Professional Documents
Culture Documents
4/11/2013
Hampir 20 % senyawa yang diketahui tidak dapat dianalisis dengan Kromatografi Gas dengan berbagai alasan antara lain; Tidak mudah menguap (insufficiently volatile) Tidak dapat melewati kolom Tidak tahan panas (Thermally unstable)
HPLC tidak terbatas untuk senyawa yang mudah menguap, tetapi juga mampu memisahkan makromolekul dan jenis-jenis ion, senyawa alami yang labil, material polimer, dan berbagai senyawa dengan BM besar yang mempunyai banyak gugus fungsi dan dapat
digabungkan dengan Spektrofotometer Infra Red (IR) dan Spektrometri Massa (MS)
4/11/2013
Teori HPLC
Pemisahan komponen campuran berdasarkan pada distribusi kesetimbangan (K) dari komponen di dalam kedua fasa.
Cs
K= Cm
Cs = Konsentrasi komponen dalam fasa diam Cm = Konsentrasi komponen dalam fasa gerak
Variabel yang mempengaruhi perbedaan migrasi adalah 1. Kompetisi fasa gerak 2. Temperatur 3. Jenis fasa diam
4/11/2013 3
Volume retensi dan waktu merupakan ukuran yang bisa digunakan untuk mengidentifikasi puncak pada kromatogram.
Waktu retensi (Tr) adalah waktu yang diperlukan untuk mengelusi oleh suatu zat/bahan yang sampai pada konsentrsi maksimum. Waktu retensi merupakan suatu fungsi dari kecepatan fasa gerak dan volume fasa gerak. Sedang volume retensi adalah volume fasa gerak puncak komponen tersebut sampai tepat diujung kolom. VR = Volume retensi
Tr = Volume alir (flow rate)gerak fasa
4
VR = F x Tr
4/11/2013
Sistem HPLC
1. 2. Isokratik (ratio fasa gerak dicampur diluar sistem) Gradient (ratio fasa gerak diatur melalui sistem dengan bantuan mikroprosesor)
3.
R a t i o P e l a r u t
B 100 %
R a t i o P e l a r u t
B 100 %
A 0
4/11/2013
A 0 Waktu Retensi
5
Waktu Retensi
Pompa
Detektor Kolom
Wadah Pembuangan
Rekorder atau data prosesor
4/11/2013
1.
Tunggal (isokratik)
2.
Pompa
Injektor
1.
2. 1.
50 100 L (analitik)
500 L - 5 ml (preparatif) Prekolom Standard
Kolom
2.
3.
4. 5.
Radial Compression
Narrow Bore Short
1.
2. Detektor
4/11/2013
RI (refractive Index)
UV-Vis Flourescence PDA (Photo Diode Array) Amperometric
7
3. 4. 5.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
4/11/2013
Ultrasil-Si Ultrasil-octyl Ultrasil-ODS LiChrosorb Si LiChrosorb RP-2 LiChrosorb RP-8 LiChrosorb RP-18 LiChrosorb NH2 LiChrosorb CN
SiO2 (silika) Octana (C8) Octadecana (C-18) SiO2 (silika) Etana (C-2) Octana (C8) Octadecana (C-18) Amina Cyano
8
Kolom
A
4/11/2013
B
9
Inner Tidak bereaksi baik dengan bahan kolom dan senyawa yang akan dipisahkan Harus p.a (pro analysis) atau HPLC grade Mempunyai viskositas yang rendah Homogenous dengan pelarut lainnya Tidak mempunyai pengaruh terhadap sistem detektor Tidak korosif Tidak explosif baik akibat pemanasan maupun tekanan
10
4/11/2013
1. Tajam (sharp)
2. Kembar (twin)
3. Berbahu (Shoulder)
4. Melebar (slope)
4/11/2013 11
Tampilan puncak pada kromatogram pada HPLC tidak selalu sebagaimana yang diharapkan yaitu segi tiga sama kaki, bentuk puncak yang asimetri umum dijumpai. Hal ini terjadi sampel yang diinjeksikan lebih besar dari kapasitas daya migrasi partikel kolom. Misalkan kemampuan daya migrasi partikel kolom 0,1 mg/g, sedangkan sampel yang diinjeksikan 1 mg/g, sehingga puncak memberikan kenaikan yang tajam pada permulaan dan kemudian melebar.
AF = b/a = 1
10 % h
AF = b/a = 2
10 % h
4/11/2013
Axis waktu
Axis waktu
AF = asimetri faktor
12
4/11/2013
13
1. Mengatur kecepatan alir (flow rate) atau menaikan dan menurunkan kecepatan alir fasa gerak.
2. Merubah perbandingan (ratio) fasa gerak atau merubah kepolar fasa gerak. 3. Menaikan atau menurunkan temperatur kolom. 4. Membuat turunan (derivat) senyawa yang dipisahkan. 4. Menambah panjang kolom (double column)
4/11/2013 14
4/11/2013
15