You are on page 1of 4

Imunologi Infeksi Bakteri

1. Metode Aglutinasi (rosette) Eristrosit Metode ini merupakan cara menerka terjadinya respon kekebalan pada tubuh ikan secara sederhana, tanpa membutuhkan peralatan canggih (ELISA micro-plate reader, misalnya) Prosedur Kerja : 1. Suntikkan eritrosit (bisa dari sumber mana saja) dengan dosis 100 l per 100 gram berat badan ikan, via intra peritoneal atau intra-vena. (corn oil), bila tidak ada bisa dengan PBS 2. Biarkan ikan bereaksi terhadap antigen (eritrosit) selama paling tidak 14 hari 3. Siapkan agar yang tidak terlalu keras (soft agar) dalam Petri dish, dalam kondisi aseptic 4. Tuangkan sekitar 200 l eritosit (atau sesuaikan volumenya) pada permukaan secara merata, didalam Petri dish 5. Tambahkan suspensi sel dari ginjal kepala ikan yang telah diinjeksi dengan eritrosit (sekitar 200 l) diatas suspensi eritrosit. Biarkan selama 90 120 menit (Lebih lama Lebih baik), lalu masukkan kedalam refrigerator, suhu 4C 6. Amati rosette (kumpulan leukosit) disekitar eritrosit menggunakan loop. Bila seluruh permukaan petridish dipenuhi rosette, berarti imunisasi berhasil dengan sempurna. 2. Teknik Aglutinasi Bakterial Pasif (ABP) Reagent : a. Antiserum 1. Antiserum diperoleh dari ikan suspek penderita penyakit bacterial tertentu (perhatikan gejala klinis), anti serum kita beri ethanol 96 % dan aseton (perbandingan antiserum : ethanol : aseton = 1 : 1 : 0,3) 2. Anti serum kita absorpsikan dengan E. coli yang telah diformolasi dengan formalin 4 %, divortex selama 5 menit lalu disentrifuge pada kecepatan 15.000 rpm selama 10 menit, lalu diambil supernatantnya. b. Reagent ABP Campur eritrosit dengan volume yang sama dengan FCA atau minyak zaitun (olive oil) atau minyak jagung

1. Satu koloni Staphylococcus aerus yang diberi formalin 4 % disensitisasi dengan 10 % (vol/vol) suspensi antiserum dalam PBS 0,03 M (dalam eppendorf atau Tabung reaksi/vial 10 ml) 2. Campuran tersebut diinkubasi daalam suhu 37 C selamam 90 120 menit, dalam waterbath 3. Sentrifuge pada kecepatan 12.000 rpm, lalu tambahakan 1 ml PBS 1 %, lalu vortex selama 5 menit 4. Campuran yang kita peroleh merupakan reagent ABP, disimpan dalam suhu 4C c. 1. Reagent Kontrol Sebagai reagent control adalah 1 koloni Staphylococcus aureus yang telah distabilkan dengan formalin 4 %, lalu dicuci dengan PBS, lalu ditambahkan 500 l antiserum dan vortex selama 5 menit, simpan dalam suhu 4C d. Antigent Terlarut 1. Satu koloni Aeromonas hydrophilla diberi formalin 4 % lalu divortex selama 5 menit, lalu disimpan dalam freezer -20 C 2. Keluarkan dari freezer, biarkan mencair, Tambahkan 1 ml PBS, sentrifuge pada kecepatan 12.000 rpm, buang supernatant, sedimen (pellet) yang diperoleh pada dasar tube adalah LPS 3. Ke dalam LPS ditambahkan 1 ml PBS, simpan dalam suhu 4C Prosedur Kerja 1. Pembuatan Kontrol Positif a. Sebanyak 5 l reagent ABP, 5 l antigen LPS, 80 l PBS dan 10 l Bromophenol Blue (BFB) 0,01 % masukkan dalam setiap well/sumur b. Kocok hingga homogen secara perlahan-lahan selama 30 menit, dan biarkaan bermalam dalam suhu kamar c. Esoknya diamati dengan reading mirror pada kolony counter 2. Pembuatan Kontrol Negatif a. Sebanyak 5 l reagent kontrol, 5 l antigen LPS, 80 l PBS dan 10 l BFB 0,01 % ditambahkan ke dalam setiap well.

b. Homogenkan selama 30 menit dengan cara dikocok perlahan, biarkan bermalam pada suhu kamar c. Esoknya diamati dengan reading mirror pada kolony counter 3. Pemeriksaan Serum Ikan Suspek a. Sebanyak 5 l serum ikan, 5 l antigen LPS, 80 l PBS dan 10 l BFB 0,01 % ditambahkan di dalam setiap well b. Homogenkan selama 30 menit dengan cara dikocok perlahan, biarkan bermalam pada suhu kamar c. Esoknya diamati dengan reading mirror pada kolony counter 4. Pembacaan Hasil Uji Teknik ABP Prinsipnya, kita melihat apakah terjadi aglutinasi di bawah reading mirror yang menandakan adanya penyakit bakteri tertentu dalam tubuh ikan dengan memperhatikan : a. Jika gumpalan/aglutinasi yang terjadi besar dan terjadi diseluruh permukaan well microplate, dinyatakan positif 4 (++++) b. Jika gumpalan yang terjadi kecil, namun terjadi di seluruh permukaan well microplate, dinyatakan positif 3 (+++) c. Jika gumpalan yang terjadi kecil-kecil, dan hanya terjadi pada setengah permukaan well pada microplate, dinyatakan positif (++) d. Jika gumpalan yang terjadi kecil-kecil, dan terjadi pada kurang dari setengah permukaan well dari microplate, dinyatakan positif 1 (+) e. Jika tidak ada gumpalan yang Terbentuk, dinyatakan negatif (-) Tingkat sensitivitas dan spesifisitas, Positif Predictive Value (PPV) dan Negative Predictive Value (NPV) dari uji diagnostic dihitung dengan rumus : Sensitivitas = a / (a + c) x 100 PPV = a / (a + b) x 100 a = test positif dan true positif b = test positif dan true negatif Spesifisitas = d / (d + b) x 100 NPV = d / (d + c) x 100

c = test negatif dan true positif d = test negatif dan true negatif True positif dan true negatif adalah kultur bakteri dari darah ikan positif dan kultur bakteri dari darah ikan negatif Analisis data Dapat menggunakan analisis statistic tabulasi silang (crosstabs) yang dilanjutkan dengan uji chi-square.

You might also like