Pewarnaan Gram Bakteri

I. TUJUAN PRAKTIKUM Dapat melakukan prosedur pewarnaan gram dan memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur, dapat memahami reaksi kimiawi dari dalam prosedur tersebut, dapat melakukan prosedur untuk membedakan mikroba dua golongan yaitu gram positif dan gram negative, serta dapat lebih mengetahui alat dan bahan yang digunakan dalam percobaan. II. TEORI DASAR Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram positif dan gram negative, berdasarka sifat kimia dan fisika dinding sel mereka, metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan denmark hans Christian gram 1853-1938 yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan pneumokokus dan bakteri klebsiella pneumoniae. Dalam melakukan pewarnaan gram diperlukan empat macam pewarnaan dengan fungsi yang berbeda yaitu : Pewarnaan primer,(dapat memberikan warna pada semua jenis bakteri) Pengikat (memperkuat ikatan kompleks antara pewarna dengan komponen dinding bakteri Penghilang warna (melarutkan sisa zat warna dan kompleks zat warna dengan lipid pada dinding bakteri) Pewarnaan pengganti (memberikan warna pada dinding bakteri yang kehilangan pewarna primernya. Pada dasarnya bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu (tongkat), kokus dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagianya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah anggur). Khusus pada spirul hanya dibagi 2 yaitu setenggah melengkung dan tidak melengkung. Stapylococcus aureus adalah bakteri gram positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentuk seperti buah anggur.Beberapa karakteristik yang dimiliki staphylococcus Aureuss diantaranya hemolytic pada darah agar, catalase-oxidase-positif dan negative, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCI pada konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim coagulase. Selain itu, biasanya Stapylococcus aureus merupaka pathogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru, radang kelenjar dada, radang urat darah serata menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepaskan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepaskan superantigens kedalam aliran darah. E.coli merupakan bakteri berbentuk batang dengan panjang sekitar 2 mikrometer dan diameter 0,5 mikrometer. Volume sel E.coli berkisar 0.6-0,7 mikrometer kubik. Bakteri ini termasuk umumnya hidup pada rentang 20-40 derajat C, optimum pada 37 derajat. Kita mungkin banyak yang tidak tahu jika diusus besar manusia terkandung sejumlah E.colli yang berfungsi membusukkan sisa makanan.

Pseudomonas auruginosa adalah aerob obligat yang tumbuh dengan mudah pada banyak jenis media pembiakan, karena memiliki kebutuhan nutrisi yang sederhana. Medium paling sederhana untuk pertumbuhannya terdiri dari asetat (untuk karbon) dan ammonium sulfat (untuk nitrogen). Metabilisme bersifat respirator tetapi dapat tumbuh tanpa O2 bila tersedia NO3 sebagai akseptor electron kadang-kadang berbau manis seperti anggur yang dihasilkan aminoasetofenon. Beberapa strain menghemolisis darah. bakteri ini pada dasarnya merugikan bagi pertanian, Bakteri ini juga memiliki karakteristik antara lain berwarna hijau kebiru-biruan serta berbentuk batang.

PEWARNAAN GRAM
Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorbsiatnupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme karena zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme dengan lingkungannya ditingkatkan. Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan diferensial yang bayak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi guna pencirian don identifiknsi bakteri. Pewarnaan gram memilahkan bakteri menjadi kelompok Gram positif dam Gram negatif. Bakteri Gram positif berwarna ungu karena bnkteri tersebut mengiknt kompleks zat warna kristal ungu-iodium, sednngkan bakteri Gram negntif berwnrna merah karena mengikat zat warna sekunder yang berwarna merah. Perbedaan hasil dalam pewarnaan ini disebabkan perbedaan struktur dinding sel bakteri don perbedaan kandungan asam ribonukleat antnara bakteri Gram positif don Gram negatif. Pewarnaan dengan zat warna yang mengandung yodium menyebabkan amilopektin berwarna biru atau keunguan, sedangkan glikogen berwarna merah kecoklatan atau merah keunguan. Dengan melakukan pewarnaan sangat memungkinkan kita untuk melihat bakteri dengan jelas, tetapi tidak dapat membedakan jenis-jenis bakteri yang berbeda dengan morfologi yang soma. Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokos, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplokokus, sampai sthapylococcus (bentukknya mirip buah anggur). Khusus pada spiral hanya di bagi dua yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung. Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negative ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (textbook, 2008). Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat di identifikasi dengan mudah, selain itu, ada endospora adalah organism yang dibentuk dalam kondisi yang stress karena kurang nutrisi, yang

memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut dilingkungan sampai kondisi menjadi baik (ncbi, 2008). Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram negative sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui jalanya mekanisme pewarnaan gram. Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumonia. Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif (berwarna ungu/biru) dan bakteri Gram negatif (berwarna merah). Perbedaan dua kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel menahan (mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi oleh alkohol. Bakteri gram positif tidak mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu kristal violet dan pada tahap akhir pengecatan tidak terwarnai safranin. Bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol dan pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram. Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru. Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek. Menurut Pelzar et al (2005), macam-macam pewarnaan antara lain pewarnaan sederhana yaitu dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis yang sudah di fiksasi. Pewarnaan differentsial yaitu prosedur

pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroba atau bagianbagian sel mikroba dari pewarnaan gram adalah teknik pewarnaan differensial digunakan untuk bakteri. Menurut Pratiwi (2009), stain merupakan gram-gram yang tersusun atas ion positif dan negative, yang salah satunya berwarna dan disebut kromofor (chromofor). Pewarnaan pada dasarnya adalah prosdur mewarnai mikroorganisme dengan menggunakan zat warna yang dapat menonjolkan strktur tertentu dari mikroorganisme yang ingin kita amati. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna krisktal violet dan karenanya akan tampak bewarna ungu tua dibawah mikroskop. Adapun bakteri gram negates akan kehilangan zat Kristal violet setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat warna air tochsin atau safranin akan tampak merah. Perbedaan warna ini disebabkan olh perbedaan struktur kimiawi dinding selnya.(wapedia,2010)

Adakala suatu perlu diwarnai dua kali setelah zat warna yang pertama (ungu) terserap, maka sediaan dicuci dengan alkohol, kemudian ditumpangi dngan zat warna yang berlainan, yaitu dngan zat warna merah. Jika sediaan itu kemudian kita cuci dengan air lau dengan alkohol maka dua kemungkinan dapat terjadi. Pertama, zat tambahan terhapus, sehingga yang tampak ialah zat warna asli (ungu). Dalam hal ini sediaan (bakteri) kita sebut gram positif. Kedua zat warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna asli tidak tampak. Dalam hal ini sediaan (bakteri) jika kita katakana gram negatif (Dwioseputro, 1984) Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4 -, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagianbagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pada bakteri gram positif menunjukkan warna biru ungu dan bakteri gram negatif berwarna merah. Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu : 1. Zat warna utama (violet kristal)

Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama. 2. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama. 3. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol. Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi 2 kelompok, salah satu di antaranya, bakteri gram positif yang mempertahankan zat warna ungu Kristal dan karenanya tampak ungu tua. Kelompok yang lain, bakteri gram negatif, kehilangan ungu Kristal ketika dicucci dengan alkohol dan waktu diberi pewarna tandingan dengan warna merah safranin, tampak bewarna merah (Zubaidah,2006). Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu. Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm). Stuktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu : 1. Struktur dasar (dimiliki hamper semua jenis bakteri )

Meliputi : dinding sel, membrane plasma, sitoplasma, ribasom, DNA, dan granula penyimpanan. 2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu) Meliputi kapsul, flagellum, pilus, fimbria, klorosom, vakuola gas dan endospora Sthaplyococcus adalah bakteri gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentuk seperti buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada dua jenis warna staphlycoccus yaitu : sthapylococcus aureus yang berwarna kuning dan sthapylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa karateristik yang dimiliki sthapylococcus aureus diantaranya hemolytic pada darah segar, catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat tumbuh paa suhu erkisar antara 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl padakonsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim coagulase. Selin itu, biasanya s. aeureus merupakan pathogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru-paru, radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis dan endocarditis) serta menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepaskan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepaskan super antigens ke dalam aliran darah (kenneath, 2008) Menurut kenneath (2008), Escherichia coli termasuk dalam family Enterobacteraceae yang termasuk gram negative dan berbentuk batangyang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membatu sistem pencernaan manusia dan melindunginya darbakteri pantogen, akn tetap pada strain baru dari e. coli merupakan pathogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic ( hus). Peranan yanag menguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indicator pada percemaraan air serta mendeteksi patoge pada feses manusia yang disebabkan oleh salmonella typi.( mikrolibrary, 2008). Endospora adalah organism yang dibentuk dalam kondisi yang stress dan kurang nutrisi, yang memiliki kemunginan untuk tetap berlanjut dilingkungan sampai kondisi menjadi baik (ncbi, 2008). Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu: Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu: - Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer. - Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam - lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat. - Kurang rentan terhadap senyawa penisilin. - Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet. - Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

Tidak resisten terhadap gangguan fisik. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat Peka terhadap streptomisin Toksin yang dibentuk Endotoksin

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu: - Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer. - Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat. kristal. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit. Lebih resisten terhadap gangguan fisik. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut Tidak peka terhadap streptomisin Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

Cara Pewarnaan Bakteri MACAM-MACAM TEKNIK PEWARNAAN BAKTERI Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifatsifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jimmo, 2008). Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah pewarna sederhana dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktorfaktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).

Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagianbagian sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul.(waluyo,2010) Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi yng mengandung zat pati dan granula fosfat (Entjang, 2003) Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitianpenelitian mikrobiologi (Rizki, 2008). 2.1 Macam-macam pewarnaan 2.1.1 Pewarnaan Tujuan pewarnaan terhadap mikroorganisme ialah untuk : 1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, maupun fungi. 2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad 3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam jasad. 4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia dapat diketahui. Langkah-langkah utama teknik pewarnaan 1. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis 2. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun, formalin, fenol. 3. Aplikasi zat warna : tunggal, atau lebih dari 1 zat warna Teknik pewarnaan dikelompokkan menjadi beberapa tipe, berdasarkan respon sel bakteri terhadap zat pewarna dan sistem pewarnaan yang digunakan untuk pemisahan kelompok bakteri digunakan pewarnaan Gram, dan pewarnaan acidfast(tahan asam) untuk genus Mycobacterium. Untuk melihat struktur digunakan pewarnaan flagela, pewarnaan kapsul, pewarnaan spora, dan pewarnaan nukleus. Pewarnaan Neisser atau Albert digunakan untuk melihat granula metakromatik (volutin bodies) pada Corynebacterium diphtheriae. Untuk semua prosedur pewarnaan mikrobiologi dibutuhkan pembuatan apusan lebih dahulu sebelum melaksanakan beberapa teknik pewarnaan yang spesifik (Pelezar,2008). 2.1.2 Macam-Macam Pewarnaan

Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut : 1. Pewarnaan sederhana Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsinkarbol (5 detik). 2. Pewarnaan differensial dibagi pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam Pewarnaan differensial Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam. Penjelasan sebagai berikut: Pewarnaan Gram Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram. Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu : Zat warna utama (violet kristal) Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.

Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu 1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu. 2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ. 3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam. 4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm). Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu: Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu: Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana. Tidak resisten terhadap gangguan fisik. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat Peka terhadap streptomisin Toksin yang dibentuk Endotoksin Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu: Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.

Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit. Lebih resisten terhadap gangguan fisik. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut Tidak peka terhadap streptomisin Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin Pewarnaan Tahan Asam Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi zat warna khusus misalnya karbolfukhsin melalui proses pemanasan, maka akan menyerap zat warna dan akan tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun seperti asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA). Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri penyebab tuberkulosis yaitu Mycobacterium tuberculosis . Ada beberapa cara pewarnaan tahan asam, namun yang paling banyak adalah cara menurut ZiehlNeelsen.(anonymous,2009) 3. Pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan spora, pewarnaan kapsul. Pewarnaan Spora Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunakan. Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau bisa masuk ke dalam spora , seperti halnya pada pewarnaan Basil Tahan Asam dimana cat carbol fuschsin harus dipanaskan untuk bisa menembus lapisan lilin asam mycolic dari Mycobacterium . Prinsip kerja: Spora kuman mempunyai dinding yang tebal sehingga diperlukan pemanasan agar pori-pori membesar zat warna fuchsin dapat masuk, dengan pencucian pori-pori kembali mengecil menyebabkan zat warna fuchsin tidak dapat dilepas walaupun dilunturkan dengan asam alkohol, sedangkan pada badan bakteri warna fuchsin dilepaskan dan mengambil warna biru dari methylen blue. Cara Kerja : Dibuat suspensi kuman, ditambah dengan carbol fuchsin sama banyak. Dipanaskan selama 6 menit pada api kecil atau pada penangas air 80oc selama 10 menit. Dibuat sediaan dan dikeringkan. Dimasukkan kedalam H2SO4 1% selama 2 detik Dimasukkan kedalam alkohol sehingga tidak ada lagi warna merah mengalir. Sediaan dicuci dengan air.

 Diwarnai dengan methylen blue selama 1 menit kemudian dicuci dan dikeringkan. Diperiksa dibawah mikroskop. Pewarnaan flagel Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel. Pewarnaan kapsul Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang berwana biru gelap. 4. Pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri : pewarnaan Neisser (granula volutin), pewarnaan yodium (granula glikogen). 5. Pewarnaan negatif Tujuan Mempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatif untuk mengamati morfologi organisme yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta Cara pewarnaan negatif - Sediaan hapus teteskan emersi lihat dimikroskop Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin.pewarna asam memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan bakteri. oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna.