ANALISIS DALAM COPTIS CHINENSIS FRANCH DENGAN EKSTRAKSI PELARUT YANG DIPERCEPAT DIKOMBINASIKAN DENGAN ANALISIS ULTRA PERFORMANCE

LIQUID CHROMATOGRAPHY DENGAN FOTODIODA ARRAY DAN DETEKSI SPEKTROMETRI MASSA

Makalah

Disusun oleh : Kelompok VII Maulida Eka Rista Agita Raka P Yuda Anggi Pradista Putri Zakiah B (091810301031) (101810301013) (101810301025) (101810301035)

Andika Ade Kurniawan (101810301048)

JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS JEMBER 2013

BAB 1. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Pengobatan tradisional Cina (TCM) telah menarik lebih dan lebih perhatian dalam beberapa tahun terakhir karena efek terapinya yang dapat saling melengkapi dengan pengobatan barat (western medicine) serta kemampuannya dalam menangani berbagai

masalah penting yang belum terpecahkan oleh obat konvensional. Huanglian (Rhizoma Coptidis) adalah obat herbal yang sering digunakan dalam TCM, memiliki khasiat dapat menekan demam, menghilangkan toxicocis dan detoxifikasi. Akar kering dari Coptis chinensis Franch, Coptis deltoidea C.Y. Cheng et Hsiao and Coptis teeta Wall adalah sumber utama dari Huanglian. Penyusun aktif dari C. chinensis Franch adalah sejumlah alkaloid diantaranya yang utama yaitu alkaloid protoberberine dari berberin, palmatine, coptisine, dan lain-lain dan sebuah aporphinoid alkaloid dari magnoflorine. Alkaloid ini menunjukkan aktivitas antimikroba yang signifikan terhadap berbagai organisme termasuk bakteri, virus, jamur, protozoa, helminthes, dan Chlamydia serta aktivitas anti kanker yang ditunjukkan dengan sifat antineoplastiknya. Aplikasi utama dari berberine adalah untuk pengobatan diare, infeksi parasitus usus, infeksi okular trakoma dan lain-lain. Dalam Official Chinese Pharmacopoeia (edisi 2005), berberine sendiri ditetapkan sebagai spesies penanda untuk evaluasi kualitas Huanglian. Namun, kita percaya bahwa praktek kontrol kualitas untuk Huanglian harus mencakup uji dari serangkaian alkaloid utama daripada spesies tunggal. Selama beberapa dekade terakhir, beberapa metode dapat digunakan untuk penentuan alkaloid dalam ekstrak Rhizoma Coptidis diantaranya Kolorimetri, Thin Layer

Chromatography (TLC), Capilary Electrophoresis, Micellar Electrokinetic Chromatography (MEC), High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) dengan berbagai detertor yang berbeda termasuk spektrometri massa. Metode Kolorimetri hanya menentukan total kandungan alkaloid tapi nonspesifik terhadap alkaloid individu. Metode scanning Micellar Thin Layer Chromatographic telah digunakan untuk kontrol kualitas dari Rhizoma coptidis, tapi metode ini mampu menganalisis hanya tiga dari di alkaloid di atas. HPLC dengan sistem deteksi yang berbeda adalah metode yang paling banyak dipraktekkan untuk analisis alkaloid. Namun dengan metode KCKT, pemisahan alkaloid yang berbeda dalam Rhizoma Coptidis masih memiliki peluang besar untuk dikembangkan. Laporan dalam analisis spectrometri massa dari alkaloid dalam Rhizoma Coptidis telah langka, dengan hanya dua makalah yang

palmatine dan jatrorrhizine dalam ekstrak kasar C. studi perbandingan telah dibuat antara kinerja dari teknik UPLC–ESI-MS/MS and HPLC–ESI-TOF-MS. ASE umumnya beroperasi di bawah suhu tinggi. ESI-MS/MS dikombinasi dengan UPLC juga telah diterapkan untuk quantifikasi tiga alkaloid utama dan identifikasi alkaloid individu dalam ekstrak C. ASE telah ditemukan hanya terbatas pada aplikasi dalam analisis TCM. chinensis Franch. Abstrak Sebuah metode baru berdasarkan akselerasi ekstraksi pelarut (ASE) dengan analisis Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) telah dikembangkan untuk identifikasi dan kuantifikasi sebagian besar alkaloid dari ekstrak Coptis chinesis. UPLC atau UPLC-MS/MS baru diterapkan untuk analisis komposisi produk alam dan sistem metabolit dalam biologi. Dalam makalah ini. dan pada temperatur yang lebih tinggi di atas titik didih dari ekstraksi pelarut. Penggunaan ASE mengurangi waktu total ekstraksi dan meningkatkan efisiensi ekstraksi melalui manipulasi parameter seperti suhu. waktu. metode UPLC-PDA dikombinasikan dengan ekstraksi ASE telah dikembangkan untuk penentuan kuantitatif tiga alkaloid utama berberine. kepekaan dan kecepatan analisis. sistem ini menawarkan peningkatan resolusi puncak. Ketika digabungkan ke spektrometer massa tandem. Akhirnya. dan cara ekstraksi yang . meskipun teknik ini telah banyak diterapkan untuk ekstraksi bahan alam. chinensis Franch. sehingga memungkinkan penetrasi yang lebih baik dari molekul pelarut ke dalam matriks sampel. temperatur ekstraksi. chinensis Franch. telah ada minat yang besar dalam penerapan sistem UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography). sistem UPLC terdiri dari sistem deteksi dual photodioda (PDA) dan spektrometri massa dengan tandem ion positif elektrospray ionisasi dalam konfigurasi sekuen. dan lain-lain.diterbitkan baru-baru ini pada penjabaran struktural dan identifikasi dari empat alkaloid dalam Rhizoma Coptidis dengan electrospray ionization-tandem mass spectrometry.7 μm. siklus dan pelarut. Sistem ini memanfaatkan kecepatan linear tinggi dengan kolom yang dikemas dengan partikel berpori 1. waktu ekstraksi yang stabil. Baru-baru ini. Suhu tinggi meningkatkan efisiensi ekstraksi karena itu mengurangi viskositas dari pelarut. Parameter operasional dari ASE adalah pelarut ekstraksi. Terbaru. Selain itu. tetapi penerapannya pada analisis alkaloid belum dilaporkan lebih jelas. UPLC berbasis meetode fingerprinting memanfaatkan pola distribusi dari delapan alkaloid utama dalam sampel telah dikembangkan untuk evaluasi kualitas C.

Sampel juga dianalisis dengan sistem HPLC-ESI-TOF-MS untuk mengkonfirmasi hasil identifikasi. chinensis Franch.2. Preparasi Sampel . palmatine dan jatrorrhizine telah terdeteksi oleh UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS.2 Tujuan BAB 2. Tujuh sampel Huanglian dari lokasi yang berbeda dianalisis menggunakan metode yang digunakan. Amerika Serikat). chinensis Franch. Swiss). 2. Palmatine Hidroklorida dan Jatrorhizhine Hidroklorida diperoleh dari National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products of China. TINJAUAN PUSTAKA BAB 3. METODOLOGI PERCOBAAN 2. Air dimurnikan menggunakan sebuah sistem pemurnian air Milli-Q (Milipore. Hasilnya mengindikasikan bahwa dari kedua metode UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS sensitif dan dapat diandalkan untuk penentuan alkaloid dalam C. Amerika Serikat). Amonium asetat dan asam asetat didapat dari Fluka ( Buch. etanol dan lainya didapatkan dari Shanghai Chemical Factory ( Shanghai. MA. Bahan kimia lainnya seperti metanol.optimum. 1. Analisis UPLC yang digunakan adalah kolom ACQUITY UPLC BEC C18 yang dielusi oleh fase gerak asetonitril dengan larutan buffer yang terdiri dari 0. chinesis franch dibeli dari toko obat yang berbeda di daerah Qingdao. Standar dari Berberine Hidroklorida.Bedfore. China. Tiga dari delapan alkaloid utama yakni berberine. PA. Asetonitril untuk HPLC berasal dari Fisher Chemicals (Pittsburg. Fingerprint UPLC berdasarkan distribusi 8 alkaloid utama dapat menyediakan metode yang cepat dan diandalkan untuk pembuktian dan evaluasi kualitas dari obat herbal tradisional cina. China).1 Material dan Reagen Tujuh sampel C. Sebuah tandem qudropole spektrometer beroperasi dalam modus scan penuh baik dan mode MS/MS untuk multiple reaction monitoring (MRM) digunakan untuk identifikasi dan analisis kuantitatif 8 alkaloid utama pada ekstrak C.50% asam asetat dan 20 mmol/L amonium asetat.

2. Ekstraksi diulangi dengan penambahan waktu 2 kali dan ekstrak yang dihasilkan digabung.3.45 µm.2. CA. 2. Ekstraksi Refluks Pemanasan Refluks Ekstraksi dilakukan dalam kondensor dingin dan labu alas bulat 100 mL. palmatin hidroklorida dan jatrorhisin hidroklorida secara berurutan disiapkan dengan melarutkan kira-kira 10 mg setiap senyawa . Ekstraksi diulangi dengan penambahan waktu 2 kali dan ekstrak yang dihasilkan digabung. Chinensis Franch kering digiling menggunakan penumbuk dan mortar. Amerika Serikat) dilengkapi bejana baja berukuran 34 mL digunakan untuk ekstraksi cairan bertekanan. 2. 2. Sel ekstraksi ditempatkan dalam korsel dan sampel diekstraksi dalam kondisi tekanan rendah.5% HCl dalam labu alas. Chinensis Franch dihomogenasi menggunakan diatomaceous earth pada berat yang sama dan ditempatkan pada sebuah sel ekstraksi.1. Percepatan Ekstrasksi Pelarut Sebuah sistem ASE 100 (Dionex.3 mm sebelum ekstraksi. Ekstraksi Ultrasonik Ekstraksi ultrasonik dilakukan dengan menyampurkan 1 g sampel bubuk dan 35 mL larutan 80% ethanol dengan 0. Ekstrak gabungan tersebut disaring. Residu dilarutkan kembali dengan 50 metanol dan disaring dengan filter membran nilon 0. dan dievaporasi hingga kering menggunakan rotary evaporator pada suhu 50 C.2.2. Etanol 80% dengan 0. Preparasi Larutan Standar dan Kurva Kalibrasi Stok larutan standar berberin hidroklorida. Sunnyvale. dimana ditempatkan pada ultrasonik bath selama 30 menit.45 µm sebelum diinjekkan ke sistem UPLC.C.45 µm. 2. Sekitar 1 gram bubuk C. Residunya dilarutkan dalam 50 mL etanol dan disaring menggunakan filter membran nilon 0. Setelah halus serbuk tersebut diayak dengan pengayak baja 0. Satu gram sampel bubuk ditambahkan dan 35 mL pelarut ditambahkan dalam labu alas bulat. Ekstrak dievaporasi hingga kering menggunakan rotary evaporator pada suhu 50 C. Residunya dilarutkan dalam 50 mL etanol dan disaring menggunakan filter membran nilon 0.3. Suspensi diekstraksi selama 1 jam pada suhu 90 C dengan perendaman dan penyaringan.5 % HCl digunakan sebagai pelarut.

45 mg/L palmatin hidroklorida dan 0. Software yang digunakan dalam analisis ini ialah QS Software analysis. Elusi dimonitor oleh detector sinar diode. Campuran larutan standar yang terdiri dari 1. MA. Volume yang diisikan pada proses injeksi berkisar 10 µL dan pemisahan dilakukan pada 25oC dalam ruang pemanasan secara isothermal. spektro ini digunakan untuk menganalisis alkaloid dalam C .29 mg/L Berberin hidroklorida. Setiap kurva kalibrasi dibentuk oleh larutan standar dengan enam konsentrasi berbeda dalam 3 kali pengulangan. aliran gas 11 L/min. spektrometri massa di scan pertama kali dari nilai m/z 100 hingga 500 dalam mode full scan untuk menentukan informasi berat molekul alkaloid dalam C. Spektroskopi massa yang digunakan ialah G1969A TOF . 0. .Chinensis Franch. mengikuti beberapa ketentuan berikut : suhu 3300C.5% CH3COOH dengan 20mM NH4CH3COO (32:68) pada kecepatan laju alir 1. cone voltages dan energy tumbukan dioptimasi pada dua fragmentasi. Potensial kapiler di set pada 3.0 mL/min.5kV. C.2 Fase gerak mengandung pelarut A (0. MA.USA) lengkap dengan sumber ESI Z-Spray.7µm. Kondisi spektrometer massa dioptimasi untuk deteksi alkaloid. Pada 200C dan laju alir 0.1mm×50 mm). 2.2.5 High-performance liquid chromatography-electrospray ionization-time of flight mass spectrometry Analisis HPLC telah dilakukan dengan sebuah alat 1100HPLC.4 Ultra performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry Analisis dilakukan pada sistem perairan ACQUITY UPLCTM (Milford. USA). Pemisahan ini dilakukan dengan menggunakan kolom ACQUITY UPLC BEH C18 (1. 2.30 mg/L jatrorrhisin hidroklorida dipreparasi dengan cara melarutkan setiap senyawa murni (yang ditimbang secara akurat) dalam 10 ml metanol.Chinensis Franc ini dianalisis dalam multiple reaction monitoring (MRM) mode. Pada analisis rutin. Sistem UPLC digabungkan dengan Quattro premier XE tandem quadrupole mass spectrometer (Waters.5% asam asetat dan 20mmol/L NH4CH3COO) dan B (asetonitril) dengan perbandingan 80% A dan 20% B.Chinensis Franch. Milford. sebuah kolom (Alltima C18) yang dielusi secara isocratic dengan campuran biner dari Asetonitril dan 0.murni dalam 10 mL metanol. Sumber elektrospray dijalankan dalam bentuk ion positif. Larutan standar untuk kalibrasi dipreparasi dengan mengencerkan larutan standar menggunakan metanol untuk konsentrasi yang diinginkan.

