You are on page 1of 16

Materi 6

(High Performance Liquid Chromatography)

High Price Liquid Chromatography

KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)

4/11/2013

Hampir 20 % senyawa yang diketahui tidak dapat dianalisis dengan Kromatografi Gas dengan berbagai alasan antara lain; Tidak mudah menguap (insufficiently volatile) Tidak dapat melewati kolom Tidak tahan panas (Thermally unstable)

Terurai dalam kondisi saat pemisahan dengan GC.

HPLC tidak terbatas untuk senyawa yang mudah menguap, tetapi juga mampu memisahkan makromolekul dan jenis-jenis ion, senyawa alami yang labil, material polimer, dan berbagai senyawa dengan BM besar yang mempunyai banyak gugus fungsi dan dapat

digabungkan dengan Spektrofotometer Infra Red (IR) dan Spektrometri Massa (MS)
4/11/2013

Teori HPLC
Pemisahan komponen campuran berdasarkan pada distribusi kesetimbangan (K) dari komponen di dalam kedua fasa.

Cs
K= Cm

Cs = Konsentrasi komponen dalam fasa diam Cm = Konsentrasi komponen dalam fasa gerak

Variabel yang mempengaruhi perbedaan migrasi adalah 1. Kompetisi fasa gerak 2. Temperatur 3. Jenis fasa diam
4/11/2013 3

Volume retensi dan waktu merupakan ukuran yang bisa digunakan untuk mengidentifikasi puncak pada kromatogram.

Waktu retensi (Tr) adalah waktu yang diperlukan untuk mengelusi oleh suatu zat/bahan yang sampai pada konsentrsi maksimum. Waktu retensi merupakan suatu fungsi dari kecepatan fasa gerak dan volume fasa gerak. Sedang volume retensi adalah volume fasa gerak puncak komponen tersebut sampai tepat diujung kolom. VR = Volume retensi
Tr = Volume alir (flow rate)gerak fasa
4

VR = F x Tr
4/11/2013

Sistem HPLC
1. 2. Isokratik (ratio fasa gerak dicampur diluar sistem) Gradient (ratio fasa gerak diatur melalui sistem dengan bantuan mikroprosesor)

3.

Recycling (isokratik dan gradient fasa gerak kembali kedalam sistim)

R a t i o P e l a r u t

B 100 %

R a t i o P e l a r u t

B 100 %

A 0
4/11/2013

A 0 Waktu Retensi
5

Waktu Retensi

Rangkaian Dasar HPLC


Injektor

Wadah fasa gerak

Pompa

Detektor Kolom

Wadah Pembuangan
Rekorder atau data prosesor

4/11/2013

Wadah fasa gerak

1.

Tunggal (isokratik)

2.

Lebih dari satu (gradient)


1. 2. Piston tunggal Piston ganda

Pompa

Injektor

1.
2. 1.

50 100 L (analitik)
500 L - 5 ml (preparatif) Prekolom Standard

Kolom

2.

3.
4. 5.

Radial Compression
Narrow Bore Short

1.
2. Detektor
4/11/2013

RI (refractive Index)
UV-Vis Flourescence PDA (Photo Diode Array) Amperometric
7

3. 4. 5.

Jenis-jenis kolom HPLC


N0 Nama kolom Jenis adsorban

1 2 3 4 5 6 7 8 9
4/11/2013

Ultrasil-Si Ultrasil-octyl Ultrasil-ODS LiChrosorb Si LiChrosorb RP-2 LiChrosorb RP-8 LiChrosorb RP-18 LiChrosorb NH2 LiChrosorb CN

SiO2 (silika) Octana (C8) Octadecana (C-18) SiO2 (silika) Etana (C-2) Octana (C8) Octadecana (C-18) Amina Cyano
8

Mekanisme pemisahan pada HPLC


A dan B mulai terpisah Fasa gerak

Sampel A dan B Fasa diam

Kolom

Fasa gerak ke detektor

A
4/11/2013

B
9

Waktu retensi (min)

Sinyal pada rekorder

Syarat fasa gerak (pelarut/elusi) HPLC

Inner Tidak bereaksi baik dengan bahan kolom dan senyawa yang akan dipisahkan Harus p.a (pro analysis) atau HPLC grade Mempunyai viskositas yang rendah Homogenous dengan pelarut lainnya Tidak mempunyai pengaruh terhadap sistem detektor Tidak korosif Tidak explosif baik akibat pemanasan maupun tekanan
10

4/11/2013

Macam-macam tampilan puncak senyawa pada kromatogram

1. Tajam (sharp)

2. Kembar (twin)

3. Berbahu (Shoulder)

4. Melebar (slope)
4/11/2013 11

Tampilan puncak pada kromatogram pada HPLC tidak selalu sebagaimana yang diharapkan yaitu segi tiga sama kaki, bentuk puncak yang asimetri umum dijumpai. Hal ini terjadi sampel yang diinjeksikan lebih besar dari kapasitas daya migrasi partikel kolom. Misalkan kemampuan daya migrasi partikel kolom 0,1 mg/g, sedangkan sampel yang diinjeksikan 1 mg/g, sehingga puncak memberikan kenaikan yang tajam pada permulaan dan kemudian melebar.

AF = b/a = 1
10 % h

AF = b/a = 2
10 % h

4/11/2013

Axis waktu

Axis waktu

AF = asimetri faktor

12

Kolom selektifitas, efesiensi, ratio pemisahan


Selektifitas cukup, tetapi efesiensi rendah

Selektifitas dan efesiensi baik

Selektifitas rendah, tetapi efesiensi baik

4/11/2013

13

Cara-cara mengatasi permasalah pemisahan/migrasi senyawa pada HPLC

1. Mengatur kecepatan alir (flow rate) atau menaikan dan menurunkan kecepatan alir fasa gerak.
2. Merubah perbandingan (ratio) fasa gerak atau merubah kepolar fasa gerak. 3. Menaikan atau menurunkan temperatur kolom. 4. Membuat turunan (derivat) senyawa yang dipisahkan. 4. Menambah panjang kolom (double column)
4/11/2013 14

Kalkulasi hasil kromatogram HPLC


Di dasarkan pada perbandingan luas area puncak yang dihasil antara cuplikan (sampel) dan kontrol (standard).

1. Luas segi tiga sama kaki (alas x 1/2 tinggi)

2. Garis regresi linier

4/11/2013

15

Keuntungan-keuntungan melakukan analisa dengan HPLC


a. Cepat (waktu analisis kurang dari 1 jam) b. Daya pisahnya (migrasi) baik c. Peka, detektor spesifik (UV-Vis dan Flourescence dapat mendeteksi sampai jumlah g)

d. Kolom dapat dipakai kembali


e. Ideal untuk molekul besar, ion yang tidak bisa dengan GC f. Mudah memperoleh kembali cuplikan (sampel)
4/11/2013 16

You might also like