P. 1
Imunologi Infeksi Bakteri Ule

Imunologi Infeksi Bakteri Ule

|Views: 6|Likes:
Published by Muhammad Chaidir
by kak ule
by kak ule

More info:

Published by: Muhammad Chaidir on Mar 14, 2013
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOC, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

06/12/2014

pdf

text

original

Imunologi Infeksi Bakteri

1. Metode Aglutinasi (rosette) Eristrosit Metode ini merupakan cara menerka terjadinya respon kekebalan pada tubuh ikan secara sederhana, tanpa membutuhkan peralatan canggih (ELISA micro-plate reader, misalnya) Prosedur Kerja : 1. Suntikkan eritrosit (bisa dari sumber mana saja) dengan dosis 100 µl per 100 gram berat badan ikan, via intra peritoneal atau intra-vena. (corn oil), bila tidak ada bisa dengan PBS 2. Biarkan ikan bereaksi terhadap antigen (eritrosit) selama paling tidak 14 hari 3. Siapkan agar yang tidak terlalu keras (soft agar) dalam Petri dish, dalam kondisi aseptic 4. Tuangkan sekitar 200 µl eritosit (atau sesuaikan volumenya) pada permukaan secara merata, didalam Petri dish 5. Tambahkan suspensi sel dari ginjal kepala ikan yang telah diinjeksi dengan eritrosit (sekitar 200 µl) diatas suspensi eritrosit. Biarkan selama 90 – 120 menit (Lebih lama Lebih baik), lalu masukkan kedalam refrigerator, suhu 4ºC 6. Amati rosette (kumpulan leukosit) disekitar eritrosit menggunakan loop. Bila seluruh permukaan petridish dipenuhi rosette, berarti imunisasi berhasil dengan sempurna. 2. Teknik Aglutinasi Bakterial Pasif (ABP) Reagent : a. Antiserum 1. Antiserum diperoleh dari ikan suspek penderita penyakit bacterial tertentu (perhatikan gejala klinis), anti serum kita beri ethanol 96 % dan aseton (perbandingan antiserum : ethanol : aseton = 1 : 1 : 0,3) 2. Anti serum kita absorpsikan dengan E. coli yang telah diformolasi dengan formalin 4 %, divortex selama 5 menit lalu disentrifuge pada kecepatan 15.000 rpm selama 10 menit, lalu diambil supernatantnya. b. Reagent ABP Campur eritrosit dengan volume yang sama dengan FCA atau minyak zaitun (olive oil) atau minyak jagung

buang supernatant. Antigent Terlarut 1. simpan dalam suhu 4ºC d. lalu dicuci dengan PBS. 80 µl PBS dan 10 µl Bromophenol Blue (BFB) 0.1. biarkan mencair. sedimen (pellet) yang diperoleh pada dasar tube adalah LPS 3. Sebanyak 5 µl reagent ABP. Ke dalam LPS ditambahkan 1 ml PBS. Tambahkan 1 ml PBS. simpan dalam suhu 4ºC Prosedur Kerja 1. Sebanyak 5 µl reagent kontrol. 5 µl antigen LPS. 5 µl antigen LPS. lalu vortex selama 5 menit 4. lalu disimpan dalam freezer -20 ºC 2. Esoknya diamati dengan reading mirror pada kolony counter 2. Campuran yang kita peroleh merupakan reagent ABP.03 M (dalam eppendorf atau Tabung reaksi/vial 10 ml) 2. Pembuatan Kontrol Negatif a. Campuran tersebut diinkubasi daalam suhu 37 ºC selamam 90 – 120 menit. dalam waterbath 3. lalu ditambahkan 500 µl antiserum dan vortex selama 5 menit. Sentrifuge pada kecepatan 12. Pembuatan Kontrol Positif a. Kocok hingga homogen secara perlahan-lahan selama 30 menit.01 % ditambahkan ke dalam setiap well. Satu koloni Aeromonas hydrophilla diberi formalin 4 % lalu divortex selama 5 menit. dan biarkaan bermalam dalam suhu kamar c. 1. 80 µl PBS dan 10 µl BFB 0. Satu koloni Staphylococcus aerus yang diberi formalin 4 % disensitisasi dengan 10 % (vol/vol) suspensi antiserum dalam PBS 0. lalu tambahakan 1 ml PBS 1 %.01 % masukkan dalam setiap well/sumur b. . Reagent Kontrol Sebagai reagent control adalah 1 koloni Staphylococcus aureus yang telah distabilkan dengan formalin 4 %. disimpan dalam suhu 4ºC c.000 rpm.000 rpm. sentrifuge pada kecepatan 12. Keluarkan dari freezer.

5 µl antigen LPS. 80 µl PBS dan 10 µl BFB 0. Jika gumpalan/aglutinasi yang terjadi besar dan terjadi diseluruh permukaan well microplate. Jika gumpalan yang terjadi kecil-kecil. Esoknya diamati dengan reading mirror pada kolony counter 4. Homogenkan selama 30 menit dengan cara dikocok perlahan. dinyatakan positif 4 (++++) b. Positif Predictive Value (PPV) dan Negative Predictive Value (NPV) dari uji diagnostic dihitung dengan rumus : Sensitivitas = a / (a + c) x 100 PPV = a / (a + b) x 100 a = test positif dan true positif b = test positif dan true negatif Spesifisitas = d / (d + b) x 100 NPV = d / (d + c) x 100 . Sebanyak 5 µl serum ikan. namun terjadi di seluruh permukaan well microplate. kita melihat apakah terjadi aglutinasi di bawah reading mirror yang menandakan adanya penyakit bakteri tertentu dalam tubuh ikan dengan memperhatikan : a. Jika gumpalan yang terjadi kecil.01 % ditambahkan di dalam setiap well b. dan terjadi pada kurang dari setengah permukaan well dari microplate. dinyatakan positif 1 (+) e. dan hanya terjadi pada setengah permukaan well pada microplate. dinyatakan positif 3 (+++) c. dinyatakan negatif (-) Tingkat sensitivitas dan spesifisitas. Pemeriksaan Serum Ikan Suspek a. Pembacaan Hasil Uji Teknik ABP Prinsipnya. Jika tidak ada gumpalan yang Terbentuk. biarkan bermalam pada suhu kamar c. Esoknya diamati dengan reading mirror pada kolony counter 3. dinyatakan positif (++) d. biarkan bermalam pada suhu kamar c. Homogenkan selama 30 menit dengan cara dikocok perlahan. Jika gumpalan yang terjadi kecil-kecil.b.

c = test negatif dan true positif d = test negatif dan true negatif True positif dan true negatif adalah kultur bakteri dari darah ikan positif dan kultur bakteri dari darah ikan negatif Analisis data Dapat menggunakan analisis statistic tabulasi silang (crosstabs) yang dilanjutkan dengan uji chi-square. .

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->