BAB I PENDAHULUAN 1.

Dasar Teori

BAKTERI Bakteri, dari kata Latin bacterium (jamak, bacteria), adalah kelompok besar Prokariota, selain Archaea, yang berukuran sangat kecil serta memiliki peran besar dalam kehidupan di bumi. Mereka sangatlah kecil (mikroskopik) dan kebanyakan uniselular (bersel tunggal), dengan struktur sel yang relatif sederhana, yaitu tanpa nukleus/inti sel, kerangka sel, dan organel-organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Bakteri dianggap sebagai organisme paling melimpah di bumi. Bakteri tersebar dan menghuni hampir semua tempat (di tanah, air, udara, atau dalam simbiosis dengan organisme lain). Banyak patogen merupakan bakteri. Kebanyakan dari mereka kecil, biasanya hanya berukuran 0,5-5 m, meski ada jenis dapat menjangkau 0,3 mm dalam diameter (Thiomargarita). Mereka umumnya memiliki dinding sel, seperti sel tumbuhan dan jamur, tetapi dengan bahan pembentuk sangat berbeda (peptidoglikan). Banyak bakteri yang bergerak menggunakan flagela, yang berbeda dalam strukturnya dari flagela kelompok lain. Tidak semua bakteri dapat membentuk spora. Jenis-jenis bakteri tertentu, terutama yang tergolong kedalam genus Bacillus dan Clostridium, membentuk suatu struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang khas, disebut endospora. Sifat dari endospora adalah tahan terhadap pemanasan serta dalam keadaan kekurangan nutrient, tahan terhadap panas dan unsur fisik lainnya dari pada bakteri biasanya, yaitu bakteri dalam bentuk vegetatif hal ini disebabkan karena dinding spora sedikit banyak impermeabel, sedang banyaknya asam ribonukleat di dalam protoplasma dapat menawar pengaruh buruk dari sinar, lebih lebih dari sinar ultra ungu. Berhubung spora itu mengandung sangat sedikit air, maka keadaan ini menyebabkan spora tidak mudah megalami perubahn temperatur. Endospora dapat tetap tinggal disalah satu ujung atau di tengah-tengah sel. Sel dapat pecah karena perkembangan endospora. Pecahan itu kemudian luluh menjadi satu dengan medium. Jika keadaan luar menguntungkan, maka spora dapat tumbuh lagi menjadi bakteri biasa. Mula mula air meresap ke dalam spora, kemudian spora mengembang dan kulit spora menjadi retak karenanya. Keretakan ini dapat terjadi pada salah ssatu ujung, tetapi dapat juga
1

pada tengah-tengah spora, hal ini merupakan salah satu ciri khas pada Bacillus. Jika kulit spora pecah di tengah-tengah, maka masing-masing pecahan akan merupakan suatu tutup pada kedua ujung bakteri. Pada bakteri, spora berfungsi dalam mempertahankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Spora bakteri mempunyai fungsi yang sama seperti kista amoeba karena bakteri dalam bentuk spora dan amoeba dalam bentuk kista berada dalam fase yang sama. Dimana kedua mikroorganisme ini berubah bentuk dalam usaha melindungi diri dari keadaan tidak menguntungkan. Bentuk spora ada yang bulat, ada pula yang bulat panjang dan ada pula yang lebih besar dari pada diameter sel induk. Hal ini bergantung kepada spesiesnya. Endospora ada yang lebih kecil dan ada pula yang besar dari pada diameter sel induk. Sel yang mengandung endospora itu kemudian disebut sporangium atau kotak spora. Biasanya satu sporangium berisi satu endospora, akan tetapi ada kalanya satu sporangium berisi dua spora, hal ini disebabkan karena pembelahan sel yang lambat. Pembentukkan spora disebut dengan sporulasi, pada umumnya sporulasi mudah terjadi, apabila keadaan medium memburuk, zat-zat yang timbul sebagai tempat pertukaran zat menumpuk dan faktor merugikan. Beberapa spesies bakteri dapat kehilangan kemampuan nya untuk dapat membentuk spora. Adanya spora dapat diketahui dengan pengamatan secara morfologi dan secara fisiologi. Bentuk spora dapat dilihat dengan mikroskop biasa, apalagi kalau spora itu diwarnai. Ada dua metode umum yang dipakai, yaitu metode scaeffer-fulton dan metode dorner. Metode dorner menggunakan nigrosin dan menghasilkan spora berwarna merah dan sporangium yang tak berwarna. Pewarnaan spora memerlukan pemanasan lebih dulu. Spora yang tidak meresap zat warna nampak berlainan dari pada sporangiumnya. Jika spora tidak diwarnai, ia nampak sebagai benda yang agak suram di samping protoplasma yang tembus cahaya. Biasanya pewarnaan spora dipakai untuk menyebut alat pembiakkan yang terdapat pada jamur, ganggang, lumut, paku pakuan.

Istilah spora pada bakteri mempunyai arti yang lain. Spora bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri terdapat pengaruh buruk dari luar. Spora bakteri mempunyai fungsi yang sama seperti kista amoeba, sebab bakteri dalam bentuk spora dan amoeba dalam bentuk kista merupakan suatu fase, dimana kedua mikroorganisme itu berubah bentuk untuk melindungi diri terhadap faktor faktor luar yang tidak menguntungkan. Setelah keadaan luar baik lagi bagi mereka, maka pecahlah bungkus spora atau dinding kista, dan tumbuhlah bakteri atau amoeba sebagaimana biasanya. Menurut knaysi terjadinya spora atau sporulasi itu dapat dibagi atas 4 tahap : 1) Tahap permulaan, di mana koloni menunjukkan pertumbuhan yang sangat lambat. 2) Selama beberapa jam kelihatan adanya bahan bahan lipo protein yang mengumpul kesalah satu ujung sel, sehingga ujung itu sangat padat. 3) Maka timbullah bungkus yang menyelubungi calon spora. Selubung terdiri atas 2 lapis, yaitu kulit luar (eksin) dan kulit dalm (intin). Pada beberapa spesies inti itu menjadi dinding sel, apabila spora melanjutkan pertumbuhannya menjadi bakteri biasa. Dinding spora melanjutkan pertumbuhannya menjadi bakteri biasa. Dinding spora itu impermeabel bagi zat zat yang dapat mengganggu kehidupan bakteri. 4) Pada tahap yang terakhir maka spora tampak berubah bentuk dan berubah volume.

Beberapa macam cara pengecatan spora adalah sebagai berikut : a. Cara pengecatan spora menurut klein Biakan bakteri berspora yang berumur 48-72 jam disuspensikan dalam larutan garam fisiologis kedalam suspensi tersebut ditambahkan larutan karbolfuksin. Kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 80o C selama 10 menit dari suspensi yang berwarna ini, dibuat film tipis diatas kaca objek. Setelah kering difiksasi, selanjutnya preparat dicelupkan beberapa detik dalam asam sulfat 1%, disusul pencucian dengan air akhirnya dicat dengan larutan metilen biru selama 3 menit, dicuci dengan air dan dikeringkan. Hasil pengecatan adalah spora berwarna merah dan bakteri berwarna biru.

b. Pewarnaan spora dengan cara lain Pengecatan Ziehl-Neelsen dengan sediklit modifikasi. Dalam hal ini dekolorisasi hanya dilakukan dengan alkohol. Hasil pengecatannya adalah spora berwarna merah dan sel bakteri berwarna biru. Film preparat disiram dengan larutan hijau malakhit jenuh dan ditunggu selama 10 menit sambil sewaktu-waktu dipanaskan, kemudian dicuci dengan air selama 10 detik. Pengecatan dilanjutkan dengan larutan safranin dalam air (0,25%) selama 15 detik. Akhirnya dicuci dengan air dan dikeringkan. Hasil pengecatan adalah spora berwana hijau dan sel berwarna merah 1. Struktur Bakteri

Struktur Sel Bakteri

a. Dinding Sel Fungsi dinding sel adalah Memberi bentuk pada sel dan melindungi bakteri dari pengaruh buruk yang datang dari luar sel (patogen). Sebagai lapisan penyokong dan pelindung struktur dalam. Secara medis, fungsi dinding sel sebagai tempat aksi antibiotik serta pembeda tipe bakteri. Komposisi kimiawi dari dinding sel yaitu peptidoglikan. Polimer yang amat besar ini terdiri dari tiga macam bahan pembangun, yaitu N-acetilglukosamin, asamN-acetilmuramik dan suatu peptide yang terdiri dari 4 asam amino (L-alanin, D-alanin, asam D-glutamat, dan Lisin
4

atau asam diaminopimelat). Dinding sel yang utuh juga mengandung kompenen-kompenen kimiawi yang lain, seperti asam tekoat, protein, polisakarida, lipoprotein, dan lipopolisakrida yang terikat pada peptydoglikan. Peptydoglikan bersama-sama dengan kedua kompenen lain dinding sel, hanya dijumpai pada prokariota. Namun, susunan kimiawi secara struktur peptydoglikan bervariasi dari suatu spesies bakteri ke spesies bakteri yang lain. Penemuan penting lain yang diperoleh selama berlangsungnya identifikasi komposisi kimiawi dinding sel bakteri ialah bahwa beberapa dari asam-asam amino di dalam peptide dan peptidoglikan terdapat dalam konfigurasi D. Ini berlawanan dengan penampilannya di dalam protein, yaitu terdapat dalam konfigurasi L. Bakteri dapat digolongkan menjadi dua kelompok berdasarkan pada perbedaan struktur dinding sel nya, yaitu Gram positif dan Gram negatif. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang tersusun dari lapisan peptidoglikan yang tebal dan asam teikoat. Sementara bakteri Gram negatif memiliki lapisan luar dari lipopolisakarida yang terdiri dari membran dan lapisan peptidoglikan yang tipis dan terletak pada periplasma (di antara lapisan luar dan membran sitoplasma).

b. Protoplasma (Cytoplasma) Merupakan zat hidup dari sel. Terdapat dalam lingkungan dinding sel. Terutama terdiri dari protein.

c. Membran Cytoplasma Merupakan bagian terluar dari cytoplasma yang melekat pada dinding sel. Perkiraan ketebalannya yang didasarkan pada mikrograf electron irisan-irisan tipis ialah sekitar 7,5 nm. Membran sitoplasma juga menyediakan peralatan biokimiawi untuk memindahkan ion-ion mineral, gula, asam-asam amino, elektron serta metabolitmetabolit lain melintasi membran. Substansi-substansi dalam larutan ini, atau solute lewat melintasi membran dengan cara difusi pasif atau angkatan aktif. Membran sitoplasma dengan cara melipat kearah dalam atau invaginasi ke dalam sitoplasma menghasilkan struktur yang disebut mesosom. Mesosom selalu sinambung dengan membran sitoplasma.

d. Nukleus (Inti) Di dalamnya terdapat pembawa sifat (chromosome)

e. Kapsul Yaitu suatu selaput lendir yang membungkus seluruh permukaan bakteri dan merupakan bagian dari sel bakteri. Kapsul ini bersifat antigen dan merupakan pelindung bakteri. Bila bakteri itu kehilangan kapsulnya sama sekali, maka ia dapat kehilangan virulensinya dan dengan demikian kehilangan kemampuannya

menyebabkan infeksi. Bakteri-bakteri berkapsul juga menyebabkan adanya gangguan seperti lendir dalam beberapa proses industri. Penumpukan lendir dalam peralatan pabrik dapat menyumbat filter membentuk lapisan yang tidak dikehendaki pada pipapipa atau peralatan atau mempengaruhi kualitas produk akhirnya.

f. Flagel Salah satu sifat bakteri adalah dapat bergerak. Alat gerak bakteri adalah flagel (bulu cambuk). Flagel mempunyai ukuran panjang : 1 70 , tebal : 1215 mili . Flagelum menyebabkan motilitas (pergerakan) pada sel bakteri. Flagelum dibuat dari subunit-subunit protein. Protein ini disebut flagelin. Tidak semua bakteri mempunyai flagellum, banyak spesies Basillus dan Spirillum yang memilikinya, tapi flagellum jarang dijumpai pada kokus.

Tabel fungsi struktur Permukaan Sel Bakteri

STRUKTUR

FUNGSI Lokomosi (alat gerak) Penutup lindung pelekatan sel makanan cadangan Tabung konjugasi pelekatan sel

KOMPOSISI KIMIAWI Protein

Flagela Kapsul dan bahan ekstra selular Pili

Polisakarida, polipeptida

Protein

Dinding sel

Penutup lindung permeabilitas

Peptidoglikan, asam teikoat, polisakarida,l ipid dan protein

C Membran sittoplasma dan i mesosom r i

Penutup semipermeabel mekanisme traspor pembelahan sel sintesis makromolekul Lipid, protein

2. Ukuran Bakteri Bakteri merupakan organisme mikroskopis rata-rata berdiameter 1,25 mikrometer (m). Ukuran bakteri adalah mikroskopis artinya dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop.

3. Bentuk Bakteri Berdasarkan bentuknya, bakteri dibagi menjadi tiga golongan besar, yaitu:

Kokus (Coccus) dalah bakteri yang berbentuk bulat seperti bola, dan mempunyai beberapa variasi sebagai berikut:

Mikrococcus. Jika kecil dan tunggal. Misal Monococcus gonorhoe. Diplococcus. Jka bergandanya dua-dua. Misal Diplococcus pneumoniae penyebab penyakit pneumonia (radang, paru-paru).

Tetracoccus. Jika bergandengan empat dan membentuk bujursangkar Sarcina. Jika bergerombol membentuk kubus. Misal Sarcina luten. Staphylococcus. Jika bergerombol, yaitu bakteri berbentuk bola yang berkoloni seperti buah anggur, misal Staphlococcus aureus, penyebab penyakit radang paruparu.

Streptococcus, jika bergandengan membentuk rantai. Misal Streptococcus lactis, Streptococcus pyogenes penyebab sakit tenggorokan dan Streptococcus thermophilis untuk pembuatan yoghurt (susu asam).

 Basil (Bacillus) adalah kelompok bakteri yang berbentuk batang atau silinder, dan mempunyai variasi sebagai berikut:

Basil tunggal : bakteri yang hanya berbentuk satu batang tunggal. Contoh: Escherichia coli bakteri yang terdapat pada usus dan Lactobacillus.

Diplobacillus. Jika bergandengan dua-dua. Streptobacillus. Jika bergandengan membentuk rantai. Misal Bacillus anthracis penyebab penyakit antrak.

Cocobacillus : batang yang sangat pendek menyerupai coccus

Spiril (Spirilum) atau bentuk spiral adalah bakteri yang berbentuk lengkung dan mempunyai variasi sebagai berikut:

Vibrio, (bentuk koma), jika lengkung kurang dari setengah lingkaran, misal Vibrio cholerae penyebab penyakit kolera.

Spiral, jika lengkung lebih dari setengah lingkaran atau spiral tidak sempurna. Spiroseta : yaitu golongan bakteri berbentuk spiral yang dapat bergerak, misal: Spirochaeta palida, penyebab penyakit sifilis.

4. Alat Gerak Bakteri Flagel atau cambuk getar merupakan bagian dari bakteri sebagai alat untuk bergerak, flagel melekat pada membran luar di dinding sel. Ukuran flagel bakteri sangat kecil, tebalnya 0,02 0,1 , dan panjangnya melebihi panjang sel bakteri. Berdasarkan tempat dan jumlah flagel yang dimiliki, bakteri dibagi menjadi lima golongan, yaitu:

Atrik, tidak mempunyai flagel. Monotrik, mempunyai satu flagel pada salah satu ujungnya. Lofotrik, mempunyai sejumlah flagel pada salah satu ujungnya. Amfitrik, mempunyai satu flagel pada kedua ujungnya. Peritrik, mempunyai flagel pada seluruh permukaan tubuhnya. A:Monotrik B : Lofotrik C : Amfitrik D : Peritrik

5. Pengaruh Lingkungan Terhadap Bakteri Kondisi lingkungan yang mendukung dapat memicu pertumbuhan dan reproduksi bakteri. Faktor-faktor lingkungan yang berpengaruh terhadap pertumbuhan dan reproduksi bakteri adalah suhu, kelembapan, dan cahaya. a) Suhu Berdasarkan kisaran suhu aktivitasnya, bakteri dibagi menjadi 3 golongan: Bakteri psikrofil, yaitu bakteri yang hidup pada daerah suhu antara 0 30 C, dengan suhu optimum 15 C. Bakteri mesofil, yaitu bakteri yang hidup di daerah suhu antara 15 55 C, dengan suhu optimum 25 40 C. Bakteri termofil, yaitu bakteri yang dapat hidup di daerah suhu tinggi antara 40 75 C, dengan suhu optimum 50o - 65 C

b) Kelembaban udara Pada umumnya bakteri memerlukan kelembaban udara yang cukup tinggi, kirakira 85%. Pengurangan kadar air dari protoplasma menyebabkan kegiatan metabolisme terhenti, misalnya pada proses pembekuan dan pengeringan.

c) Cahaya Cahaya sangat berpengaruh pada proses pertumbuhan bakteri. Umumnya cahaya merusak sel mikroorganisme yang tidak berklorofil. Sinar ultraviolet dapat menyebabkan terjadinya ionisasi komponen sel yang berakibat menghambat pertumbuhan atau menyebabkan kematian. Pengaruh cahaya terhadap bakteri dapat digunakan sebagai dasar sterilisasi atau pengawetan bahan makanan. Jika keadaan lingkungan tidak menguntungkan seperti suhu tinggi, kekeringan atau zat-zat kimia tertentu, beberapa spesies dari Bacillus yang aerob dan beberapa spesies dari Clostridium yang anaerob dapat mempertahankan diri dengan spora. Spora tersebut dibentuk dalam sel yang disebut endospora. Endospora dibentuk oleh penggumpalan protoplasma yang sedikit sekali mengandung air. Oleh karena itu endospora lebih tahan terhadap keadaan lingkungan yang tidak menguntungkan dibandingkan dengan bakteri aktif. Apabila keadaan lingkungan membaik kembali, endospora dapat tumbuh menjadi satu sel bakteri biasa. Letak endospora di tengah-tengah sel bakteri atau pada salah satu ujungnya.

6. Peranan Bakteri a. Bakteri Menguntungkan Bakteri Pengurai Bakteri saprofit menguraikan tumbuhan atau hewan yang mati, serta sisa-sisa atau kotoran organisme. Bakteri tersebut menguraikan protein, karbohidrat dan senyawa organik lain menjadi CO2, gas amoniak, dan senyawa-senyawa lain yang lebih sederhana. Oleh karena itu keberadaan bakteri ini sangat

10

berperan dalam mineralisasi di alam dan dengan cara ini bakteri membersihkan dunia dari sampah-sampah organik. Bakteri Nitrifikasi Bakteri nitrifikasi adalah bakteri-bakteri tertentu yang mampu menyusun senyawa nitrat dari amoniak yang berlangsung secara aerob di dalam tanah. Bakteri Nitrogen Bakteri nitrogen adalah bakteri yang mampu mengikat nitrogen bebas dari udara dan mengubahnya menjadi suatu senyawa yang dapat diserap oleh tumbuhan. Karena kemampuannya mengikat nitrogen di udara, bakteri-bakteri tersebut berpengaruh terhadap nilai ekonomi tanah pertanian. Kelompok bakteri ini ada yang hidup bebas maupun simbiosis. Bakteri Usus Bakteri Eschereria coli hidup di kolon (usus besar) manusia, berfungsi membantu membusukkan sisa pencernaan juga menghasilkan vitamin B12, dan vitamin K yang penting dalam proses pembekuan darah. Bakteri Fermentasi Beberapa makanan hasil fermentasi : No. Nama produk atau makanan Yoghurt Mentega Asinan buahbuahan Bahan baku susu susu buahbuahan Bakteri yang berperan Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus Streptococcus lactis Lactobacillus sp.

1. 2. 4.

Bakteri Penghasil Antibiotik Antibiotik merupakan zat yang dihasilkan oleh mikroorganisme dan mempunyai daya hambat terhadap kegiatan mikroorganisme lain. Beberapa bakteri yang menghasilkan antibiotik adalah:

Bacillus brevis, menghasilkan terotrisin

11

Bacillus subtilis, menghasilkan basitrasin Bacillus polymyxa, menghasilkan polimixin

b. Bakteri Merugikan 1. Bakteri Perusak Makanan Beberapa spesies pengurai tumbuh di dalam makanan. Mereka mengubah makanan dan mengeluarkan hasil metabolisme yang berupa toksin. 2. Bakteri Denitrifikasi Jika oksigen dalam tanah kurang maka akan berlangsung denitrifikasi, yaitu nitrat direduksi sehingga terbentuk nitrit dan akhirnya menjadi amoniak yang tidak dapat dimanfaatkan oleh tumbuhan. 3. Bakteri Patogen Merupakan kelompok bakteri parasit yang menimbulkan penyakit pada manusia, hewan dan tumbuhan. Contoh penyebab penyakit TBC paru-paru. Mycobacterium tuberculosis

Pewarnaan ZN (Ziehl-Neelsen) atau Pewarnaan Tahan Asam Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan pewarnaan gram. Zat pewarna ZN disebut juga zat pewarna tahan asam. Dasarnya dari sebagian organisme menahan fuksin karbol walaupun dilunturkan dengan asam. Organisme seperti ini disebut kuman tahan asam. Meskipun demikian, sifat tahan asam ini disebabkan oleh adanya asam mikolat. Pewarnaan ini digunakan untuk mengidentifikasi organisme bermarga Mycobacterium dan Spirochaeta. Contoh kuman tahan asam ialah Mycobacterium, spora kuman, aksospora jamur-jamur tertentu, rangka luar serangga, benda inklusi pada paru penderita pneumonia lemak, dan pigmen lipid pada hati tikus. Suatu Mycobacteria dikatakan tahan asam karena dapat mempertahankan zat pewarna merah (karbolfuchsin) meskipun dicuci dengan alcohol. Perlakuan ini menghilangkan zat pewarna dari organisme lain dalam olesan. Suatu perkecualian pada bakteri pathogen yaitu marga Nocardia. Bakteri ini tidak tahan asam seperti Mycobacteria. Dengan pencucian yang terus-menerus menyebabkan Nocardia kehilangan zat warna.

12

Mycobacterium memiliki lapisan lilin di sebelah luar dinding sel sehingga zat warna tidak dapat masuk ke dalam. Mycobacterium memiliki kandungan lipida yang tinggi dan mempunyai lapisan lilin di luar sel yang bersifat impermeable. Supaya zat warna dapat menembus ke dalam sel diperlukan pemanasan dan penambahan bahan kimia khusus. Untuk membantu perasukan zat warna, ditambahkan karbolfuchsin yang mengandung fenol 5%. Jika warna telah masuk ke dalam sel maka Mycobacterium akan tetap berwarna merah meski ditambahkan asam alcohol sebagai pemucat. Larutan pemucat dalam pewarnaan ZN lebih kuat karena mengandung HCl 3%. Lamanya pemucatan tidak akan mempengaruhi reaksi pewarnaan ZN. Bakteri-bakteri yang sifat dinding selnya tahan asam ZN (+) akan tetap mengikat pewarna pertama/merah setelah pelunturan, sebaliknya bakteri yang tidak tahan asam ZN (-) akan melepaskan pewarna pertama/merah setelah pelunturan dan dengan pemberian counterstain (pewarna setelah proses pelunturan) akan mengikat warna counterstain/ungu. Langkah-langkah pewarnaan ZN atau tahan asam adalah sebagai berikut : Film bakteri pada kaca obyek yang telah difiksasi, disiram dengan karnolfuksin, kemudian dipanaskan sampai keluar uap (tidak sampai mendidih). Pemanasan diulang beberapa kali agar bahan cat tetap hangat , kemudian didiamkan selama lima menit. Dekolorisasi dilakukan dengan asam-alkohol dalam waktu yang singkat, kemudian cepat cuci dengan air. Pewarnaan dengan cat kontras dilakukan dengan metilenbiru dalam larutan KOH 1/1000. Setelah dicuci kembali dengan air preparat dikeringkan di udara. Hasil pewarnaan adalah : Mycobacterium berwarna merah dan bakteri lainnya berwarna biru.

Pewarnaan Spora Jenis-jenis bakteri tertentu, terutama yang digolongkan ke dalam genus Bacillus dan Clostridium, membentuk struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang khas, disebut Endospora. Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrient, tahan terhadap panas dan unsur-unsur fisik lainnya seperti pembekuan, kekeringan, radiasi sinar ultraviolet serta terhadap bahan-bahan kimia yang dapat menghancurkan bakteri yang tidak dapat membentuk spora. Ketahanan tersebut disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras.
13

Endospora merupakan bentuk kehidupan yang paling resisten karena organism yang bersangkutan dapat bertahan dalam debu dan tanah secara bertahun-tahun. Sifat endospora yang demikian menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Prosedur pewarnaan gram misalnya, tidak dapat mewarnainya. Hanya bila diberikan perlakuan panas yang cukup, pewarna yang sesuai dapat menembus endospora. Tetapi sekali pewarna tersebut memasuki endospora, sulit dihilangkan. Ada dua metode yang umum dipakai yaitu : metode Schaeffer-Fulton (SF) dan metode Dorner. Pada metode Schaeffer-Fulton menggunakan larutan malachite-green (SF I) dan fuksin (SF II) akan menghasilkan spora yang berwarna hijau. Metode Dorner menggunakan nigrosin dan menghasilkan spora yang berwarna merah dan sporangium yang tidak berwarna. Beberapa macam cara pewarnaan spora adalah sebagai berikut : a. Cara pewarnaan Spora menurut Klein 1. Biakan bakteri spora yang berumur 48-72 jam disuspensi dalam larutan garam fisiologis 2. Ke dalam suspensi tersebut ditambahkan larutan karbolfuksin, kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 80o C selama 10 menit. 3. Dari suspensi yang berwarna ini dibuat film yang tipis di atas kaca objek, setelah kering difiksasi. 4. Selanjutnya preparat dicelupkan beberapa detik dalam asam sulfat 1%, disusul dengan pencucian dengan air 5. Akhirnya diwarna dengan larutan metilenbiru selama 3 menit, dicuci dengan air dan dikeringkan. b. Pewarnaan Spora dengan Cara Lain 1. Pewarnaan Ziehl-Neelsen dengan sedikit modifikasi. Dalam hal ini dekolorisasi hanya dilakukan dengan alkohol. Hasil pewarnaannya adalah spora berwarna merah dan sel bakteri berwarna biru. 2. Film preparat disiram dengan larutan hijau, malakhit jenuh (kira-kira 7,6%) dan ditunggu selama 10 menit sambil sewaktu-waktu dipanaskan, kemudian dicuci dengan air selama 10 detik. Pewarnaan dilanjutkan dengan larutan safranin dalam air (0,25%) selama 15 detik. Akhirnya dicuci dengan air dan keringkan. Hasil pewarnaan adalah spora berwarna hijau dan sel berwarna merah.

14

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam mempelajari spora dari pewarnaan adalah sebagai berikut : a. Letak spora dalam sel kemungkinannya adalah sebagai terminal, subterminal, atau sentral b. Bentuk spora bulat atau lonjong c. Adanya spora dapat mengubah bentuk sel. Dalam hal letak spora terminal, bila terdapat spora yang mengubah bentuk bakteri, dan spora menonjol keluar, maka bentuknya seperti pemukul tambur (Clostridium tetani). Bila letaknya sentral atau subterminal, dan diameter spora lebih besar dari diameter sel bakteri, maka bentuknya seperti kumparan.

PREPARAT OLESAN UNTUK PEWARNAAN Sebelum dilakukan pewarnaan, bakteri disuspensikan dalam setets air pada kaca preparat yang bersih, kemudian disebarkan hingga membentuk lapisan yang tipis. Olesan dibiarkan kering di udara dan organismenya difiksasi pada kaca preparat dengan cara pemanasan hati-hati atau secaraka kimiawi. Preparat ini disebut sebagai olesan yang telah difiksasi dan siap diwarnai. Olesan yang baik tidak mengandung terlalu banyak sel bakteri dalam kondisi mengumpul, tetapi harus memiliki jumlah sel yang cukup dan menyebar untuk memungkinkan pengamatan yang tepat. Kaca preparat harus bebas lemak dengan cara dicuci bersih dengan detergen dibilas dengan air dan dikeringkan dengan tisue atau dilewatkan di atas api. Jarum ose harus dilewatkan api sebelum dan sesudah mengambil biakan bakteri.

15

BAB II METODE KERJA

TUJUAN PRAKTIKUM Pewarnaan ZN (Ziehl-Neelsen) atau Pewarnaan Tahan Asam Melakukan pewarnaan ZN pada sel bakteri Membedakan kelompok bakteri ZN (+) dan (-)

Pewarnaan Spora Melakukan pewarnaan spora pada sel bakteri Membedakan letak spora pada bakteri

1. Pembuatan Preparat Olesan Bakteri untuk Pewarnaan a. Siapkan kaca obyek bebas lemak. Ambil 4-5 ose suspensi sel yang akan diamati secara aseptis, kemudian dengan jarum ose sebarkan suspensi bakteri tersebut secara merata dari tengah-tengah kaca obyek ke arah luas (posisi jarum ose horizontal). Bila biakan berasal dari biakan padat atau bukan kultur cair maka suspensikan dulu sel-sel bakteri ke dalam larutan NaCl 0.85 % selanjutnya lakukan cara di atas. b. Biarkan olesan bakteri kering di udara, jangan dikeringkan dengan pemanasan. Bila perlu pengeringan cepat, lewatkan preparat di atas api spiritus pada ketinggian + 33 cm di atas api spiritus. c. Lakukan fiksasi untuk melekatkan olesan bakteri pada kaca obyek, dengan cara melewatkan olesan yang telah kering tersebut di atas api soiritus beberapa kali (bagian yang ada olesan bakteri menghadap ke atas).

2. Pewarnaan ZN a. Siapkan preparat olesan bakteri Staphylococcus aureus yang telah difiksasi b. Tetesi dengan beberapa tetes larutan carbol-fuchsin (ZN I). Panaskan di atas api spiritus hingga timbul uap . Sisihkan dari api hingga uap hilang. Kemudian panaskan lagi hingga timbul uap lagi dan lakukan lagi seperti di atas sebanyak 2-3 kali (selama

16

4-5 menit). Jaga jangan sampai larutan pewarna mendidih atau mengering, tambahkan lagi larutan ZN I bila pewarna mulai berkurang / mengering. c. Dinginkan preparat. Bilas air, tetesi dengan larutan ZN II (larutan alkohol-HCl) hingga tidak ada pewarna yang terlunturkan d. Bilas secara hati-hati dengan air e. Warnai dengan pewarna tandingan (ZN III) yaitu larutan biru metilen selama 30 detik f. Bilas dengan air. Kemudian kering-udarakan atau dikeringkan dengan cara menyerap kelebihan air dengan kertas saring atau tisue. g. Amati di bawah mikroskop pada perbesaran 400x dan 1000x. Gambar bentuk sel dan reaksi pewarnaan tahan asam yang anda amati pada perbesaran 1000x.

3. Pewarnaan Spora a. Siapkan preparat olesan Bacillus subtilis yang telah difiksasi b. Tetesi dengan beberapa tetes larutan Malachite-green (SF I). Panaskan di atas api spiritus hingga timbul uap. Sisihkan dari api hingga uap hilang. Kemudian panaskan lagi hingga timbul uap lagi dan lakukan lagi seperti di atas sebanyak 2-3 kali (selama 4-5 menit). Jaga jangan sampai larutan pewarna mendidih atau mongering, tambahkan lagi larutan SF I selama pemanasan untuk mencegah pengeringan. c. Dinginkan preparat. Bilas dengan air hingga tidak ada pewarna yang terlunturkan. d. Tetesi dengan larutan fuchsin basa selama 1 menit. e. Bilas dengan air. Kemudian kering-udarakan atau dikeringkan dengan cara menyerap kelebihan air dengan kertas saring atau tisue. f. Amati di bawah mikroskop pada perbesaran 400x dan 1000x. gambar bentuk sel dan reaksi pewarnaan than asam yang anda amati pada perbesaran 1000x. g. Lakukan pengamatan juga pada preparat Escherichia coli yang telah disiapkan petugas.

17

BAB IV HASIL PENGAMATAN

Gambar Hasil pengamatan Mikroskopik Pewarnaan Zn Gambar sel-sel Staphylococus aureus 1000X

Warna sel Sel termasuk ZN

: Ungu : Negatif

Gambar Hasil pengamatan Mikroskopik Pewarnaan spora

Bacilus subtilis 1000 x Bentuk sel vegetatif : Basil

18

Warna sel Warna spora Letak spora

: merah : hijau : terminal, sentral, dan sub terminal

Escherichia coli Bentuk sel vegetatif Warna sel Warna spora Letak spora : Coco Basil : merah ::-

19

BAB V PEMBAHASAN PEWARNAAN ZN Fungsi zat warna yang digunakan dalam pewarnaan ini: 1. ZN I sebagai pewarna dasar berupa larutan karbol-fuchsin Jika setelah proses pewarnaan bakteri berwarna merah, maka bakteri tersebut termasuk dalam golongan bakteri tahan asam. Carbol fuchsin merupakan fuchsin base yang dilarutkan dalam suatu campuran (fenol -alkohol-air). 2. ZN II sebagai peluntur berupa Alkohol-HCl Digunakan untuk menguji ketahanan dinding sel terhadap suasana asam. Pada bakteri tahan asam dinding sel tidak luntur,warna sel merah. Sedangkan, pada bakteri tidak tahan asam dinding sel menjadi rusak. 3. ZN III sebagai counterstain atau pewarna tandingan berupa metilen biru Pada bakteri tahan asam warna sel tetap merah. Sedangkan, pada bakteri tidak tahan asam warna dari metilen-blue terserap masuk dan warna sel menjadi biru/ungu. Pewarnaan ZN berdasarkan pada kandungan lapisan lilin atau wax yang terdapat pada dinding sel bakteri tertentu yang ditandai dengan warna merah jika hasil positif (bakteri ZN positif). Contoh bakteri yang memberikan hasil positif adalah Mycobacterium dan Spirochaeta. Mycobacterium mempunyai kandungan lipid yang tebal (50% asam mikolat) dan bersifat impermeabel. Lapisan lilin itu sangat tebal di daerah luar dinding sel sehingga pewarnaan tidak dapat masuk ke dalam dinding sel. Oleh karena itu diperlukan pemanasan. Pemanasan akan membantu penyerapan zat warna utama (karbol fuchsin) menembus dinding selnya melalui pemberian larutan pemucat (alkohol-HCl), bakteri tahan asam tetap berwarna merah sedangkan pada bakteri tidak tahan asam zat warna utama akan luntur sehingga pada penambahan warna kedua (Methylen blue) bakteri akan menyerap zat warna tersebut (biru). Pada percobaan yang digunakan adalah Staphylococcus aureus, bakteri ini memiliki lapisan lilin yang rendah atau tidak ada pada dinding selnya sehingga memberikan hasil negatif (Bakteri ZN negatif) yang ditandai dengan warna biru-ungu. Mekanismenya adalah sebagai berikut: 1. Setelah pewarnaan ZN I menembus dinding sel yang kandungan lilinnya rendah, maka saat diberi peluntur ZN II warna merah akan keluar dari sel. Lalu dengan penambahan

20

counterstain, warna biru akan masuk sehingga tampak dalam mikroskop bakteri tersebut berwarna biru (ZN negatif) 2. Pada bakteri ZN positif akan menunjukkan warna merah karena setelah pemberian ZN I, bakteri masih mengikat warna ZN I walaupun setelah pelunturan karena mengandung lapisan lilin pada dinding selnya sehingga waktu diberi pewarna tandingan tetap memberikan warna merah.

PEWARNAAN SPORA Spora bakteri berfungsi sebagai mekanisme pertahanan dari lingkungan yang ekstrim. Bakteri yang dapat membentuk spora berasal dari bakteri Gram Positif, seperti dari genus Bacillus, Clostridium. Lokasi spora membantu identifikasi berbagai spesies bakteri. Spora tahan terhadap proses pewarnaan biasa, tetapi beberapa pewarna basa dapat dipaksa masuk ke dalam spora dengan cara pemanasan (pori-pori spora membesar sehingga zat warna dapat masuk). Sekali spora menyerap zat warna maka spora tidak mudah di dekolorisasi dilunturkan warnanya). Sedangkan zat warna dapat dengan mudah dicuci dari sel vegetatif. Karena itu, saat olesan dicuci dan diberi pewarna tandingan dengan zat warna kedua, spora akan tetap mempertahankan pewarna pertama dan sel vegetatif akan menunjukkan warna dari pewarna kedua. Fungsi zat warna yang digunakan dalam pewarnaan ini adalah: 1. SF I sebagai pewarna dasar berupa larutan malachite-green 2. SF II sebagai conterstain berupa larutan fuchsin basa. Pewarnaan spora termasuk salah satu contoh pewarnaan selektif. Spora umumnya dihasilkan oleh familia Bacillaceae. Sel bakteri akan membentuk satu spora dan dilepas ke lingkungannya setelah lepas dari sel vegetatifnya. Spora umumnya tidak terdapat pada kultur muda dan menjadi banyak pada kultur yang tua. Pembentukkan spora segera terjadi pada kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan. Spora sangat tahan panas, kekeringan, radiasi, desinfektan dan pembekuan untuk jangka waktu yang lama. Hal ini karena dinding spora lebih bersifat impermeabel dan spora mengandung sangat sedikit air, sehingga keadaan ini menyebabkan spora tidak mudah mengalami perubahan temperatur. Spora bakteri berfungsi sebagai mekanisme pertahanan dan kelangsungan hidup jenis-jenis bakteri tertentu.
21

Letak spora dalam sel: 1. Terminal, jika spora dibentuk di daerah ujung sel 2. Subterminal, jika spora dibentuk di daerah dekat ujung sel 3. Sentral, jika spora dibentuk di daerah tengah-tengah sel Larutan SF I berisi Malachite green sebagai pewarna untuk spora. Sehingga pada tahap pewarnaan ini dilakukan pemanasan supaya dapat menembus dinding spora. Larutan ini memberi warna hijau. Endospora sukar menyerap zat warna, tetapi sekali diberi zat warna, warna tersebut sulit dilunturkan. Dalam praktikum pewarnaan spora pada bakteri Bacillus subtilis setelah diberi warna safarin I ( larutan melachite green ) dilakukan pemanasan 2-3 menit yang ditujukan untuk membantu masuknya pewarna menembus kulit spora yang tebal, dengan adanya pemanasan poripori membesar , spora meregang dan zat warna dapat masuk dengan mudah. Pewarna pertama untuk spora belum tentu malachite green, bisa juga menggunakan pewarna lain, misal karbol fuksin yang berwarna merah, tapi proses tetap diikuti dengan pemanasan. Pada pewarnaan karbon fuksin, spora berwarna merah. Malachite green segera masuk ke dalam spora dan spora yang telah terpisah dari sel vegetatif akhirnya terlihat berwarna hijau pada perbesaran dengan mikroskop. Selanjutnya karena spora telah terpisah dari sel vegetatif dan berwarna oleh safranin I, maka sel vegetatif terakhir terlihat berwarna merah karena warna yang terserap adalah warna merah dari safranin II yang terakhir diberikan dan dibiarkan 1 menit, dibilas dan dikeringkan. Pembilasan dengan air akan melunturkan warna Malachite green dari sel vegetatif. Air berfungsi sebagai agen dekolorisasi sel. Larutan SF II berisi larutan fuchsin basa atau dapat juga digunakan larutan safranin. Larutan ini digunakan untuk mewarnai sel vegetatif sehingga timbul warna merah, warna ini tidak mempengaruhi warna hijau dari spora. Spora tahan proses pewarnaan biasa, tetapi beberapa pewarnaan biasa dapat dipaksa masuk ke dalam spora dengan cara pemanasan (melalui pori-pori spora zat warna dapat masuk). Sekali spora menyerap zat warna maka spora tidak mudah didekolorisasi (penghilangan warna), sedangkan zat warna dapat dengan mudah dicuci dari sel vegetatif. Karena itu saat olesan dicuci dan diberi pewarna tandingan dengan zat warna kedua, spora akan tetap mempertahankan pewarna pertama dan sel vegetatif akan menunjukkan pewarna dari pewarna kedua. Larutan pewarna dari pewarna gram tidak akan mewarnai spora dan akibatnya spora akan tampak tak

22

berwarna (transparan) dalam sitoplasma sel-sel bakteri yang diwarnai. Berikut merupakan prosedur pewarnaan endospora dengan metode Schaeffer-Fulton. Pada percobaan ini kami menemukan spora di dalam sel vegetatif, tetapi sudah terlepas dari sel vegetatif. Untuk Bacillus subtilis letak sporanya di central (di tengah-tengah) sel vegetatif, tetapi letak spora yang paling dominan berada di ujung terminal. Bakteri Bacillus subtilis memiliki sel vegetatif berwarna merah dan spora berwarna hijau, serta memiliki bentuk batang yang lebih besar daripada E.coli.

Pada E.coli tidak ditemukan adanya spora karena E.coli tidak menghasilkan spora, sehingga hanya ditemui sel vegetatif berwarna merah. Bakteri yang tidak memiliki spora bisa disebabkan beberapa faktor, seperti faktor lingkungan. Dalam lingkungan yang menguntungkan, spora bergerminasi kembali menjadi sel vegetatif. Bila lingkungan tidak menguntungkan sel vegetatif berubah menjadi spora.

23

BAB VI KESIMPULAN Pembuatan preparat untuk pewarnaan harus difikasi terlebih dulu sebelum ditetesi larutan pewarna (gram). Sebelum difikasi preparat harus benar-benar kering karena jika tidak struktur bakteri akan berubah akibat bakteri terebus bersama air steril. Pada pengamatan 1000x lensa objektif harus diberi minyak imersi terlebih dulu untuk memfokuskan cahaya. Pembuatan olesan tidak boleh terlalu tebal, karena akan membuat sel bakteri bertumpuk sehingga sukar untuk menentukan bentuk sel secara individu. Pensuspensian harus merata dan tipis supaya pengamatan bakteri mudah, terutama pada medium padat cenderung saling melekat dengan sesamanya

PEWARNAAN ZN Pewarnaan ZN disebut juga pewarnaan tahan asam ZN positif ditunjukkan dengan warna merah, sedangkan ZN negatif berwarna biru. Staphylococcus aureus memberikan ungu, yang berarti bakteri ini termasuk ke dalam ZN negatif. Sehingga dapat disimpulkan bakteri ini tidak tahan asam Pemanasan menyebabkan zat warna mudah masuk. Letak spora pada bakteri ada tiga yaitu terminal,subterminal dan sentral. Adanya spora ditunjukkan dengan warna hijau.

Ukuran dan letak endospora di dalm sel merupakan ciri-ciri yang digunakan untuk membedakan spesies-spesies bakeri yang membentuknya. Bacillus subtilis tergolong pada jenis bacillus yang dapat membentuk suatu struktur dalam sel pada tempat- tempat yang khas disebut endospora. Spora dapat diamati dengan pewarnaan spora terlihat spora berwarna hijau dan letak spora pada sel vegetatif terletak pada sentral, terminal, dan subterminal Endospora pada Bacillus dapat membuat bakteri Bacillus bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrient, tahan terhadap panas dan unsur-unsur fisik lainnya seperti pembekuan, kekeringan, radiasi ultraviolet serta terhadap bahan-bahan kimia sehingga dibutuhkan usaha yang

24

keras untuk mewarnai spora dengan pewarna khusus untuk dapat menembus endospora serta pemanasan yang cukup untuk memuaikan spora agar pewarna bisa masuk.

25

DAFTAR PUSTAKA Budiyanto, Moch. Agus Krisno. 2002. Mikrobiologi Terapan. Malang : Universitas Muhammadiyah Malang. Drs. Koes Irianto. 2006. Mikrobiologi : Menguak Dunia Organisme. Bandung : Penerbit Yrama Widya. Entjang Indan. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi. Bandung: PT. Citra Aditya Bakti. Michael,j.Pelczar,jr,E.S.C Gerard Chan, Merna Foss Pelczar 1986.Dasar-Dasar

Mikrobiologi.Jakarta:UI-Press Bonang,Enggar S.Koeswardono 1982.Mikrobiologi kedokteran:Untuk

Laboratorium dan Klinik.Jakarta:Gramedia. Hadioetomo & Ratna Siri. 1990. Mikrobiaologi Dasar dan Praktek. Jakarta: PT Gramedia. Bibiana. 1992. Mikrobiologi. Jakarta : CV. Rajawali Dwijosepotro, D. 1978. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan. Entjang, Indah. 2003. Mikrobiologi dan Patofisiologi Untuk Akademi Keperawatan dan Sekolah Tenaga Kesehatan yang Sederajat. Bandung : PT. Citra Aditya Bakti. FK Universitas Indonesia. 1993. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta : FK Universitas Indonesia. Gupte, Satish. 1982. Mikrobiologi Dasar edisi 3. Jakarta : Binarupa Aksara Staff Pengajar Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. 1993. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta : Binarupa Aksara. Waluyo, Iud. 2004. Mikrobiologi Umum. Malang : Universitas Muhammadiyah.

26