Materi 6

(High Performance Liquid Chromatography)

High Price Liquid Chromatography

KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)

4/11/2013

1

Hampir 20 % senyawa yang diketahui tidak dapat dianalisis dengan Kromatografi Gas dengan berbagai alasan antara lain. HPLC tidak terbatas untuk senyawa yang mudah menguap. dan berbagai senyawa dengan BM besar yang mempunyai banyak gugus fungsi dan dapat digabungkan dengan Spektrofotometer Infra Red (IR) dan Spektrometri Massa (MS) 4/11/2013 . senyawa alami yang labil. material polimer. • Tidak mudah menguap (insufficiently volatile) • Tidak dapat melewati kolom • Tidak tahan panas (Thermally unstable) • Terurai dalam kondisi saat pemisahan dengan GC. 2 . tetapi juga mampu memisahkan makromolekul dan jenis-jenis ion.

Kompetisi fasa gerak 2. Cs K= Cm Cs = Konsentrasi komponen dalam fasa diam Cm = Konsentrasi komponen dalam fasa gerak Variabel yang mempengaruhi perbedaan migrasi adalah’ 1.Teori HPLC Pemisahan komponen campuran berdasarkan pada distribusi kesetimbangan (K) dari komponen di dalam kedua fasa. Jenis fasa diam 4/11/2013 3 . Temperatur 3.

VR = Volume retensi Tr = Volume alir (flow rate)gerak fasa 4 VR = F x Tr 4/11/2013 .Volume retensi dan waktu merupakan ukuran yang bisa digunakan untuk mengidentifikasi puncak pada kromatogram. Sedang volume retensi adalah volume fasa gerak puncak komponen tersebut sampai tepat diujung kolom. Waktu retensi merupakan suatu fungsi dari kecepatan fasa gerak dan volume fasa gerak. Waktu retensi (Tr) adalah waktu yang diperlukan untuk mengelusi oleh suatu zat/bahan yang sampai pada konsentrsi maksimum.

Isokratik (ratio fasa gerak dicampur diluar sistem) Gradient (ratio fasa gerak diatur melalui sistem dengan bantuan mikroprosesor) 3. 2. Recycling (isokratik dan gradient fasa gerak kembali kedalam sistim) R a t i o P e l a r u t B 100 % R a t i o P e l a r u t B 100 % A 0 4/11/2013 A 0 Waktu Retensi 5 Waktu Retensi .Sistem HPLC 1.

Rangkaian Dasar HPLC Injektor Wadah fasa gerak Pompa Detektor Kolom Wadah Pembuangan Rekorder atau data prosesor 4/11/2013 6 .

5 ml (preparatif) Prekolom Standard Kolom 2. 50 – 100 L (analitik) 500 L . Radial Compression Narrow Bore Short 1. . 3. Detektor 4/11/2013 RI (refractive Index) UV-Vis Flourescence PDA (Photo Diode Array) Amperometric 7 3.Wadah fasa gerak 1. Piston tunggal Piston ganda Pompa Injektor 1. 4. 2. 5. 2. 2. Tunggal (isokratik) 2. 5. 1. 4. Lebih dari satu (gradient) 1.

Jenis-jenis kolom HPLC N0 Nama kolom Jenis adsorban 1 2 3 4 5 6 7 8 9 4/11/2013 Ultrasil-Si Ultrasil-octyl Ultrasil-ODS LiChrosorb Si LiChrosorb RP-2 LiChrosorb RP-8 LiChrosorb RP-18 LiChrosorb NH2 LiChrosorb CN SiO2 (silika) Octana (C8) Octadecana (C-18) SiO2 (silika) Etana (C-2) Octana (C8) Octadecana (C-18) Amina Cyano 8 .

Mekanisme pemisahan pada HPLC A dan B mulai terpisah Fasa gerak Sampel A dan B Fasa diam Kolom Fasa gerak ke detektor A 4/11/2013 B 9 Waktu retensi (min) Sinyal pada rekorder .

a (pro analysis) atau HPLC grade Mempunyai viskositas yang rendah Homogenous dengan pelarut lainnya Tidak mempunyai pengaruh terhadap sistem detektor Tidak korosif Tidak explosif baik akibat pemanasan maupun tekanan 10 4/11/2013 .Syarat fasa gerak (pelarut/elusi) HPLC        Inner Tidak bereaksi baik dengan bahan kolom dan senyawa yang akan dipisahkan Harus p.

Macam-macam tampilan puncak senyawa pada kromatogram 1. Kembar (twin) 3. Melebar (slope) 4/11/2013 11 . Berbahu (Shoulder) 4. Tajam (sharp) 2.

bentuk puncak yang asimetri umum dijumpai. Hal ini terjadi sampel yang diinjeksikan lebih besar dari kapasitas daya migrasi partikel kolom.1 mg/g. Misalkan kemampuan daya migrasi partikel kolom 0.Tampilan puncak pada kromatogram pada HPLC tidak selalu sebagaimana yang diharapkan yaitu segi tiga sama kaki. sehingga puncak memberikan kenaikan yang tajam pada permulaan dan kemudian melebar. h AF = b/a = 1 10 % h h AF = b/a = 2 10 % h a b a b 4/11/2013 Axis waktu Axis waktu AF = asimetri faktor 12 . sedangkan sampel yang diinjeksikan 1 mg/g.

Kolom selektifitas. efesiensi. ratio pemisahan Selektifitas cukup. tetapi efesiensi baik 4/11/2013 13 . tetapi efesiensi rendah Selektifitas dan efesiensi baik Selektifitas rendah.

Membuat turunan (derivat) senyawa yang dipisahkan. Merubah perbandingan (ratio) fasa gerak atau merubah kepolar fasa gerak. 2. Mengatur kecepatan alir (flow rate) atau menaikan dan menurunkan kecepatan alir fasa gerak. Menaikan atau menurunkan temperatur kolom. Menambah panjang kolom (double column) 4/11/2013 14 . 3. 4.Cara-cara mengatasi permasalah pemisahan/migrasi senyawa pada HPLC 1. 4.

Luas segi tiga sama kaki (alas x 1/2 tinggi) 2.Kalkulasi hasil kromatogram HPLC Di dasarkan pada perbandingan luas area puncak yang dihasil antara cuplikan (sampel) dan kontrol (standard). Garis regresi linier 4/11/2013 15 . 1.

Daya pisahnya (migrasi) baik c. Kolom dapat dipakai kembali e. detektor spesifik (UV-Vis dan Flourescence dapat mendeteksi sampai jumlah g) d. Mudah memperoleh kembali cuplikan (sampel) 4/11/2013 16 . ion yang tidak bisa dengan GC f. Cepat (waktu analisis kurang dari 1 jam) b. Ideal untuk molekul besar. Peka.Keuntungan-keuntungan melakukan analisa dengan HPLC a.