maka dalam penelitian berikut digunakan asam asetat.050873 untuk kalibrasi massa untuk menghilangkan sistem bias. Agar metode pemisahan dapat kompatible dengan menggunakan ESI-MS/MS. Standar deviasi relative dari pengukuran tiga alkaloid diambil sebagai indicator untuk stabilitas system. fragmentor 100 V.6 Metode validasi UPLC Kurva kalibrasi dibangun dengan menjalankan enam campuran standar konsentrasi yang berbeda dalam triplicate.Chinensis Franch. Dalam penelitian ini menggunakan gradien elusi dan asam asetat-ammonium asetat additive. Larutan standar (reff) digunakan m/z 121. Hal tersebut menunjukkan bahwa penambahan ammonium asetat . Reprodusibilitas dari metode ditinjau dengan menjalankan enam replikasi sampel. potensial kapiler 4000V. Co-elusi epiberine. palmatine and jatrorrhizine dihitung sebagai standar deviasi relative dari enam pengulangan kerja. jatrorhizine. Tiga alkaloid dalam campuran standar dimasukkan dalam sampel dan hasil penemuan dihitung dengan perbedaan antara sampel yang dimasukkan dengan yang tidak. Penemuan alkaloid ditentukan dengan metode standar addisi. Hasil dan Pembahasan 3.5]. dan columbamine telah menjadi permasalahan umum yang telah dilaporkan dalam penelitian sebelumnya[3. 3. Optimasi UPLC-PDA-MS/kondisi MS Kondisi kromatografi telah dioptimasi menggunakan larutan standard alkaloid dan sampel real C.dan resolusi terbaik dari delapan alkaloid telah didapatkan. Namun peningkatan di puncak resolusi dan peak shape yang cukup besar dapat terpantau (diamati) setelah penambahan asam trifluoroasetat atau asam fosfat ke dalam fase gerak. dan batas quantifikasi (LOQ) diartikan sebagai sepuluh kali tingkat keramaian (Noise) dari blank sampel matriks yang bekerja. Ketepatan dari waktu retensi UPLC dan pengukuran area puncak untuk berberine. Fasa terbalik (reversed phase) UPLC dengan gradien elusi yang digunakan berdasarkan pada kondisi yang telah diberikan dalam literatur laporan. Stabilitas sampel dipantau dalam analisis sampel selama 3 hari pada interval setiap 12 jam.1. 2. Batas deteksi diartikan sebagai tiga kali tingkat keramaian (Noisy) yang diperoleh. Hubungan koefisien ditentukan menggunakan sebuah model regresi linier. Variasi pada rasio air untuk asetonitril pada fase gerak dapat meningkatkan pemisahan.tekanan gas 50 psi.

Lebih dari delapan puncak telah terdeteksi dalam 5 menit pada kromatogram UPLC-PDA dari ekstrak etanol.15. 265. (2) tetrahidroscoulerine/tetradehydrocheilanthifolinium.5% dan 20 mm amonium asetat kedalam fase gerak memberikan resolusi dan sinyal /noise rasio terbaik jika dibandingkan dengan sistem yang telah dilaporkan dalam laporan sebelumnya [3. Untuk analisis scan UPLC-MS dari sampel real C. kedelapan alkaloid dapat dihasilkan hanya dalam . ekstrak dari Coptis chinensis Franch (B). (5) Jatrorrhizine. Selain itu waktu yang berlangsung antara –waktu equlibrasi kolom sampel telah dipersingkat. spektrum massa elektrospay dari alkaloid bervariasi dengan cone volt dan tegangan energi tumbukan. yang menghasilkan resolusi kromatografi dan peningkatan rasio sinyal-to-noise.Chinensis Franch. dan 350 telah diamati dan dibandingkan hasilnya. (4)Epiberberine. Lebar puncak khas yang dihasilkan oleh sistem UPLC berada di urutan 5 hingga 10 s. Noise terendah untuk barberin telah diamati dengan menggunakan panjang gelombang 350 nm. palmatine dan jatrorrhizine standar (A). (7) Palmatine.sangat mempengaruhi pemisahan dari jatrorhizine dan columbamine. Penggunaan metode UPLC-PDA menghasilkan peningkatan kapasitas puncak yang signifikan. dan oleh sebab itu panjang gelombang tersebut digunakan untuk semua percobaan selanjutnya. (8) berberine.17]. (1) magnoflorine. Gambar 2 menunjukkan bahwa kedelapan senyawa alkaloid telah dipisahkan dengan baik dibawah kondisi optimal. Juga supaya optimasi kondisi deteksi UPLC.PDA tiga panjang gelombang yang berbeda yakni pada panjang gelombang 230. Gambar 2. Dalam spektroskopi massa tandem. terutama untuk jatrrorhizine dan columbanie. (6)Coptisine. Keterangan Kromatogram UPLC-PDA berberine.(3) Columbamine. Metode ini lebih kompatible dengan menggunakan ESI/MS dan meningkatkan pemisahan alkaloid. Penambahan asam asetat 0.

