Imunologi Infeksi Bakteri

1. Metode Aglutinasi (rosette) Eristrosit Metode ini merupakan cara menerka terjadinya respon kekebalan pada tubuh ikan secara sederhana, tanpa membutuhkan peralatan canggih (ELISA micro-plate reader, misalnya) Prosedur Kerja : 1. Suntikkan eritrosit (bisa dari sumber mana saja) dengan dosis 100 µl per 100 gram berat badan ikan, via intra peritoneal atau intra-vena. (corn oil), bila tidak ada bisa dengan PBS 2. Biarkan ikan bereaksi terhadap antigen (eritrosit) selama paling tidak 14 hari 3. Siapkan agar yang tidak terlalu keras (soft agar) dalam Petri dish, dalam kondisi aseptic 4. Tuangkan sekitar 200 µl eritosit (atau sesuaikan volumenya) pada permukaan secara merata, didalam Petri dish 5. Tambahkan suspensi sel dari ginjal kepala ikan yang telah diinjeksi dengan eritrosit (sekitar 200 µl) diatas suspensi eritrosit. Biarkan selama 90 – 120 menit (Lebih lama Lebih baik), lalu masukkan kedalam refrigerator, suhu 4ºC 6. Amati rosette (kumpulan leukosit) disekitar eritrosit menggunakan loop. Bila seluruh permukaan petridish dipenuhi rosette, berarti imunisasi berhasil dengan sempurna. 2. Teknik Aglutinasi Bakterial Pasif (ABP) Reagent : a. Antiserum 1. Antiserum diperoleh dari ikan suspek penderita penyakit bacterial tertentu (perhatikan gejala klinis), anti serum kita beri ethanol 96 % dan aseton (perbandingan antiserum : ethanol : aseton = 1 : 1 : 0,3) 2. Anti serum kita absorpsikan dengan E. coli yang telah diformolasi dengan formalin 4 %, divortex selama 5 menit lalu disentrifuge pada kecepatan 15.000 rpm selama 10 menit, lalu diambil supernatantnya. b. Reagent ABP Campur eritrosit dengan volume yang sama dengan FCA atau minyak zaitun (olive oil) atau minyak jagung

Kocok hingga homogen secara perlahan-lahan selama 30 menit. Pembuatan Kontrol Positif a. simpan dalam suhu 4ºC d. Sebanyak 5 µl reagent ABP. 5 µl antigen LPS. biarkan mencair. lalu vortex selama 5 menit 4. Pembuatan Kontrol Negatif a. Campuran tersebut diinkubasi daalam suhu 37 ºC selamam 90 – 120 menit. Esoknya diamati dengan reading mirror pada kolony counter 2. lalu disimpan dalam freezer -20 ºC 2. simpan dalam suhu 4ºC Prosedur Kerja 1.000 rpm. buang supernatant. Ke dalam LPS ditambahkan 1 ml PBS.1. dan biarkaan bermalam dalam suhu kamar c. sentrifuge pada kecepatan 12. Keluarkan dari freezer. lalu ditambahkan 500 µl antiserum dan vortex selama 5 menit. 1. 80 µl PBS dan 10 µl BFB 0. lalu dicuci dengan PBS.01 % masukkan dalam setiap well/sumur b.01 % ditambahkan ke dalam setiap well. Satu koloni Staphylococcus aerus yang diberi formalin 4 % disensitisasi dengan 10 % (vol/vol) suspensi antiserum dalam PBS 0. dalam waterbath 3. disimpan dalam suhu 4ºC c. Antigent Terlarut 1. 5 µl antigen LPS. Satu koloni Aeromonas hydrophilla diberi formalin 4 % lalu divortex selama 5 menit. Campuran yang kita peroleh merupakan reagent ABP. .03 M (dalam eppendorf atau Tabung reaksi/vial 10 ml) 2. Reagent Kontrol Sebagai reagent control adalah 1 koloni Staphylococcus aureus yang telah distabilkan dengan formalin 4 %. sedimen (pellet) yang diperoleh pada dasar tube adalah LPS 3.000 rpm. lalu tambahakan 1 ml PBS 1 %. Tambahkan 1 ml PBS. 80 µl PBS dan 10 µl Bromophenol Blue (BFB) 0. Sebanyak 5 µl reagent kontrol. Sentrifuge pada kecepatan 12.

Pemeriksaan Serum Ikan Suspek a. kita melihat apakah terjadi aglutinasi di bawah reading mirror yang menandakan adanya penyakit bakteri tertentu dalam tubuh ikan dengan memperhatikan : a. Positif Predictive Value (PPV) dan Negative Predictive Value (NPV) dari uji diagnostic dihitung dengan rumus : Sensitivitas = a / (a + c) x 100 PPV = a / (a + b) x 100 a = test positif dan true positif b = test positif dan true negatif Spesifisitas = d / (d + b) x 100 NPV = d / (d + c) x 100 . Jika gumpalan yang terjadi kecil. dan hanya terjadi pada setengah permukaan well pada microplate. namun terjadi di seluruh permukaan well microplate.01 % ditambahkan di dalam setiap well b. 80 µl PBS dan 10 µl BFB 0. dinyatakan positif 3 (+++) c. Jika gumpalan yang terjadi kecil-kecil. dinyatakan positif 4 (++++) b. Sebanyak 5 µl serum ikan. Pembacaan Hasil Uji Teknik ABP Prinsipnya. Jika gumpalan/aglutinasi yang terjadi besar dan terjadi diseluruh permukaan well microplate. biarkan bermalam pada suhu kamar c. Jika gumpalan yang terjadi kecil-kecil. Esoknya diamati dengan reading mirror pada kolony counter 3. Homogenkan selama 30 menit dengan cara dikocok perlahan. dinyatakan positif 1 (+) e. biarkan bermalam pada suhu kamar c. dinyatakan positif (++) d. dinyatakan negatif (-) Tingkat sensitivitas dan spesifisitas. 5 µl antigen LPS. Esoknya diamati dengan reading mirror pada kolony counter 4. Homogenkan selama 30 menit dengan cara dikocok perlahan. Jika tidak ada gumpalan yang Terbentuk.b. dan terjadi pada kurang dari setengah permukaan well dari microplate.

.c = test negatif dan true positif d = test negatif dan true negatif True positif dan true negatif adalah kultur bakteri dari darah ikan positif dan kultur bakteri dari darah ikan negatif Analisis data Dapat menggunakan analisis statistic tabulasi silang (crosstabs) yang dilanjutkan dengan uji chi-square.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful