ANALISIS DALAM COPTIS CHINENSIS FRANCH DENGAN EKSTRAKSI PELARUT YANG DIPERCEPAT DIKOMBINASIKAN DENGAN ANALISIS ULTRA PERFORMANCE

LIQUID CHROMATOGRAPHY DENGAN FOTODIODA ARRAY DAN DETEKSI SPEKTROMETRI MASSA

Makalah

Disusun oleh : Kelompok VII Maulida Eka Rista Agita Raka P Yuda Anggi Pradista Putri Zakiah B (091810301031) (101810301013) (101810301025) (101810301035)

Andika Ade Kurniawan (101810301048)

JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS JEMBER 2013

BAB 1. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Pengobatan tradisional Cina (TCM) telah menarik lebih dan lebih perhatian dalam beberapa tahun terakhir karena efek terapinya yang dapat saling melengkapi dengan pengobatan barat (western medicine) serta kemampuannya dalam menangani berbagai

masalah penting yang belum terpecahkan oleh obat konvensional. Huanglian (Rhizoma Coptidis) adalah obat herbal yang sering digunakan dalam TCM, memiliki khasiat dapat menekan demam, menghilangkan toxicocis dan detoxifikasi. Akar kering dari Coptis chinensis Franch, Coptis deltoidea C.Y. Cheng et Hsiao and Coptis teeta Wall adalah sumber utama dari Huanglian. Penyusun aktif dari C. chinensis Franch adalah sejumlah alkaloid diantaranya yang utama yaitu alkaloid protoberberine dari berberin, palmatine, coptisine, dan lain-lain dan sebuah aporphinoid alkaloid dari magnoflorine. Alkaloid ini menunjukkan aktivitas antimikroba yang signifikan terhadap berbagai organisme termasuk bakteri, virus, jamur, protozoa, helminthes, dan Chlamydia serta aktivitas anti kanker yang ditunjukkan dengan sifat antineoplastiknya. Aplikasi utama dari berberine adalah untuk pengobatan diare, infeksi parasitus usus, infeksi okular trakoma dan lain-lain. Dalam Official Chinese Pharmacopoeia (edisi 2005), berberine sendiri ditetapkan sebagai spesies penanda untuk evaluasi kualitas Huanglian. Namun, kita percaya bahwa praktek kontrol kualitas untuk Huanglian harus mencakup uji dari serangkaian alkaloid utama daripada spesies tunggal. Selama beberapa dekade terakhir, beberapa metode dapat digunakan untuk penentuan alkaloid dalam ekstrak Rhizoma Coptidis diantaranya Kolorimetri, Thin Layer

Chromatography (TLC), Capilary Electrophoresis, Micellar Electrokinetic Chromatography (MEC), High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) dengan berbagai detertor yang berbeda termasuk spektrometri massa. Metode Kolorimetri hanya menentukan total kandungan alkaloid tapi nonspesifik terhadap alkaloid individu. Metode scanning Micellar Thin Layer Chromatographic telah digunakan untuk kontrol kualitas dari Rhizoma coptidis, tapi metode ini mampu menganalisis hanya tiga dari di alkaloid di atas. HPLC dengan sistem deteksi yang berbeda adalah metode yang paling banyak dipraktekkan untuk analisis alkaloid. Namun dengan metode KCKT, pemisahan alkaloid yang berbeda dalam Rhizoma Coptidis masih memiliki peluang besar untuk dikembangkan. Laporan dalam analisis spectrometri massa dari alkaloid dalam Rhizoma Coptidis telah langka, dengan hanya dua makalah yang

