ANALISIS DALAM COPTIS CHINENSIS FRANCH DENGAN EKSTRAKSI PELARUT YANG DIPERCEPAT DIKOMBINASIKAN DENGAN ANALISIS ULTRA PERFORMANCE

LIQUID CHROMATOGRAPHY DENGAN FOTODIODA ARRAY DAN DETEKSI SPEKTROMETRI MASSA

Makalah

Disusun oleh : Kelompok VII Maulida Eka Rista Agita Raka P Yuda Anggi Pradista Putri Zakiah B (091810301031) (101810301013) (101810301025) (101810301035)

Andika Ade Kurniawan (101810301048)

JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS JEMBER 2013

BAB 1. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Pengobatan tradisional Cina (TCM) telah menarik lebih dan lebih perhatian dalam beberapa tahun terakhir karena efek terapinya yang dapat saling melengkapi dengan pengobatan barat (western medicine) serta kemampuannya dalam menangani berbagai

masalah penting yang belum terpecahkan oleh obat konvensional. Huanglian (Rhizoma Coptidis) adalah obat herbal yang sering digunakan dalam TCM, memiliki khasiat dapat menekan demam, menghilangkan toxicocis dan detoxifikasi. Akar kering dari Coptis chinensis Franch, Coptis deltoidea C.Y. Cheng et Hsiao and Coptis teeta Wall adalah sumber utama dari Huanglian. Penyusun aktif dari C. chinensis Franch adalah sejumlah alkaloid diantaranya yang utama yaitu alkaloid protoberberine dari berberin, palmatine, coptisine, dan lain-lain dan sebuah aporphinoid alkaloid dari magnoflorine. Alkaloid ini menunjukkan aktivitas antimikroba yang signifikan terhadap berbagai organisme termasuk bakteri, virus, jamur, protozoa, helminthes, dan Chlamydia serta aktivitas anti kanker yang ditunjukkan dengan sifat antineoplastiknya. Aplikasi utama dari berberine adalah untuk pengobatan diare, infeksi parasitus usus, infeksi okular trakoma dan lain-lain. Dalam Official Chinese Pharmacopoeia (edisi 2005), berberine sendiri ditetapkan sebagai spesies penanda untuk evaluasi kualitas Huanglian. Namun, kita percaya bahwa praktek kontrol kualitas untuk Huanglian harus mencakup uji dari serangkaian alkaloid utama daripada spesies tunggal. Selama beberapa dekade terakhir, beberapa metode dapat digunakan untuk penentuan alkaloid dalam ekstrak Rhizoma Coptidis diantaranya Kolorimetri, Thin Layer

Chromatography (TLC), Capilary Electrophoresis, Micellar Electrokinetic Chromatography (MEC), High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) dengan berbagai detertor yang berbeda termasuk spektrometri massa. Metode Kolorimetri hanya menentukan total kandungan alkaloid tapi nonspesifik terhadap alkaloid individu. Metode scanning Micellar Thin Layer Chromatographic telah digunakan untuk kontrol kualitas dari Rhizoma coptidis, tapi metode ini mampu menganalisis hanya tiga dari di alkaloid di atas. HPLC dengan sistem deteksi yang berbeda adalah metode yang paling banyak dipraktekkan untuk analisis alkaloid. Namun dengan metode KCKT, pemisahan alkaloid yang berbeda dalam Rhizoma Coptidis masih memiliki peluang besar untuk dikembangkan. Laporan dalam analisis spectrometri massa dari alkaloid dalam Rhizoma Coptidis telah langka, dengan hanya dua makalah yang

7 μm. chinensis Franch. metode UPLC-PDA dikombinasikan dengan ekstraksi ASE telah dikembangkan untuk penentuan kuantitatif tiga alkaloid utama berberine. Akhirnya. Parameter operasional dari ASE adalah pelarut ekstraksi. Dalam makalah ini. UPLC berbasis meetode fingerprinting memanfaatkan pola distribusi dari delapan alkaloid utama dalam sampel telah dikembangkan untuk evaluasi kualitas C. Suhu tinggi meningkatkan efisiensi ekstraksi karena itu mengurangi viskositas dari pelarut. waktu. Abstrak Sebuah metode baru berdasarkan akselerasi ekstraksi pelarut (ASE) dengan analisis Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) telah dikembangkan untuk identifikasi dan kuantifikasi sebagian besar alkaloid dari ekstrak Coptis chinesis.diterbitkan baru-baru ini pada penjabaran struktural dan identifikasi dari empat alkaloid dalam Rhizoma Coptidis dengan electrospray ionization-tandem mass spectrometry. siklus dan pelarut. chinensis Franch. ESI-MS/MS dikombinasi dengan UPLC juga telah diterapkan untuk quantifikasi tiga alkaloid utama dan identifikasi alkaloid individu dalam ekstrak C. palmatine dan jatrorrhizine dalam ekstrak kasar C. Terbaru. Baru-baru ini. sistem UPLC terdiri dari sistem deteksi dual photodioda (PDA) dan spektrometri massa dengan tandem ion positif elektrospray ionisasi dalam konfigurasi sekuen. Selain itu. tetapi penerapannya pada analisis alkaloid belum dilaporkan lebih jelas. dan cara ekstraksi yang . Sistem ini memanfaatkan kecepatan linear tinggi dengan kolom yang dikemas dengan partikel berpori 1. sehingga memungkinkan penetrasi yang lebih baik dari molekul pelarut ke dalam matriks sampel. meskipun teknik ini telah banyak diterapkan untuk ekstraksi bahan alam. kepekaan dan kecepatan analisis. Ketika digabungkan ke spektrometer massa tandem. temperatur ekstraksi. dan pada temperatur yang lebih tinggi di atas titik didih dari ekstraksi pelarut. ASE umumnya beroperasi di bawah suhu tinggi. dan lain-lain. UPLC atau UPLC-MS/MS baru diterapkan untuk analisis komposisi produk alam dan sistem metabolit dalam biologi. telah ada minat yang besar dalam penerapan sistem UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography). studi perbandingan telah dibuat antara kinerja dari teknik UPLC–ESI-MS/MS and HPLC–ESI-TOF-MS. chinensis Franch. ASE telah ditemukan hanya terbatas pada aplikasi dalam analisis TCM. Penggunaan ASE mengurangi waktu total ekstraksi dan meningkatkan efisiensi ekstraksi melalui manipulasi parameter seperti suhu. sistem ini menawarkan peningkatan resolusi puncak. waktu ekstraksi yang stabil.

1 Material dan Reagen Tujuh sampel C. TINJAUAN PUSTAKA BAB 3. etanol dan lainya didapatkan dari Shanghai Chemical Factory ( Shanghai.Bedfore. Standar dari Berberine Hidroklorida. chinesis franch dibeli dari toko obat yang berbeda di daerah Qingdao.50% asam asetat dan 20 mmol/L amonium asetat. 2. chinensis Franch. palmatine dan jatrorrhizine telah terdeteksi oleh UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS. Tujuh sampel Huanglian dari lokasi yang berbeda dianalisis menggunakan metode yang digunakan. Asetonitril untuk HPLC berasal dari Fisher Chemicals (Pittsburg. MA. Analisis UPLC yang digunakan adalah kolom ACQUITY UPLC BEC C18 yang dielusi oleh fase gerak asetonitril dengan larutan buffer yang terdiri dari 0. Fingerprint UPLC berdasarkan distribusi 8 alkaloid utama dapat menyediakan metode yang cepat dan diandalkan untuk pembuktian dan evaluasi kualitas dari obat herbal tradisional cina. Hasilnya mengindikasikan bahwa dari kedua metode UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS sensitif dan dapat diandalkan untuk penentuan alkaloid dalam C. chinensis Franch.2.optimum. Bahan kimia lainnya seperti metanol. Air dimurnikan menggunakan sebuah sistem pemurnian air Milli-Q (Milipore. Amonium asetat dan asam asetat didapat dari Fluka ( Buch. Tiga dari delapan alkaloid utama yakni berberine. Amerika Serikat). 1.2 Tujuan BAB 2. PA. China. Palmatine Hidroklorida dan Jatrorhizhine Hidroklorida diperoleh dari National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products of China. Amerika Serikat). METODOLOGI PERCOBAAN 2. Sebuah tandem qudropole spektrometer beroperasi dalam modus scan penuh baik dan mode MS/MS untuk multiple reaction monitoring (MRM) digunakan untuk identifikasi dan analisis kuantitatif 8 alkaloid utama pada ekstrak C. Preparasi Sampel . Sampel juga dianalisis dengan sistem HPLC-ESI-TOF-MS untuk mengkonfirmasi hasil identifikasi. Swiss). China).

2. Satu gram sampel bubuk ditambahkan dan 35 mL pelarut ditambahkan dalam labu alas bulat. Amerika Serikat) dilengkapi bejana baja berukuran 34 mL digunakan untuk ekstraksi cairan bertekanan.C. CA.45 µm.3.45 µm sebelum diinjekkan ke sistem UPLC. Chinensis Franch dihomogenasi menggunakan diatomaceous earth pada berat yang sama dan ditempatkan pada sebuah sel ekstraksi.2. palmatin hidroklorida dan jatrorhisin hidroklorida secara berurutan disiapkan dengan melarutkan kira-kira 10 mg setiap senyawa .2.5% HCl dalam labu alas. Chinensis Franch kering digiling menggunakan penumbuk dan mortar. Ekstrak gabungan tersebut disaring. Residunya dilarutkan dalam 50 mL etanol dan disaring menggunakan filter membran nilon 0. Percepatan Ekstrasksi Pelarut Sebuah sistem ASE 100 (Dionex. Ekstraksi diulangi dengan penambahan waktu 2 kali dan ekstrak yang dihasilkan digabung. Residu dilarutkan kembali dengan 50 metanol dan disaring dengan filter membran nilon 0. Suspensi diekstraksi selama 1 jam pada suhu 90 C dengan perendaman dan penyaringan. Setelah halus serbuk tersebut diayak dengan pengayak baja 0. Preparasi Larutan Standar dan Kurva Kalibrasi Stok larutan standar berberin hidroklorida. 2. Sekitar 1 gram bubuk C. Sel ekstraksi ditempatkan dalam korsel dan sampel diekstraksi dalam kondisi tekanan rendah. Ekstrak dievaporasi hingga kering menggunakan rotary evaporator pada suhu 50 C. 2. Ekstraksi Ultrasonik Ekstraksi ultrasonik dilakukan dengan menyampurkan 1 g sampel bubuk dan 35 mL larutan 80% ethanol dengan 0.3. Etanol 80% dengan 0.1.45 µm. dan dievaporasi hingga kering menggunakan rotary evaporator pada suhu 50 C.2.3 mm sebelum ekstraksi. dimana ditempatkan pada ultrasonik bath selama 30 menit. Residunya dilarutkan dalam 50 mL etanol dan disaring menggunakan filter membran nilon 0.5 % HCl digunakan sebagai pelarut. 2. 2. Ekstraksi diulangi dengan penambahan waktu 2 kali dan ekstrak yang dihasilkan digabung. Sunnyvale. Ekstraksi Refluks Pemanasan Refluks Ekstraksi dilakukan dalam kondensor dingin dan labu alas bulat 100 mL.

5kV. aliran gas 11 L/min.Chinensis Franch. Pada analisis rutin.4 Ultra performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry Analisis dilakukan pada sistem perairan ACQUITY UPLCTM (Milford. USA). . Pemisahan ini dilakukan dengan menggunakan kolom ACQUITY UPLC BEH C18 (1. Pada 200C dan laju alir 0.45 mg/L palmatin hidroklorida dan 0. spektro ini digunakan untuk menganalisis alkaloid dalam C . 2. Sumber elektrospray dijalankan dalam bentuk ion positif.0 mL/min.murni dalam 10 mL metanol. spektrometri massa di scan pertama kali dari nilai m/z 100 hingga 500 dalam mode full scan untuk menentukan informasi berat molekul alkaloid dalam C. Elusi dimonitor oleh detector sinar diode.Chinensis Franc ini dianalisis dalam multiple reaction monitoring (MRM) mode. mengikuti beberapa ketentuan berikut : suhu 3300C. Milford. 2. Campuran larutan standar yang terdiri dari 1. Sistem UPLC digabungkan dengan Quattro premier XE tandem quadrupole mass spectrometer (Waters. Spektroskopi massa yang digunakan ialah G1969A TOF . MA.7µm.30 mg/L jatrorrhisin hidroklorida dipreparasi dengan cara melarutkan setiap senyawa murni (yang ditimbang secara akurat) dalam 10 ml metanol. Kondisi spektrometer massa dioptimasi untuk deteksi alkaloid.2 Fase gerak mengandung pelarut A (0. sebuah kolom (Alltima C18) yang dielusi secara isocratic dengan campuran biner dari Asetonitril dan 0.5% asam asetat dan 20mmol/L NH4CH3COO) dan B (asetonitril) dengan perbandingan 80% A dan 20% B.29 mg/L Berberin hidroklorida.Chinensis Franch. Volume yang diisikan pada proses injeksi berkisar 10 µL dan pemisahan dilakukan pada 25oC dalam ruang pemanasan secara isothermal. Larutan standar untuk kalibrasi dipreparasi dengan mengencerkan larutan standar menggunakan metanol untuk konsentrasi yang diinginkan.1mm×50 mm). Setiap kurva kalibrasi dibentuk oleh larutan standar dengan enam konsentrasi berbeda dalam 3 kali pengulangan. cone voltages dan energy tumbukan dioptimasi pada dua fragmentasi. MA. C. Software yang digunakan dalam analisis ini ialah QS Software analysis.2. 0.USA) lengkap dengan sumber ESI Z-Spray. Potensial kapiler di set pada 3.5% CH3COOH dengan 20mM NH4CH3COO (32:68) pada kecepatan laju alir 1.5 High-performance liquid chromatography-electrospray ionization-time of flight mass spectrometry Analisis HPLC telah dilakukan dengan sebuah alat 1100HPLC.

