ANALISIS DALAM COPTIS CHINENSIS FRANCH DENGAN EKSTRAKSI PELARUT YANG DIPERCEPAT DIKOMBINASIKAN DENGAN ANALISIS ULTRA PERFORMANCE

LIQUID CHROMATOGRAPHY DENGAN FOTODIODA ARRAY DAN DETEKSI SPEKTROMETRI MASSA

Makalah

Disusun oleh : Kelompok VII Maulida Eka Rista Agita Raka P Yuda Anggi Pradista Putri Zakiah B (091810301031) (101810301013) (101810301025) (101810301035)

Andika Ade Kurniawan (101810301048)

JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS JEMBER 2013

BAB 1. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Pengobatan tradisional Cina (TCM) telah menarik lebih dan lebih perhatian dalam beberapa tahun terakhir karena efek terapinya yang dapat saling melengkapi dengan pengobatan barat (western medicine) serta kemampuannya dalam menangani berbagai

masalah penting yang belum terpecahkan oleh obat konvensional. Huanglian (Rhizoma Coptidis) adalah obat herbal yang sering digunakan dalam TCM, memiliki khasiat dapat menekan demam, menghilangkan toxicocis dan detoxifikasi. Akar kering dari Coptis chinensis Franch, Coptis deltoidea C.Y. Cheng et Hsiao and Coptis teeta Wall adalah sumber utama dari Huanglian. Penyusun aktif dari C. chinensis Franch adalah sejumlah alkaloid diantaranya yang utama yaitu alkaloid protoberberine dari berberin, palmatine, coptisine, dan lain-lain dan sebuah aporphinoid alkaloid dari magnoflorine. Alkaloid ini menunjukkan aktivitas antimikroba yang signifikan terhadap berbagai organisme termasuk bakteri, virus, jamur, protozoa, helminthes, dan Chlamydia serta aktivitas anti kanker yang ditunjukkan dengan sifat antineoplastiknya. Aplikasi utama dari berberine adalah untuk pengobatan diare, infeksi parasitus usus, infeksi okular trakoma dan lain-lain. Dalam Official Chinese Pharmacopoeia (edisi 2005), berberine sendiri ditetapkan sebagai spesies penanda untuk evaluasi kualitas Huanglian. Namun, kita percaya bahwa praktek kontrol kualitas untuk Huanglian harus mencakup uji dari serangkaian alkaloid utama daripada spesies tunggal. Selama beberapa dekade terakhir, beberapa metode dapat digunakan untuk penentuan alkaloid dalam ekstrak Rhizoma Coptidis diantaranya Kolorimetri, Thin Layer

Chromatography (TLC), Capilary Electrophoresis, Micellar Electrokinetic Chromatography (MEC), High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) dengan berbagai detertor yang berbeda termasuk spektrometri massa. Metode Kolorimetri hanya menentukan total kandungan alkaloid tapi nonspesifik terhadap alkaloid individu. Metode scanning Micellar Thin Layer Chromatographic telah digunakan untuk kontrol kualitas dari Rhizoma coptidis, tapi metode ini mampu menganalisis hanya tiga dari di alkaloid di atas. HPLC dengan sistem deteksi yang berbeda adalah metode yang paling banyak dipraktekkan untuk analisis alkaloid. Namun dengan metode KCKT, pemisahan alkaloid yang berbeda dalam Rhizoma Coptidis masih memiliki peluang besar untuk dikembangkan. Laporan dalam analisis spectrometri massa dari alkaloid dalam Rhizoma Coptidis telah langka, dengan hanya dua makalah yang

sistem UPLC terdiri dari sistem deteksi dual photodioda (PDA) dan spektrometri massa dengan tandem ion positif elektrospray ionisasi dalam konfigurasi sekuen. Selain itu. ESI-MS/MS dikombinasi dengan UPLC juga telah diterapkan untuk quantifikasi tiga alkaloid utama dan identifikasi alkaloid individu dalam ekstrak C. Ketika digabungkan ke spektrometer massa tandem. chinensis Franch. dan cara ekstraksi yang . Sistem ini memanfaatkan kecepatan linear tinggi dengan kolom yang dikemas dengan partikel berpori 1. Baru-baru ini. waktu ekstraksi yang stabil. studi perbandingan telah dibuat antara kinerja dari teknik UPLC–ESI-MS/MS and HPLC–ESI-TOF-MS. sistem ini menawarkan peningkatan resolusi puncak. dan pada temperatur yang lebih tinggi di atas titik didih dari ekstraksi pelarut. chinensis Franch. palmatine dan jatrorrhizine dalam ekstrak kasar C. Suhu tinggi meningkatkan efisiensi ekstraksi karena itu mengurangi viskositas dari pelarut. kepekaan dan kecepatan analisis. waktu. telah ada minat yang besar dalam penerapan sistem UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography).7 μm. UPLC atau UPLC-MS/MS baru diterapkan untuk analisis komposisi produk alam dan sistem metabolit dalam biologi. ASE telah ditemukan hanya terbatas pada aplikasi dalam analisis TCM.diterbitkan baru-baru ini pada penjabaran struktural dan identifikasi dari empat alkaloid dalam Rhizoma Coptidis dengan electrospray ionization-tandem mass spectrometry. Dalam makalah ini. meskipun teknik ini telah banyak diterapkan untuk ekstraksi bahan alam. Terbaru. dan lain-lain. UPLC berbasis meetode fingerprinting memanfaatkan pola distribusi dari delapan alkaloid utama dalam sampel telah dikembangkan untuk evaluasi kualitas C. tetapi penerapannya pada analisis alkaloid belum dilaporkan lebih jelas. sehingga memungkinkan penetrasi yang lebih baik dari molekul pelarut ke dalam matriks sampel. chinensis Franch. Penggunaan ASE mengurangi waktu total ekstraksi dan meningkatkan efisiensi ekstraksi melalui manipulasi parameter seperti suhu. Abstrak Sebuah metode baru berdasarkan akselerasi ekstraksi pelarut (ASE) dengan analisis Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) telah dikembangkan untuk identifikasi dan kuantifikasi sebagian besar alkaloid dari ekstrak Coptis chinesis. siklus dan pelarut. metode UPLC-PDA dikombinasikan dengan ekstraksi ASE telah dikembangkan untuk penentuan kuantitatif tiga alkaloid utama berberine. Akhirnya. temperatur ekstraksi. Parameter operasional dari ASE adalah pelarut ekstraksi. ASE umumnya beroperasi di bawah suhu tinggi.

Swiss). Sampel juga dianalisis dengan sistem HPLC-ESI-TOF-MS untuk mengkonfirmasi hasil identifikasi. chinesis franch dibeli dari toko obat yang berbeda di daerah Qingdao. Analisis UPLC yang digunakan adalah kolom ACQUITY UPLC BEC C18 yang dielusi oleh fase gerak asetonitril dengan larutan buffer yang terdiri dari 0. TINJAUAN PUSTAKA BAB 3.2 Tujuan BAB 2. Asetonitril untuk HPLC berasal dari Fisher Chemicals (Pittsburg. Air dimurnikan menggunakan sebuah sistem pemurnian air Milli-Q (Milipore.50% asam asetat dan 20 mmol/L amonium asetat. palmatine dan jatrorrhizine telah terdeteksi oleh UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS. Hasilnya mengindikasikan bahwa dari kedua metode UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS sensitif dan dapat diandalkan untuk penentuan alkaloid dalam C. etanol dan lainya didapatkan dari Shanghai Chemical Factory ( Shanghai. Amerika Serikat).optimum. Amonium asetat dan asam asetat didapat dari Fluka ( Buch. Sebuah tandem qudropole spektrometer beroperasi dalam modus scan penuh baik dan mode MS/MS untuk multiple reaction monitoring (MRM) digunakan untuk identifikasi dan analisis kuantitatif 8 alkaloid utama pada ekstrak C. MA. Palmatine Hidroklorida dan Jatrorhizhine Hidroklorida diperoleh dari National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products of China. Tiga dari delapan alkaloid utama yakni berberine. Amerika Serikat). Preparasi Sampel . Fingerprint UPLC berdasarkan distribusi 8 alkaloid utama dapat menyediakan metode yang cepat dan diandalkan untuk pembuktian dan evaluasi kualitas dari obat herbal tradisional cina. 1.2. PA. Bahan kimia lainnya seperti metanol. Standar dari Berberine Hidroklorida.1 Material dan Reagen Tujuh sampel C. chinensis Franch. chinensis Franch. 2. China.Bedfore. China). METODOLOGI PERCOBAAN 2. Tujuh sampel Huanglian dari lokasi yang berbeda dianalisis menggunakan metode yang digunakan.

Ekstraksi diulangi dengan penambahan waktu 2 kali dan ekstrak yang dihasilkan digabung. Residu dilarutkan kembali dengan 50 metanol dan disaring dengan filter membran nilon 0.C. Satu gram sampel bubuk ditambahkan dan 35 mL pelarut ditambahkan dalam labu alas bulat.2. 2.2.45 µm sebelum diinjekkan ke sistem UPLC.45 µm.3. Chinensis Franch kering digiling menggunakan penumbuk dan mortar.2. Ekstraksi Ultrasonik Ekstraksi ultrasonik dilakukan dengan menyampurkan 1 g sampel bubuk dan 35 mL larutan 80% ethanol dengan 0. Ekstraksi diulangi dengan penambahan waktu 2 kali dan ekstrak yang dihasilkan digabung. Chinensis Franch dihomogenasi menggunakan diatomaceous earth pada berat yang sama dan ditempatkan pada sebuah sel ekstraksi.5 % HCl digunakan sebagai pelarut.5% HCl dalam labu alas. Percepatan Ekstrasksi Pelarut Sebuah sistem ASE 100 (Dionex. Preparasi Larutan Standar dan Kurva Kalibrasi Stok larutan standar berberin hidroklorida. Setelah halus serbuk tersebut diayak dengan pengayak baja 0.3. 2. Etanol 80% dengan 0. Ekstrak dievaporasi hingga kering menggunakan rotary evaporator pada suhu 50 C. 2. Ekstraksi Refluks Pemanasan Refluks Ekstraksi dilakukan dalam kondensor dingin dan labu alas bulat 100 mL. Sekitar 1 gram bubuk C.45 µm. Residunya dilarutkan dalam 50 mL etanol dan disaring menggunakan filter membran nilon 0.1.3 mm sebelum ekstraksi. CA. dan dievaporasi hingga kering menggunakan rotary evaporator pada suhu 50 C. Suspensi diekstraksi selama 1 jam pada suhu 90 C dengan perendaman dan penyaringan. Ekstrak gabungan tersebut disaring. Amerika Serikat) dilengkapi bejana baja berukuran 34 mL digunakan untuk ekstraksi cairan bertekanan. 2. palmatin hidroklorida dan jatrorhisin hidroklorida secara berurutan disiapkan dengan melarutkan kira-kira 10 mg setiap senyawa . dimana ditempatkan pada ultrasonik bath selama 30 menit.2. Sunnyvale. Residunya dilarutkan dalam 50 mL etanol dan disaring menggunakan filter membran nilon 0. Sel ekstraksi ditempatkan dalam korsel dan sampel diekstraksi dalam kondisi tekanan rendah.

5% CH3COOH dengan 20mM NH4CH3COO (32:68) pada kecepatan laju alir 1. Potensial kapiler di set pada 3. cone voltages dan energy tumbukan dioptimasi pada dua fragmentasi. aliran gas 11 L/min. C. sebuah kolom (Alltima C18) yang dielusi secara isocratic dengan campuran biner dari Asetonitril dan 0. spektrometri massa di scan pertama kali dari nilai m/z 100 hingga 500 dalam mode full scan untuk menentukan informasi berat molekul alkaloid dalam C.USA) lengkap dengan sumber ESI Z-Spray. Sistem UPLC digabungkan dengan Quattro premier XE tandem quadrupole mass spectrometer (Waters.5% asam asetat dan 20mmol/L NH4CH3COO) dan B (asetonitril) dengan perbandingan 80% A dan 20% B.0 mL/min.2. 2. Campuran larutan standar yang terdiri dari 1. 0.4 Ultra performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry Analisis dilakukan pada sistem perairan ACQUITY UPLCTM (Milford.Chinensis Franch.2 Fase gerak mengandung pelarut A (0.7µm.45 mg/L palmatin hidroklorida dan 0. Setiap kurva kalibrasi dibentuk oleh larutan standar dengan enam konsentrasi berbeda dalam 3 kali pengulangan. Kondisi spektrometer massa dioptimasi untuk deteksi alkaloid. Pemisahan ini dilakukan dengan menggunakan kolom ACQUITY UPLC BEH C18 (1. 2. MA.30 mg/L jatrorrhisin hidroklorida dipreparasi dengan cara melarutkan setiap senyawa murni (yang ditimbang secara akurat) dalam 10 ml metanol. Larutan standar untuk kalibrasi dipreparasi dengan mengencerkan larutan standar menggunakan metanol untuk konsentrasi yang diinginkan.1mm×50 mm).murni dalam 10 mL metanol. Pada 200C dan laju alir 0.5 High-performance liquid chromatography-electrospray ionization-time of flight mass spectrometry Analisis HPLC telah dilakukan dengan sebuah alat 1100HPLC. Volume yang diisikan pada proses injeksi berkisar 10 µL dan pemisahan dilakukan pada 25oC dalam ruang pemanasan secara isothermal. Software yang digunakan dalam analisis ini ialah QS Software analysis. Elusi dimonitor oleh detector sinar diode. mengikuti beberapa ketentuan berikut : suhu 3300C. USA).Chinensis Franc ini dianalisis dalam multiple reaction monitoring (MRM) mode.Chinensis Franch. MA. . Sumber elektrospray dijalankan dalam bentuk ion positif. spektro ini digunakan untuk menganalisis alkaloid dalam C .5kV. Spektroskopi massa yang digunakan ialah G1969A TOF . Milford.29 mg/L Berberin hidroklorida. Pada analisis rutin.

