1

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik

LAPORAN RESMI ISOLASI BAKTERI DARI SUATU CAMPURAN

I.

Tujuan I.I Isolasi Bakteri Dari Suatu Campuran Mengisolasi bakteri Escherichia coli atau Bacillus subtilis dari suatu campuran bakteri Escherichia coli dan Bacillus subtilis dengan teknik cawan gores dan cawan tuang.

Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik

II. Pengamatan II.1 Metode Cawan Gores Tabel 1. Hasil Pengamatan 24 Jam Metode Cawan Gores Bentuk koloni jika dilihat dari: Sektor 0 Pengamatan Petridish Sektor 1 Sektor II Sektor III

-Atas Keseluruhan

-Atas Tepi

-Permukaan

Keterangan Warna : Diameter : Kepekatan : Putih susu 2 mm Tipis Putih susu 10 mm Pekat Putih susu 5 mm Pekat Putih susu 3 mm Tipis

Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik

Tabel 2. Hasil Pengamatan 48 Jam Metode Cawan Gores Bentuk koloni jika dilihat dari: -Atas Keseluruhan Pengamatan Petridish Sektor 0 Sektor 1 Sektor II Sektor III

-Atas Tepi

-Permukaan

Keterangan: -Warna: -Diameter: -Kepekatan Putih susu 3 mm pekat Putih susu 13 mm Pekat Putih susu 7 mm Pekat Putih susu 6 mm Pekat

Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik

Gambar 1. Hasil Pengamatan Metode Cawan Gores

(a)

(b)

(c)

(d)

Gambar 2. Hasil Pengamatan Isolasi Bakteri Campuran Berdasarkan Sektor Inokulasi Pada Petridish (a) Blanko, (b) Sektor 1, (c) Sektor 2, (d) Sektor 3

Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik

II.2. Metode Cawan Tuang Tabel 3. Hasil Pengamatan 24 Jam Metode Cawan Tuang Bentuk koloni jika dilihat dari: -Atas Keseluruhan Pengamatan Blanko Petridish I Petridish II Petridish I11

-Atas Tepi

-Permukaan

Keterangan: -Warna: -Diameter: -Kepekatan -Jumlah Koloni I -Jumlah Koloni II Bening Putih susu 4 mm Tipis >50 10 Putih susu 6 mm Pekat <50 Putih susu 2 mm Tipis -

Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik

Tabel 4. Hasil Pengamatan 48 Jam Metode Cawan Tuang Bentuk koloni jika dilihat dari: -Atas Keseluruhan Pengamatan Blanko Petridish I Petridish II Petridish I11

-Atas Tepi

-Permukaan

Keterangan: -Warna: -Diameter: -Kepekatan -Jumlah Koloni I -Jumlah Koloni II Bening Putih susu 5 mm Pekat >100 >100 Putih susu 15 mm Pekat >100 <100 Putih susu 12 mm Pekat >100 18

Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik

Gambar 3. Hasil pengamatan Metode Cawan Tuang (Inokulasi Pertama)

Gambar 4. Hasil pengamatan Metode Cawan Tuang (Inokulasi Kedua)

Gambar 5. Hasil pengamatan Metode Cawan Tuang (Inokulasi Ketiga)

Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik

III. Pembahasan A. Metode Cawan Gores Kuadran/ Sektor (Strike Plate) Percobaan Isolasi Bakteri dari suatu campuran dengan teknik cawan gores adalah mengisolasi bakteri Escherichia coli atau Bacillus subtilis dari suatu campuran bakteri Escherichia coli dan Bacillus subtilis menjadi bakteri tunggal (biakan murni) dengan teknik cawan gores. Metode ini praktis, hemat biaya dan waktu, hanya membutuhkan keterampilan. Hasil penggoresan diharapkan tampak seperti gambar di bawah ini.

Gambar 6. Pembagian Kuadran dalam Teknik Strike Plate (Sektor/ Kuadran) Kesalahan-kesalahan yang umum dilakukan dalam metode ini antara lain : (1) tidak memanfaatkan permukaan medium untuk digores sehingga pengenceran kurang optimal, (2) penggunaan inokulum yang terlalau banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel waktu Digores (Anonim, 2012). Percobaan ini dimulai dengan menyiapkan sebuah petridish dan membagi petridish menjadi 4 sektor yaitu 0,I,II,III dari sisi luar. Sektor 0 adalah sector untuk blanko yaitu media pembanding antara media tanpa bakteri dan media yang ditumbuhi bakteri untuk mengetahui adanya kontaminasi selama proses percobaan. Jika media yang digunakan steril, maka tidak akan ditemukan koloni bakteri pada sektor 0 (warna media adalah bening). Sedangkan, sektor III adalah Sektor untuk goresan terakhir dimana bakteri akan dalam keadaan tunggal atau satu jenis (biakan murni). Pembagian petridish dalam beberapa sector bertujuan untuk menghemat tempat dan sebagai sarana mendapatkan biakan murni itu sendiri. Tahap selanjutnya adalah mengisi petridish dengan medium Nutrien Broth (NB) secara merata. Kemudian, membungkus petridish dengan kertas coklat dan mensterikannya dari mikroba-mikroba yang ada dengan cara memasukkan ke dalam autoclave selama 15 menit pada suhu 1210C dan tekanan 15 psia. Autoclave digunakan untuk mensterilkan alat-alat biotek seperti tip, e-tube, mortar pestle, dan lain-lain. Selain

Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik

itu alat ini juga digunakan untuk mensterilkan media, baik media agar atau pun media cair dari mikroorganisme yang tidak diinginkan (Anonim,-) Setelah proses sterilisasi selesai, petridish dibiarkan di dalam incase sehingga media menjadi padat. Proses percobaan dilakukan di dalam incase dimaksudkan agar proses percobaan berjalan secara aseptic. Kemudian, Campuran bakteri diinokulasikan pada medium NB menggunakan kawat oase yang telah padat di dalam petridish secara estafet dari sektor I ke sektor II dan terakhir ke sektor III dengan metode gores halus media secara zig-zag. Penggoresan bakteri pada media ke media selanjutnya dilakukan dengan mengambil goresan terakhir (Inokulum terakhir), jejak terakhir goresan, pada media sebelumnya karena dimungkinkan goresan terakhir mengandung populasi bakteri yang lebih sedikit dan mendukung proses isolasi bakteri. Sektor 0 tidak diinokulasikan bakteri karena fungsinya sebagai sektor blanko. bakteri yang diinokulasikan/ digoreskan adalah campuran antara Escherichia coli dan Bacillus subtilis. Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E.coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia,

yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen (Sri,2010). Marga Bacillus merupakan bakteri yang berbentuk batang dapat dijumpai di tanah dan air termasuk pada air laut. Beberapa jenis menghasil enzim straseluler yang dapat menghidrolisis protein dan polisakarida kompleks. Bacillus spp membentuk

endospora, merupakan gram positif, bergerak dengan adanya flagel peritrikus, dapat bersifat aerobik atau fakultatif anaerobik serta bersifat katalase positif (Ariani,2000). Setiap menggunakan kawat ose, harus dipijarkan terlebih dahulu menggunakan api bunsen sebelum dan sesudah penggunaan. Hal ini bertujuan untuk membunuh bakteri lain yang ada pada kawat oase. Kemudian kawat ose didiamkan selama 10 detik untuk menurunkan suhunya. Penurunan suhu bertujuan untuk menghindari bakteri yang diambil dari tabung biakan campuran mati. Setelah proses inokulasi selesai, petridish kembali dibungkus dengan kertas coklat lalu diinkubasi di dalam incubator dalam posisi terbalik pada suhu 300C selama 48 jam. Berdasarkan pengamatan yang telah dilakukan, diperoleh koloni bakteri yang berwarna putih susu. Koloni bakteri ditemukan Pada semua sektor yakni sektor 0, I, II, dan III. Hal ini terjadi karena ada kemungkinan pada proses inkbubasi peletakan petridish miring, sehingga terjadi kontaminasi pada sektor 0. Dapat dilihat pada gambar di bawah, kontaminasi sektor 0 terjadi pada tepi garis perbatasan dengan sektor lainnya.
Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

10

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik

Gambar 7. Kontaminasi Bakteri pada Sektor 0 Pada sektor 0, I, II, dan III diambil satu koloni untuk diamati dan didapati diameternya sebesar 2, 10, 5, dan 3 mm, pada pengamatan setelah 24 jam. Sementara pada pengamatan setelah 48 jam, diperoleh diameter masing-masing 3, 13, 7, dan 6 mm untuk sektor 0, I, II, dan III. Dari hasil pengamatan dapat diamati perkembangbiakan bakteri dengan bertambah luasnya dan kepekatan warna koloni bakteri pada daerah goresan yang dilakukan pada setiap sektor sehingga lebih memperjelas hasil isolasi, dimana pada sektor I luasan koloni bakteri lebih luas dibanding pada sektor II (I > II > III) Berdasarkan pengamatan secara makroskopis, terdapat satu koloni pada sektor III yang berbentuk bulat kasar, berwarna putih susu dan pekat. Ciri-ciri tersebut sesuai dengan karakteristik morfologi koloni Bacillus subtilis yang berbentuk batang. Bacillus subtilis membentuk endospora, merupakan gram positif, bergerak dengan adanya flagel peritrikus, dapat bersifat aerobik atau fakultatif anaerobik serta bersifat katalase positif. Warna koloni pada umumnya putih sampai kekuningan atau putih suram, tepi koloni bermacam-macam namun pada umumnya tidak rata, permukaannya kasar dan tidak berlendir, bahkan ada yang cenderung kering berbubuk, koloni besar dan tidak mengkilat (Ariani,2000).

B. Metode Cawan Tuang Percobaan Isolasi Bakteri dari suatu campuran dengan teknik cawan tuang adalah mengisolasi bakteri Escherichia coli atau Bacillus subtilis dari suatu campuran bakteri Escherichia coli dan Bacillus subtilis menjadi bakteri tunggal (biakan murni) dengan teknik cawan tuang. Metode cawan tuang merupakan teknik lain yang dapat digunakan untuk mendapatkan koloni murni mikroorganisme. Kelemahan metode ini adalah membutuhkan waktu dan bahan yang lama dan banyak, akan tetapi tidak memerlukan keterampilan tinggi (Anonim, 2012). Percobaan ini membutuhkan peralatan berupa 4 petridish dan 4 tabung reaksi yang berisi media Nutrien Broth (NB), Peralatan tersebut disterilkan di dalam autoclave selama 15 menit pada suhu 1210C dan tekanan 15 psia. Autoclave digunakan untuk mensterilkan
Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

11

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik

alat-alat biotek seperti tip, e-tube, mortar pestle, dan lain-lain. Selain itu alat ini juga digunakan untuk mensterilkan media, baik media agar atau pun media cair dari mikroorganisme yang tidak diinginkan (Anonim,-) Setelah itu, semua peralatan tersebut dimasukkan ke dalam incase untuk melakukan proses inokulasi campuran bateri, antara Escherichia coli dan Bacillus subtilis ke dalam media NB di dalam tabung reaksi dengan menggunakan kawan oase. Salah satu media pada tabung reaksi langsung dimasukkan ke dalam petridish tanpa inokulasi bakteri untuk dijadikan blanko, media pembanding. Pada tabung reaksi I diinokulasikan biakan campuran Escherichia coli dan Bacillus subtilis menggunakan kawat oase. Kawat oase harus dipanaskan terlebih dahulu baik sebelum dan sesudah penggunaan sampai berpijar. Kemudian diamkan kawat oase sejenak sehingga tidak berpijar lagi, dan kawat oase bisa digunakan. Perlakuan ini diberikan kepada kawat oase sebagai proses sterilisasi kawat oase dari mikroorganisme yang tidak diinginkan. Selanjutnya, tabung reaksi I diputar menggunakan telapak tangan agar konsentrasi bakteri dalam media menjadi homogen. Tahap berikutnya adalah melakukan inokulasi campuran bakteri pada tabung reaksi II dengan mengambil inokulum pada tabung reaksi I (Proses inokulasi secara estafet). Begitu pula dengan proses inokulasi pada tabung reaksi ketiga (III). Proses inokulasi secara estafet ini dilakukan dengan harapan akan terjadi seleksi bakteri secara alami, dimana pada tabung reaksi III akan didapatkan bakteri tunggal (biakan murni). Setelah proses inokulasi selesai, bakteri dituangkan ke dalam petridish sesuai dengan nomor tabung reaksi. Selanjutnya, pembungkusan petridish menggunakan kertas coklat disertakan kode petridish pada kertas coklat agar tidak tertukar. Lalu, bakteri diinkubasi pada suhu 300C di dalam incubator selamat 48 Jam. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam dan 48 jam pada tiap-tiap petridish. Dari percobaan yang dilakukan, diperoleh koloni bakteri pada semua sektor. Pada sektor I, media agar dipenuhi oleh koloni bakteri yang tersebar merata. Pada sektor II, koloni bakteri berkurang dan lebih besar. Pada sektor III didapati koloni yang lebih sedikit dibanding sektor I dan II, koloni lebih kecil dan merata, warnanya pun kurang pekat jika dibandingkan dengan sektor II. Pada pengamatan setelah 24 jam, diperoleh diameter untuk sektor I, II, dan III sebesar 4 mm, 6 mm, dan 2 mm. Sedangkan pada pengamatan setelah 48 jam, diperoleh diameter untuk sektor I, II, dan III sebesar 5 mm, 15 mm, dan 12 mm.

Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

12

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik

Berdasarkan hasil pengamatan, koloni bakteri yang terisolasi adalah

Bacillus subtilis yang merupakan bakteri yang berbentuk batang. Bacillus subtilis membentuk endospora, dapat bersifat aerobik atau fakultatif anaerobik serta bersifat katalase positif. Warna koloni pada umumnya putih sampai kekuningan atau putih suram, tepi koloni bermacam-macam namun pada umumnya tidak rata, permukaannya kasar dan tidak berlendir, bahkan ada yang cenderung kering berbubuk, koloni besar dan tidak mengkilat (Ariani,2000).

Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

13

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik

Jawaban Pertanyaan V.I Isolasi Bakteri dari Suatu Campuran 1. Keadaan media pembanding seharusnya steril atau tidak ditumbuhi bakteri, hanya berupa media agar. Kegunaan media pembanding adalah sebagai pembanding dengan media yang ditanami bakteri. Sehingga dapat dilakukan identifikasi tingkat steril sebuah praktikum. 2. Isolasi bateri terjadi pada sektor III yang merupakan estafet ketiga setelah sektor II dan I. pada sector tersebut seharusnya bakteri tunggal (biakan murni) didapatkan. 3. Ada. Pada media blanko (Sektor 0) metode cawan gores terdapat koloni bateri pada sisi perbatasan dengan sector II. Hal ini terjadi karena posisi pada saat inkubasi miring sehingga media agar yang kemungkinan belum 100 % pada bergeser dari Sektor II ke sektor 0. 4. keunggulan cawan gores : menghemat waktu, menghemat bahan, membutuhkan alat yang sedikit. Keunggulan cawan tuang : mikroorganisme tersebar merata ke seluruh media agar sehingga memudahkan untuk tahap uji selanjutnya (Candra,2006), tidak membutuhkan keterampilan khusus, dapat digunakan untuk menghitung bakteri. Kekurangan cawan goers : memerlukan keterampilan yang khusus agar mikroba terisolasi dengan baik. Kekurangan cawan tuang : Kelemahan metode ini adalah membutuhkan waktu dan bahan yang lama dan banyak, akan tetapi tidak memerlukan keterampilan tinggi (Anonim, 2012).

Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

14

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik

IV. Kesimpulan Berdasarkan hasil pengamatan yang telah dilakukan, diperoleh kesimpulan sebagai berikut: 1. Proses Isolasi bakteri terjadi secara sempurna pada sektor III dalam metode cawan gores yaitu sektor terakhir yang ditanami bakteri. Koloni yang didapat adalah Bacillus subtilis 2. Proses Isolasi bakteri terjadi secara sempurna pada sektor III dalam metode cawan tuang yaitu sektor estafet terakhir yang ditanami bakteri. Koloni yang didapat adalah Bacillus subtilis

Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

15

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik

Daftar Pustaka Agung Fitri Kusuma, Sri. 2010. Escherichia coli. Fakulttas Farmasi Universitas Padjadjaran. Anonim, 2012. Modul 3 : Teknik Isolasi Bakteri. Praktikum Mikrobiologi Laut. Anonim, -. Sterilisasi dan Autoclave Candra, Joddi Iryandi.2006. SKRIPSI : Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Produk Bekasam Ikan Bandeng (Chanos chanos). Program Studi Teknologi Hasil Perikanan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institute Pertanian Bogor. Harmanti, Ariani.2000.Pengenalan Bacillus SPP. Balitbang Lingkungan Laut, Puslitbang Oseanologi-LIPI, Jakarta.

Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS