Materi 6

(High Performance Liquid Chromatography)

High Price Liquid Chromatography

KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)

4/11/2013

1

2 . • Tidak mudah menguap (insufficiently volatile) • Tidak dapat melewati kolom • Tidak tahan panas (Thermally unstable) • Terurai dalam kondisi saat pemisahan dengan GC. HPLC tidak terbatas untuk senyawa yang mudah menguap. material polimer.Hampir 20 % senyawa yang diketahui tidak dapat dianalisis dengan Kromatografi Gas dengan berbagai alasan antara lain. tetapi juga mampu memisahkan makromolekul dan jenis-jenis ion. senyawa alami yang labil. dan berbagai senyawa dengan BM besar yang mempunyai banyak gugus fungsi dan dapat digabungkan dengan Spektrofotometer Infra Red (IR) dan Spektrometri Massa (MS) 4/11/2013 .

Temperatur 3. Cs K= Cm Cs = Konsentrasi komponen dalam fasa diam Cm = Konsentrasi komponen dalam fasa gerak Variabel yang mempengaruhi perbedaan migrasi adalah’ 1.Teori HPLC Pemisahan komponen campuran berdasarkan pada distribusi kesetimbangan (K) dari komponen di dalam kedua fasa. Kompetisi fasa gerak 2. Jenis fasa diam 4/11/2013 3 .

Waktu retensi merupakan suatu fungsi dari kecepatan fasa gerak dan volume fasa gerak.Volume retensi dan waktu merupakan ukuran yang bisa digunakan untuk mengidentifikasi puncak pada kromatogram. Waktu retensi (Tr) adalah waktu yang diperlukan untuk mengelusi oleh suatu zat/bahan yang sampai pada konsentrsi maksimum. Sedang volume retensi adalah volume fasa gerak puncak komponen tersebut sampai tepat diujung kolom. VR = Volume retensi Tr = Volume alir (flow rate)gerak fasa 4 VR = F x Tr 4/11/2013 .

2. Recycling (isokratik dan gradient fasa gerak kembali kedalam sistim) R a t i o P e l a r u t B 100 % R a t i o P e l a r u t B 100 % A 0 4/11/2013 A 0 Waktu Retensi 5 Waktu Retensi . Isokratik (ratio fasa gerak dicampur diluar sistem) Gradient (ratio fasa gerak diatur melalui sistem dengan bantuan mikroprosesor) 3.Sistem HPLC 1.

Rangkaian Dasar HPLC Injektor Wadah fasa gerak Pompa Detektor Kolom Wadah Pembuangan Rekorder atau data prosesor 4/11/2013 6 .

Lebih dari satu (gradient) 1. 2. 2. 5.Wadah fasa gerak 1. Detektor 4/11/2013 RI (refractive Index) UV-Vis Flourescence PDA (Photo Diode Array) Amperometric 7 3. Radial Compression Narrow Bore Short 1. 2. Piston tunggal Piston ganda Pompa Injektor 1. Tunggal (isokratik) 2. 50 – 100 L (analitik) 500 L . 5. 4. 1. .5 ml (preparatif) Prekolom Standard Kolom 2. 4. 3.

Jenis-jenis kolom HPLC N0 Nama kolom Jenis adsorban 1 2 3 4 5 6 7 8 9 4/11/2013 Ultrasil-Si Ultrasil-octyl Ultrasil-ODS LiChrosorb Si LiChrosorb RP-2 LiChrosorb RP-8 LiChrosorb RP-18 LiChrosorb NH2 LiChrosorb CN SiO2 (silika) Octana (C8) Octadecana (C-18) SiO2 (silika) Etana (C-2) Octana (C8) Octadecana (C-18) Amina Cyano 8 .

Mekanisme pemisahan pada HPLC A dan B mulai terpisah Fasa gerak Sampel A dan B Fasa diam Kolom Fasa gerak ke detektor A 4/11/2013 B 9 Waktu retensi (min) Sinyal pada rekorder .

Syarat fasa gerak (pelarut/elusi) HPLC        Inner Tidak bereaksi baik dengan bahan kolom dan senyawa yang akan dipisahkan Harus p.a (pro analysis) atau HPLC grade Mempunyai viskositas yang rendah Homogenous dengan pelarut lainnya Tidak mempunyai pengaruh terhadap sistem detektor Tidak korosif Tidak explosif baik akibat pemanasan maupun tekanan 10 4/11/2013 .

Macam-macam tampilan puncak senyawa pada kromatogram 1. Tajam (sharp) 2. Melebar (slope) 4/11/2013 11 . Berbahu (Shoulder) 4. Kembar (twin) 3.

sehingga puncak memberikan kenaikan yang tajam pada permulaan dan kemudian melebar. h AF = b/a = 1 10 % h h AF = b/a = 2 10 % h a b a b 4/11/2013 Axis waktu Axis waktu AF = asimetri faktor 12 .Tampilan puncak pada kromatogram pada HPLC tidak selalu sebagaimana yang diharapkan yaitu segi tiga sama kaki. Misalkan kemampuan daya migrasi partikel kolom 0. Hal ini terjadi sampel yang diinjeksikan lebih besar dari kapasitas daya migrasi partikel kolom. bentuk puncak yang asimetri umum dijumpai.1 mg/g. sedangkan sampel yang diinjeksikan 1 mg/g.

tetapi efesiensi baik 4/11/2013 13 . ratio pemisahan Selektifitas cukup.Kolom selektifitas. efesiensi. tetapi efesiensi rendah Selektifitas dan efesiensi baik Selektifitas rendah.

Menambah panjang kolom (double column) 4/11/2013 14 . 3. 2.Cara-cara mengatasi permasalah pemisahan/migrasi senyawa pada HPLC 1. 4. 4. Membuat turunan (derivat) senyawa yang dipisahkan. Mengatur kecepatan alir (flow rate) atau menaikan dan menurunkan kecepatan alir fasa gerak. Menaikan atau menurunkan temperatur kolom. Merubah perbandingan (ratio) fasa gerak atau merubah kepolar fasa gerak.

Garis regresi linier 4/11/2013 15 .Kalkulasi hasil kromatogram HPLC Di dasarkan pada perbandingan luas area puncak yang dihasil antara cuplikan (sampel) dan kontrol (standard). 1. Luas segi tiga sama kaki (alas x 1/2 tinggi) 2.

Peka. Ideal untuk molekul besar. detektor spesifik (UV-Vis dan Flourescence dapat mendeteksi sampai jumlah g) d. ion yang tidak bisa dengan GC f. Cepat (waktu analisis kurang dari 1 jam) b. Mudah memperoleh kembali cuplikan (sampel) 4/11/2013 16 . Daya pisahnya (migrasi) baik c.Keuntungan-keuntungan melakukan analisa dengan HPLC a. Kolom dapat dipakai kembali e.