maka dalam penelitian berikut digunakan asam asetat.Chinensis Franch. dan batas quantifikasi (LOQ) diartikan sebagai sepuluh kali tingkat keramaian (Noise) dari blank sampel matriks yang bekerja. fragmentor 100 V.5]. Optimasi UPLC-PDA-MS/kondisi MS Kondisi kromatografi telah dioptimasi menggunakan larutan standard alkaloid dan sampel real C. Namun peningkatan di puncak resolusi dan peak shape yang cukup besar dapat terpantau (diamati) setelah penambahan asam trifluoroasetat atau asam fosfat ke dalam fase gerak. Agar metode pemisahan dapat kompatible dengan menggunakan ESI-MS/MS. Larutan standar (reff) digunakan m/z 121. Fasa terbalik (reversed phase) UPLC dengan gradien elusi yang digunakan berdasarkan pada kondisi yang telah diberikan dalam literatur laporan. Hasil dan Pembahasan 3. Standar deviasi relative dari pengukuran tiga alkaloid diambil sebagai indicator untuk stabilitas system. Penemuan alkaloid ditentukan dengan metode standar addisi.1.tekanan gas 50 psi. palmatine and jatrorrhizine dihitung sebagai standar deviasi relative dari enam pengulangan kerja.050873 untuk kalibrasi massa untuk menghilangkan sistem bias. Hubungan koefisien ditentukan menggunakan sebuah model regresi linier. Variasi pada rasio air untuk asetonitril pada fase gerak dapat meningkatkan pemisahan. Co-elusi epiberine. 2. Dalam penelitian ini menggunakan gradien elusi dan asam asetat-ammonium asetat additive.6 Metode validasi UPLC Kurva kalibrasi dibangun dengan menjalankan enam campuran standar konsentrasi yang berbeda dalam triplicate. Stabilitas sampel dipantau dalam analisis sampel selama 3 hari pada interval setiap 12 jam. Batas deteksi diartikan sebagai tiga kali tingkat keramaian (Noisy) yang diperoleh. Hal tersebut menunjukkan bahwa penambahan ammonium asetat . Tiga alkaloid dalam campuran standar dimasukkan dalam sampel dan hasil penemuan dihitung dengan perbedaan antara sampel yang dimasukkan dengan yang tidak. potensial kapiler 4000V. dan columbamine telah menjadi permasalahan umum yang telah dilaporkan dalam penelitian sebelumnya[3. 3.dan resolusi terbaik dari delapan alkaloid telah didapatkan. jatrorhizine. Reprodusibilitas dari metode ditinjau dengan menjalankan enam replikasi sampel. Ketepatan dari waktu retensi UPLC dan pengukuran area puncak untuk berberine.

Lebih dari delapan puncak telah terdeteksi dalam 5 menit pada kromatogram UPLC-PDA dari ekstrak etanol. (1) magnoflorine.PDA tiga panjang gelombang yang berbeda yakni pada panjang gelombang 230. (4)Epiberberine. (2) tetrahidroscoulerine/tetradehydrocheilanthifolinium.sangat mempengaruhi pemisahan dari jatrorhizine dan columbamine. Gambar 2 menunjukkan bahwa kedelapan senyawa alkaloid telah dipisahkan dengan baik dibawah kondisi optimal. Selain itu waktu yang berlangsung antara –waktu equlibrasi kolom sampel telah dipersingkat.15.(3) Columbamine. (5) Jatrorrhizine.17].5% dan 20 mm amonium asetat kedalam fase gerak memberikan resolusi dan sinyal /noise rasio terbaik jika dibandingkan dengan sistem yang telah dilaporkan dalam laporan sebelumnya [3.Chinensis Franch. (6)Coptisine. Penambahan asam asetat 0. Untuk analisis scan UPLC-MS dari sampel real C. Penggunaan metode UPLC-PDA menghasilkan peningkatan kapasitas puncak yang signifikan. Gambar 2. Metode ini lebih kompatible dengan menggunakan ESI/MS dan meningkatkan pemisahan alkaloid. palmatine dan jatrorrhizine standar (A). (8) berberine. (7) Palmatine. dan 350 telah diamati dan dibandingkan hasilnya. dan oleh sebab itu panjang gelombang tersebut digunakan untuk semua percobaan selanjutnya. ekstrak dari Coptis chinensis Franch (B). 265. Keterangan Kromatogram UPLC-PDA berberine. terutama untuk jatrrorhizine dan columbanie. Noise terendah untuk barberin telah diamati dengan menggunakan panjang gelombang 350 nm. Juga supaya optimasi kondisi deteksi UPLC. kedelapan alkaloid dapat dihasilkan hanya dalam . yang menghasilkan resolusi kromatografi dan peningkatan rasio sinyal-to-noise. Lebar puncak khas yang dihasilkan oleh sistem UPLC berada di urutan 5 hingga 10 s. spektrum massa elektrospay dari alkaloid bervariasi dengan cone volt dan tegangan energi tumbukan. Dalam spektroskopi massa tandem.

muatan ion tunggal [M+] dengan mild cone volt. Energi tumbukan dan cone volt digunakan untuk akuisisi yang dievaluasi untuk respon terbaik dibawah modus positif ESI dengan menambahkan larutan standar berberin dan palmatin. palmatine dan jatrorrhizine . Keterangan: UPLC-ESI-MS/MS kromatogram total arus ion pada ekstrak Coptis chinensis Franch dan MRM UPLC-MS/MS kromatogram dari berberine. Gambar 3. cone volt selalu disetel untuk menghasilkan respon terkuat . Pemantauan beberapa reaksi sering digunakan untuk kuantifikasi pada MS quadrupole tandem. Dalam spektroskopi massa tandem. Dalam penelitian ini energi tumbukan yang berbeda ditentukan melalui percobaan optimasi yang telah diterapkan kepada kedelapan alkaloid. sementara energi tumbukan telah disetel untuk ion prekursor yang lebih sensitif dan produk ion stabil di kedua modus scan massal.

73)dibandingkan dengan dua tingkat lainnya. 3. Jangkauan terbesar dari tiga faktor adalah 0. Faktor eksperimental. sedangkan terkecil adalah 0.Chinensis Franch.Keterangan tabel (1) total ion kromatogram dan kromatogram MRM dari sampel C. Hal ini menunjukkan bahwa tingkat ketiga adalah kondisi terbaik dari faktor A dengan analogi tingkat kedua Faktor B. Ini berarti bahwa faktor A adalah faktor utama dalam kondisi ekstraksi alkaloid di C.36 faktor D. dan tingkat ketiga adlah faktor C tingkat kedua faktor D merupakan kondisi terbaik.87 dari faktor A. Optimasi kondisi ekstraksi dengan desain ortogonal Percobaan ortogonal dilakukan dalam rangka mengoptimalkan kondisi ekstraksi.chinensis Franch yang ditunjukkan pada gambar 3.2. Adapun empat faktor yang terlibat dalam proses ini adalah : (A) temperatur ekstraksi (B) waktu ekstraksi (C) Ekstraksi pelarut (D) jumlah sampel. tingkat yang sesuai dengan desain ortogonal L9 (34) ditunjukkan pada tabel 5. dan untuk kondisi optimum ekstraksi ditetapkan sebagai berikut: 1 gram bubuk sampel kering di ekstrak dengan .4. Tingkat ketiga faktor A memiliki nilai rata-rata sebesar (k3 adalah 8.

Dalam hal ini untuk memperkuat unsur pokok dan penyelidikan pola pemisahan. yang mencirikan jenis alkaloid aporphinoid. dan 315-335. kedelapan alkaloid tersebut menghasilkan ion [M]+ dalam jenis ion positif. 2. Pada jurnal ini. Hasil yang diperoleh untuk semua senyawa target berada dalam 3. dan 5 diperlihatkan di bawah. panjang gelombang serapan maksimum dari puncak target akan teridentifikasi berdasarkan pada perbandingan dari informasi online UV dan MS dengan data literature atau standar. Pada deteksi menggunakan photodiode. Proses pengurangan struktur dari data MS/MS puncak 1. Spektrum UV pada puncak 1 menunjukkan tiga pita serapan kuat pada 225-235. . 3. Franch.etanol 80 5 ( dengan 0. suhu ekstraksi 130 ◦C dan waktu ekstraksi selama 10 menit.2 identifikasi alkaloid pada ekstrak sampel menggunakan UPLC-PDA-ESI-MS Electrospray ionization-mass spectrometry (ESI-MS) adalah teknik ionisasi yag menghasilkan puncak molekul ion yang menonjol tepat di bawah arus. Pengaruh dari waktu ekstraksi ditentukan dengan tiga kali ekstraksi secara berturutturut pada sampel yang sama. dan MS ion molekul dll. Untuk puncak 2-8. Keterangan tersebut memberikan informasi struktur lebih lanjut untuk identifikasi. Pemeriksaan dari spektra UV dan data MS memungkinkan identifikasi sementara dari 8 komponen yang disusun pada Tabel 2. panjang gelombang serapan maksimum (). semua spektrum menunjukkan serapan alkaloid protoberberine yang khas pada 225-245. seperti yang terlihat pada tabel 6. 260-270. Untuk mengevaluai pengulangan dari prosedur ekstraksi. dua kali ekstraksi sudah cukup untuk mengekstrak komponen target sepenuhnya dari Chinensis C. Sifat pemecahan ion dari semua alkaloid diperoleh dengan analisis MS2 yang tertera pada Tabel 2. 270280. dan 335-355. dilakukan serangkaian pengulangan sebanyak enam kali yang telah dilakukan pada hari yang sama dan hari yang berbeda.50 % HCl). Daftar tabel berisis waktu retensi (Rt). collision-induced dissociation (CID) MS/MS spectrum akan terekam.

dan 250. tetradehydroscoulerine or tetradehydrocheilanthifolinium berdasarkan pada hasil literatur. Selanjutnya. Dengan menggabungkan hasil spektrum serapan UV dan karakterisasi pola fragmentasi MS dengan hasil lain pada referensi. 297. dan fragmen netral CO dengan massa molekul 44 Dadari ion molekular (m/z 322).8 dan 250.2 [M-15-29-28]+. 308.0 ([M--CH4--NHCH2--CH3--OH--CO]+) teramati.2 ([M- . Sifat fragmentasi ion dari dua puncak dalam analisis yang MS2 tercantum pada Tabel 2 sangat mirip. sementara ion dengan m/z 250.2 [M-15]+. Puncak 2 dan puncak 5 dengan waktu retensi berturut-turut 3. puncak 2 sementara dapat diidentifikasi sebagai tetradehydroscoulerine or tetradehydro- cheilanthifolinium. Pada percobaan MS2.2. sesuai dengan struktur alkaloid aporphinoid. dua ion fragmen menarik terlihat pada m/z 277.2 ([M-CH3-H]+). 277.19 dan 3. 279. radikal hidrogen. ion yang dominan muncul pada m/z 307.5 ([M]+). Oleh karena itu.2 dan 279. puncak tersebut diidentifikasi sebagai Magnoflorin. Dengan perbandingan menggunakan data literatur dan massa molekul yang alkaloid yang diketahui dalam Coptidis Rhizoma. Ion dominan muncul pada m/z 307. Tidak ada laporan mengenai identifikasi berberrubine menggunakan ESIMS.1 ([M--CH4--NHCH2]+). Fragmen ion yang teramati 322. 281.2 ([M-CH3-CH3]+).2 [M-1528]+.2 dihasilkan oleh hilagnya fragmen netral CO yang lain dari ion m/z 277. Ion dengan m/z 277. ions 342.0 ([M--CH4--NHCH2--CH3--OH]+. 265. Berat molekul pada puncak 2 adalah 322 dan hal itu bisa diidentifikasi sementara sebagai berberrubine.8 [M-15-29]+.8 ([M--CH4--NHCH2-CH3]+).Puncak 1 dapat diamati pada Gambar 2 dan massa yang terdeteksi adalah 342.8.45 menit (Gambar 2b) memiliki massa molekul yang sama berdasarkan pada analisi MS. Pada spektra MS2. Dua senyawa tersebut memiliki struktur isomer yang mirip dengan komposisi penyusun yang sama. 294. 237. puncak 1 diidentifikasi sebagai Magnoflorin dengan karakteristik pola fragmentasi tersebut.2 yang sesuai dengan penghapusan metil radikal diikuti dengan hilangnya fragmen netral dengan massa molekul 28 Da (CO) dari ion molekular (m/z 322).8 dihasilkan oleh hilangnya radikal metil.

7 ([M-CH3-CH3-CO]+). Selain itu system UPLC memerlukan pelarut yang sedikit karena digunakan dalam laju aliran yang lebih kecil (0.2 mL/menit). Pemisahan HPLC isocratic membutukan sebuah kolom (250 mm x 4. 3.6 mm) dan waktu total 20 menit. Akhirnya puncak 5 dengan tegas teridentifikasi sebagai Jatrorrhizine dengan menggabungkan waktu retensi dengan Jatrorrhizine standar. dan puncak 3 teridentifikasi sebagai Columbamine. Tipe kromatogram massa (Total Ion Chromatography (TIC))dari ekstraksi Rhizoma Coptidis dengan HPLC-ESI-TOF-MS yang ditunjukkan dalam gambar berikut : Ionisasi permukaan electrospray dalam positif mode juga digunakan dan dari semua sample menunjukkan kelimpahan ion [M+] seperti dalam table berikut : . Sampel dijalankan oleh HPLC-ESI-TOF-MS untuk mengidentifikasi spesies tujuan.3 Perbandingan dengan LC-DAD-ESI-TOF-MS Perbandingan pembelajaran dihasilkan antara teknik HPLC dengan UPLC.CH3-H-CO]+). Sebaliknya UPLC menghasilkan perbandingan puncak pemisahan tetapi membutuhkan waktu kerja hanya 5 menit. Dua puncak teridentifikasi sebagai Columbamine dan Jatrorrhizine. and 279.

palmatin dan jathorisin sebagai indikator hasil. Pada analisis TOF-MS. terlebih lagi distribusi massa isotropic secara teori cocok dengan pengukuran oleh TOF-MS pada kedua intensitas dan posisi m/z yang ditunjukkan dalam gambar (B) : Dengan mengkombinasikan informasi tersebut dengan Double Bond Equivalent (DBE).4. yakni menggunakan total hasil ekstraksi dan rasio relatif ekstraksi berberin. H. Dibandingkan dengan perlakuan lainyang mungkin . unsur C. Parameter tersebut dapat dioptimasi dengan pendekatan univariate . . C20H18NO4 memiliki massa error yang lebih sedikit. O. selain pengukuran massa. analit dapat diidentifikasi dengan jelas sebagai berberin. distribusi massa isotropic juga menginformasikan tentang komposisi unsur. waktu ekstraksi statis.1. Analisis Berberin dan homologinya. Pengembangan Metode Ekstraksi Kondisi ekstraksi seperti pelarut ekstraksi. ambang batas akurasi yang diterima secara luas untuk konfirmasi komposisi unsur adalah 5 ppm. volume pembilasan dan siklus ekstraksi adalah parameter yang penting untuk mengontrol hasil ekstraksi. temperatur. Dengan demikian keakuratan pengukuran massa memungkinkan untuk puncak komposisi unsur. Kedelapan senyawa yang dideteksi dan diidentifikasi secara sukses dengan UPLC–ESIMS/MS begitu pula dengan HPLC–ESI-MS/MS.Kesalahan keakuratan pengukuran masa kurang dari 2 ppm dalam semua kasus. 3. N dipilih sebagai unsur yang memungkinkan.

50% HCl) dan 60% metanol (v/v) terlarut (dengan 0. Kondisi ASE yang digunakan antara lain : 100 C untuk temperatur ekstraksi. metanol terlarut dan etanol terlarut adalah yang pertama kali ditaksir.50% HCl) adalah yang tertinggi diikuti dengan penurunan tingkatan yakni 80% etanol (v/v) terlarut (dengan 0.50% HCl) sebagai pelarut dengan 10 menit untuk waktu statis ekstraksi.50% HCl). Eksperimen ekstraksi dilakukan menggunakan 80% etanol terlarut (dengan 0. Hasil ditunjukkan dengan Gambar 6. Saat 60% (v/v) etanol terlarut (dengan 0. Sejak temperatur sangat berpengaruh pada efisiensi ekstraksi. 80% etanol terlarut (dengan 0. 60% volume pembilasan dengan dua siklus ekstraksi. rangkaian eksperimen pada temperatur yang berbeda (70-170 C) ditunjukkan untuk menentukan temperatur ekstraksi yang paling baik. Masalah dapat diatasi dengan menggunakan rasio pengurangan air dalam sistem pelarut.50% HCl) digunakan sebagai pelarut ekstraksi.5% HCl). palmatin dan jathorisin yang diekstrak dalam 60% (v/v) etanol terlarut (dengan 0. e..Efisiensi ekstraksi dari tiga pelarut yakni metanol. Sistem dari enam komposisi pelarut dibandingkan dalam Table 4 : Jumlah relatif dari berberin.g. . Salah satu problem yang ditemukan dalam ASE adalah material yang berupa tanaman mempunyai kecenderungan dalam menyerap air selama perlakuan ekstraksi. ditemukan hambatan dalam sistem ASE. 60% volume pembilasan dengan dua siklus ekstraksi. 10 menit untuk waktu statis ekstraksi.

15 menit ) ditunjukkan dengan mengikuti kondisi ASE : 130 C untuk temperatur ekstraksi. Dengan demikian . Hasilnya ditunjukkan pada Gambar 7. Chinensis Franch. 7. perbedaan waktu ekstraksi ( 5.130 C ditentukan sebagai temperatur ekstraksi. . 13. 60% untuk volume pembilasan dengan dua siklus ekstraksi. Penurunan yang terjadi pada efisiensi ekstrasi kemungkinan berkaitan dengan degradasi dari ketiga senyawa tersebut pada saat temperatur diatas 130 C. Untuk menentukan jika waktu statis ekstraksi dapat mempengaruhi efisiensi ekstraksi alkaloid dalam C. 10.Efisiensi ekstraksi dari semua tiga alkaloid utama tetap konstan hingga suhu 130 C dan menurun pada temperatur yang lebih tinggi.

LOQs dan LODs dengan UPLC-PDA-MS/MS untuk 3 alkaloid dari berberine. Linearitas dari kurva kalibrasi telah diverifikasi dengan studi korelasi dan koefisien korelasi adalah semua lebih baik dari 0. volume pembilasan yang dipakai adalah 60%. Linearitas dan Limit Deteksi Hasil studi kalibrasi. palmatine dan jatrorrizine dirangkum dalam tabel 8.5 Validasi dari UPLC-PDA-MS/MS 3. 60.9984. Rentang dinamis linear kurva kalibrasi untuk kedua penentuan UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS melebihi dua order besaran. efisisensi ekstraksi dari ketiga alkaloid utama menurun secara signifikan.1.5. 40. 80% ) tidak memberikan pengaruh yang signifikan terhadap efisiensi ekstrasi senyawa target dalam C. Kedua prosedur memungkinkan kuantitasi dalam studi kisaran mempelajari meskipun batas kuantifikasi untuk UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS dibedakan. Jadi waktu statis ekstraksi yang digunakan adalah 10 menit dalam satu kali siklus ekstraksi.Kenaikan waktu statis ekstrasi dari 7 hingga 10 menit tidak mempengaruhi ekstraksi senyawa target.5 μgL-1 untuk 3 alkaloid yang lebih baik daripada yang dilaporkan menggunakan HPCE-UV.2–1. Chinensis Franch. Setiap deteksi batas dari teknik UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS adalah dalam rentang 60–75 and 1. LOQs dan LODs diperoleh dengan UPLC-MS/MS lebih kecil . 3. Jadi. Saat waktu statis ekstrasi diatas 10 menit. Volume pembilasan ( 20.

Reprodusibilitas. Perolehan kembali berada dalam rentang 94.S. .0% dan nilai R.52 % (n=6) untuk analisis PDA dan 2. Recovery Perolehan kembali dari tiga alkaloid ditentukan dengan UPLC-MS/MS menggunakan metode standart tambahan dimana tiga level analisis dari sampel yang berduri (tajam) dilakukan dalam hari yang sama.dengan UPLC-PDA untuk 3 alkaloid. dan Stabilitas Presisi masing-masing daerah puncak pengukuran PDA dan MS/MS yang ditemukan lebik baik dari 1.94-3.63 % (R.2.0 %.S.72 % untuk PDA dan 3.2-103.14 % dari enam injeksi replikasi. Variasi dari waktu retensi dari semua puncak adalah kurang dari 0. MS/MS lebih cocok untuk penentuan alkaloid pada rentang konsentrasi rendah karena sensitivitasnya lebih dari 50 kali lipat.58-2. 3. Hasil ringkasan dalam tabel 10.5.S.D. 3. Stabilitas penyimpanan (R. menunjukkan metode recovery dan presisi yang baik. Rentang dinamis linear dari quantitasi dua teknik juga berbeda.S. berada di kisaran dari 2.D) dari pengukurang tiga alkaloid adalah 2.D dari ketiga alkaloid dari 3 injeksi replikasi adalah lebih baik dari 5. Presisi (R.68 % untuk analisis MS/MS (tabel 9).47-3.11 % dari semua alkaloid target. Presisi. Tabel 9 menunjukkan bahwa metode UPLC dengan masing-masing PDA (350 nm) dan deteksi MS/MS menunjukkan presisi yang baik untuk ketiga alkaloid tetapi presisi yang pertama tinggi.3..5.18-2.11 % (n=6) untuk penentuan MS/MS.D) dari metoda yang diusulkan berdasarkan enam suntikan replikasi. n=6) dan waktu retensi lebih baik dari 0.

3. Chinensis Franch terasa berbeda. berberin adalah alkaloid yang paling melimpah dalam C. konsisten dengan laporan sebelumnya. Variasi bisa terjadi karena berbagai faktor seperti sumber geografis. Hasil kita menunjukkan bahwa kandungan dari tiga alkaloid utama dalam tujuh sampel C.5. panen. .4. Di antara tiga alkaloid. Chinensis Franch yang berbeda. Kromatogram yang mewakili dari ekstrak C. Masing-masing sampel diekstraksi dan dianalisis tiga rangkap. budidaya. Chinensis Franch. Chinensis Franch ini ditunjukkan pada gambar 2 dan hasil dari alkaloid individu dirangkum dalam tabel 11. Kuantifikasi MS dari alkaloid Eningkatan metode UPLC-MS/MS diaplikasikan untuk penentuan tiga alkaloid dalam sampel C. penyimpanan dan pemrosesan dari ramuan.

Cjininsis Franch. tetapi variasi besar dari puncak intensitas relative tampak jelas. chinensis Franch samples using UPLC Alkaloid – alkaloid yang berbeda diketahui memiliki perbedaan bioaktivitas yang luas.6 Fingerprint analysis of representative C. Pada Gambar berikut diungkapkan bahwa distribusi dari kedelapan puncak alkaloid adalah mirip disekitar sample tersebut . Tidak hanya menyediakan profil senyawa yang ditandai tetapi juga komponen aktif lainnya. Dengan demikian pola distribusi dari kedelapan alkaloid diharapkan menjadi representasi yang lebih baik dari keseluruhan bioaktivitas dari C.3. Penilaian kualitas obat – obatan herbal selalu menjadi tantangan karena keragaman multi komponen matriks. Metode kromatografi fingerprint menjadi salah satu yang sering diterapkan. Jika dibandingkan waktu kerja dari UPLC memiliki waktu yang Sembilan kali lebih cepat dibandingkan dengan HPLC (7 menit : 60 menit). karena Fingerprint UPLC dari kedelapan senyawa alkaloid dihasilkan untuk pembuktian atau tujuan control kualitas. .

.Hasil yang diperoleh dalam tulisan ini dan dua referensi lain menunjukkan bahwa UPLC merupakan alat yang sangat berguna dalam aplikasi kromatografi fingerprint.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful