Jurnal Pembelajaran Sains Vol. 5 No.

2, Agustus 2009, 172-178

Skrining Fitokimia Tumbuhan Ophiopogon jaburan Lodd dari Kabupaten Kolaka Provinsi Sulawesi Tenggara
N o h o n g* Jurusan Kimia FMIPA Universitas Haluoleo Kendari Abstract Phytochemistry screening for Ophiopogon jaburan Lodd showed the presence of metabolite secondary compounds flavonoids, triterpenoid and steroids. Isolation of triterpenoid used soklet for 345,78 gram of root Ophiopogon jaburan Lodd. with n-hexana as solvent gave 5,16 gram non polar extract (1,49%). Fractination for non polar extract by thin layer chromatography preparative used chloroform:hexane (8:1/2) as eluen gave seven fraction. Analysis by GC-MS of second fraction contain 12 constituents compound, two of them suspected was tritepane and monoaromatic triterpenoid compounds while the others was bicyclic sesquiterpanes, tricyclic diterpane, terpenes, methyl sterol, dioctyl phthalate and acid compound. Keywords : Ophiopogon jaburan Lodd., phytochemistry screening, metabolite secondary compounds ___________________________________________________________________________ A. Pendahuluan Tumbuh-tumbuhan mempunyai kedudukan dan peranan yang amat penting dalam kehidupan manusia. Hampir lima dekade terakhir ini timbul ketertarikan yang kuat dalam meneliti tumbuhan sebagai sumber obat-obatan. Ini didasarkan pada beberapa alasan. Pertama, adanya gerakan revolusi hijau yang didasari keyakinan bahwa pengobatan dengan tumbuhan lebih aman dan dapat mengurangi efek samping pada tubuh manusia dibandingkan dengan obat-obatan sintetis. Kedua, adanya fakta bahwa banyak obat-obatan penting yang digunakan sekarang berasal dari tumbuhan (Williamson, 1996). Diperkirakan sekitar 30.000 spesies tumbuhan ditemukan di dalam hutan hujan tropika, sekitar 1.260 spesies diantaranya berkhasiat sebagai obat. Pada saat ini, baru sekitar 180 spesies yang telah digunakan untuk berbagai keperluan industri obat dan jamu, tetapi baru beberapa spesies yang telah dibudidayakan secara intensif. Diperkirakan masih banyak tumbuhan berkhasiat obat yang belum diketahui kandungan senyawa aktifnya, sehingga diperlukan penelitian khusus. Agar pengobatan secara tradisional dapat dipertanggungjawabkan maka diperlukan penelitian ilmiah seperti penelitian di bidang farmakologi, toksikologi, identifikasi dan isolasi zat kimia aktif yang terdapat dalam tumbuhan (Lenny, 2006). Tumbuhan dapat digunakan sebagai obatobatan karena tumbuhan tersebut menghasilkan suatu senyawa yang memperlihatkan aktifitas biologis tertentu. Senyawa aktif biologis itu merupakan senyawa metabolit sekunder yang meliputi alkaloid, flavonoid, terpenoid dan steroid. Famili Liliaceae adalah salah satu dari begitu banyaknya famili yang ada dalam dunia tumbuhan yang memiliki kandungan senyawa metabolit sekunder yang berguna. Beberapa tumbuhan dalam famili ini telah banyak digunakan untuk pengobatan, seperti obat batuk, penumbuh rambut, mengobati asma, kencing manis, sakit perut dan pencahar (Heyne, K., 1987). Penelitian terhadap famili Liliaceae telah banyak mengungkapkan senyawa-senyawa kimia baru yang berfungsi sebagai obat. Salah satu diantaranya pada Allium

Nohong/Jurnal Pembelajaran Sains Vol. 5 No. 2, Agustus 2009, 172-178

jesdianum ditemukan empat steroid glikosida yang menunjukkan aktifitas sitostatik dan sitotoksik yang dapat melawan beberapa sel tumor berbahaya, serta ditemukan pula senyawa spirostanol saponin baru (Mimaki, Y., et al, 1999). Selain itu pada spesies Hosta sielbodii ditemukan 18 steroid saponin tipe gitogenin, tigogenin, F-gitoginin, hekogenin dan manogenin yang memiliki aktifitas sitotstatik pada sel leukemia (Mimaki, Y., et al, 1998). Salah satu genus dalam famili Liliaceae adalah genus Ophiopogon yang memiliki kandungan senyawa metabolit sekunder (Buckhingham, J., 1994). Tabel 1. Kandungan Senyawa Metabolit Sekunder Genus Ophiopogon
Spesies Kandungan senyawa kimia Ophiopogon 6-aldehoisoophiopogonon A japonicus 6-aldehoisoophiopogonon B desmetilisoophiopogonon B metilophiopogonon A metilophiopogonanon A 6-formilisoophiopogonanon A 7-O-metil-6formilisoophiopogonanon A metilophiopogonanon B 6-formilisoophiopogonanon B 7-O-metil-6formilisoophiopogonanon B ophiopogonon A ophiopogonanon A ophiopogonon B ophiopogonanon ophiopogonin B ophiopogonin D Ophiopogon ophiopogonin C japonicus ophiopogonin A ophiopogonin B ophiopogonin C ophiopogonin D Ophiopogon Kaemferol 3,4-diglukosida jaburan Kaemferol 4 glukosida Ophionin Ophiopogon 6-formilisoophiopogonanon A ohwii metilophiopogonon B 6-formilisoophiopogonanon B

yang ditimbulkan oleh senyawa metabolit sekunder yang berasal dari tumbuhan sangat diperlukan dalam usaha penemuan sumber obat baru. Skrining fitokimia merupakan metode pendekatan yang dapat digunakan untuk mengungkapkan keberadaan senyawa-senyawa metabolit sekunder dari tumbuh-tumbuhan. Metode ini digunakan karena cara pengerjaannya yang sederhana, cepat, sedikit menggunakan peralatan serta sangat selektif. Selain itu, bagian tumbuhan yang digunakan hanya sedikit yang dibutuhkan sehingga tidak akan merusak tumbuhan itu secara keseluruhan. Disamping itu, skrining fitokimia dapat memberikan informasi tentang keberadaan senyawa metabolit sekunder yang merupakan sumber senyawa aktif biologis yang terdistribusi dalam jaringan tanaman. Adapun secara umum kandungan senyawa metabolit sekunder genus Ophiopogon dapat dilihat pada tabel 1. B. Metode Penelitian Akar tumbuhan Ophiopogon jaburan Lodd dicuci bersih dari tanah dan pengotor lain yang melekat dan dikeringkan di udara terbuka tanpa terkena matahari langsung. Akar tumbuhan yang telah bersih ini digerus sampai halus sehingga terbentuk serbuk halus yang siap untuk diekstraksi. Pengujian Alkaloid Pengujian Alkaloid dilakukan melalui tahapan berikut. Tambahkan 20 ml kloroform ke dalam bahan yang sudah digerus halus lalu tambahkan kloroform amoniak, digerus lagi dan disaring. Kemudian ke dalam filtrate ditambahkan asam sulfat 2 N sebanyak 10 tetes, kocok dan didiamkan sampai batas kedua lapisan terlihat. Lapisan bagian atas diambil dan dipindahkan ke dalam tiga tabung reaksi. Selanjutnya kepada masing-masing tabung reaksi ditambahkan pereaksi Mayer, dan Wagner. Jika bahan mengandung alkaloid maka akan terbentuk berturut-turut endapan putih dengan peraksi Mayer, dan endapan coklat dengan pereaksi Wagner. Sebagai penentu kadar relatif digunakan pembanding brucin dalam asam klorida

Mengingat pentingnya peran tumbuhan bagi kehidupan manusia, maka pengetahuan mengenai aktifitas biologis 173

Nohong/Jurnal Pembelajaran Sains Vol. 5 No. 2, Agustus 2009, 172-178

yang kadarnya 0,01%; 0,025%; 0,05% dan 0,1%. Kadar ini biasa dinyatakan secara kualitatif dengan sebutan berturut-turut sebagai : +, ++, +++ dan ++++. Pengujian Steroid dan Triterpenoid dilakukan melalui tahapan berikut. Lapisan bawah dari sisa pemeriksaan alkaloid, diambil dan dikeringkan pada plat tetes. Asam asetat anhidrat ditambahkan beberapa tetes, dikocok agar sisa yang kering larut kembali. Dua tetes asam sulfat pekat ditambahkan dan diamati perubahan warna yang terjadi. Adanya steroid ditunjukkan dengan terbentuknya warna biru, sedangkan triterpenoid ditunjukkan dengan terjadinya warna jingga sampai ungu. Sebagai penentu kadar relatif untuk steroid digunakan pembanding bubuk kolesterol dengan nilai +++ dan untuk triterpenoid digunakan biji mahoni dengan nilai +++. Pengujian Flavonoid. Bahan yang telah halus sebanyak 4 gram dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan diekstraksi dengan eter. Saring dan tambahkan natrium hidroksida 10% lalu kocok. Larutan bagian bawah yang berupa Na-fenolat ditambahkan asam klorida 2N dan ditambah eter lagi, kocok dan didiamkan sampai terbentuk dua lapisan larutan. Lapisan sebelah atas diambil dan dipindahkan ke dalam tabung reaksi. Selanjutnya ke dalam tabung reaksi ditambahkan FeCl3. Terbentuknya larutan merah menunjukkan adanya flavonoid. Sebagai penentu kadar relatif digunakan pembanding daun lagundi ( Vitex trifolia) yang memberikan reaksi positif terhadap pereaksi FeCl3 dan dinyatakan dengan nilai ++. Ekstraksi Akar Ophiopogon jaburan Lodd. Serbuk halus akar tumbuhan Ophiopogon jaburan Lodd.345,78 gram diekstraksi kontinu menggunakan alat soklet dengan pelarut n-heksan teknis. Ekstraksi dilakukan beberapa kali dan dihentikan bila ekstrak telah menunjukkan hasil negatif terhadap pereaksi Leibermann-Burchard. Ekstrak n-heksan

yang diperoleh dikumpulkan dan pelarutnya diuapkan dengan rotary evapator sehingga menjadi ekstrak pekat. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Sedikit ekstrak n-heksan ditotolkan pada plat kromatografi lais tipis silica gel GF254 (0,25 mm), kemudian dielusi dengan pelarut dan campuran pelarut yang berbeda. Eluen yang digunakan adalah kloroform (100%), heksana (100%), methanol (100%), diklorometan (100%), campuran pelarut kloroform : diklorometan dan campuran pelarut kloroform : heksan. Pelarut yang memberikan pemisahan terbaik pada plat kromatografi lapis tipis akan digunakan sebagai fase gerak untuk kromatografi lapis tipis preparatif. Pemisahan Secara Kromatografi Lapis Tipis Preparatif Ekstrak n-heksan sebanyak 2,50 gram dilarutkan dalam pelarut kloroform. Cuplikan yang akan dipisahkan ini ditotolkan pada garis dengan jarak 2 cm dari tepi bawah plat kromatografi lapis tipis ukuran 20x20 cm yang menggunakan silica gel GF254 (0,5 mm) sebagai fase diam, dan dielusi dengan eluen kloroform : heksan (8:1/2) secara acak tegak lurus pada garis cupilkan di dalam ruang pengembangan (chamber) sehingga campuran akan terpisah menjadi beberapa fraksi. Plat kromatografi lapis tipis preparatif yang telah dielusi dibiarkan kering terbuka dan disinari dengan lampu UV. Pita-pita pemisahan yang tampak ditandai dengan pensil. Masing-masing fraksi yang terpisah dikerok dari plat kaca lalu ditampung dalam gelas piala, diekstraksi dengan pelarut kloroform dan disaring untuk mendapatkan filtratnya. Masing-masing filtrat dikumpulkan dan diuapkan pelarutnya untuk mendapatkan padatan. Analisa Kromatografi Gas-Spektroskopi massa (KG-SM) Fraksi hasil pemisahan secara kromatografi lapis tipis preparatif yang berupa padatan diidentifikasi dengan 174