ESI-MS/MS dikombinasi dengan UPLC juga telah diterapkan untuk quantifikasi tiga alkaloid utama dan identifikasi alkaloid individu dalam ekstrak C. sistem ini menawarkan peningkatan resolusi puncak. chinensis Franch. UPLC atau UPLC-MS/MS baru diterapkan untuk analisis komposisi produk alam dan sistem metabolit dalam biologi. studi perbandingan telah dibuat antara kinerja dari teknik UPLC–ESI-MS/MS and HPLC–ESI-TOF-MS. Selain itu. telah ada minat yang besar dalam penerapan sistem UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography). ASE umumnya beroperasi di bawah suhu tinggi.diterbitkan baru-baru ini pada penjabaran struktural dan identifikasi dari empat alkaloid dalam Rhizoma Coptidis dengan electrospray ionization-tandem mass spectrometry. UPLC berbasis meetode fingerprinting memanfaatkan pola distribusi dari delapan alkaloid utama dalam sampel telah dikembangkan untuk evaluasi kualitas C. waktu ekstraksi yang stabil. chinensis Franch. Terbaru. Dalam makalah ini. dan cara ekstraksi yang . Abstrak Sebuah metode baru berdasarkan akselerasi ekstraksi pelarut (ASE) dengan analisis Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) telah dikembangkan untuk identifikasi dan kuantifikasi sebagian besar alkaloid dari ekstrak Coptis chinesis. Suhu tinggi meningkatkan efisiensi ekstraksi karena itu mengurangi viskositas dari pelarut. palmatine dan jatrorrhizine dalam ekstrak kasar C. kepekaan dan kecepatan analisis. meskipun teknik ini telah banyak diterapkan untuk ekstraksi bahan alam. ASE telah ditemukan hanya terbatas pada aplikasi dalam analisis TCM. sistem UPLC terdiri dari sistem deteksi dual photodioda (PDA) dan spektrometri massa dengan tandem ion positif elektrospray ionisasi dalam konfigurasi sekuen. tetapi penerapannya pada analisis alkaloid belum dilaporkan lebih jelas. Parameter operasional dari ASE adalah pelarut ekstraksi. Akhirnya. sehingga memungkinkan penetrasi yang lebih baik dari molekul pelarut ke dalam matriks sampel. Ketika digabungkan ke spektrometer massa tandem. siklus dan pelarut. dan lain-lain. chinensis Franch. Baru-baru ini. metode UPLC-PDA dikombinasikan dengan ekstraksi ASE telah dikembangkan untuk penentuan kuantitatif tiga alkaloid utama berberine.7 μm. temperatur ekstraksi. Penggunaan ASE mengurangi waktu total ekstraksi dan meningkatkan efisiensi ekstraksi melalui manipulasi parameter seperti suhu. Sistem ini memanfaatkan kecepatan linear tinggi dengan kolom yang dikemas dengan partikel berpori 1. dan pada temperatur yang lebih tinggi di atas titik didih dari ekstraksi pelarut. waktu.

TINJAUAN PUSTAKA BAB 3. METODOLOGI PERCOBAAN 2. etanol dan lainya didapatkan dari Shanghai Chemical Factory ( Shanghai. Sebuah tandem qudropole spektrometer beroperasi dalam modus scan penuh baik dan mode MS/MS untuk multiple reaction monitoring (MRM) digunakan untuk identifikasi dan analisis kuantitatif 8 alkaloid utama pada ekstrak C. Sampel juga dianalisis dengan sistem HPLC-ESI-TOF-MS untuk mengkonfirmasi hasil identifikasi. 1. PA. Preparasi Sampel . China). Standar dari Berberine Hidroklorida. Fingerprint UPLC berdasarkan distribusi 8 alkaloid utama dapat menyediakan metode yang cepat dan diandalkan untuk pembuktian dan evaluasi kualitas dari obat herbal tradisional cina.2 Tujuan BAB 2. Amonium asetat dan asam asetat didapat dari Fluka ( Buch. Analisis UPLC yang digunakan adalah kolom ACQUITY UPLC BEC C18 yang dielusi oleh fase gerak asetonitril dengan larutan buffer yang terdiri dari 0.50% asam asetat dan 20 mmol/L amonium asetat. Hasilnya mengindikasikan bahwa dari kedua metode UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS sensitif dan dapat diandalkan untuk penentuan alkaloid dalam C.optimum. 2. Amerika Serikat). Palmatine Hidroklorida dan Jatrorhizhine Hidroklorida diperoleh dari National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products of China. chinensis Franch.1 Material dan Reagen Tujuh sampel C.2. chinesis franch dibeli dari toko obat yang berbeda di daerah Qingdao. Tujuh sampel Huanglian dari lokasi yang berbeda dianalisis menggunakan metode yang digunakan. Bahan kimia lainnya seperti metanol. Tiga dari delapan alkaloid utama yakni berberine. Swiss). chinensis Franch. Air dimurnikan menggunakan sebuah sistem pemurnian air Milli-Q (Milipore. China.Bedfore. MA. palmatine dan jatrorrhizine telah terdeteksi oleh UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS. Asetonitril untuk HPLC berasal dari Fisher Chemicals (Pittsburg. Amerika Serikat).

Chinensis Franch kering digiling menggunakan penumbuk dan mortar. CA.C. Etanol 80% dengan 0.2. Sunnyvale. Ekstraksi diulangi dengan penambahan waktu 2 kali dan ekstrak yang dihasilkan digabung.5% HCl dalam labu alas.45 µm. palmatin hidroklorida dan jatrorhisin hidroklorida secara berurutan disiapkan dengan melarutkan kira-kira 10 mg setiap senyawa .2. Satu gram sampel bubuk ditambahkan dan 35 mL pelarut ditambahkan dalam labu alas bulat. Suspensi diekstraksi selama 1 jam pada suhu 90 C dengan perendaman dan penyaringan. Ekstrak dievaporasi hingga kering menggunakan rotary evaporator pada suhu 50 C.3. Setelah halus serbuk tersebut diayak dengan pengayak baja 0. dan dievaporasi hingga kering menggunakan rotary evaporator pada suhu 50 C. Ekstraksi Refluks Pemanasan Refluks Ekstraksi dilakukan dalam kondensor dingin dan labu alas bulat 100 mL.2. Preparasi Larutan Standar dan Kurva Kalibrasi Stok larutan standar berberin hidroklorida. Residunya dilarutkan dalam 50 mL etanol dan disaring menggunakan filter membran nilon 0.45 µm. Ekstraksi Ultrasonik Ekstraksi ultrasonik dilakukan dengan menyampurkan 1 g sampel bubuk dan 35 mL larutan 80% ethanol dengan 0.1.2. Sekitar 1 gram bubuk C. 2. Ekstrak gabungan tersebut disaring. Residu dilarutkan kembali dengan 50 metanol dan disaring dengan filter membran nilon 0. 2.5 % HCl digunakan sebagai pelarut. Chinensis Franch dihomogenasi menggunakan diatomaceous earth pada berat yang sama dan ditempatkan pada sebuah sel ekstraksi.3. Sel ekstraksi ditempatkan dalam korsel dan sampel diekstraksi dalam kondisi tekanan rendah. 2. Amerika Serikat) dilengkapi bejana baja berukuran 34 mL digunakan untuk ekstraksi cairan bertekanan.3 mm sebelum ekstraksi.45 µm sebelum diinjekkan ke sistem UPLC. Residunya dilarutkan dalam 50 mL etanol dan disaring menggunakan filter membran nilon 0. Ekstraksi diulangi dengan penambahan waktu 2 kali dan ekstrak yang dihasilkan digabung. 2. dimana ditempatkan pada ultrasonik bath selama 30 menit. Percepatan Ekstrasksi Pelarut Sebuah sistem ASE 100 (Dionex.

Pada analisis rutin. MA. Pemisahan ini dilakukan dengan menggunakan kolom ACQUITY UPLC BEH C18 (1.0 mL/min.USA) lengkap dengan sumber ESI Z-Spray. Elusi dimonitor oleh detector sinar diode. Sumber elektrospray dijalankan dalam bentuk ion positif. sebuah kolom (Alltima C18) yang dielusi secara isocratic dengan campuran biner dari Asetonitril dan 0.7µm.45 mg/L palmatin hidroklorida dan 0. 2. spektro ini digunakan untuk menganalisis alkaloid dalam C . Pada 200C dan laju alir 0. Software yang digunakan dalam analisis ini ialah QS Software analysis.29 mg/L Berberin hidroklorida. Spektroskopi massa yang digunakan ialah G1969A TOF .Chinensis Franch.Chinensis Franc ini dianalisis dalam multiple reaction monitoring (MRM) mode. Campuran larutan standar yang terdiri dari 1.5% CH3COOH dengan 20mM NH4CH3COO (32:68) pada kecepatan laju alir 1.Chinensis Franch. Potensial kapiler di set pada 3. aliran gas 11 L/min.murni dalam 10 mL metanol. .2. C. 2. mengikuti beberapa ketentuan berikut : suhu 3300C.2 Fase gerak mengandung pelarut A (0. Setiap kurva kalibrasi dibentuk oleh larutan standar dengan enam konsentrasi berbeda dalam 3 kali pengulangan.4 Ultra performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry Analisis dilakukan pada sistem perairan ACQUITY UPLCTM (Milford.5 High-performance liquid chromatography-electrospray ionization-time of flight mass spectrometry Analisis HPLC telah dilakukan dengan sebuah alat 1100HPLC. MA. USA).30 mg/L jatrorrhisin hidroklorida dipreparasi dengan cara melarutkan setiap senyawa murni (yang ditimbang secara akurat) dalam 10 ml metanol. cone voltages dan energy tumbukan dioptimasi pada dua fragmentasi. Larutan standar untuk kalibrasi dipreparasi dengan mengencerkan larutan standar menggunakan metanol untuk konsentrasi yang diinginkan. Milford. 0. Volume yang diisikan pada proses injeksi berkisar 10 µL dan pemisahan dilakukan pada 25oC dalam ruang pemanasan secara isothermal.5% asam asetat dan 20mmol/L NH4CH3COO) dan B (asetonitril) dengan perbandingan 80% A dan 20% B. spektrometri massa di scan pertama kali dari nilai m/z 100 hingga 500 dalam mode full scan untuk menentukan informasi berat molekul alkaloid dalam C. Kondisi spektrometer massa dioptimasi untuk deteksi alkaloid. Sistem UPLC digabungkan dengan Quattro premier XE tandem quadrupole mass spectrometer (Waters.1mm×50 mm).5kV.

1. fragmentor 100 V. Hasil dan Pembahasan 3. Reprodusibilitas dari metode ditinjau dengan menjalankan enam replikasi sampel. Hal tersebut menunjukkan bahwa penambahan ammonium asetat . 3. Stabilitas sampel dipantau dalam analisis sampel selama 3 hari pada interval setiap 12 jam. jatrorhizine.dan resolusi terbaik dari delapan alkaloid telah didapatkan. Hubungan koefisien ditentukan menggunakan sebuah model regresi linier. Larutan standar (reff) digunakan m/z 121. Tiga alkaloid dalam campuran standar dimasukkan dalam sampel dan hasil penemuan dihitung dengan perbedaan antara sampel yang dimasukkan dengan yang tidak. Fasa terbalik (reversed phase) UPLC dengan gradien elusi yang digunakan berdasarkan pada kondisi yang telah diberikan dalam literatur laporan. Namun peningkatan di puncak resolusi dan peak shape yang cukup besar dapat terpantau (diamati) setelah penambahan asam trifluoroasetat atau asam fosfat ke dalam fase gerak. palmatine and jatrorrhizine dihitung sebagai standar deviasi relative dari enam pengulangan kerja. Variasi pada rasio air untuk asetonitril pada fase gerak dapat meningkatkan pemisahan. potensial kapiler 4000V. Batas deteksi diartikan sebagai tiga kali tingkat keramaian (Noisy) yang diperoleh. Co-elusi epiberine.050873 untuk kalibrasi massa untuk menghilangkan sistem bias. maka dalam penelitian berikut digunakan asam asetat. Penemuan alkaloid ditentukan dengan metode standar addisi. Standar deviasi relative dari pengukuran tiga alkaloid diambil sebagai indicator untuk stabilitas system. 2.6 Metode validasi UPLC Kurva kalibrasi dibangun dengan menjalankan enam campuran standar konsentrasi yang berbeda dalam triplicate. Optimasi UPLC-PDA-MS/kondisi MS Kondisi kromatografi telah dioptimasi menggunakan larutan standard alkaloid dan sampel real C. Ketepatan dari waktu retensi UPLC dan pengukuran area puncak untuk berberine.Chinensis Franch.tekanan gas 50 psi. dan columbamine telah menjadi permasalahan umum yang telah dilaporkan dalam penelitian sebelumnya[3. Agar metode pemisahan dapat kompatible dengan menggunakan ESI-MS/MS. dan batas quantifikasi (LOQ) diartikan sebagai sepuluh kali tingkat keramaian (Noise) dari blank sampel matriks yang bekerja.5]. Dalam penelitian ini menggunakan gradien elusi dan asam asetat-ammonium asetat additive.

(1) magnoflorine. Gambar 2 menunjukkan bahwa kedelapan senyawa alkaloid telah dipisahkan dengan baik dibawah kondisi optimal.Chinensis Franch. dan 350 telah diamati dan dibandingkan hasilnya. spektrum massa elektrospay dari alkaloid bervariasi dengan cone volt dan tegangan energi tumbukan. (4)Epiberberine. ekstrak dari Coptis chinensis Franch (B). kedelapan alkaloid dapat dihasilkan hanya dalam . (2) tetrahidroscoulerine/tetradehydrocheilanthifolinium.(3) Columbamine. Keterangan Kromatogram UPLC-PDA berberine. dan oleh sebab itu panjang gelombang tersebut digunakan untuk semua percobaan selanjutnya. (5) Jatrorrhizine. yang menghasilkan resolusi kromatografi dan peningkatan rasio sinyal-to-noise.PDA tiga panjang gelombang yang berbeda yakni pada panjang gelombang 230. Lebar puncak khas yang dihasilkan oleh sistem UPLC berada di urutan 5 hingga 10 s. Penggunaan metode UPLC-PDA menghasilkan peningkatan kapasitas puncak yang signifikan. Dalam spektroskopi massa tandem. Metode ini lebih kompatible dengan menggunakan ESI/MS dan meningkatkan pemisahan alkaloid. Noise terendah untuk barberin telah diamati dengan menggunakan panjang gelombang 350 nm. (6)Coptisine.17]. terutama untuk jatrrorhizine dan columbanie.sangat mempengaruhi pemisahan dari jatrorhizine dan columbamine. Untuk analisis scan UPLC-MS dari sampel real C. (8) berberine. Juga supaya optimasi kondisi deteksi UPLC. 265. Selain itu waktu yang berlangsung antara –waktu equlibrasi kolom sampel telah dipersingkat. Lebih dari delapan puncak telah terdeteksi dalam 5 menit pada kromatogram UPLC-PDA dari ekstrak etanol.5% dan 20 mm amonium asetat kedalam fase gerak memberikan resolusi dan sinyal /noise rasio terbaik jika dibandingkan dengan sistem yang telah dilaporkan dalam laporan sebelumnya [3. Gambar 2.15. Penambahan asam asetat 0. (7) Palmatine. palmatine dan jatrorrhizine standar (A).

Energi tumbukan dan cone volt digunakan untuk akuisisi yang dievaluasi untuk respon terbaik dibawah modus positif ESI dengan menambahkan larutan standar berberin dan palmatin. palmatine dan jatrorrhizine .muatan ion tunggal [M+] dengan mild cone volt. Dalam penelitian ini energi tumbukan yang berbeda ditentukan melalui percobaan optimasi yang telah diterapkan kepada kedelapan alkaloid. Keterangan: UPLC-ESI-MS/MS kromatogram total arus ion pada ekstrak Coptis chinensis Franch dan MRM UPLC-MS/MS kromatogram dari berberine. Pemantauan beberapa reaksi sering digunakan untuk kuantifikasi pada MS quadrupole tandem. cone volt selalu disetel untuk menghasilkan respon terkuat . Gambar 3. Dalam spektroskopi massa tandem. sementara energi tumbukan telah disetel untuk ion prekursor yang lebih sensitif dan produk ion stabil di kedua modus scan massal.

4. Faktor eksperimental. Ini berarti bahwa faktor A adalah faktor utama dalam kondisi ekstraksi alkaloid di C.Keterangan tabel (1) total ion kromatogram dan kromatogram MRM dari sampel C.chinensis Franch yang ditunjukkan pada gambar 3. Hal ini menunjukkan bahwa tingkat ketiga adalah kondisi terbaik dari faktor A dengan analogi tingkat kedua Faktor B. Adapun empat faktor yang terlibat dalam proses ini adalah : (A) temperatur ekstraksi (B) waktu ekstraksi (C) Ekstraksi pelarut (D) jumlah sampel. 3. Jangkauan terbesar dari tiga faktor adalah 0. Tingkat ketiga faktor A memiliki nilai rata-rata sebesar (k3 adalah 8. Optimasi kondisi ekstraksi dengan desain ortogonal Percobaan ortogonal dilakukan dalam rangka mengoptimalkan kondisi ekstraksi.36 faktor D.73)dibandingkan dengan dua tingkat lainnya. tingkat yang sesuai dengan desain ortogonal L9 (34) ditunjukkan pada tabel 5.Chinensis Franch.87 dari faktor A. dan untuk kondisi optimum ekstraksi ditetapkan sebagai berikut: 1 gram bubuk sampel kering di ekstrak dengan .2. sedangkan terkecil adalah 0. dan tingkat ketiga adlah faktor C tingkat kedua faktor D merupakan kondisi terbaik.

dan 335-355.50 % HCl). panjang gelombang serapan maksimum dari puncak target akan teridentifikasi berdasarkan pada perbandingan dari informasi online UV dan MS dengan data literature atau standar. dan 315-335. Keterangan tersebut memberikan informasi struktur lebih lanjut untuk identifikasi. seperti yang terlihat pada tabel 6. Untuk mengevaluai pengulangan dari prosedur ekstraksi. suhu ekstraksi 130 ◦C dan waktu ekstraksi selama 10 menit. collision-induced dissociation (CID) MS/MS spectrum akan terekam. Daftar tabel berisis waktu retensi (Rt). 260-270.2 identifikasi alkaloid pada ekstrak sampel menggunakan UPLC-PDA-ESI-MS Electrospray ionization-mass spectrometry (ESI-MS) adalah teknik ionisasi yag menghasilkan puncak molekul ion yang menonjol tepat di bawah arus. 270280. Pada jurnal ini. panjang gelombang serapan maksimum (). Dalam hal ini untuk memperkuat unsur pokok dan penyelidikan pola pemisahan.etanol 80 5 ( dengan 0. Franch. Hasil yang diperoleh untuk semua senyawa target berada dalam 3. dan 5 diperlihatkan di bawah. dua kali ekstraksi sudah cukup untuk mengekstrak komponen target sepenuhnya dari Chinensis C. dilakukan serangkaian pengulangan sebanyak enam kali yang telah dilakukan pada hari yang sama dan hari yang berbeda. dan MS ion molekul dll. Pemeriksaan dari spektra UV dan data MS memungkinkan identifikasi sementara dari 8 komponen yang disusun pada Tabel 2. Proses pengurangan struktur dari data MS/MS puncak 1. . 3. kedelapan alkaloid tersebut menghasilkan ion [M]+ dalam jenis ion positif. 2. Untuk puncak 2-8. yang mencirikan jenis alkaloid aporphinoid. Pada deteksi menggunakan photodiode. Spektrum UV pada puncak 1 menunjukkan tiga pita serapan kuat pada 225-235. Sifat pemecahan ion dari semua alkaloid diperoleh dengan analisis MS2 yang tertera pada Tabel 2. semua spektrum menunjukkan serapan alkaloid protoberberine yang khas pada 225-245. Pengaruh dari waktu ekstraksi ditentukan dengan tiga kali ekstraksi secara berturutturut pada sampel yang sama.

277. 279.2 yang sesuai dengan penghapusan metil radikal diikuti dengan hilangnya fragmen netral dengan massa molekul 28 Da (CO) dari ion molekular (m/z 322). 281. sementara ion dengan m/z 250. Dua senyawa tersebut memiliki struktur isomer yang mirip dengan komposisi penyusun yang sama. Ion dominan muncul pada m/z 307. dan fragmen netral CO dengan massa molekul 44 Dadari ion molekular (m/z 322).45 menit (Gambar 2b) memiliki massa molekul yang sama berdasarkan pada analisi MS.2 ([M-CH3-H]+).0 ([M--CH4--NHCH2--CH3--OH--CO]+) teramati. Oleh karena itu.8 [M-15-29]+. Fragmen ion yang teramati 322. Berat molekul pada puncak 2 adalah 322 dan hal itu bisa diidentifikasi sementara sebagai berberrubine. 308. ion yang dominan muncul pada m/z 307. 297. ions 342.2 [M-1528]+. Pada percobaan MS2. puncak 2 sementara dapat diidentifikasi sebagai tetradehydroscoulerine or tetradehydro- cheilanthifolinium. Dengan menggabungkan hasil spektrum serapan UV dan karakterisasi pola fragmentasi MS dengan hasil lain pada referensi. Ion dengan m/z 277. dua ion fragmen menarik terlihat pada m/z 277.5 ([M]+). radikal hidrogen.2. puncak 1 diidentifikasi sebagai Magnoflorin dengan karakteristik pola fragmentasi tersebut.8 dan 250.8 dihasilkan oleh hilangnya radikal metil. Sifat fragmentasi ion dari dua puncak dalam analisis yang MS2 tercantum pada Tabel 2 sangat mirip. Dengan perbandingan menggunakan data literatur dan massa molekul yang alkaloid yang diketahui dalam Coptidis Rhizoma.2 ([M- . sesuai dengan struktur alkaloid aporphinoid. puncak tersebut diidentifikasi sebagai Magnoflorin.1 ([M--CH4--NHCH2]+). 265. 294. 237.0 ([M--CH4--NHCH2--CH3--OH]+.2 ([M-CH3-CH3]+). dan 250.8.2 dan 279. Pada spektra MS2. Tidak ada laporan mengenai identifikasi berberrubine menggunakan ESIMS. Puncak 2 dan puncak 5 dengan waktu retensi berturut-turut 3.Puncak 1 dapat diamati pada Gambar 2 dan massa yang terdeteksi adalah 342.2 dihasilkan oleh hilagnya fragmen netral CO yang lain dari ion m/z 277.8 ([M--CH4--NHCH2-CH3]+). tetradehydroscoulerine or tetradehydrocheilanthifolinium berdasarkan pada hasil literatur. Selanjutnya.2 [M-15]+.2 [M-15-29-28]+.19 dan 3.

Selain itu system UPLC memerlukan pelarut yang sedikit karena digunakan dalam laju aliran yang lebih kecil (0. Dua puncak teridentifikasi sebagai Columbamine dan Jatrorrhizine.2 mL/menit).7 ([M-CH3-CH3-CO]+). and 279. 3. Tipe kromatogram massa (Total Ion Chromatography (TIC))dari ekstraksi Rhizoma Coptidis dengan HPLC-ESI-TOF-MS yang ditunjukkan dalam gambar berikut : Ionisasi permukaan electrospray dalam positif mode juga digunakan dan dari semua sample menunjukkan kelimpahan ion [M+] seperti dalam table berikut : . Sebaliknya UPLC menghasilkan perbandingan puncak pemisahan tetapi membutuhkan waktu kerja hanya 5 menit. Pemisahan HPLC isocratic membutukan sebuah kolom (250 mm x 4. Akhirnya puncak 5 dengan tegas teridentifikasi sebagai Jatrorrhizine dengan menggabungkan waktu retensi dengan Jatrorrhizine standar.6 mm) dan waktu total 20 menit.3 Perbandingan dengan LC-DAD-ESI-TOF-MS Perbandingan pembelajaran dihasilkan antara teknik HPLC dengan UPLC. dan puncak 3 teridentifikasi sebagai Columbamine. Sampel dijalankan oleh HPLC-ESI-TOF-MS untuk mengidentifikasi spesies tujuan.CH3-H-CO]+).

Pada analisis TOF-MS. analit dapat diidentifikasi dengan jelas sebagai berberin. selain pengukuran massa. 3. terlebih lagi distribusi massa isotropic secara teori cocok dengan pengukuran oleh TOF-MS pada kedua intensitas dan posisi m/z yang ditunjukkan dalam gambar (B) : Dengan mengkombinasikan informasi tersebut dengan Double Bond Equivalent (DBE). Kedelapan senyawa yang dideteksi dan diidentifikasi secara sukses dengan UPLC–ESIMS/MS begitu pula dengan HPLC–ESI-MS/MS. temperatur. ambang batas akurasi yang diterima secara luas untuk konfirmasi komposisi unsur adalah 5 ppm. Parameter tersebut dapat dioptimasi dengan pendekatan univariate . waktu ekstraksi statis. unsur C. O. palmatin dan jathorisin sebagai indikator hasil.4. Dibandingkan dengan perlakuan lainyang mungkin . volume pembilasan dan siklus ekstraksi adalah parameter yang penting untuk mengontrol hasil ekstraksi. N dipilih sebagai unsur yang memungkinkan. H.1. Pengembangan Metode Ekstraksi Kondisi ekstraksi seperti pelarut ekstraksi. distribusi massa isotropic juga menginformasikan tentang komposisi unsur. . Dengan demikian keakuratan pengukuran massa memungkinkan untuk puncak komposisi unsur. yakni menggunakan total hasil ekstraksi dan rasio relatif ekstraksi berberin.Kesalahan keakuratan pengukuran masa kurang dari 2 ppm dalam semua kasus. Analisis Berberin dan homologinya. C20H18NO4 memiliki massa error yang lebih sedikit.

5% HCl).50% HCl) sebagai pelarut dengan 10 menit untuk waktu statis ekstraksi. 60% volume pembilasan dengan dua siklus ekstraksi.50% HCl) digunakan sebagai pelarut ekstraksi. palmatin dan jathorisin yang diekstrak dalam 60% (v/v) etanol terlarut (dengan 0. ditemukan hambatan dalam sistem ASE. Saat 60% (v/v) etanol terlarut (dengan 0. Masalah dapat diatasi dengan menggunakan rasio pengurangan air dalam sistem pelarut.Efisiensi ekstraksi dari tiga pelarut yakni metanol. . Sejak temperatur sangat berpengaruh pada efisiensi ekstraksi. Hasil ditunjukkan dengan Gambar 6.50% HCl) adalah yang tertinggi diikuti dengan penurunan tingkatan yakni 80% etanol (v/v) terlarut (dengan 0.g. rangkaian eksperimen pada temperatur yang berbeda (70-170 C) ditunjukkan untuk menentukan temperatur ekstraksi yang paling baik. Eksperimen ekstraksi dilakukan menggunakan 80% etanol terlarut (dengan 0. Kondisi ASE yang digunakan antara lain : 100 C untuk temperatur ekstraksi.50% HCl). metanol terlarut dan etanol terlarut adalah yang pertama kali ditaksir. e. 10 menit untuk waktu statis ekstraksi. Salah satu problem yang ditemukan dalam ASE adalah material yang berupa tanaman mempunyai kecenderungan dalam menyerap air selama perlakuan ekstraksi. 80% etanol terlarut (dengan 0. Sistem dari enam komposisi pelarut dibandingkan dalam Table 4 : Jumlah relatif dari berberin.. 60% volume pembilasan dengan dua siklus ekstraksi.50% HCl) dan 60% metanol (v/v) terlarut (dengan 0.

. 10.130 C ditentukan sebagai temperatur ekstraksi. Hasilnya ditunjukkan pada Gambar 7.Efisiensi ekstraksi dari semua tiga alkaloid utama tetap konstan hingga suhu 130 C dan menurun pada temperatur yang lebih tinggi. 13. 60% untuk volume pembilasan dengan dua siklus ekstraksi. Untuk menentukan jika waktu statis ekstraksi dapat mempengaruhi efisiensi ekstraksi alkaloid dalam C. 7. perbedaan waktu ekstraksi ( 5. Chinensis Franch. Dengan demikian . 15 menit ) ditunjukkan dengan mengikuti kondisi ASE : 130 C untuk temperatur ekstraksi. Penurunan yang terjadi pada efisiensi ekstrasi kemungkinan berkaitan dengan degradasi dari ketiga senyawa tersebut pada saat temperatur diatas 130 C.

5.1.Kenaikan waktu statis ekstrasi dari 7 hingga 10 menit tidak mempengaruhi ekstraksi senyawa target.5 Validasi dari UPLC-PDA-MS/MS 3. Chinensis Franch.9984. 40. 80% ) tidak memberikan pengaruh yang signifikan terhadap efisiensi ekstrasi senyawa target dalam C. Rentang dinamis linear kurva kalibrasi untuk kedua penentuan UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS melebihi dua order besaran.2–1. Saat waktu statis ekstrasi diatas 10 menit. palmatine dan jatrorrizine dirangkum dalam tabel 8. Linearitas dan Limit Deteksi Hasil studi kalibrasi. 60. Setiap deteksi batas dari teknik UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS adalah dalam rentang 60–75 and 1. efisisensi ekstraksi dari ketiga alkaloid utama menurun secara signifikan. Jadi waktu statis ekstraksi yang digunakan adalah 10 menit dalam satu kali siklus ekstraksi. 3. Jadi. Volume pembilasan ( 20. Kedua prosedur memungkinkan kuantitasi dalam studi kisaran mempelajari meskipun batas kuantifikasi untuk UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS dibedakan. volume pembilasan yang dipakai adalah 60%. Linearitas dari kurva kalibrasi telah diverifikasi dengan studi korelasi dan koefisien korelasi adalah semua lebih baik dari 0. LOQs dan LODs dengan UPLC-PDA-MS/MS untuk 3 alkaloid dari berberine.5 μgL-1 untuk 3 alkaloid yang lebih baik daripada yang dilaporkan menggunakan HPCE-UV. LOQs dan LODs diperoleh dengan UPLC-MS/MS lebih kecil .

D) dari metoda yang diusulkan berdasarkan enam suntikan replikasi.58-2.3. Reprodusibilitas. Presisi.72 % untuk PDA dan 3.94-3.D) dari pengukurang tiga alkaloid adalah 2.11 % dari semua alkaloid target. Tabel 9 menunjukkan bahwa metode UPLC dengan masing-masing PDA (350 nm) dan deteksi MS/MS menunjukkan presisi yang baik untuk ketiga alkaloid tetapi presisi yang pertama tinggi. 3. Stabilitas penyimpanan (R.0 %. Variasi dari waktu retensi dari semua puncak adalah kurang dari 0.S.5.47-3.S.11 % (n=6) untuk penentuan MS/MS. menunjukkan metode recovery dan presisi yang baik.68 % untuk analisis MS/MS (tabel 9).S.52 % (n=6) untuk analisis PDA dan 2.5. Hasil ringkasan dalam tabel 10. berada di kisaran dari 2.2.dengan UPLC-PDA untuk 3 alkaloid. n=6) dan waktu retensi lebih baik dari 0.S. Rentang dinamis linear dari quantitasi dua teknik juga berbeda. MS/MS lebih cocok untuk penentuan alkaloid pada rentang konsentrasi rendah karena sensitivitasnya lebih dari 50 kali lipat.2-103. 3.0% dan nilai R. . Perolehan kembali berada dalam rentang 94.63 % (R.18-2.. Recovery Perolehan kembali dari tiga alkaloid ditentukan dengan UPLC-MS/MS menggunakan metode standart tambahan dimana tiga level analisis dari sampel yang berduri (tajam) dilakukan dalam hari yang sama.D. Presisi (R. dan Stabilitas Presisi masing-masing daerah puncak pengukuran PDA dan MS/MS yang ditemukan lebik baik dari 1.14 % dari enam injeksi replikasi.D dari ketiga alkaloid dari 3 injeksi replikasi adalah lebih baik dari 5.

Masing-masing sampel diekstraksi dan dianalisis tiga rangkap. Kuantifikasi MS dari alkaloid Eningkatan metode UPLC-MS/MS diaplikasikan untuk penentuan tiga alkaloid dalam sampel C. Chinensis Franch terasa berbeda. Chinensis Franch ini ditunjukkan pada gambar 2 dan hasil dari alkaloid individu dirangkum dalam tabel 11. Di antara tiga alkaloid. Variasi bisa terjadi karena berbagai faktor seperti sumber geografis. Chinensis Franch yang berbeda. Kromatogram yang mewakili dari ekstrak C. penyimpanan dan pemrosesan dari ramuan. budidaya. . berberin adalah alkaloid yang paling melimpah dalam C. Chinensis Franch. panen.5. Hasil kita menunjukkan bahwa kandungan dari tiga alkaloid utama dalam tujuh sampel C.3. konsisten dengan laporan sebelumnya.4.

chinensis Franch samples using UPLC Alkaloid – alkaloid yang berbeda diketahui memiliki perbedaan bioaktivitas yang luas.Cjininsis Franch. Pada Gambar berikut diungkapkan bahwa distribusi dari kedelapan puncak alkaloid adalah mirip disekitar sample tersebut .6 Fingerprint analysis of representative C. Penilaian kualitas obat – obatan herbal selalu menjadi tantangan karena keragaman multi komponen matriks. Jika dibandingkan waktu kerja dari UPLC memiliki waktu yang Sembilan kali lebih cepat dibandingkan dengan HPLC (7 menit : 60 menit). Dengan demikian pola distribusi dari kedelapan alkaloid diharapkan menjadi representasi yang lebih baik dari keseluruhan bioaktivitas dari C. Tidak hanya menyediakan profil senyawa yang ditandai tetapi juga komponen aktif lainnya. tetapi variasi besar dari puncak intensitas relative tampak jelas.3. Metode kromatografi fingerprint menjadi salah satu yang sering diterapkan. karena Fingerprint UPLC dari kedelapan senyawa alkaloid dihasilkan untuk pembuktian atau tujuan control kualitas. .

.Hasil yang diperoleh dalam tulisan ini dan dua referensi lain menunjukkan bahwa UPLC merupakan alat yang sangat berguna dalam aplikasi kromatografi fingerprint.