raymundo. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 2011. Abstrak: Cobalt and Manganese Stress in the Microalga Pavlova viridis (Prymnesiophyceae): Effect on Lipid Peroxidation and Antioxidant enzymes. Sukenik.. Sousa. Manahan. M. Effect of Iron Electrovalence and Spesies on Growth and Astaxanthin Production of Haemotococcus pluvialis. S. Mora. Shariati. aff galbana.. dan Nield. Secara umum. C. J. 2007. 2. M. R. Y. Interclinical Laboratories Pty Limited.3 ppm dan 1. L. 10 (4): 476-494. dan Shahidi. 2002.. Hu. Botanical Monograph. dapat disimpulkan sebagai berikut: 1. Handbook of PhotosynthesisChapter 44: Heavy Metal Toxicity Induced Alteration in Photosynthetic Metabolims in Plants.tamu.95 µg/g BK pada penambahan Mn2+ 0. M.. P.. Microalgae As Source of High Added-Value Compound-Brief Riview of Recent Work.. 27 Juli 2012) Millaleo. I. Penambahan Fe2+ secara umum memiliki pengaruh yang lebih besar dibandingkan dengan penambahan Mn2+ untuk produksi β-karoten. 4. USA: 401. W/. Environ Sci. Interclinical Laboratories. Cai. 2003. Data ini dibandingkan dengan kontrol memberikan perbedaan sinifikan dengan I.2 ppm pada I. J. Matsuzawa. 2nd edition. Photosystem I and II. aff galbana diperoleh 1. Aquaculture. dan Herrero.. Inc: 1-37. 1998. Accumulation and Resistance and Mechanisms.. Puthyiyaveetil. F. Ivanov.. F. A.. 19 (11): 1330-1335. T. Guedes. A. 2010. R. dan Shiraiwa. peroksidase dan superoksidase (SOD) yang memainkan peran protektif terhadap tekanan radikal (Manahan. A. B. B. K. 27 (2) : 370-375. 2005. S. G.97 µg/g BK pada penambahan Fe2+ 0. dan Alberdi.. 2005. L. H. J. Toicological Chemistry and Biochemistry. M.. USA: 2. de Paula. 0. Futatsugawa. dan Afsharzadeh. (online).. Chen. Dunaliella salinaMarine Phytoplankton. Abstrack: Change in element composition of microalgal cells under iron-deficient conditions: basic study on homeostasis of element utilization. Vol. Technical Monograph Series: Influence of Provitamin A Carotenoids of Iron. Hadi. DAFTAR PUSTAKA Allen... Reyes-Diaz. C.95 µg/g). Z. Liu. Torres.M.THE EFFECT OF Fe2+ DAN Mn2+ IONS TOWARD Penambahan Mn2+ (Gambar 5). Zhe. J..20 ppm. A. CRC Press. M.5 kali konsentrasi berat kering. 2010. Hal ini kemungkinan terjadi dimana ion logam Mn memiliki potensial reduksi yang kecil dibandingkan ion logam Fe. K. M. J.. Nova Science Publishers. konsentrasi berat kering β-karoten pada spesies ini tidak terlalu dipengaruhi oleh penambahan Mn2+. Harvest Plus-UK: 4-28. dan Malcata. Technology and Applications. L. Soil Sci.. M. Biotechnol. A. NMCC Annual Report. (http://www..... A. P.. S. 2009. aff galbana (1. memperlihatkan konsentrasi berat kering I. Review: A structural Phylogenetic Map for Chloroplast Photosynthesis. M. 2005. 3. Interaksi logam Fe2+ dan Mn2+ terhadap fitoplankton uji didominasi oleh pembentukan senyawa kompleks M←OH-C.. Effect of Nitrogen Source and Growth Phase on Proximate Biochemical Composition. Cid. Trends in Plant Science. KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian tersebut. CRC Press. 166:105-116. D.. S. J. P.. 13 No. 2 Research Developments. Peningkatan produktifitas konsentrasi berat kering β-karoten tertinggi yaitu 4. Batista... 2004. Oceanol. Pessarakli. X. Gouveia. W. 2003). dan Bandarra. Chin.Plant Nutr. 12: 103. Q. 2008. Miles. Hess. 13: 540-544. Y. galbana. L. P. M. F. Z. D. E. Lipid Classes and Fatty Acid Profile of The Marine Microalga Isochrysis aff. Limnol.. N.. Zinc and Vitamin A Status. 16 (12): 645-655. Antioxidants: Science. F. Iran. dan Anxiang. 27 (3): 597-613.. Fidalgo.pdf. Q.. Li. M. Ahu.edu/faculty/bmiles/lectu res/photosystems. Microalgae in Novel Food Product. M.. Sera. Selain itu. I. I. A. Manganese as Essential and Toxic Element for Plants: Transport. Thurnham. 2011. S. Microalgal Biotechnology: Carotenoid and Glycerol Production by The Green Algae Dunaliella Isolated from the Gave-Khooni Salt Marsh. Amaro. dan Hurrell. J.R.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->