Nohong/Jurnal Pembelajaran Sains Vol. 5 No. 2, Agustus 2009, 172-178

menggunakan kromatografi gasspektroskopi massa (KG-SM). Bahan (1,0 mgram) dilarutkan dalam 2 mL pelarut kloroform hingga larut semuanya, kemudian cuplikan sebanyak 0,5 L diinjeksikan kedalam peralatan KG-SM merek Shimadzu QP-5000, dengan kondisi operasi sebagai berikut : Jenis pengionan : EI (Elektroron Impact); Jenis kolom : DB1 (100% dimetil polisiksan) panjang 30 meter; Suhu kolom 600C (5 menit) s/d 2900C, kenaikan 100C/menit; Gas pembawa :Helium, aliran 40 mL/menit; Tekanan : 15 Kpa; Suhu injector: 2900C; Suhu detector : 2800C dan Jumlah injeks : 0,5L. C. Hasil Penelitian dan Pembahasan Ekstraksi Akar Ophiopogon jaburan Lodd. Hasil skrining fitokimia menunjukkan bahwa akar spesies Ophiopogon jaburan Lodd positif mengandung flavonoid, triterpenoid dan steroid. Tumbuhan ini memiliki kandungan triterpenoid terbesar dibandingkan spesiesspesies yang lainnya ( Erika, 2006), oleh karena itu spesies ini dipilih untuk di teliti lebih lanjut. Ekstraksi 345,78 gram akar Ophiopogon jaburan Lodd dilakukan dengan alat soklet dengan pelarut n-heksan teknis. Penguapan pelarut dengan alat rotary evapator menghasilkan ekstrak pekat non polar yang berwarna oranye sebanyak 5,16 gram (1,49%). Analisa Kromatografi Lapis Tipis Analisa kromatografi lapis tipis dilakukan untuk menentukan eluen yang akan digunakan pada kromatografi lapis tipis preparatif. Noda memisah dengan baik setelah eluen yang digunakan kloroform : heksan (8:1/2). Pemisahan terhadap ekstrak n-heksan dengan pelarut kloroform terdapat tujuh noda yang terpisah dengan baik sehingga pemisahan selanjutnya dilakukan secara kromatografi lapis tipis preparatif. 175

Pemisahan Secara Kromatografi Lapis Tipis Sebanyak 2,50 gram ekstrak pekat nheksan dilarutkan dalam 8 ml pelarut kloroform sehingga ekstrak dapat larut sempurna. Cuplikan ini selanjutnya ditotolkan berupa garis pada jarak 2 cm dari tepi bawah plat kromatografi lapis tipis. Plat kromatografi lapis tipis dielusi dengan campuran pelarut kloroform : heksan (8:1/2) dalam ruang pengembang (chamber). Plat yang sudah dielusi dikeluarkan dari ruang pengembang dan pelarut dibiarkan menguap di udara terbuka dan disinari dengan lampu UV. Penyinarin dengan lampu UV memperlihatkan tujuh pita kelompok senyawa yang menunjukkan tujuh fraksi. Perhitungan nilai Rf dan warna masing-masing fraksi dapat dilihat pada tabel 2. Tabel 2. Nilai Rf dan Warna Fraksi Fraksi 1 2 3 4 5 6 7 Warna Merah muda Kuning Ungu Ungu Oranye Ungu Kuning Rf 0,06-0,09 0,10-0,17 0,25-0,34 0,36-0,44 0,56-0,63 0,66-0,75 0,77-0,93

Ketujuh fraksi tersebut selanjutnya dikerok dari plat kromatografi lapis tipis, silikanya dihaluskan dan kemudian diekstrak dengan pelarut kloroform untuk mendapatkan kembali masing-masing senyawa yang ada. Filtrat yang diperoleh diuapkan dengan penguap vakum sehingga didapatkan fraksi pekat, seperti dilihat pada 3. Tabel 3. Daftar Berat Fraksi Fraksi Wujud Jumlah 1 Padatan 8,70 mg 2 3 4 5 6 7 Padatan Padatan Padatan Padatan Padatan Padatan 10,5 mg 10,7 mg 10,6 mg 11,3 mg 17,8 mg 19,2 mg Warna Merah muda Kuning Putih Putih Merah Oranye Kuning

Nohong/Jurnal Pembelajaran Sains Vol. 5 No. 2, Agustus 2009, 172-178

Uji kromatografi lapis tipis yang dilakukan terhadap ketujuh fraksi pekat dengan eluen kloroform : heksan (8:1/2) tersebut menunjukkan hanya fraksi 2 yang memberikan pemisahan yang lebih baik. Oleh karena itu, identifikasi senyawa hasil fraksinasi secara kromatografi gas spektroskopi-massa hanya dilakukan terhadap fraksi 2. Identifikasi Senyawa Hasil Fraksinasi Analisa kromatografi gasspektroskopi massa terhadap fraksi 2 menunjukkan bahwa masing-masing fraksi belumlah merupakan komponen murni. Terlihat pada gambar:

Gambar 1. Kromatogram fraksi 2 Data kromatografi gas menunjukkan adanya 12 puncak yang menunjukkan adanya 12 komponen senyawa. Kedua belas senyawa tersebut dianalisa lagi secara spektroskopi-massa. Pola fragmentasi senyawa nomor 1 mempunyai fragmentasi yang sama dengan senyawa bisiklik seskuiterpen yang memberikan puncak pada m/z 43 55 69 81 121 133 149 191 205 dan 234 [M+] dengan puncak dasar m/z 43. Munculnya puncak m/z 95 121 149 191 merupakan fragmen khas dari senyawa-senyawa bisiklik seskuiterpen sehingga dapat diduga nomor 1 merupakan senyawa bisiklik seskuiterpen. Senyawa nomor 2 memberikan puncak-puncak pada m/z 43 55 79 107 121 139 187 220 362 dan 406 [M+] dengan puncak dasar m/z 43. Adanya fragmentasi pada m/z 107 dan 121 yang khas bagi senyawa terpen [54] memberikan dugaan senyawa ini merupakan senyawa terpen. Spektrum massa senyawa nomor 3 memberikan puncak-puncak pada m/z 43 60 73 83 97 115 129 171 185 199 213 227

256 dan 494 [M+] dengan puncak dasar m/z 43. Fragmen-fragmen pada senyawa ini mempunyai kemiripan dengan fragmen senyawa asam alifatik yakni dengan adanya fragmen khas pada m/z 43 60 73 83 97 115 129 [55,56] sehingga senyawa ini diduga sebagai senyawa asam. Senyawa nomor 4 memberikan puncak-puncak pada m/z 51 65 77 91 107 121 134 148 151 166 178 195 269 155 284 300 358 dan 448 [M+] dengan puncak dasar pada m/z 178. Andanya fragmen khas 121 148 dan 178 yang merupakan fragmen khas untuk senyawa metal sterol. Keberadaan gugus metal ditandai dengan pengurangan fragmen sebanyak 15 dari m/z 166 ke m/z 151 demikian juga dari m/z 284 ke m/z 269, sehingga dapat diduga senyawa nomor 4 kemungkinan suatu metal sterol. Spektrum senyawa nomor 5 memberikan puncak pada m/z 39 65 77 911 103 121 134 148 161 175 260 270 dan 487 [M+] dengan puncak dasar m/z 148. Fragmen khas untuk senyawa yang muncul pada m/z 121 memberi dugaan bahwa senyawa ini termasuk senyawa terpen. Spektrum massa pada puncak 6 merupakan senyawa dioktil ptalat (C16H22O4). Ditandai dengan adanya puncak dasar yang kuat pada m/z 149 dab fragmentasi khas pada m/z 43 57 71 104 149. Senyawa ini kemungkinan merupakan senyawa pengotor yang berasal dari pelarut atau silica yang digunakan. Spektrum massa senyawa nomor 7 memberikan m/z 39 55 69 77 91 107 121 137 284 339 374 dan 428 [M+] dengan puncak dasar m/z 121. Adanya fragmen khas m/z 121 137 163 dan 190 spesifik untuk senyawa trisiklik diterpen sehingga diperkirakan senyawa ini merupakan trisiklik diterpen. Spektrum massa senyawa nomor 8 mempunyai puncak-puncak pada m/z 39 63 77 91 102 121 130 149 151 175 194 235 251 281 296 314 dan 452 [M+] dengan puncak dasar pada m/z 175. Fragmen khas untuk senyawa terpen yang muncul pada m/z 121 memberi dugaan bahwa senyawa nomor 8 merupakan senyawa terpen.

176

Nohong/Jurnal Pembelajaran Sains Vol. 5 No. 2, Agustus 2009, 172-178

Spektrum massa senyawa nomor 9 memberikan puncak-puncak pada m/z 39 53 77 91 105 117 131 137 151 189 283 dan 314 [M+] dengan puncak dasar m/z 314. Munculnya fragmen bagi senyawa terpen m/z 137 151 189 memberi dugaan bahwa senyawa ini merupakan senyawa terpen. Spektrum massa senyawa nomor 10 memberikan puncak dasar pada m/z 137 dan adanya fragmen khas m/z 109 121 137 163 dan 207 yang spesifik untuk senyawa trisiklik diterpen dengan berat molekul 346 memberi dugaan bahwa senyawa nomor 10 merupakan senyawa trisiklik diterpen. Spektrum massa senyawa nomor 11 memberikan puncak-puncak pada m/z 39 51 69 75 94 119 123 151 165 201 217 257 297 343 358 359 dan 386 [M+] dengan puncak dasar m/z 358. Munculnya fragmen khas senyawa triterpen pada m/z 123 135 217 315 memberi dugaan kemungkinan senyawa ini merupakan triterpen. Spektrum massa senyawa nomor 12 mempunyai berat molekul 402 dengan puncak dasar m/z 55 mempunyai fragmentasi khas pada m/z 105 133 145 159 189 218 287 369 yang spesifik untuk senyawa triterpen monoaromatik. Keberadaan senyawa aromatic ditandai dengan pengurangan fragmen sebanyak 78 dari m/z 133 ke m/z 55 demikian juga dari m/z 145 ke m/z 67, sehingga dapat diperkirakan senyawa nomor 12 kemungkinan suatu triterpen monoaromatik. D. Kesimpulan Ekstraksi yang dilakukan terhadap 345,78 gram akar tanaman Ophiopogon jaburan Lodd. Menghasilkan ekstrak pekat non polar sebanyak 5,16 gram (1,49%). Fraksinasi dengan kromatografi lapis tipis preparatif dengan eluen kloroform:heksan (8:1/2) didapatkan tujuh fraksi. Analisa KG-SM terhadap fraksi dua mendapatkan 12 komponen senyawa, dua diantaranya diduga merupakan senyawa triterpen dan triterpen 177

monoaromatik sedangkan yang lain merupakan senyawa bisiklik seskuiterpen, trisiklik diterpen, senyawa-senyawa terpen, metal sterol, dioktil ftalat dan asam alifatik.

Daftar Pustaka 1. Buckhingham, J., 1994, Dictionary of Natural Products Spesies Index, vol 7, Chapman and Hall, London. 2. Erika, F., 2006, Skrining Fitokimia Tumbuhan famili Liliaceae koleksi Kebun Raya Purwodadi, Buletin Bappeda Kaltim, vol VII No. 10, Samarinda. 3. Harborne, J.B. 1987, Metode Fitokimia (terjemah), Penerbit ITB, Bandung. 4. Hendayana dkk., 1994, Kimia Analitik Instrumen, edisi pertama, IKIP Semarang Press, Semarang. 5. Heyne, K., 1987, Tumbuhan Berguna Indonesia I, Departemen Kehutanan, Jakarta. 6. Lenny, S., 2006, Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah (Gruptophyllum pictum L.Griff), USU Respitory, Medan. 7. Mc Lafferty, F.W., 1998, Interpertasi Spektra Massa (terjemah), edisi ketiga, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. 8. Mimaki, Y., et al, 1999, Steroidal Glycosides from The Bulbs of Allium jesdianum, Journal of Natural Product. 9. Mimaki, Y., et al, 1998, Steroidal Saponins from The Rhizomes of Hosta seilboldii and Their Cytostatic Activity on HL-60 Cells, Phytochemistry 10. Pasto, Johnson and Miller, 1992, Experimental and Technique in Organic Chemistry, Prentice Hall Inc, New Jersey. 11. Sastrohamidjojo,H., 1991, Spektroskopi, edisi kedua, Liberty, Yogyakarta.

Nohong/Jurnal Pembelajaran Sains Vol. 5 No. 2, Agustus 2009, 172-178

12.

13.

14.

Supriadi dkk., 2001, Tumbuhan Obat Indonesia, Penggunaan dan Khasiatnya, Pustaka Populer Obor, Jakarta. Touchstone, J.C., 1995, Pratice of Thin Layer Chromatography, third edition, John Wiley Interscience Publication, New York. Williamson, E.M.,et al , 1996, Selection, Preparation and Pharmacological Evaluation of Plant Material, Chichester, John Wiley&Sons

178