MOST PROBABLE NUMBER (MPN)

Hari,tanggal Materi Tujuan

: 11-13 Maret 2013 : Most Probable Number (MPN) : Untuk menghitung jumlah bakteri coliform dan E.coli pencemaran makanan atau minuman. : indicator

Dasar Teori

MPN (Most Probable Number) atau JPT (Jumlah Perkiraan Terdekat), umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri coliform dan E.coli sebagai indicator pencemaran makanan atau minuman, namun bisa juga untuk kuman lain, tetapi media yang digunakan harus diganti. Bakteri coliform, bakteri enteric, gram negative, fermentative, kadang-kadang sebatas pada bakteri (basil) enteric gram negative yang meragi laktosa, contoh: E.coli, Klebsiella,Citrobacter. Jenis coliform: 1.faecal : dari faecal 2.Non faecal : dari farmit / benda-benda mati, missal : tanah, daun yang busuk. Koliform merupakan suatu grup bakteri yang digunakan sebagai indicator adanya polusi kotoran dan kondisi yang tidak baik terhadap air, makanan, susu, dan produk-produk susu. Koliform sebagai suatu kelompok dicirikan sebagai bakteri berbentuk batang, gram negatif, tidak membentuk spora, aerob dan anaerob fakultatif yang memfermentasi laktosa dengan menghasilkan asam dan gas dalam waktu 48 jam pada suhu 35oC. adanya bakteri koliform di dalam makanan/minuman menunjukkan kemungkinan adanya mikroba yang bersifat enteropatogenik dan atau toksigenik yang berbahaya bagi kesehatan. Bakteri koliform dapat dibedakan menjadi 2 grup yaitu: (1) koliform fekal misalnya Escherichia coli dan (2) koliform non fekal misalnya Enterobacter aerogenes. Escherichia coli merupakan bakteri yang berasal dari kotoran hewan atau manusia, sedangkanEnterobacter aerogenes biasanya ditemukan pada hewan atau tanaman-tanaman yang sudah mati. Jadi, adanya Escherichia coli dalam air minum menunjukkan bahwa air minum itu pernah terkontaminasi feses manusia dan mungkin dapat mengandung pathogen usus. Oleh karena itu, standar air minum mensyaratkan Escherichia coli harus nol dalam 100 ml. untuk mengetahui jumlah koliform di dalam sampel digunakan metode Most Probable Number (MPN), pemeriksaan kehadiran bakteri koli dari air dilakukan berdasarkan penggunaan medium lactose broth yang ditempatkan di dalam tabung reaksi berisi tabung Durham (tabung kecil yang letaknya terbaik, digunakan untuk menangkap gas yang terjadi akibat fermentasi laktosa menjadi asam dan gas). Metode perhitungan jumlah kuman. - Direct : Menghitung kuman yang hidup dan mati, missal : dengan kamar hitung dan spektrofotometer. - Indirect : Menghitung kuman yang hidup, missal : dengan MPN dan ALT. Sampel atau bahan yang di periksa :
1|M P N ( M o s t Probable Number)-Christine dan Diah

 Air

: 1. Sumur gali dan sumur bor. Cara pengambilan:botol steril dimasukkan ke tengah sumur (tidak boleh menyentuh dinding) dengan pemberat steril, setelah berisi penuh, kemudian isinya di buang seperempat.

2. PDAM, contoh air kran Cara pengambilan : kran di steril dengan api (jika dari besi), alcohol (jika dari plastik). Buka kran dan biarkan air mengalir sampai beberapa menit kemudian tampung pada tempat steril. Air minum : 1. Air kemasan : air merk aqua, club, dan lain sebagainya 2. Air yang sudah dimasak 3. Air isi ulang : mengalami water treatment atau penyaringan dan dilakukan penyinaran sinar UV Minuman : Sirup dan jus (ditempatkan di plastik steril), buah (di blender sampai hancur) Tidak memakai minuman dari bahan pabrik karena ada pengawetnya atau carsentrant yang berfungsi untuk menghambat pertumbuhan kuman. Urine : Cara pengambilan (bagian uretra dibersihkan dengan PZ steril atau detergen kemudian di ambil urine porsi tengah secara steril (secara suprapubic aspirasi) Indikator pemeriksaan air : di Indonesia (ada E.coli berarti tercemar faeses),di luar negeri (ada clostridium perfringer,S.vaecalis berarti tercemar faeses). Nilai MPN di peroleh dari : Pemeriksaan pendahuluan atau persumtive test : Dibutuhkan media LB I (Single Strength Lactose Broth) dan LB II (Double Strength Lactose Broth), jumlah tabung yang digunakan disesuaikan dengan metode. Hasil : positif (+) atau negative (-) gas. Pemeriksaan Penegasan atau Convirmative test : Menggunakan media BGLB (Brilliant Green Lactosa Broth), media ini berfungsi untuk menghambat kuman coccus gram (+) yang memecah lactosa dan gas (+). Hasil : positif (+) atau negative (-) gas. Completed test : Menggunakan media EMB (Eosin Methylen Blue) Reagensia dan media IMVIC (Indol, MR, VP, Simon Citrat), jika pada EMB (+) E.coli. Setelah dari EMB, kuman bisa di tambah di TSIA / KIA, baru kemudian ditanam di IMVIC. Ragam pemeriksaan MPN 1. Sistem 5.1.1 Digunakan untuk pemeriksaan air yang sudah diolah karena di perkiraan Jumlah kuman rendah(<240) 2. Sistem 3.3.3 dan sistem 5.5.5 Digunakan untuk pemeriksaan air yang belum diolah,karena diperkiraan jumlah kuman tinggi(>240/100 ml)
2|M P N ( M o s t Probable Number)-Christine dan Diah

Rumus MPN =

tabung (+) 100 ( )

Contoh: Dari BGLB terdapat 2 tabung (+),dari LB II,LBI(+) 1 tabung,LBI(-) MPN = ( = ) ( ) 3 100 ( ) ( ) ( )

= 7,65/100 ML bahan

Apabila dari 7 tabung reaksi ada 1 yang (+) test positif Apabila dari 7 tabung reaksi semua (-) MPN 0 (harus dinyatakan dengan angka bukan positif atau negative. Metode : 5.1.1

Alat dan bahan : Alat : 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Bahan 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. : Media EMB (Eosin Methylen Blue) LB I (Single Strength Lactose Broth) dan LB II (Double Strength Lactose Broth) BGLB (Brilliant Green Lactosa Bile) IMVIC (Indol, MR, VP, Simon Citrate) Aquadest steril TSIA (Triple Sugar Iron Agar) Sampel : jus jeruk Autoclave Math pipet 10 ml dan 1 ml Erlenmeyer Petridish Kapas Tabung reaksi besar (untuk LB) Tabung reaksi sedang Tabung durham Kapas berlemak

3|M P N ( M o s t

Probable Number)-Christine dan Diah

Langkah Kerja : 1. 2. 3. 4. Menyiapkan alat dan bahan. Mensterilisasi alat gelas dan aquadest yang akan digunakan. Membuat media yang dibutuhkan. Pemeriksaan pendahuluan atau persumtive test. a. Memipet 10 ml sampel pemeriksaan ke dalam media LB II (Double Strength Lactose Broth). b. Memipet 1 ml dan 0,1 ml sampel pemeriksaan ke dalam media masing-masing tabung LB I (Single Strength Lactose Broth). c. Menginkubasi kuman selama 24 jam 370 C. 5. Pemeriksaan Penegasan atau Convirmative test. a. Mengambil kuman sebanyak 2-3 mata ose dari tabung LB I dan LB II yang positif, dilihat dari timbulnya gelembung udara pada tabung durham. b. Menanam sebanyak 2-3 mata ose tersebut ke dalam media BGLB. c. Menginkubasi kuman selama 24 jam 370 C. 6. Completed test. a. Melakukan strike kuman pada media EMB dari salah satu media BGLB yang positif kuman. b. Menginkubasi kuman dalam media EMB selama 24 jam 370 C. c. Jika kuman merupakan E.coli, akan terlihat adanya koloni methalic sheen pada media EMB. d. Menanam koloni methalic sheen pada media TSIA sebagai media differential. e. Menginkubasi kuman dalam media TSIA selama 24 jam 370 C. f. Menanam kuman dari media TSIA ke media IMVIC untuk dilakukan uji biokimia terhadap kuman. g. Menginkubasi selama 24 jam 370 C. h. Melakukan uji biokimia terhadap bakteri. 7. Menyimpulkan hasil praktikum dengan tabel MPN Test.

Skema Praktikum

Sampel : Jus Jeruk

4|M P N ( M o s t

Probable Number)-Christine dan Diah

LB II 10 ml media 10 ml sampel

LB I 10 ml media 10 ml sampel

Inkubasi 24 jam 370 C

BGLB 10 ml media 3 mata ose kuman

Inkubasi 24 jam 370 C

5|M P N ( M o s t

Probable Number)-Christine dan Diah

EMB
Inkubasi 24 jam 370 C

EMB
Inkubasi 24 jam 370 C

6|M P N ( M o s t

Probable Number)-Christine dan Diah

Hasil Pemeriksaan : 1) 2) 3) 4) Media LB Media BGLB Media EMB Media TSIA : : : : 5.1.1 0.1.1 1,8 MPN /100ml Methalic Sheen (E.coli) Lereng : Acid Dasar : Acid Gas : (+) Positif H2S : (-) Negatif Indole : (+) Positif MR : (+) Positif VP : (-) Negatif SC : (-) Negatif

5) Media IMVIC :

Gambar Praktikum

IMVIC

Simon Citrate

VP

MR TSIA

7|M P N ( M o s t

Probable Number)-Christine dan Diah