Fasa terbalik (reversed phase) UPLC dengan gradien elusi yang digunakan berdasarkan pada kondisi yang telah diberikan dalam literatur laporan. palmatine and jatrorrhizine dihitung sebagai standar deviasi relative dari enam pengulangan kerja. Variasi pada rasio air untuk asetonitril pada fase gerak dapat meningkatkan pemisahan. Namun peningkatan di puncak resolusi dan peak shape yang cukup besar dapat terpantau (diamati) setelah penambahan asam trifluoroasetat atau asam fosfat ke dalam fase gerak. Hal tersebut menunjukkan bahwa penambahan ammonium asetat . Batas deteksi diartikan sebagai tiga kali tingkat keramaian (Noisy) yang diperoleh.6 Metode validasi UPLC Kurva kalibrasi dibangun dengan menjalankan enam campuran standar konsentrasi yang berbeda dalam triplicate. Hasil dan Pembahasan 3. Optimasi UPLC-PDA-MS/kondisi MS Kondisi kromatografi telah dioptimasi menggunakan larutan standard alkaloid dan sampel real C. Ketepatan dari waktu retensi UPLC dan pengukuran area puncak untuk berberine. fragmentor 100 V. Larutan standar (reff) digunakan m/z 121.050873 untuk kalibrasi massa untuk menghilangkan sistem bias. 3.dan resolusi terbaik dari delapan alkaloid telah didapatkan.1. Tiga alkaloid dalam campuran standar dimasukkan dalam sampel dan hasil penemuan dihitung dengan perbedaan antara sampel yang dimasukkan dengan yang tidak. Reprodusibilitas dari metode ditinjau dengan menjalankan enam replikasi sampel. Penemuan alkaloid ditentukan dengan metode standar addisi. Stabilitas sampel dipantau dalam analisis sampel selama 3 hari pada interval setiap 12 jam. 2. Standar deviasi relative dari pengukuran tiga alkaloid diambil sebagai indicator untuk stabilitas system. maka dalam penelitian berikut digunakan asam asetat. Co-elusi epiberine. Dalam penelitian ini menggunakan gradien elusi dan asam asetat-ammonium asetat additive. jatrorhizine.Chinensis Franch. potensial kapiler 4000V. dan columbamine telah menjadi permasalahan umum yang telah dilaporkan dalam penelitian sebelumnya[3. Hubungan koefisien ditentukan menggunakan sebuah model regresi linier.tekanan gas 50 psi.5]. Agar metode pemisahan dapat kompatible dengan menggunakan ESI-MS/MS. dan batas quantifikasi (LOQ) diartikan sebagai sepuluh kali tingkat keramaian (Noise) dari blank sampel matriks yang bekerja.

Metode ini lebih kompatible dengan menggunakan ESI/MS dan meningkatkan pemisahan alkaloid. (5) Jatrorrhizine.Chinensis Franch. yang menghasilkan resolusi kromatografi dan peningkatan rasio sinyal-to-noise. Juga supaya optimasi kondisi deteksi UPLC. Gambar 2. (2) tetrahidroscoulerine/tetradehydrocheilanthifolinium. Penambahan asam asetat 0. kedelapan alkaloid dapat dihasilkan hanya dalam .PDA tiga panjang gelombang yang berbeda yakni pada panjang gelombang 230. palmatine dan jatrorrhizine standar (A). Dalam spektroskopi massa tandem. Penggunaan metode UPLC-PDA menghasilkan peningkatan kapasitas puncak yang signifikan. Lebih dari delapan puncak telah terdeteksi dalam 5 menit pada kromatogram UPLC-PDA dari ekstrak etanol. spektrum massa elektrospay dari alkaloid bervariasi dengan cone volt dan tegangan energi tumbukan. Keterangan Kromatogram UPLC-PDA berberine. (7) Palmatine. dan 350 telah diamati dan dibandingkan hasilnya.sangat mempengaruhi pemisahan dari jatrorhizine dan columbamine.17]. Lebar puncak khas yang dihasilkan oleh sistem UPLC berada di urutan 5 hingga 10 s. (1) magnoflorine. (4)Epiberberine.15. Gambar 2 menunjukkan bahwa kedelapan senyawa alkaloid telah dipisahkan dengan baik dibawah kondisi optimal. 265. dan oleh sebab itu panjang gelombang tersebut digunakan untuk semua percobaan selanjutnya. (8) berberine. (6)Coptisine. Selain itu waktu yang berlangsung antara –waktu equlibrasi kolom sampel telah dipersingkat.(3) Columbamine. Untuk analisis scan UPLC-MS dari sampel real C. Noise terendah untuk barberin telah diamati dengan menggunakan panjang gelombang 350 nm.5% dan 20 mm amonium asetat kedalam fase gerak memberikan resolusi dan sinyal /noise rasio terbaik jika dibandingkan dengan sistem yang telah dilaporkan dalam laporan sebelumnya [3. ekstrak dari Coptis chinensis Franch (B). terutama untuk jatrrorhizine dan columbanie.

Dalam penelitian ini energi tumbukan yang berbeda ditentukan melalui percobaan optimasi yang telah diterapkan kepada kedelapan alkaloid. palmatine dan jatrorrhizine . cone volt selalu disetel untuk menghasilkan respon terkuat . Pemantauan beberapa reaksi sering digunakan untuk kuantifikasi pada MS quadrupole tandem.muatan ion tunggal [M+] dengan mild cone volt. Gambar 3. sementara energi tumbukan telah disetel untuk ion prekursor yang lebih sensitif dan produk ion stabil di kedua modus scan massal. Keterangan: UPLC-ESI-MS/MS kromatogram total arus ion pada ekstrak Coptis chinensis Franch dan MRM UPLC-MS/MS kromatogram dari berberine. Dalam spektroskopi massa tandem. Energi tumbukan dan cone volt digunakan untuk akuisisi yang dievaluasi untuk respon terbaik dibawah modus positif ESI dengan menambahkan larutan standar berberin dan palmatin.

Optimasi kondisi ekstraksi dengan desain ortogonal Percobaan ortogonal dilakukan dalam rangka mengoptimalkan kondisi ekstraksi. Faktor eksperimental. 3. Hal ini menunjukkan bahwa tingkat ketiga adalah kondisi terbaik dari faktor A dengan analogi tingkat kedua Faktor B. tingkat yang sesuai dengan desain ortogonal L9 (34) ditunjukkan pada tabel 5. sedangkan terkecil adalah 0.2. Tingkat ketiga faktor A memiliki nilai rata-rata sebesar (k3 adalah 8. Adapun empat faktor yang terlibat dalam proses ini adalah : (A) temperatur ekstraksi (B) waktu ekstraksi (C) Ekstraksi pelarut (D) jumlah sampel.4.Chinensis Franch.73)dibandingkan dengan dua tingkat lainnya. dan untuk kondisi optimum ekstraksi ditetapkan sebagai berikut: 1 gram bubuk sampel kering di ekstrak dengan . Jangkauan terbesar dari tiga faktor adalah 0. dan tingkat ketiga adlah faktor C tingkat kedua faktor D merupakan kondisi terbaik.87 dari faktor A.Keterangan tabel (1) total ion kromatogram dan kromatogram MRM dari sampel C.36 faktor D. Ini berarti bahwa faktor A adalah faktor utama dalam kondisi ekstraksi alkaloid di C.chinensis Franch yang ditunjukkan pada gambar 3.

Untuk mengevaluai pengulangan dari prosedur ekstraksi. Spektrum UV pada puncak 1 menunjukkan tiga pita serapan kuat pada 225-235. semua spektrum menunjukkan serapan alkaloid protoberberine yang khas pada 225-245. Dalam hal ini untuk memperkuat unsur pokok dan penyelidikan pola pemisahan. dua kali ekstraksi sudah cukup untuk mengekstrak komponen target sepenuhnya dari Chinensis C. . Keterangan tersebut memberikan informasi struktur lebih lanjut untuk identifikasi. seperti yang terlihat pada tabel 6. Pemeriksaan dari spektra UV dan data MS memungkinkan identifikasi sementara dari 8 komponen yang disusun pada Tabel 2. 3.50 % HCl). Franch. panjang gelombang serapan maksimum dari puncak target akan teridentifikasi berdasarkan pada perbandingan dari informasi online UV dan MS dengan data literature atau standar. 2. dan MS ion molekul dll. 260-270. yang mencirikan jenis alkaloid aporphinoid. dan 335-355. Hasil yang diperoleh untuk semua senyawa target berada dalam 3. Pengaruh dari waktu ekstraksi ditentukan dengan tiga kali ekstraksi secara berturutturut pada sampel yang sama. Daftar tabel berisis waktu retensi (Rt). Sifat pemecahan ion dari semua alkaloid diperoleh dengan analisis MS2 yang tertera pada Tabel 2. dan 5 diperlihatkan di bawah.2 identifikasi alkaloid pada ekstrak sampel menggunakan UPLC-PDA-ESI-MS Electrospray ionization-mass spectrometry (ESI-MS) adalah teknik ionisasi yag menghasilkan puncak molekul ion yang menonjol tepat di bawah arus. dilakukan serangkaian pengulangan sebanyak enam kali yang telah dilakukan pada hari yang sama dan hari yang berbeda. collision-induced dissociation (CID) MS/MS spectrum akan terekam. Pada jurnal ini.etanol 80 5 ( dengan 0. suhu ekstraksi 130 ◦C dan waktu ekstraksi selama 10 menit. Untuk puncak 2-8. panjang gelombang serapan maksimum (). 270280. kedelapan alkaloid tersebut menghasilkan ion [M]+ dalam jenis ion positif. Pada deteksi menggunakan photodiode. Proses pengurangan struktur dari data MS/MS puncak 1. dan 315-335.

8 ([M--CH4--NHCH2-CH3]+). Pada spektra MS2. 265. dan 250.19 dan 3. dan fragmen netral CO dengan massa molekul 44 Dadari ion molekular (m/z 322). ions 342. Ion dominan muncul pada m/z 307. ion yang dominan muncul pada m/z 307. Selanjutnya.2 [M-1528]+. Puncak 2 dan puncak 5 dengan waktu retensi berturut-turut 3. Pada percobaan MS2.8 dan 250. Ion dengan m/z 277.2 dihasilkan oleh hilagnya fragmen netral CO yang lain dari ion m/z 277. Fragmen ion yang teramati 322. Sifat fragmentasi ion dari dua puncak dalam analisis yang MS2 tercantum pada Tabel 2 sangat mirip. 237. Dua senyawa tersebut memiliki struktur isomer yang mirip dengan komposisi penyusun yang sama.45 menit (Gambar 2b) memiliki massa molekul yang sama berdasarkan pada analisi MS. dua ion fragmen menarik terlihat pada m/z 277.2 ([M- . Tidak ada laporan mengenai identifikasi berberrubine menggunakan ESIMS. sesuai dengan struktur alkaloid aporphinoid.2 ([M-CH3-H]+).5 ([M]+).0 ([M--CH4--NHCH2--CH3--OH--CO]+) teramati. puncak 1 diidentifikasi sebagai Magnoflorin dengan karakteristik pola fragmentasi tersebut.1 ([M--CH4--NHCH2]+).8 dihasilkan oleh hilangnya radikal metil. sementara ion dengan m/z 250. tetradehydroscoulerine or tetradehydrocheilanthifolinium berdasarkan pada hasil literatur. 281. 308.8 [M-15-29]+.2 ([M-CH3-CH3]+). radikal hidrogen. 297. Dengan menggabungkan hasil spektrum serapan UV dan karakterisasi pola fragmentasi MS dengan hasil lain pada referensi. Berat molekul pada puncak 2 adalah 322 dan hal itu bisa diidentifikasi sementara sebagai berberrubine.2 [M-15]+.2. puncak tersebut diidentifikasi sebagai Magnoflorin. Oleh karena itu. 279.Puncak 1 dapat diamati pada Gambar 2 dan massa yang terdeteksi adalah 342.2 dan 279.8.2 [M-15-29-28]+.0 ([M--CH4--NHCH2--CH3--OH]+. Dengan perbandingan menggunakan data literatur dan massa molekul yang alkaloid yang diketahui dalam Coptidis Rhizoma. 277. puncak 2 sementara dapat diidentifikasi sebagai tetradehydroscoulerine or tetradehydro- cheilanthifolinium. 294.2 yang sesuai dengan penghapusan metil radikal diikuti dengan hilangnya fragmen netral dengan massa molekul 28 Da (CO) dari ion molekular (m/z 322).

Akhirnya puncak 5 dengan tegas teridentifikasi sebagai Jatrorrhizine dengan menggabungkan waktu retensi dengan Jatrorrhizine standar.2 mL/menit).6 mm) dan waktu total 20 menit. and 279.CH3-H-CO]+). Tipe kromatogram massa (Total Ion Chromatography (TIC))dari ekstraksi Rhizoma Coptidis dengan HPLC-ESI-TOF-MS yang ditunjukkan dalam gambar berikut : Ionisasi permukaan electrospray dalam positif mode juga digunakan dan dari semua sample menunjukkan kelimpahan ion [M+] seperti dalam table berikut : . Pemisahan HPLC isocratic membutukan sebuah kolom (250 mm x 4. Sampel dijalankan oleh HPLC-ESI-TOF-MS untuk mengidentifikasi spesies tujuan. Selain itu system UPLC memerlukan pelarut yang sedikit karena digunakan dalam laju aliran yang lebih kecil (0. Sebaliknya UPLC menghasilkan perbandingan puncak pemisahan tetapi membutuhkan waktu kerja hanya 5 menit.3 Perbandingan dengan LC-DAD-ESI-TOF-MS Perbandingan pembelajaran dihasilkan antara teknik HPLC dengan UPLC.7 ([M-CH3-CH3-CO]+). 3. Dua puncak teridentifikasi sebagai Columbamine dan Jatrorrhizine. dan puncak 3 teridentifikasi sebagai Columbamine.

Dibandingkan dengan perlakuan lainyang mungkin . . C20H18NO4 memiliki massa error yang lebih sedikit. temperatur. palmatin dan jathorisin sebagai indikator hasil. unsur C. volume pembilasan dan siklus ekstraksi adalah parameter yang penting untuk mengontrol hasil ekstraksi. ambang batas akurasi yang diterima secara luas untuk konfirmasi komposisi unsur adalah 5 ppm. Pengembangan Metode Ekstraksi Kondisi ekstraksi seperti pelarut ekstraksi. H.4.1. distribusi massa isotropic juga menginformasikan tentang komposisi unsur.Kesalahan keakuratan pengukuran masa kurang dari 2 ppm dalam semua kasus. waktu ekstraksi statis. O. terlebih lagi distribusi massa isotropic secara teori cocok dengan pengukuran oleh TOF-MS pada kedua intensitas dan posisi m/z yang ditunjukkan dalam gambar (B) : Dengan mengkombinasikan informasi tersebut dengan Double Bond Equivalent (DBE). Dengan demikian keakuratan pengukuran massa memungkinkan untuk puncak komposisi unsur. Kedelapan senyawa yang dideteksi dan diidentifikasi secara sukses dengan UPLC–ESIMS/MS begitu pula dengan HPLC–ESI-MS/MS. selain pengukuran massa. Pada analisis TOF-MS. Analisis Berberin dan homologinya. N dipilih sebagai unsur yang memungkinkan. analit dapat diidentifikasi dengan jelas sebagai berberin. Parameter tersebut dapat dioptimasi dengan pendekatan univariate . yakni menggunakan total hasil ekstraksi dan rasio relatif ekstraksi berberin. 3.

. 60% volume pembilasan dengan dua siklus ekstraksi. Kondisi ASE yang digunakan antara lain : 100 C untuk temperatur ekstraksi..50% HCl) sebagai pelarut dengan 10 menit untuk waktu statis ekstraksi. palmatin dan jathorisin yang diekstrak dalam 60% (v/v) etanol terlarut (dengan 0. Hasil ditunjukkan dengan Gambar 6.50% HCl). metanol terlarut dan etanol terlarut adalah yang pertama kali ditaksir.50% HCl) adalah yang tertinggi diikuti dengan penurunan tingkatan yakni 80% etanol (v/v) terlarut (dengan 0.5% HCl). Eksperimen ekstraksi dilakukan menggunakan 80% etanol terlarut (dengan 0. Sejak temperatur sangat berpengaruh pada efisiensi ekstraksi. Sistem dari enam komposisi pelarut dibandingkan dalam Table 4 : Jumlah relatif dari berberin. 60% volume pembilasan dengan dua siklus ekstraksi.50% HCl) digunakan sebagai pelarut ekstraksi. 10 menit untuk waktu statis ekstraksi.50% HCl) dan 60% metanol (v/v) terlarut (dengan 0. ditemukan hambatan dalam sistem ASE. Salah satu problem yang ditemukan dalam ASE adalah material yang berupa tanaman mempunyai kecenderungan dalam menyerap air selama perlakuan ekstraksi. Saat 60% (v/v) etanol terlarut (dengan 0. rangkaian eksperimen pada temperatur yang berbeda (70-170 C) ditunjukkan untuk menentukan temperatur ekstraksi yang paling baik. e.Efisiensi ekstraksi dari tiga pelarut yakni metanol. 80% etanol terlarut (dengan 0. Masalah dapat diatasi dengan menggunakan rasio pengurangan air dalam sistem pelarut.g.

130 C ditentukan sebagai temperatur ekstraksi.Efisiensi ekstraksi dari semua tiga alkaloid utama tetap konstan hingga suhu 130 C dan menurun pada temperatur yang lebih tinggi. 7. 13. 60% untuk volume pembilasan dengan dua siklus ekstraksi. 10. 15 menit ) ditunjukkan dengan mengikuti kondisi ASE : 130 C untuk temperatur ekstraksi. Penurunan yang terjadi pada efisiensi ekstrasi kemungkinan berkaitan dengan degradasi dari ketiga senyawa tersebut pada saat temperatur diatas 130 C. Hasilnya ditunjukkan pada Gambar 7. perbedaan waktu ekstraksi ( 5. Chinensis Franch. Untuk menentukan jika waktu statis ekstraksi dapat mempengaruhi efisiensi ekstraksi alkaloid dalam C. . Dengan demikian .

Volume pembilasan ( 20.5 μgL-1 untuk 3 alkaloid yang lebih baik daripada yang dilaporkan menggunakan HPCE-UV. 80% ) tidak memberikan pengaruh yang signifikan terhadap efisiensi ekstrasi senyawa target dalam C.Kenaikan waktu statis ekstrasi dari 7 hingga 10 menit tidak mempengaruhi ekstraksi senyawa target. 3.2–1. Setiap deteksi batas dari teknik UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS adalah dalam rentang 60–75 and 1. palmatine dan jatrorrizine dirangkum dalam tabel 8.5 Validasi dari UPLC-PDA-MS/MS 3.9984. Kedua prosedur memungkinkan kuantitasi dalam studi kisaran mempelajari meskipun batas kuantifikasi untuk UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS dibedakan. Jadi.5. Saat waktu statis ekstrasi diatas 10 menit. Linearitas dan Limit Deteksi Hasil studi kalibrasi. Rentang dinamis linear kurva kalibrasi untuk kedua penentuan UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS melebihi dua order besaran. LOQs dan LODs diperoleh dengan UPLC-MS/MS lebih kecil . efisisensi ekstraksi dari ketiga alkaloid utama menurun secara signifikan. Linearitas dari kurva kalibrasi telah diverifikasi dengan studi korelasi dan koefisien korelasi adalah semua lebih baik dari 0. 60. volume pembilasan yang dipakai adalah 60%.1. 40. Chinensis Franch. Jadi waktu statis ekstraksi yang digunakan adalah 10 menit dalam satu kali siklus ekstraksi. LOQs dan LODs dengan UPLC-PDA-MS/MS untuk 3 alkaloid dari berberine.

3. Rentang dinamis linear dari quantitasi dua teknik juga berbeda. n=6) dan waktu retensi lebih baik dari 0.58-2. Recovery Perolehan kembali dari tiga alkaloid ditentukan dengan UPLC-MS/MS menggunakan metode standart tambahan dimana tiga level analisis dari sampel yang berduri (tajam) dilakukan dalam hari yang sama.68 % untuk analisis MS/MS (tabel 9). menunjukkan metode recovery dan presisi yang baik. Tabel 9 menunjukkan bahwa metode UPLC dengan masing-masing PDA (350 nm) dan deteksi MS/MS menunjukkan presisi yang baik untuk ketiga alkaloid tetapi presisi yang pertama tinggi.D dari ketiga alkaloid dari 3 injeksi replikasi adalah lebih baik dari 5. Stabilitas penyimpanan (R.3.D) dari metoda yang diusulkan berdasarkan enam suntikan replikasi.63 % (R.0% dan nilai R.0 %. Presisi (R.2-103.47-3.11 % (n=6) untuk penentuan MS/MS.18-2.S. dan Stabilitas Presisi masing-masing daerah puncak pengukuran PDA dan MS/MS yang ditemukan lebik baik dari 1. .S.14 % dari enam injeksi replikasi. berada di kisaran dari 2.11 % dari semua alkaloid target.dengan UPLC-PDA untuk 3 alkaloid.5.D) dari pengukurang tiga alkaloid adalah 2.52 % (n=6) untuk analisis PDA dan 2.S. 3.5.72 % untuk PDA dan 3.94-3. Hasil ringkasan dalam tabel 10. Presisi.. Reprodusibilitas.S.2. Perolehan kembali berada dalam rentang 94.D. MS/MS lebih cocok untuk penentuan alkaloid pada rentang konsentrasi rendah karena sensitivitasnya lebih dari 50 kali lipat. Variasi dari waktu retensi dari semua puncak adalah kurang dari 0.

Hasil kita menunjukkan bahwa kandungan dari tiga alkaloid utama dalam tujuh sampel C. penyimpanan dan pemrosesan dari ramuan. berberin adalah alkaloid yang paling melimpah dalam C. Masing-masing sampel diekstraksi dan dianalisis tiga rangkap.5. konsisten dengan laporan sebelumnya. Chinensis Franch ini ditunjukkan pada gambar 2 dan hasil dari alkaloid individu dirangkum dalam tabel 11. Kuantifikasi MS dari alkaloid Eningkatan metode UPLC-MS/MS diaplikasikan untuk penentuan tiga alkaloid dalam sampel C. Chinensis Franch.4. Di antara tiga alkaloid. Chinensis Franch terasa berbeda. Variasi bisa terjadi karena berbagai faktor seperti sumber geografis. . panen. budidaya. Chinensis Franch yang berbeda.3. Kromatogram yang mewakili dari ekstrak C.

6 Fingerprint analysis of representative C. Pada Gambar berikut diungkapkan bahwa distribusi dari kedelapan puncak alkaloid adalah mirip disekitar sample tersebut . karena Fingerprint UPLC dari kedelapan senyawa alkaloid dihasilkan untuk pembuktian atau tujuan control kualitas. chinensis Franch samples using UPLC Alkaloid – alkaloid yang berbeda diketahui memiliki perbedaan bioaktivitas yang luas. Tidak hanya menyediakan profil senyawa yang ditandai tetapi juga komponen aktif lainnya. Jika dibandingkan waktu kerja dari UPLC memiliki waktu yang Sembilan kali lebih cepat dibandingkan dengan HPLC (7 menit : 60 menit). Metode kromatografi fingerprint menjadi salah satu yang sering diterapkan. tetapi variasi besar dari puncak intensitas relative tampak jelas. Penilaian kualitas obat – obatan herbal selalu menjadi tantangan karena keragaman multi komponen matriks.Cjininsis Franch.3. . Dengan demikian pola distribusi dari kedelapan alkaloid diharapkan menjadi representasi yang lebih baik dari keseluruhan bioaktivitas dari C.

.Hasil yang diperoleh dalam tulisan ini dan dua referensi lain menunjukkan bahwa UPLC merupakan alat yang sangat berguna dalam aplikasi kromatografi fingerprint.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful