Hastuti,

Jurnal PROTEIN

Pengaruh Penyuntikan Poly I:C terhadap Ekspresi Protein Yang Bertanggung Jawab Terhadap Sistem Kekebalan Lobster Air Tawar (Cherax quadricarinatrus Von Martens) The Effect of Poly I:C Injection On Protein Expression Wich Responsible to Immune System of Of Redclaw (Cherax quadricarinatrus Von Martens)
Sri Dwi Hastuti Fakultas Peternakan Perikanan Universitas Muhammadiyah Malang Jl. Raya Tlogomas No. 246 Malang. Telp. (0341) 464318. email: sridwihastuti@yahoo.com
Abstract

Background: Redclaw (Cherax quadricarinatrus Von Martens) is one of aquaculture organism

which widely cultured in many countries. The occurred of diseases often become a constrain in aquaculture industry and have not solved entirely. Therefore the understanding of redclaw immune sistem is important as an effort and strategic to combat disease problems in aquaculture. Methods: This research aims to investigate the effect of Poly I:C injection on the expression of protein which responsible on the immune sistem of redclaw for example is Mx proteins. Animal used in this study was redclaw with size of 13-20 g, injected with Poly I:C or Phosfat Buffer Saline (PBS) (as control). Animal injected with 2 mg/ml Poly I:C or PBS then sampled to get its haemocyte and hepatopancreas. Result: Gel electrophoresis of haemocyte showed that there is a protein with molecular weight of 3145 kDa which indicated as Lypopolisacharrides and -1,3-glucan Binding Protein (LGBP). While, gel electrophoresis of hepatopancreas showed an expression of protein with the band of molecular weight below 66.2 kDa. This protein can be assumed as a member of Mx protein which has antiviral property. Keywords : poly i:c, haemocytes, lypopolisacharrides and -1,3-glucan binding protein (lgbp), mx protein Abstraksi Latar Belakang: Lobster air tawar (Cherax quadricarinatrus Von Martens) merupakan hewan akuatik yang bayak dibudidayakan di beberapa negara. Dalam kegiatan budidaya hewan akuatik, resiko serangan penyakit seringkali muncul dan sampai saat ini belum bisa diatasi secara tuntas. Oleh karena itulah pemahaman yang mendalam terhadap sistem kekebalan redclaw sangat berguna dalam upaya dan strategi penanggulangan penyakit. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh penyuntikan Poly I:C terhadap ekspresi protein yang bertanggung jawab terhadap sistem kekebalan lobster air tawar misalnya Mx protein. Metode: Metode yang digunakan adalah eksperimen dengan materi uji berupa lobster air tawar berukuran 13-20 gram yang disuntik dengan Poly I:C atau Phosfat Buffer Saline (PBS) sebagai pembanding dengan dosis 2 mg/ml per ekor lobster air tawar dan diambil hemosit dan hepatopankreasnya. Hasil: Hasil elektroforesis hemosit mendeteksi bahwa ada protein dengan berat molekul 31-45 kDa yang kemungkinan adalah Lypopolisacharrides and -1,3-glucan Binding Protein (LGBP). Sementara elektroforesis hepatopankreas menunjukkan ekspresi protein yang ditunjukkan oleh band yang berada pada berat molekul tepat dibawah 66.2 kDa. Protein yang dimaksud kemungkinan merupakan famili dari Mx protein yang mempunyai aktivitas antivirus. Kata kunci: poly i:c, hemosit, lypopolisacharrides and -1,3-glucan binding protein (lgbp), mx protein

154

Hastuti,

Jurnal PROTEIN

PENDAHULUAN Lobster air tawar (Cherax quadricarinatus) yang di daerah asalnya Australia dikenal dengan sebutan redclaw merupakan spesies yang potensial untuk dibudidayakan. Hewan ini mempunyai beberapa keunggulan sebagai organisme budidaya, yaitu dapat dipelihara dalam padat penebaran yang tinggi, pertumbuhan cepat dibanding dengan lobster air tawar jenis lain, reproduksinya yang mudah, dan dapat bertahan pada kondisi kualitas air yang buruk seperti kandungan oksigen terlarut yang rendah (Meade & Watts, 1995; Muzinic et al., 2004). Hewan ini sudah banyak dibudidayakan di beberapa negara seperti Ecuador, Israel, China, Amerika Serikat (Barki, Gur, & Karplus, 2001; Chen & Edgerton, 2001; Jacinto et al., 2004) serta Indonesia. Dengan semakin berkembangnya budidaya kearah intensifikasi akan meningkatkan stress pada hewan yang selanjutnya akan menyebabkan munculnya masalah penyakit sebagaimana yang dialami oleh budidaya udang windu dalam sistem intensif (Lorenzon et al., 1997). Beberapa negara telah mengalami kerugian yang besar akibat penyakit white spot yang disebabkan infeksi virus WSSV pada budidaya udang (Zhang, Huang, Xu, & Hew, 2002), dan telah dilaporkan bahwa virus WSSV yang merupakan virus dengan tingkat patogenitas yang sangat tinggi telah ditemukan dapat menginfeksi lobster air tawar dalam uji laboratorium (Edgerton et al., 2002). Beberapa virus lain juga telah ditemukan dapat menyerang redclaw (Edgerton, 1996; Edgerton & Owens, 1999; Edgerton et al., 1994; Edgerton et al., 2000), sehingga infeksi virus menjadi fokus utama yang harus diwaspadai dalam budidaya lobster air tawar khususnya jika budidaya telah berkembang kearah intensif. Oleh karena itulah pemahaman yang mendalam terhadap sistem kekebalan redclaw sangat berguna dalam upaya dan strategi penanggulangan penyakit. Sebagai hewan yang masuk dalam kelas krustasea, redclaw tidak mempunyai sistem kekebalan adaptif dan tergantung pada

sistem kekebalan alami (innate immunity) dalam mempertahankan diri terhadap serangan patogen. Innate immunity yang dimiliki oleh krustasea mampu mendeteksi pola molekuler yang merupakan ciri spesifik suatu patogen (Sritunyalucksana, 2001), seperti misalnya lipopolysaccharida (LPS) dari bakteri gram negatif, glycolipids dari mycobacteria, asam lipoteichoic bakteri gram positif, mannans dari yeast, -1,3-glucan dari jamur dan rantai ganda dari RNA virus (Hoffman, Kafatos, Janeway, & Ekekowitz, 1999). Redclaw mempunyai satu set reseptor yang disebut dengan pattern recognition proteins / receptors (PRPs or PRRs). Pendeteksian substansi mikrobial dari patogen oleh PRPs akan mengaktifkan beberapa molekul biologis yang bertanggung jawab dalam sistem kekebalan tubuh termasuk protein antimikrobial (antimicrobial peptides) (Sritunyalucksana, 2001). Penyuntikan virus sintetis yang mirip rantai ganda RNA virus (Poly I:C) pada vertebrata telah terbukti mampu menginduksi respon antivirus dengan cara induksi sistem interferon (IFN system). IFN system merupakan sistem pertahanan tubuh yang pertama untuk melawan infeksi virus pada vertebrata. Type I sistem interferon terdiri dari dan interferons, yang menginduksi sintesis dari beberapa protein, termasuk protein kinase R (PKR),, adenosine deaminase dan Mx proteins (Plant & Thune, 2004). Studi yang telah dilakukan pada ikan yang diinjeksi dengan Poly I:C menunjukkan kemunculan Mx protein yang berperan sebagai agen antivirus (V. Jensen & Robertsen, 2000; J. Y. Lee, Hirono et al., 2000; Plant & Thune, 2004; Yap et al., 2003). Gel elektroforesis menunjukkan bahwa Mx protein mempunyai berat molekul antara 72.5 dan 76 kDa (I. Jensen, Albuqueque, Sommer, & Robertsen, 2002; Nygaard et al., 2000; Plant & Thune, 2004). Saat ini belum ada penelitian tentang pengaruh Poly I:C terhadap sistem immunitas krustasea. Karena itulah penelitian ini bertujuan untuk mengetahui ekspresi protein pada redclaw yang diinjeksi dengan Poly I:C. MATERI DAN METODE

155

Vol. 14 No. 2 Tahun 2006

Pengaruh Penyuntikan Poly I:C terhadap Ekspresi Protein

Hewan Uji dan Penyuntikan Redclaw yang berukuran 13-20 gram dipelihara dalam akuarium dengan volume air 60 liter, tiap akuarium diisi dengan 4 ekor redclaw. Akuarium A berisi hewan uji yang diinjeksi dengan Poly I:C dengan dosis 2 mg/ml dan akuarium 2 berisi 4 ekor hewan uji yang diinjeksi dengan Phosfat Buffer Saline (PBS) (sebagai kontrol/pembanding). Injeksi dilakukan secara intramuscular pada bagian ventral (otot abdominal). Setelah 4 hari, haemolymph dan hepatopankreas dari hewan uji disampling dan dilakukan uji lanjutan. Sampling Haemolymph dan Hepatopankreas Haemolymph diambil dari pangkal kaki jalan ke lima menggunakan syringe yang berukuran 1 ml, yang sebelumnya telah diisi dengan 100 l larutan Alsevers yang terdiri atas 19,3 mM Sodium citrate ; 239,8 mM Sodium chloride; 182,5 mM Glucose dan 6,2 mM EDTA pH 7,3) untuk menghindari penggumpalan haemolymph. Hepatopankreas diambil dengan membedah hewan uji pada bagian cephalothorax, memotong sebagian kecil hepatopankreas dan diletakan dalam 200 l phosphate buffer konsentrasi 50 mM, pH 7.4, kemudian ditambahkan dengan 1 l PMSF (10 mg/ml dalam isopropanol) untuk mencegah aktivitas proteolitik. Sampel kemudian disimpan pada suhu beku (-80 ) sampai digunakan. Persiapan Gel Elektroforesis Haemolymph disentrifus pada 700 x g selama 15 menit pada suhu 4 C, supernatant dibuang dan pellet disuspensikan dalam 50 l phosphate buffer konsentrasi 50mM. Protein dalam suspensi sel diukur dengan BCA protein assay kit (Pierce Biotechnology, USA). Berdasarkan hasil pengukuran protein, suspensi sel kemudian diencerkan untuk mencapai

konsentrasi protein 1 mg/ml. Sel kemudian diekstraksi dalam SDS sample buffer, kemudian dipanaskan selama 5 minutes pada suhu 95 C. Sampel yang mengandung 10g protein di running pada 10% SDS polyacrylamide gels (SDS-PAGE) selama 45 menit dengan tegangan 200V (Laemmli, 1970). Hepatopankreas dihomogenisasi menggunakan pestle kemudian disentrifus pada 10,000 x g selama 15 minutes pada 4 C. Supernatant (fase cair) diambil kemudian disentrifus sebanyak 2 kali untuk meghilangkan lemak yang berlebihan. Konsentrasi protein kemudian diukur seperti cara untuk hemocytes diatas dan kemudian diencerkan sampai konsentrasi 1 mg/ml. Sampel ditambahkan dengan 2 volume SDS sample buffer, dipanaskan selama 5 menit pada 95 C and dirunning pada SDS-PAGE 10% elektroforesis selama 45 minutes pada 200V, sesuai metode Laemmli, 1970. SDS-PAGE yang digunakan adalah standards (Bio-Rad, Hercules, CA). Resolving gel terdiri dari TrisHCl buffers 1.5 M pH 7.8 sementara Stacking gel terdiri atas 0.5 M pH 8.8. Gel kemudian diwarnai dengan Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad, Hercules, CA). HASIL DAN PEMBAHASAN Hemosit Semua hewan uji baik pada perlakuan Poly I:C dan PBS tetap hidup sampai saat sampling. Hasil elektroforesis hemosits disajikan pada Gambar 1. Dari hasil elektroforesis didapatkan bahwa tidak ada perbedaan dalam ekspresi protein antara perlakuan dengan Poly I:C dan PBS. Namun demikian elektroforesis mendeteksi bahwa ada protein dengan berat molekul 31-45 kDa yang kemungkinan adalah Lypopolisacharrides and -1,3-glucan Binding Protein (LGBP) (panah).

156

Hastuti,

Jurnal PROTEIN

Gambar 1.

Hasil Elektroforesis Protein Hemosit. Kolom 1= protein marker; Kolom 2,3,6,7 = sampel protein hemosit hewan uji dengan penyuntikan Poly I:C ; Kolom 4,5,8,9 = sampel hewan dengan penyuntikan PBS (kontrol) berat molekul tepat dibawah 66.2 kDa, protein ini sebenarnya juga muncul pada sampel dari perlakuan dengan PBS (Gambar 2. kolom 3 dan 6), namun kemunculannya meningkat secara nyata pada sampel hepatopankreas dari perlakuan Poly I:C (Gambar 2., kolom 2 dan 5). Protein yang dimaksud diindikasikan dengan tanda panah pada gambar, kemungkinan merupakan famili dari Mx protein yang mempunyai aktivitas antivirus.

Hepatopankreas Gel elektroforesis hepatopankreas ditunjukkan pada Gambar 2. Hasil elektroforesis menunjukkan adanya beberapa protein yang terrekspresi. Kolom 1 dan 7 menunjukkan protein marker, sementara kolom 2 dan 5 merupakan sampel protein dari perlakuan Poly I:C, kolom 3 dan 6 merupakan protein dari sample perlakuan PBS (kontrol). Ekspresi protein yang menjadi perhatian adalah yang ditunjukkan oleh band yang berada pada

Gambar 2.

Gel elektroforesis Protein yang terekspresi dari hepatopankreas Redclaw. Kolom 1,7 = marker; kolom 2,3 = treatment Poly I:C; kolom 4 = treatment LPS ; kolom 5, 6 = treatment PBS

157

Vol. 14 No. 2 Tahun 2006

Pengaruh Penyuntikan Poly I:C terhadap Ekspresi Protein

Hasil elektroforesis hemosit menunjukkan kemuculan protein yang diasumsikan sebagai LGBP berdasarkan berat molekulnya. Dilaporkan bahwa LGBP mempunyai berat molekul antara 36 dan 40 kDa (J. Y. Lee, Wang et al., 2000). Ekspresi LGBP pada perlakuan dengan Poly I:C kemungkinan karena hewan uji telah terinfeksi oleh bakteri dari lokasi pemeliharaan. Sebagaimana diketahui ekspresi LGBP biasanya meningkat pada hewan yang terinfeksi bakteri atau jamur. Pengikatan lipopolisakarida bakteri terhadap LGBP akan mengaktifkan system proPO dan gen untuk antibakteri. (Hoffman, Reichart, & Hetru, 1996; S. Y. Lee & Soderhall, 2002). Roux dan kawan-kawan menemukan bahwa LGBP dapat terindetifikasi pada hemosit hewan yang sehat maupun yang terinfeksi oleh WSSV (Roux, Pain, Klimpel, & Dhar, 2002). Selanjutnya dikatakan bahwa LGBP protein yang kemungkinan besar berperan penting dalam patogenitas virus sebagaimana bakteri dan jamur. Karena itu masuk akal jika penyuntikan hewan uji dengan rantai ganda virus RNA sintetis dapat merangsang ekspresi LGBP. Hemosits krustasea diketahui berperanan dalam innate immunity secara selular dan humoral (I. Soderhall & Soderhall, 2002). Akan tetapi hanya sedikit informasi tentang sistem kekebalan pada organ lain. Oleh karena itu penelitian ini juga mengamati ekspresi gen pada hepatopankreas yang berperan dalam sistem kekebalan. Hepatopankreas adalah organ kunci yang terlibat dalam respon kekebalan krustasea. Oleh karenanya, dapat diasumsikan sebagai tempat utama produksi molekul yang berperan dalam system kekebalan (Gross, Bartlett, Browdy, Chapman, & Warr, 2001; Johnson, 1987). Gross dan rekannya menyatakan bahwa organ tempat filtrasi haemolymph pencernakan seperti hepatopankreas seharusnya berperan penting dalam sistem kekebalan tubuh (Gross et al., 2001). Dilaporkan dari beberapa studi bahwa hepatopankreas mempunyai aktivitas antimikroba melawan bakteri, jamur, dan virus (J. R. Chisholm & Smith, 1992; Gross et al., 2001; Haug, Kjuul, Stensvag, Sandsdalen, & Styrvold, 2002; Johnson, 1987; Luo et al., 2003; Pan et al., 2000).

Poly I:C merupakan dsRNA sintetis yang telah diketahui mempunyai efek terhadap system kekebalan alami (innate) vertebrate dalam melawan infeksi virus melalui induksi interferons (IFN) yang selanjutnya akan memacu pengaturan transkripsi berbagai gen yang melindungi sel dari kerusakan dan kematian (Loker, Adema, Zhang, & Kepler, 2004; Salinas et al., 2004). Type I IFN merubah sel menjadi antivirus dengan induksi protein seperti 2, 5-oligoadenylate synthetase (OAS), dsRNA dependent protein kinase (PKR) dan Mx protein yang dapat menghambat replikasi virus (Salinas et al., 2004). Type I IFNs diproduksi oleh berbagai tipe (Robertsen et al., 2003). Toll like receptor (TLR) yang berlokasi pada permukaan sel mampu untuk mengenali dan mengikat struktur virus yang kemudian menginduksi IFN melalui jalur NF toll untuk mengaktifkan mekanisme pertahanan terhadap materi asing yang masuk dalam tubuh dengan menginduksi Mx protein, yang merupakan anggota GTP-ases superfamily, yang mempunyai aktivitas antivirus (S. Lee & Vidal, 2002). Akan tetapi, tidak ada data yang mengatakan bahwa invertebrata mempunyai reseptor yang mampu untuk mengenali virus dan homolog yang jelas dari interferon (Loker et al., 2004). Berat molekul dari protein yang terekspresi dengan perlakuan PolyI:C pada penelitian kali ini sama seperti Mx protein yang lain. Lebih lanjut dikatakan upregulasi ekspresi pada elektroforesis sebagai respon terhadap penyuntikan PolyI:C juga mengindikasikan aktivitas seperti Mx protein. Sequencing protein diperlukan untuk mengidentifikasi secara lebih detil protein yang terekspresi. Jika hasil sequencing membuktikan bahwa protein tersebut adalah anggota dari Mx protein, penelitian ini akan membuktikan adanya Mx protein pada krustasea, dan yang lebih penting lagi mungkin mengindikasikan adanya aktivitas antivirus yang lebih luas pada invertebrata. Walaupun Mx protein dan mekanisme induksinya pada krustasean masih belum jelas, namun dipercaya bahwa krustasea memiliki protein antimikroba yang dapat merespon infeksi bakteri, jamur, dan virus. Protein antimikroba ini tidak hanya terletak pada haemolymph, tapi juga dapat dideteksi pada organ atau jaringan yang lain seperti hepatopankreas (J. R. Chisholm & Smith, 1992;

158

Hastuti,

Jurnal PROTEIN

Haug et al., 2002; Luo et al., 2003; Zhang et al., 2004). Dengan demikian perlu penelitian lebih lanjut untuk mendapatkan pemahaman yang lebih dalam tentang mekanisme antivirus pada krustasea dalam hubungannya dengan Mx protein. Diperlukan sequencing terhadap protein yang telah ditemukan dalam penelitian ini untuk memastikan bahwa protein tersebut masuk dalam golongan Mx protein. Perlu juga dilakukan penelitian lanjutan dengan penyuntikan Poly I: C dengan berbagai dosis dan sampling yang dilakukan dalam waktu yang berbeda untuk mengetahui dosis letal injeksi Poly I:C dan memahami kinetika protein yang diharapkan. Disarankan juga untuk meneliti ekspresi protein pada organ lain seperti lymphoid organ. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Saran DAFTAR PUSTAKA Barki, A., Gur, N., & Karplus, I. (2001). Management of interspecific food competition in fish-crayfish communal culture: the effects of the spatial and temporal separation of feed. Aquaculture, 201, 343-354. Chen, X., & Edgerton, B. F. (2001). Freshwater crayfish culture in China. Aquaculture magazine, 27, 4144.

Le Moullac, G., & Haffner, P. (2000). Environmental factors affecting immune responses in Krustasea. Aquaculture, 191(1-3), 121-131. Le Moullac, G., Le Groumellec, M., Ansquer, D., Froissard, S., Levy, P., & Aquacop. (1997). Haematological and phenoloxidase activity changes in the shrimp Penaeus stylirostris in relation with the moult cycle: protection against vibriosis. Fish and Shellfish Immunology, 7, 227-234. Lee, S. Y., & Soderhall, K. (2002). Early events in krustasean innate immunity. Fish and Shellfish Immunology, 12, 421-437. Liang, Z., Sottrup-Jensen, L., & Soderhall, K. (1997). Pacifastin, a novel 155-kDa heterodimeric proteinase inhibitor containing a unique transferrin chain. Proceding of the National Academy of Science USA, 94, 66826687. Lorenzon, S., Giulianini, P. G., & Ferrero, E. A. (1997). Lipopolysaccharide-induced hyperglycaemia is mediated by CHH release in krustaseans. General and Comparative Endocrinology, 108, 395405. Lunde, H., & Robertsen, B. (1997). The complement component C3 is produced by hepatocytes and behaves as an acute-phase protein in Atlantic salmon, Salmo salar L., after injection of B-1,3-glucan. Developmental and Comparative Immunology, 21, 150. Meade, M. E., & Watts, S. A. (1995). Weight gain and survival of juvenile Australian crayfish Cherax quadricarinatus fed formulated feeds. Journal of the World Aquaculture Society, 26, 469-474. Sakai, M. (1999). Current research status of fish immunostimulants. Aquaculture, 172, 63-92. Sakai, M., Taniguchi, K., Mamoto, K., Ogawa, H., & Tabata, M. (2001). Immunostimulant effects of

Hoffman, J. A., Kafatos, F. C., Janeway, C. A., & Ekekowitz, R. A. B. (1999). Phylogenetic perspectives in innate immunity. Science, 284, 1313-1318. Hoffman, J. A., Reichart, J. M., & Hetru, C. (1996). Innate immunity in higher insects. Current Opinion in Immunology, 8, 8-13. Janeway, C. A. J. (1989). Approaching the asymptole? Evolution and revolution in immunology. Cold Spring Habour Symposium of Quantitation Biology, 54, 1-13.

159

Vol. 14 No. 2 Tahun 2006

Pengaruh Penyuntikan Poly I:C terhadap Ekspresi Protein

nucleotide isolated from yeast RNA on carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases, 24, 433-438. Selvin, J., Huxleya, A.J., Lipton, A.P. 2004. Immunomodulatory potential of marine secondary metabolites against bacterial diseases of shrimp. Aquaculture 230 : 241248 Smith, V. J., & Ratcliffe, N. A. (1980). Host defence reactions of the shore crab, Carcinus maenas (L.); clearance and distribution of injected particles. Journal of Marine Biology Associated UK, 60, 89-102. Soderhall, I., & Soderhall, K. (2002). Immune reactions. In D. M. Holdich (Ed.), Biology of Freshwater Crayfish (pp. 439-464). Iowa, USA: Blackwell Science. Soderhall, K. (1982). Prophenoloxidase activating system and melanization-a recognition mechanism of arthropods Development and Comparative Immunology, 6, 601-611. Soderhall, K., & Cerenius, L. (1998a). Role of the prophenoloxidase-activating system in invertebrate immunity. Current Opinion in Immunology, 10(1), 23-28.

Soderhall, K., & Cerenius, L. (1998b). Role of the prophenoloxidase-activating system in invertebrate immunity. Current Opinion in Immunology, 10, 23-28. Sritunyalucksana, K. (2001). Characterisation of some immune genes in the black tiger shrimp, Penaeus monodon. Unpublished Dissertation of Doctor of Philosophy, Uppsala University, Sweden. Sritunyalucksana, K., & Soderhall, K. (2000). The proPO and clotting system in krustaseans. Aquaculture, 191(1-3), 53-69. Tuckova, L., & Bilej, M. (1996). Mechanisms of antigen processing in invertebrates: are there receptors? In L. Cooper (Ed.), Advances in Comparative and Environmental Physiology (Invertebrate Immune Responses:Cells and Molecular Products) (Vol. 23, pp. 41-72). Berlin: Springer. Zhang, X., Huang, C., Xu, X., & Hew, C. L. (2002). Identification and localization of a prawn white spot syndrome virus gene that encodes an envelope protein. Journal of General Virology, 83, 1069-1074.

160