Pemantauan beberapa reaksi sering digunakan untuk kuantifikasi pada MS quadrupole tandem. Energi tumbukan dan cone volt digunakan untuk akuisisi yang dievaluasi untuk respon terbaik dibawah modus positif ESI dengan menambahkan larutan standar berberin dan palmatin. palmatine dan jatrorrhizine . Dalam spektroskopi massa tandem. Gambar 3. sementara energi tumbukan telah disetel untuk ion prekursor yang lebih sensitif dan produk ion stabil di kedua modus scan massal. Keterangan: UPLC-ESI-MS/MS kromatogram total arus ion pada ekstrak Coptis chinensis Franch dan MRM UPLC-MS/MS kromatogram dari berberine. Dalam penelitian ini energi tumbukan yang berbeda ditentukan melalui percobaan optimasi yang telah diterapkan kepada kedelapan alkaloid. cone volt selalu disetel untuk menghasilkan respon terkuat .muatan ion tunggal [M+] dengan mild cone volt.

36 faktor D. Optimasi kondisi ekstraksi dengan desain ortogonal Percobaan ortogonal dilakukan dalam rangka mengoptimalkan kondisi ekstraksi. Faktor eksperimental.87 dari faktor A. 3. dan tingkat ketiga adlah faktor C tingkat kedua faktor D merupakan kondisi terbaik.4. Tingkat ketiga faktor A memiliki nilai rata-rata sebesar (k3 adalah 8. Jangkauan terbesar dari tiga faktor adalah 0.73)dibandingkan dengan dua tingkat lainnya. Hal ini menunjukkan bahwa tingkat ketiga adalah kondisi terbaik dari faktor A dengan analogi tingkat kedua Faktor B.Keterangan tabel (1) total ion kromatogram dan kromatogram MRM dari sampel C. dan untuk kondisi optimum ekstraksi ditetapkan sebagai berikut: 1 gram bubuk sampel kering di ekstrak dengan . tingkat yang sesuai dengan desain ortogonal L9 (34) ditunjukkan pada tabel 5.2.Chinensis Franch. Adapun empat faktor yang terlibat dalam proses ini adalah : (A) temperatur ekstraksi (B) waktu ekstraksi (C) Ekstraksi pelarut (D) jumlah sampel. Ini berarti bahwa faktor A adalah faktor utama dalam kondisi ekstraksi alkaloid di C. sedangkan terkecil adalah 0.chinensis Franch yang ditunjukkan pada gambar 3.

270280. suhu ekstraksi 130 ◦C dan waktu ekstraksi selama 10 menit. dan MS ion molekul dll. Daftar tabel berisis waktu retensi (Rt). Proses pengurangan struktur dari data MS/MS puncak 1. Untuk mengevaluai pengulangan dari prosedur ekstraksi. Keterangan tersebut memberikan informasi struktur lebih lanjut untuk identifikasi. Spektrum UV pada puncak 1 menunjukkan tiga pita serapan kuat pada 225-235. Franch. dan 5 diperlihatkan di bawah. Pengaruh dari waktu ekstraksi ditentukan dengan tiga kali ekstraksi secara berturutturut pada sampel yang sama. Sifat pemecahan ion dari semua alkaloid diperoleh dengan analisis MS2 yang tertera pada Tabel 2. 260-270. 3. Dalam hal ini untuk memperkuat unsur pokok dan penyelidikan pola pemisahan.50 % HCl). dan 335-355. . semua spektrum menunjukkan serapan alkaloid protoberberine yang khas pada 225-245.etanol 80 5 ( dengan 0. Hasil yang diperoleh untuk semua senyawa target berada dalam 3. dan 315-335. Pada deteksi menggunakan photodiode. Pemeriksaan dari spektra UV dan data MS memungkinkan identifikasi sementara dari 8 komponen yang disusun pada Tabel 2. dua kali ekstraksi sudah cukup untuk mengekstrak komponen target sepenuhnya dari Chinensis C. Pada jurnal ini. 2. collision-induced dissociation (CID) MS/MS spectrum akan terekam. yang mencirikan jenis alkaloid aporphinoid. dilakukan serangkaian pengulangan sebanyak enam kali yang telah dilakukan pada hari yang sama dan hari yang berbeda.2 identifikasi alkaloid pada ekstrak sampel menggunakan UPLC-PDA-ESI-MS Electrospray ionization-mass spectrometry (ESI-MS) adalah teknik ionisasi yag menghasilkan puncak molekul ion yang menonjol tepat di bawah arus. kedelapan alkaloid tersebut menghasilkan ion [M]+ dalam jenis ion positif. seperti yang terlihat pada tabel 6. panjang gelombang serapan maksimum (). panjang gelombang serapan maksimum dari puncak target akan teridentifikasi berdasarkan pada perbandingan dari informasi online UV dan MS dengan data literature atau standar. Untuk puncak 2-8.

ion yang dominan muncul pada m/z 307. sementara ion dengan m/z 250. Puncak 2 dan puncak 5 dengan waktu retensi berturut-turut 3.2 [M-15]+. puncak 1 diidentifikasi sebagai Magnoflorin dengan karakteristik pola fragmentasi tersebut.2 ([M- .8 ([M--CH4--NHCH2-CH3]+). radikal hidrogen.5 ([M]+).2 ([M-CH3-CH3]+). Tidak ada laporan mengenai identifikasi berberrubine menggunakan ESIMS.8 dan 250.45 menit (Gambar 2b) memiliki massa molekul yang sama berdasarkan pada analisi MS. Fragmen ion yang teramati 322. dan 250. 279.2 yang sesuai dengan penghapusan metil radikal diikuti dengan hilangnya fragmen netral dengan massa molekul 28 Da (CO) dari ion molekular (m/z 322). sesuai dengan struktur alkaloid aporphinoid. Ion dengan m/z 277. Dengan menggabungkan hasil spektrum serapan UV dan karakterisasi pola fragmentasi MS dengan hasil lain pada referensi. Ion dominan muncul pada m/z 307. Dengan perbandingan menggunakan data literatur dan massa molekul yang alkaloid yang diketahui dalam Coptidis Rhizoma. Pada spektra MS2.8. Pada percobaan MS2.19 dan 3. Dua senyawa tersebut memiliki struktur isomer yang mirip dengan komposisi penyusun yang sama. 281.2 [M-15-29-28]+. Selanjutnya.2 dihasilkan oleh hilagnya fragmen netral CO yang lain dari ion m/z 277.8 dihasilkan oleh hilangnya radikal metil.0 ([M--CH4--NHCH2--CH3--OH--CO]+) teramati. ions 342. puncak tersebut diidentifikasi sebagai Magnoflorin.2. Oleh karena itu.2 [M-1528]+. Sifat fragmentasi ion dari dua puncak dalam analisis yang MS2 tercantum pada Tabel 2 sangat mirip. Berat molekul pada puncak 2 adalah 322 dan hal itu bisa diidentifikasi sementara sebagai berberrubine. 265. 294.2 dan 279.1 ([M--CH4--NHCH2]+). puncak 2 sementara dapat diidentifikasi sebagai tetradehydroscoulerine or tetradehydro- cheilanthifolinium. tetradehydroscoulerine or tetradehydrocheilanthifolinium berdasarkan pada hasil literatur. dan fragmen netral CO dengan massa molekul 44 Dadari ion molekular (m/z 322). 237.8 [M-15-29]+. 308.0 ([M--CH4--NHCH2--CH3--OH]+. dua ion fragmen menarik terlihat pada m/z 277.Puncak 1 dapat diamati pada Gambar 2 dan massa yang terdeteksi adalah 342. 277. 297.2 ([M-CH3-H]+).

Tipe kromatogram massa (Total Ion Chromatography (TIC))dari ekstraksi Rhizoma Coptidis dengan HPLC-ESI-TOF-MS yang ditunjukkan dalam gambar berikut : Ionisasi permukaan electrospray dalam positif mode juga digunakan dan dari semua sample menunjukkan kelimpahan ion [M+] seperti dalam table berikut : . Selain itu system UPLC memerlukan pelarut yang sedikit karena digunakan dalam laju aliran yang lebih kecil (0. Akhirnya puncak 5 dengan tegas teridentifikasi sebagai Jatrorrhizine dengan menggabungkan waktu retensi dengan Jatrorrhizine standar.3 Perbandingan dengan LC-DAD-ESI-TOF-MS Perbandingan pembelajaran dihasilkan antara teknik HPLC dengan UPLC.6 mm) dan waktu total 20 menit. Pemisahan HPLC isocratic membutukan sebuah kolom (250 mm x 4. and 279.2 mL/menit). 3.7 ([M-CH3-CH3-CO]+). Sampel dijalankan oleh HPLC-ESI-TOF-MS untuk mengidentifikasi spesies tujuan. dan puncak 3 teridentifikasi sebagai Columbamine. Sebaliknya UPLC menghasilkan perbandingan puncak pemisahan tetapi membutuhkan waktu kerja hanya 5 menit. Dua puncak teridentifikasi sebagai Columbamine dan Jatrorrhizine.CH3-H-CO]+).

. yakni menggunakan total hasil ekstraksi dan rasio relatif ekstraksi berberin. terlebih lagi distribusi massa isotropic secara teori cocok dengan pengukuran oleh TOF-MS pada kedua intensitas dan posisi m/z yang ditunjukkan dalam gambar (B) : Dengan mengkombinasikan informasi tersebut dengan Double Bond Equivalent (DBE).Kesalahan keakuratan pengukuran masa kurang dari 2 ppm dalam semua kasus. 3. Dibandingkan dengan perlakuan lainyang mungkin . analit dapat diidentifikasi dengan jelas sebagai berberin. H. Analisis Berberin dan homologinya. temperatur. Dengan demikian keakuratan pengukuran massa memungkinkan untuk puncak komposisi unsur. O.1. unsur C. selain pengukuran massa. C20H18NO4 memiliki massa error yang lebih sedikit. waktu ekstraksi statis. distribusi massa isotropic juga menginformasikan tentang komposisi unsur. Parameter tersebut dapat dioptimasi dengan pendekatan univariate . Kedelapan senyawa yang dideteksi dan diidentifikasi secara sukses dengan UPLC–ESIMS/MS begitu pula dengan HPLC–ESI-MS/MS. volume pembilasan dan siklus ekstraksi adalah parameter yang penting untuk mengontrol hasil ekstraksi. Pengembangan Metode Ekstraksi Kondisi ekstraksi seperti pelarut ekstraksi. palmatin dan jathorisin sebagai indikator hasil. N dipilih sebagai unsur yang memungkinkan. Pada analisis TOF-MS. ambang batas akurasi yang diterima secara luas untuk konfirmasi komposisi unsur adalah 5 ppm.4.

Masalah dapat diatasi dengan menggunakan rasio pengurangan air dalam sistem pelarut.50% HCl) sebagai pelarut dengan 10 menit untuk waktu statis ekstraksi.50% HCl) dan 60% metanol (v/v) terlarut (dengan 0. 10 menit untuk waktu statis ekstraksi. Sejak temperatur sangat berpengaruh pada efisiensi ekstraksi. palmatin dan jathorisin yang diekstrak dalam 60% (v/v) etanol terlarut (dengan 0. 60% volume pembilasan dengan dua siklus ekstraksi. metanol terlarut dan etanol terlarut adalah yang pertama kali ditaksir. Saat 60% (v/v) etanol terlarut (dengan 0.50% HCl) adalah yang tertinggi diikuti dengan penurunan tingkatan yakni 80% etanol (v/v) terlarut (dengan 0.Efisiensi ekstraksi dari tiga pelarut yakni metanol. ditemukan hambatan dalam sistem ASE. Sistem dari enam komposisi pelarut dibandingkan dalam Table 4 : Jumlah relatif dari berberin.. 80% etanol terlarut (dengan 0.g.5% HCl). Salah satu problem yang ditemukan dalam ASE adalah material yang berupa tanaman mempunyai kecenderungan dalam menyerap air selama perlakuan ekstraksi. Kondisi ASE yang digunakan antara lain : 100 C untuk temperatur ekstraksi. rangkaian eksperimen pada temperatur yang berbeda (70-170 C) ditunjukkan untuk menentukan temperatur ekstraksi yang paling baik. Eksperimen ekstraksi dilakukan menggunakan 80% etanol terlarut (dengan 0. . e.50% HCl). Hasil ditunjukkan dengan Gambar 6. 60% volume pembilasan dengan dua siklus ekstraksi.50% HCl) digunakan sebagai pelarut ekstraksi.

7.130 C ditentukan sebagai temperatur ekstraksi. Penurunan yang terjadi pada efisiensi ekstrasi kemungkinan berkaitan dengan degradasi dari ketiga senyawa tersebut pada saat temperatur diatas 130 C. 13. Dengan demikian . 15 menit ) ditunjukkan dengan mengikuti kondisi ASE : 130 C untuk temperatur ekstraksi. 60% untuk volume pembilasan dengan dua siklus ekstraksi. Chinensis Franch. Hasilnya ditunjukkan pada Gambar 7. 10. Untuk menentukan jika waktu statis ekstraksi dapat mempengaruhi efisiensi ekstraksi alkaloid dalam C.Efisiensi ekstraksi dari semua tiga alkaloid utama tetap konstan hingga suhu 130 C dan menurun pada temperatur yang lebih tinggi. perbedaan waktu ekstraksi ( 5. .

Jadi waktu statis ekstraksi yang digunakan adalah 10 menit dalam satu kali siklus ekstraksi. Linearitas dan Limit Deteksi Hasil studi kalibrasi. Setiap deteksi batas dari teknik UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS adalah dalam rentang 60–75 and 1.Kenaikan waktu statis ekstrasi dari 7 hingga 10 menit tidak mempengaruhi ekstraksi senyawa target.9984. efisisensi ekstraksi dari ketiga alkaloid utama menurun secara signifikan. 3.1. Saat waktu statis ekstrasi diatas 10 menit.5. LOQs dan LODs diperoleh dengan UPLC-MS/MS lebih kecil .5 Validasi dari UPLC-PDA-MS/MS 3. volume pembilasan yang dipakai adalah 60%. palmatine dan jatrorrizine dirangkum dalam tabel 8. LOQs dan LODs dengan UPLC-PDA-MS/MS untuk 3 alkaloid dari berberine. 40. Chinensis Franch.5 μgL-1 untuk 3 alkaloid yang lebih baik daripada yang dilaporkan menggunakan HPCE-UV. Rentang dinamis linear kurva kalibrasi untuk kedua penentuan UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS melebihi dua order besaran. 80% ) tidak memberikan pengaruh yang signifikan terhadap efisiensi ekstrasi senyawa target dalam C. Volume pembilasan ( 20. 60.2–1. Kedua prosedur memungkinkan kuantitasi dalam studi kisaran mempelajari meskipun batas kuantifikasi untuk UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS dibedakan. Linearitas dari kurva kalibrasi telah diverifikasi dengan studi korelasi dan koefisien korelasi adalah semua lebih baik dari 0. Jadi.

0 %.S.D dari ketiga alkaloid dari 3 injeksi replikasi adalah lebih baik dari 5. Rentang dinamis linear dari quantitasi dua teknik juga berbeda.3.2.68 % untuk analisis MS/MS (tabel 9). 3. dan Stabilitas Presisi masing-masing daerah puncak pengukuran PDA dan MS/MS yang ditemukan lebik baik dari 1. MS/MS lebih cocok untuk penentuan alkaloid pada rentang konsentrasi rendah karena sensitivitasnya lebih dari 50 kali lipat.dengan UPLC-PDA untuk 3 alkaloid.94-3.0% dan nilai R.11 % (n=6) untuk penentuan MS/MS.5.S. Stabilitas penyimpanan (R.D) dari pengukurang tiga alkaloid adalah 2. Tabel 9 menunjukkan bahwa metode UPLC dengan masing-masing PDA (350 nm) dan deteksi MS/MS menunjukkan presisi yang baik untuk ketiga alkaloid tetapi presisi yang pertama tinggi..72 % untuk PDA dan 3.14 % dari enam injeksi replikasi. Hasil ringkasan dalam tabel 10.5. .D.58-2.47-3. Variasi dari waktu retensi dari semua puncak adalah kurang dari 0.D) dari metoda yang diusulkan berdasarkan enam suntikan replikasi.S. menunjukkan metode recovery dan presisi yang baik. Perolehan kembali berada dalam rentang 94. n=6) dan waktu retensi lebih baik dari 0.63 % (R.S. Reprodusibilitas.52 % (n=6) untuk analisis PDA dan 2. Presisi (R.2-103.11 % dari semua alkaloid target. Presisi. Recovery Perolehan kembali dari tiga alkaloid ditentukan dengan UPLC-MS/MS menggunakan metode standart tambahan dimana tiga level analisis dari sampel yang berduri (tajam) dilakukan dalam hari yang sama. 3. berada di kisaran dari 2.18-2.

konsisten dengan laporan sebelumnya. Kuantifikasi MS dari alkaloid Eningkatan metode UPLC-MS/MS diaplikasikan untuk penentuan tiga alkaloid dalam sampel C. Chinensis Franch yang berbeda. penyimpanan dan pemrosesan dari ramuan. panen. Hasil kita menunjukkan bahwa kandungan dari tiga alkaloid utama dalam tujuh sampel C.3. Chinensis Franch terasa berbeda. Chinensis Franch. berberin adalah alkaloid yang paling melimpah dalam C.4. Masing-masing sampel diekstraksi dan dianalisis tiga rangkap. Chinensis Franch ini ditunjukkan pada gambar 2 dan hasil dari alkaloid individu dirangkum dalam tabel 11. Kromatogram yang mewakili dari ekstrak C. . Di antara tiga alkaloid. budidaya.5. Variasi bisa terjadi karena berbagai faktor seperti sumber geografis.

Penilaian kualitas obat – obatan herbal selalu menjadi tantangan karena keragaman multi komponen matriks. Pada Gambar berikut diungkapkan bahwa distribusi dari kedelapan puncak alkaloid adalah mirip disekitar sample tersebut . tetapi variasi besar dari puncak intensitas relative tampak jelas.6 Fingerprint analysis of representative C. Dengan demikian pola distribusi dari kedelapan alkaloid diharapkan menjadi representasi yang lebih baik dari keseluruhan bioaktivitas dari C. karena Fingerprint UPLC dari kedelapan senyawa alkaloid dihasilkan untuk pembuktian atau tujuan control kualitas. chinensis Franch samples using UPLC Alkaloid – alkaloid yang berbeda diketahui memiliki perbedaan bioaktivitas yang luas.3. Metode kromatografi fingerprint menjadi salah satu yang sering diterapkan. . Tidak hanya menyediakan profil senyawa yang ditandai tetapi juga komponen aktif lainnya. Jika dibandingkan waktu kerja dari UPLC memiliki waktu yang Sembilan kali lebih cepat dibandingkan dengan HPLC (7 menit : 60 menit).Cjininsis Franch.

.Hasil yang diperoleh dalam tulisan ini dan dua referensi lain menunjukkan bahwa UPLC merupakan alat yang sangat berguna dalam aplikasi kromatografi fingerprint.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful