P. 1
makalah kromatografi

makalah kromatografi

|Views: 282|Likes:
Published by Agita Raka

More info:

Published by: Agita Raka on Apr 14, 2013
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOCX, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

05/20/2015

pdf

text

original

ANALISIS DALAM COPTIS CHINENSIS FRANCH DENGAN EKSTRAKSI PELARUT YANG DIPERCEPAT DIKOMBINASIKAN DENGAN ANALISIS ULTRA PERFORMANCE

LIQUID CHROMATOGRAPHY DENGAN FOTODIODA ARRAY DAN DETEKSI SPEKTROMETRI MASSA

Makalah

Disusun oleh : Kelompok VII Maulida Eka Rista Agita Raka P Yuda Anggi Pradista Putri Zakiah B (091810301031) (101810301013) (101810301025) (101810301035)

Andika Ade Kurniawan (101810301048)

JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS JEMBER 2013

BAB 1. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Pengobatan tradisional Cina (TCM) telah menarik lebih dan lebih perhatian dalam beberapa tahun terakhir karena efek terapinya yang dapat saling melengkapi dengan pengobatan barat (western medicine) serta kemampuannya dalam menangani berbagai

masalah penting yang belum terpecahkan oleh obat konvensional. Huanglian (Rhizoma Coptidis) adalah obat herbal yang sering digunakan dalam TCM, memiliki khasiat dapat menekan demam, menghilangkan toxicocis dan detoxifikasi. Akar kering dari Coptis chinensis Franch, Coptis deltoidea C.Y. Cheng et Hsiao and Coptis teeta Wall adalah sumber utama dari Huanglian. Penyusun aktif dari C. chinensis Franch adalah sejumlah alkaloid diantaranya yang utama yaitu alkaloid protoberberine dari berberin, palmatine, coptisine, dan lain-lain dan sebuah aporphinoid alkaloid dari magnoflorine. Alkaloid ini menunjukkan aktivitas antimikroba yang signifikan terhadap berbagai organisme termasuk bakteri, virus, jamur, protozoa, helminthes, dan Chlamydia serta aktivitas anti kanker yang ditunjukkan dengan sifat antineoplastiknya. Aplikasi utama dari berberine adalah untuk pengobatan diare, infeksi parasitus usus, infeksi okular trakoma dan lain-lain. Dalam Official Chinese Pharmacopoeia (edisi 2005), berberine sendiri ditetapkan sebagai spesies penanda untuk evaluasi kualitas Huanglian. Namun, kita percaya bahwa praktek kontrol kualitas untuk Huanglian harus mencakup uji dari serangkaian alkaloid utama daripada spesies tunggal. Selama beberapa dekade terakhir, beberapa metode dapat digunakan untuk penentuan alkaloid dalam ekstrak Rhizoma Coptidis diantaranya Kolorimetri, Thin Layer

Chromatography (TLC), Capilary Electrophoresis, Micellar Electrokinetic Chromatography (MEC), High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) dengan berbagai detertor yang berbeda termasuk spektrometri massa. Metode Kolorimetri hanya menentukan total kandungan alkaloid tapi nonspesifik terhadap alkaloid individu. Metode scanning Micellar Thin Layer Chromatographic telah digunakan untuk kontrol kualitas dari Rhizoma coptidis, tapi metode ini mampu menganalisis hanya tiga dari di alkaloid di atas. HPLC dengan sistem deteksi yang berbeda adalah metode yang paling banyak dipraktekkan untuk analisis alkaloid. Namun dengan metode KCKT, pemisahan alkaloid yang berbeda dalam Rhizoma Coptidis masih memiliki peluang besar untuk dikembangkan. Laporan dalam analisis spectrometri massa dari alkaloid dalam Rhizoma Coptidis telah langka, dengan hanya dua makalah yang

studi perbandingan telah dibuat antara kinerja dari teknik UPLC–ESI-MS/MS and HPLC–ESI-TOF-MS. ESI-MS/MS dikombinasi dengan UPLC juga telah diterapkan untuk quantifikasi tiga alkaloid utama dan identifikasi alkaloid individu dalam ekstrak C. sehingga memungkinkan penetrasi yang lebih baik dari molekul pelarut ke dalam matriks sampel. meskipun teknik ini telah banyak diterapkan untuk ekstraksi bahan alam. Dalam makalah ini. waktu ekstraksi yang stabil. waktu. Ketika digabungkan ke spektrometer massa tandem. UPLC berbasis meetode fingerprinting memanfaatkan pola distribusi dari delapan alkaloid utama dalam sampel telah dikembangkan untuk evaluasi kualitas C. Akhirnya. temperatur ekstraksi. Terbaru.7 μm. tetapi penerapannya pada analisis alkaloid belum dilaporkan lebih jelas. kepekaan dan kecepatan analisis. chinensis Franch. palmatine dan jatrorrhizine dalam ekstrak kasar C. dan lain-lain. Suhu tinggi meningkatkan efisiensi ekstraksi karena itu mengurangi viskositas dari pelarut. sistem UPLC terdiri dari sistem deteksi dual photodioda (PDA) dan spektrometri massa dengan tandem ion positif elektrospray ionisasi dalam konfigurasi sekuen. ASE telah ditemukan hanya terbatas pada aplikasi dalam analisis TCM. metode UPLC-PDA dikombinasikan dengan ekstraksi ASE telah dikembangkan untuk penentuan kuantitatif tiga alkaloid utama berberine. Parameter operasional dari ASE adalah pelarut ekstraksi. chinensis Franch.diterbitkan baru-baru ini pada penjabaran struktural dan identifikasi dari empat alkaloid dalam Rhizoma Coptidis dengan electrospray ionization-tandem mass spectrometry. UPLC atau UPLC-MS/MS baru diterapkan untuk analisis komposisi produk alam dan sistem metabolit dalam biologi. Selain itu. Sistem ini memanfaatkan kecepatan linear tinggi dengan kolom yang dikemas dengan partikel berpori 1. dan pada temperatur yang lebih tinggi di atas titik didih dari ekstraksi pelarut. dan cara ekstraksi yang . ASE umumnya beroperasi di bawah suhu tinggi. telah ada minat yang besar dalam penerapan sistem UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography). Penggunaan ASE mengurangi waktu total ekstraksi dan meningkatkan efisiensi ekstraksi melalui manipulasi parameter seperti suhu. siklus dan pelarut. sistem ini menawarkan peningkatan resolusi puncak. chinensis Franch. Abstrak Sebuah metode baru berdasarkan akselerasi ekstraksi pelarut (ASE) dengan analisis Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) telah dikembangkan untuk identifikasi dan kuantifikasi sebagian besar alkaloid dari ekstrak Coptis chinesis. Baru-baru ini.

2. chinensis Franch. Analisis UPLC yang digunakan adalah kolom ACQUITY UPLC BEC C18 yang dielusi oleh fase gerak asetonitril dengan larutan buffer yang terdiri dari 0. Sampel juga dianalisis dengan sistem HPLC-ESI-TOF-MS untuk mengkonfirmasi hasil identifikasi. Bahan kimia lainnya seperti metanol. Standar dari Berberine Hidroklorida. chinensis Franch. 1. METODOLOGI PERCOBAAN 2. Swiss). Fingerprint UPLC berdasarkan distribusi 8 alkaloid utama dapat menyediakan metode yang cepat dan diandalkan untuk pembuktian dan evaluasi kualitas dari obat herbal tradisional cina.2. chinesis franch dibeli dari toko obat yang berbeda di daerah Qingdao. Amonium asetat dan asam asetat didapat dari Fluka ( Buch. China). Asetonitril untuk HPLC berasal dari Fisher Chemicals (Pittsburg. TINJAUAN PUSTAKA BAB 3. Sebuah tandem qudropole spektrometer beroperasi dalam modus scan penuh baik dan mode MS/MS untuk multiple reaction monitoring (MRM) digunakan untuk identifikasi dan analisis kuantitatif 8 alkaloid utama pada ekstrak C.1 Material dan Reagen Tujuh sampel C. Tiga dari delapan alkaloid utama yakni berberine.2 Tujuan BAB 2. Hasilnya mengindikasikan bahwa dari kedua metode UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS sensitif dan dapat diandalkan untuk penentuan alkaloid dalam C.optimum. palmatine dan jatrorrhizine telah terdeteksi oleh UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS. Air dimurnikan menggunakan sebuah sistem pemurnian air Milli-Q (Milipore. Tujuh sampel Huanglian dari lokasi yang berbeda dianalisis menggunakan metode yang digunakan. MA. PA.Bedfore. Amerika Serikat). Palmatine Hidroklorida dan Jatrorhizhine Hidroklorida diperoleh dari National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products of China.50% asam asetat dan 20 mmol/L amonium asetat. Preparasi Sampel . Amerika Serikat). etanol dan lainya didapatkan dari Shanghai Chemical Factory ( Shanghai. China.

C. Ekstrak dievaporasi hingga kering menggunakan rotary evaporator pada suhu 50 C. palmatin hidroklorida dan jatrorhisin hidroklorida secara berurutan disiapkan dengan melarutkan kira-kira 10 mg setiap senyawa . Amerika Serikat) dilengkapi bejana baja berukuran 34 mL digunakan untuk ekstraksi cairan bertekanan. 2. Ekstraksi diulangi dengan penambahan waktu 2 kali dan ekstrak yang dihasilkan digabung. Sekitar 1 gram bubuk C. Sel ekstraksi ditempatkan dalam korsel dan sampel diekstraksi dalam kondisi tekanan rendah.45 µm.2.5 % HCl digunakan sebagai pelarut. 2. Preparasi Larutan Standar dan Kurva Kalibrasi Stok larutan standar berberin hidroklorida. CA. Residu dilarutkan kembali dengan 50 metanol dan disaring dengan filter membran nilon 0. Residunya dilarutkan dalam 50 mL etanol dan disaring menggunakan filter membran nilon 0. Ekstraksi diulangi dengan penambahan waktu 2 kali dan ekstrak yang dihasilkan digabung. Chinensis Franch kering digiling menggunakan penumbuk dan mortar. Setelah halus serbuk tersebut diayak dengan pengayak baja 0.2. Sunnyvale.45 µm. Ekstrak gabungan tersebut disaring.3 mm sebelum ekstraksi.3. Satu gram sampel bubuk ditambahkan dan 35 mL pelarut ditambahkan dalam labu alas bulat. dan dievaporasi hingga kering menggunakan rotary evaporator pada suhu 50 C. Ekstraksi Refluks Pemanasan Refluks Ekstraksi dilakukan dalam kondensor dingin dan labu alas bulat 100 mL. Suspensi diekstraksi selama 1 jam pada suhu 90 C dengan perendaman dan penyaringan.2.3. Percepatan Ekstrasksi Pelarut Sebuah sistem ASE 100 (Dionex.5% HCl dalam labu alas. Chinensis Franch dihomogenasi menggunakan diatomaceous earth pada berat yang sama dan ditempatkan pada sebuah sel ekstraksi. Etanol 80% dengan 0.45 µm sebelum diinjekkan ke sistem UPLC. Residunya dilarutkan dalam 50 mL etanol dan disaring menggunakan filter membran nilon 0.1. 2.2. Ekstraksi Ultrasonik Ekstraksi ultrasonik dilakukan dengan menyampurkan 1 g sampel bubuk dan 35 mL larutan 80% ethanol dengan 0. 2. dimana ditempatkan pada ultrasonik bath selama 30 menit.

Chinensis Franch.5% asam asetat dan 20mmol/L NH4CH3COO) dan B (asetonitril) dengan perbandingan 80% A dan 20% B.29 mg/L Berberin hidroklorida. Campuran larutan standar yang terdiri dari 1.Chinensis Franc ini dianalisis dalam multiple reaction monitoring (MRM) mode. Milford. spektro ini digunakan untuk menganalisis alkaloid dalam C . MA.7µm. 2. Volume yang diisikan pada proses injeksi berkisar 10 µL dan pemisahan dilakukan pada 25oC dalam ruang pemanasan secara isothermal. Elusi dimonitor oleh detector sinar diode. spektrometri massa di scan pertama kali dari nilai m/z 100 hingga 500 dalam mode full scan untuk menentukan informasi berat molekul alkaloid dalam C.4 Ultra performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry Analisis dilakukan pada sistem perairan ACQUITY UPLCTM (Milford.5% CH3COOH dengan 20mM NH4CH3COO (32:68) pada kecepatan laju alir 1. C.2. mengikuti beberapa ketentuan berikut : suhu 3300C.1mm×50 mm). MA. USA). Larutan standar untuk kalibrasi dipreparasi dengan mengencerkan larutan standar menggunakan metanol untuk konsentrasi yang diinginkan.5 High-performance liquid chromatography-electrospray ionization-time of flight mass spectrometry Analisis HPLC telah dilakukan dengan sebuah alat 1100HPLC. 0. cone voltages dan energy tumbukan dioptimasi pada dua fragmentasi.30 mg/L jatrorrhisin hidroklorida dipreparasi dengan cara melarutkan setiap senyawa murni (yang ditimbang secara akurat) dalam 10 ml metanol. Kondisi spektrometer massa dioptimasi untuk deteksi alkaloid. 2. Spektroskopi massa yang digunakan ialah G1969A TOF . Potensial kapiler di set pada 3. aliran gas 11 L/min.5kV.0 mL/min. Pada 200C dan laju alir 0.murni dalam 10 mL metanol. Software yang digunakan dalam analisis ini ialah QS Software analysis.2 Fase gerak mengandung pelarut A (0.USA) lengkap dengan sumber ESI Z-Spray.45 mg/L palmatin hidroklorida dan 0.Chinensis Franch. Setiap kurva kalibrasi dibentuk oleh larutan standar dengan enam konsentrasi berbeda dalam 3 kali pengulangan. . Sumber elektrospray dijalankan dalam bentuk ion positif. Pada analisis rutin. Sistem UPLC digabungkan dengan Quattro premier XE tandem quadrupole mass spectrometer (Waters. sebuah kolom (Alltima C18) yang dielusi secara isocratic dengan campuran biner dari Asetonitril dan 0. Pemisahan ini dilakukan dengan menggunakan kolom ACQUITY UPLC BEH C18 (1.

Stabilitas sampel dipantau dalam analisis sampel selama 3 hari pada interval setiap 12 jam.1.5].Chinensis Franch. Reprodusibilitas dari metode ditinjau dengan menjalankan enam replikasi sampel. Namun peningkatan di puncak resolusi dan peak shape yang cukup besar dapat terpantau (diamati) setelah penambahan asam trifluoroasetat atau asam fosfat ke dalam fase gerak. Larutan standar (reff) digunakan m/z 121. Penemuan alkaloid ditentukan dengan metode standar addisi. Hal tersebut menunjukkan bahwa penambahan ammonium asetat . Hubungan koefisien ditentukan menggunakan sebuah model regresi linier. maka dalam penelitian berikut digunakan asam asetat. 2. Batas deteksi diartikan sebagai tiga kali tingkat keramaian (Noisy) yang diperoleh.050873 untuk kalibrasi massa untuk menghilangkan sistem bias. fragmentor 100 V. Agar metode pemisahan dapat kompatible dengan menggunakan ESI-MS/MS. dan columbamine telah menjadi permasalahan umum yang telah dilaporkan dalam penelitian sebelumnya[3. Tiga alkaloid dalam campuran standar dimasukkan dalam sampel dan hasil penemuan dihitung dengan perbedaan antara sampel yang dimasukkan dengan yang tidak. Variasi pada rasio air untuk asetonitril pada fase gerak dapat meningkatkan pemisahan. Co-elusi epiberine.dan resolusi terbaik dari delapan alkaloid telah didapatkan. jatrorhizine.6 Metode validasi UPLC Kurva kalibrasi dibangun dengan menjalankan enam campuran standar konsentrasi yang berbeda dalam triplicate. 3. potensial kapiler 4000V. Standar deviasi relative dari pengukuran tiga alkaloid diambil sebagai indicator untuk stabilitas system. Hasil dan Pembahasan 3. palmatine and jatrorrhizine dihitung sebagai standar deviasi relative dari enam pengulangan kerja. Ketepatan dari waktu retensi UPLC dan pengukuran area puncak untuk berberine. dan batas quantifikasi (LOQ) diartikan sebagai sepuluh kali tingkat keramaian (Noise) dari blank sampel matriks yang bekerja.tekanan gas 50 psi. Optimasi UPLC-PDA-MS/kondisi MS Kondisi kromatografi telah dioptimasi menggunakan larutan standard alkaloid dan sampel real C. Fasa terbalik (reversed phase) UPLC dengan gradien elusi yang digunakan berdasarkan pada kondisi yang telah diberikan dalam literatur laporan. Dalam penelitian ini menggunakan gradien elusi dan asam asetat-ammonium asetat additive.

spektrum massa elektrospay dari alkaloid bervariasi dengan cone volt dan tegangan energi tumbukan. 265. Noise terendah untuk barberin telah diamati dengan menggunakan panjang gelombang 350 nm. Dalam spektroskopi massa tandem. Keterangan Kromatogram UPLC-PDA berberine. (6)Coptisine. Penggunaan metode UPLC-PDA menghasilkan peningkatan kapasitas puncak yang signifikan. Lebih dari delapan puncak telah terdeteksi dalam 5 menit pada kromatogram UPLC-PDA dari ekstrak etanol. (2) tetrahidroscoulerine/tetradehydrocheilanthifolinium. Metode ini lebih kompatible dengan menggunakan ESI/MS dan meningkatkan pemisahan alkaloid. (8) berberine. (4)Epiberberine.15. terutama untuk jatrrorhizine dan columbanie. Untuk analisis scan UPLC-MS dari sampel real C.17]. (1) magnoflorine. Penambahan asam asetat 0. Lebar puncak khas yang dihasilkan oleh sistem UPLC berada di urutan 5 hingga 10 s. kedelapan alkaloid dapat dihasilkan hanya dalam . (5) Jatrorrhizine. Juga supaya optimasi kondisi deteksi UPLC. Gambar 2 menunjukkan bahwa kedelapan senyawa alkaloid telah dipisahkan dengan baik dibawah kondisi optimal. yang menghasilkan resolusi kromatografi dan peningkatan rasio sinyal-to-noise. dan oleh sebab itu panjang gelombang tersebut digunakan untuk semua percobaan selanjutnya.PDA tiga panjang gelombang yang berbeda yakni pada panjang gelombang 230. palmatine dan jatrorrhizine standar (A).5% dan 20 mm amonium asetat kedalam fase gerak memberikan resolusi dan sinyal /noise rasio terbaik jika dibandingkan dengan sistem yang telah dilaporkan dalam laporan sebelumnya [3.sangat mempengaruhi pemisahan dari jatrorhizine dan columbamine. Gambar 2.(3) Columbamine. dan 350 telah diamati dan dibandingkan hasilnya.Chinensis Franch. ekstrak dari Coptis chinensis Franch (B). Selain itu waktu yang berlangsung antara –waktu equlibrasi kolom sampel telah dipersingkat. (7) Palmatine.

Dalam spektroskopi massa tandem. Energi tumbukan dan cone volt digunakan untuk akuisisi yang dievaluasi untuk respon terbaik dibawah modus positif ESI dengan menambahkan larutan standar berberin dan palmatin. Gambar 3. Pemantauan beberapa reaksi sering digunakan untuk kuantifikasi pada MS quadrupole tandem.muatan ion tunggal [M+] dengan mild cone volt. sementara energi tumbukan telah disetel untuk ion prekursor yang lebih sensitif dan produk ion stabil di kedua modus scan massal. palmatine dan jatrorrhizine . Keterangan: UPLC-ESI-MS/MS kromatogram total arus ion pada ekstrak Coptis chinensis Franch dan MRM UPLC-MS/MS kromatogram dari berberine. cone volt selalu disetel untuk menghasilkan respon terkuat . Dalam penelitian ini energi tumbukan yang berbeda ditentukan melalui percobaan optimasi yang telah diterapkan kepada kedelapan alkaloid.

Hal ini menunjukkan bahwa tingkat ketiga adalah kondisi terbaik dari faktor A dengan analogi tingkat kedua Faktor B.4. Optimasi kondisi ekstraksi dengan desain ortogonal Percobaan ortogonal dilakukan dalam rangka mengoptimalkan kondisi ekstraksi.36 faktor D. dan tingkat ketiga adlah faktor C tingkat kedua faktor D merupakan kondisi terbaik.2. Jangkauan terbesar dari tiga faktor adalah 0. dan untuk kondisi optimum ekstraksi ditetapkan sebagai berikut: 1 gram bubuk sampel kering di ekstrak dengan .73)dibandingkan dengan dua tingkat lainnya.Keterangan tabel (1) total ion kromatogram dan kromatogram MRM dari sampel C.chinensis Franch yang ditunjukkan pada gambar 3. tingkat yang sesuai dengan desain ortogonal L9 (34) ditunjukkan pada tabel 5. Faktor eksperimental. Adapun empat faktor yang terlibat dalam proses ini adalah : (A) temperatur ekstraksi (B) waktu ekstraksi (C) Ekstraksi pelarut (D) jumlah sampel. Ini berarti bahwa faktor A adalah faktor utama dalam kondisi ekstraksi alkaloid di C.87 dari faktor A. sedangkan terkecil adalah 0.Chinensis Franch. 3. Tingkat ketiga faktor A memiliki nilai rata-rata sebesar (k3 adalah 8.

dan 5 diperlihatkan di bawah. kedelapan alkaloid tersebut menghasilkan ion [M]+ dalam jenis ion positif. collision-induced dissociation (CID) MS/MS spectrum akan terekam.50 % HCl). 3. panjang gelombang serapan maksimum (). semua spektrum menunjukkan serapan alkaloid protoberberine yang khas pada 225-245.etanol 80 5 ( dengan 0. dilakukan serangkaian pengulangan sebanyak enam kali yang telah dilakukan pada hari yang sama dan hari yang berbeda. Untuk mengevaluai pengulangan dari prosedur ekstraksi. dan 315-335. Dalam hal ini untuk memperkuat unsur pokok dan penyelidikan pola pemisahan.2 identifikasi alkaloid pada ekstrak sampel menggunakan UPLC-PDA-ESI-MS Electrospray ionization-mass spectrometry (ESI-MS) adalah teknik ionisasi yag menghasilkan puncak molekul ion yang menonjol tepat di bawah arus. dua kali ekstraksi sudah cukup untuk mengekstrak komponen target sepenuhnya dari Chinensis C. dan 335-355. Pada deteksi menggunakan photodiode. Proses pengurangan struktur dari data MS/MS puncak 1. Sifat pemecahan ion dari semua alkaloid diperoleh dengan analisis MS2 yang tertera pada Tabel 2. seperti yang terlihat pada tabel 6. Pada jurnal ini. 270280. panjang gelombang serapan maksimum dari puncak target akan teridentifikasi berdasarkan pada perbandingan dari informasi online UV dan MS dengan data literature atau standar. dan MS ion molekul dll. 2. Franch. 260-270. Spektrum UV pada puncak 1 menunjukkan tiga pita serapan kuat pada 225-235. suhu ekstraksi 130 ◦C dan waktu ekstraksi selama 10 menit. Pemeriksaan dari spektra UV dan data MS memungkinkan identifikasi sementara dari 8 komponen yang disusun pada Tabel 2. Pengaruh dari waktu ekstraksi ditentukan dengan tiga kali ekstraksi secara berturutturut pada sampel yang sama. . Daftar tabel berisis waktu retensi (Rt). yang mencirikan jenis alkaloid aporphinoid. Hasil yang diperoleh untuk semua senyawa target berada dalam 3. Keterangan tersebut memberikan informasi struktur lebih lanjut untuk identifikasi. Untuk puncak 2-8.

19 dan 3. Dengan perbandingan menggunakan data literatur dan massa molekul yang alkaloid yang diketahui dalam Coptidis Rhizoma. 237. 297. dua ion fragmen menarik terlihat pada m/z 277. Pada spektra MS2. puncak 2 sementara dapat diidentifikasi sebagai tetradehydroscoulerine or tetradehydro- cheilanthifolinium.0 ([M--CH4--NHCH2--CH3--OH--CO]+) teramati. Dua senyawa tersebut memiliki struktur isomer yang mirip dengan komposisi penyusun yang sama.2 [M-15-29-28]+. 265. puncak tersebut diidentifikasi sebagai Magnoflorin. Pada percobaan MS2. Puncak 2 dan puncak 5 dengan waktu retensi berturut-turut 3. Ion dominan muncul pada m/z 307.2 ([M-CH3-H]+).2 yang sesuai dengan penghapusan metil radikal diikuti dengan hilangnya fragmen netral dengan massa molekul 28 Da (CO) dari ion molekular (m/z 322).2 [M-15]+.8 dihasilkan oleh hilangnya radikal metil. ions 342.2 ([M-CH3-CH3]+). 277.2.8.5 ([M]+). dan fragmen netral CO dengan massa molekul 44 Dadari ion molekular (m/z 322). Tidak ada laporan mengenai identifikasi berberrubine menggunakan ESIMS.2 ([M- .8 dan 250. Dengan menggabungkan hasil spektrum serapan UV dan karakterisasi pola fragmentasi MS dengan hasil lain pada referensi. Berat molekul pada puncak 2 adalah 322 dan hal itu bisa diidentifikasi sementara sebagai berberrubine. 279. tetradehydroscoulerine or tetradehydrocheilanthifolinium berdasarkan pada hasil literatur.8 [M-15-29]+. sesuai dengan struktur alkaloid aporphinoid. Oleh karena itu.8 ([M--CH4--NHCH2-CH3]+).Puncak 1 dapat diamati pada Gambar 2 dan massa yang terdeteksi adalah 342. puncak 1 diidentifikasi sebagai Magnoflorin dengan karakteristik pola fragmentasi tersebut. radikal hidrogen. sementara ion dengan m/z 250.1 ([M--CH4--NHCH2]+). Selanjutnya. dan 250.0 ([M--CH4--NHCH2--CH3--OH]+.2 dihasilkan oleh hilagnya fragmen netral CO yang lain dari ion m/z 277.2 dan 279.45 menit (Gambar 2b) memiliki massa molekul yang sama berdasarkan pada analisi MS. 294. Fragmen ion yang teramati 322. 281. Sifat fragmentasi ion dari dua puncak dalam analisis yang MS2 tercantum pada Tabel 2 sangat mirip.2 [M-1528]+. 308. ion yang dominan muncul pada m/z 307. Ion dengan m/z 277.

Tipe kromatogram massa (Total Ion Chromatography (TIC))dari ekstraksi Rhizoma Coptidis dengan HPLC-ESI-TOF-MS yang ditunjukkan dalam gambar berikut : Ionisasi permukaan electrospray dalam positif mode juga digunakan dan dari semua sample menunjukkan kelimpahan ion [M+] seperti dalam table berikut : .CH3-H-CO]+). 3.6 mm) dan waktu total 20 menit.3 Perbandingan dengan LC-DAD-ESI-TOF-MS Perbandingan pembelajaran dihasilkan antara teknik HPLC dengan UPLC. Akhirnya puncak 5 dengan tegas teridentifikasi sebagai Jatrorrhizine dengan menggabungkan waktu retensi dengan Jatrorrhizine standar. Selain itu system UPLC memerlukan pelarut yang sedikit karena digunakan dalam laju aliran yang lebih kecil (0. Sebaliknya UPLC menghasilkan perbandingan puncak pemisahan tetapi membutuhkan waktu kerja hanya 5 menit.2 mL/menit).7 ([M-CH3-CH3-CO]+). Pemisahan HPLC isocratic membutukan sebuah kolom (250 mm x 4. Sampel dijalankan oleh HPLC-ESI-TOF-MS untuk mengidentifikasi spesies tujuan. and 279. dan puncak 3 teridentifikasi sebagai Columbamine. Dua puncak teridentifikasi sebagai Columbamine dan Jatrorrhizine.

4.Kesalahan keakuratan pengukuran masa kurang dari 2 ppm dalam semua kasus. yakni menggunakan total hasil ekstraksi dan rasio relatif ekstraksi berberin. temperatur. 3. Pengembangan Metode Ekstraksi Kondisi ekstraksi seperti pelarut ekstraksi. Kedelapan senyawa yang dideteksi dan diidentifikasi secara sukses dengan UPLC–ESIMS/MS begitu pula dengan HPLC–ESI-MS/MS. volume pembilasan dan siklus ekstraksi adalah parameter yang penting untuk mengontrol hasil ekstraksi. terlebih lagi distribusi massa isotropic secara teori cocok dengan pengukuran oleh TOF-MS pada kedua intensitas dan posisi m/z yang ditunjukkan dalam gambar (B) : Dengan mengkombinasikan informasi tersebut dengan Double Bond Equivalent (DBE). O. Analisis Berberin dan homologinya. H. Dibandingkan dengan perlakuan lainyang mungkin . Pada analisis TOF-MS. waktu ekstraksi statis. selain pengukuran massa. unsur C. distribusi massa isotropic juga menginformasikan tentang komposisi unsur. N dipilih sebagai unsur yang memungkinkan. C20H18NO4 memiliki massa error yang lebih sedikit. analit dapat diidentifikasi dengan jelas sebagai berberin. .1. Dengan demikian keakuratan pengukuran massa memungkinkan untuk puncak komposisi unsur. palmatin dan jathorisin sebagai indikator hasil. ambang batas akurasi yang diterima secara luas untuk konfirmasi komposisi unsur adalah 5 ppm. Parameter tersebut dapat dioptimasi dengan pendekatan univariate .

Sejak temperatur sangat berpengaruh pada efisiensi ekstraksi. Kondisi ASE yang digunakan antara lain : 100 C untuk temperatur ekstraksi. metanol terlarut dan etanol terlarut adalah yang pertama kali ditaksir.50% HCl).50% HCl) dan 60% metanol (v/v) terlarut (dengan 0. 60% volume pembilasan dengan dua siklus ekstraksi.. Sistem dari enam komposisi pelarut dibandingkan dalam Table 4 : Jumlah relatif dari berberin. Salah satu problem yang ditemukan dalam ASE adalah material yang berupa tanaman mempunyai kecenderungan dalam menyerap air selama perlakuan ekstraksi. Saat 60% (v/v) etanol terlarut (dengan 0. .Efisiensi ekstraksi dari tiga pelarut yakni metanol. palmatin dan jathorisin yang diekstrak dalam 60% (v/v) etanol terlarut (dengan 0. e.50% HCl) adalah yang tertinggi diikuti dengan penurunan tingkatan yakni 80% etanol (v/v) terlarut (dengan 0.g. ditemukan hambatan dalam sistem ASE. Masalah dapat diatasi dengan menggunakan rasio pengurangan air dalam sistem pelarut. Hasil ditunjukkan dengan Gambar 6.50% HCl) digunakan sebagai pelarut ekstraksi. 60% volume pembilasan dengan dua siklus ekstraksi.5% HCl). 80% etanol terlarut (dengan 0. rangkaian eksperimen pada temperatur yang berbeda (70-170 C) ditunjukkan untuk menentukan temperatur ekstraksi yang paling baik.50% HCl) sebagai pelarut dengan 10 menit untuk waktu statis ekstraksi. 10 menit untuk waktu statis ekstraksi. Eksperimen ekstraksi dilakukan menggunakan 80% etanol terlarut (dengan 0.

Hasilnya ditunjukkan pada Gambar 7. Penurunan yang terjadi pada efisiensi ekstrasi kemungkinan berkaitan dengan degradasi dari ketiga senyawa tersebut pada saat temperatur diatas 130 C. Untuk menentukan jika waktu statis ekstraksi dapat mempengaruhi efisiensi ekstraksi alkaloid dalam C. 13. Chinensis Franch. 7. . Dengan demikian . 60% untuk volume pembilasan dengan dua siklus ekstraksi. perbedaan waktu ekstraksi ( 5.130 C ditentukan sebagai temperatur ekstraksi.Efisiensi ekstraksi dari semua tiga alkaloid utama tetap konstan hingga suhu 130 C dan menurun pada temperatur yang lebih tinggi. 15 menit ) ditunjukkan dengan mengikuti kondisi ASE : 130 C untuk temperatur ekstraksi. 10.

80% ) tidak memberikan pengaruh yang signifikan terhadap efisiensi ekstrasi senyawa target dalam C. efisisensi ekstraksi dari ketiga alkaloid utama menurun secara signifikan.2–1. 60. Linearitas dari kurva kalibrasi telah diverifikasi dengan studi korelasi dan koefisien korelasi adalah semua lebih baik dari 0.Kenaikan waktu statis ekstrasi dari 7 hingga 10 menit tidak mempengaruhi ekstraksi senyawa target.1.9984.5 μgL-1 untuk 3 alkaloid yang lebih baik daripada yang dilaporkan menggunakan HPCE-UV. Rentang dinamis linear kurva kalibrasi untuk kedua penentuan UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS melebihi dua order besaran.5 Validasi dari UPLC-PDA-MS/MS 3. Chinensis Franch. Kedua prosedur memungkinkan kuantitasi dalam studi kisaran mempelajari meskipun batas kuantifikasi untuk UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS dibedakan. Linearitas dan Limit Deteksi Hasil studi kalibrasi. 3.5. LOQs dan LODs dengan UPLC-PDA-MS/MS untuk 3 alkaloid dari berberine. Volume pembilasan ( 20. 40. LOQs dan LODs diperoleh dengan UPLC-MS/MS lebih kecil . Setiap deteksi batas dari teknik UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS adalah dalam rentang 60–75 and 1. Jadi waktu statis ekstraksi yang digunakan adalah 10 menit dalam satu kali siklus ekstraksi. volume pembilasan yang dipakai adalah 60%. palmatine dan jatrorrizine dirangkum dalam tabel 8. Jadi. Saat waktu statis ekstrasi diatas 10 menit.

0% dan nilai R. Variasi dari waktu retensi dari semua puncak adalah kurang dari 0. Presisi.14 % dari enam injeksi replikasi.S.72 % untuk PDA dan 3.D) dari metoda yang diusulkan berdasarkan enam suntikan replikasi. .S.47-3. dan Stabilitas Presisi masing-masing daerah puncak pengukuran PDA dan MS/MS yang ditemukan lebik baik dari 1.5.52 % (n=6) untuk analisis PDA dan 2.3.D.2-103.D) dari pengukurang tiga alkaloid adalah 2.dengan UPLC-PDA untuk 3 alkaloid.S.11 % (n=6) untuk penentuan MS/MS. n=6) dan waktu retensi lebih baik dari 0.11 % dari semua alkaloid target.2. 3. berada di kisaran dari 2. Rentang dinamis linear dari quantitasi dua teknik juga berbeda. Tabel 9 menunjukkan bahwa metode UPLC dengan masing-masing PDA (350 nm) dan deteksi MS/MS menunjukkan presisi yang baik untuk ketiga alkaloid tetapi presisi yang pertama tinggi.0 %.68 % untuk analisis MS/MS (tabel 9).63 % (R. MS/MS lebih cocok untuk penentuan alkaloid pada rentang konsentrasi rendah karena sensitivitasnya lebih dari 50 kali lipat.94-3.58-2. Perolehan kembali berada dalam rentang 94.S. menunjukkan metode recovery dan presisi yang baik. 3. Stabilitas penyimpanan (R. Presisi (R. Hasil ringkasan dalam tabel 10. Recovery Perolehan kembali dari tiga alkaloid ditentukan dengan UPLC-MS/MS menggunakan metode standart tambahan dimana tiga level analisis dari sampel yang berduri (tajam) dilakukan dalam hari yang sama.. Reprodusibilitas.18-2.D dari ketiga alkaloid dari 3 injeksi replikasi adalah lebih baik dari 5.5.

Chinensis Franch yang berbeda. Chinensis Franch terasa berbeda. Kuantifikasi MS dari alkaloid Eningkatan metode UPLC-MS/MS diaplikasikan untuk penentuan tiga alkaloid dalam sampel C. Masing-masing sampel diekstraksi dan dianalisis tiga rangkap. berberin adalah alkaloid yang paling melimpah dalam C.4. Variasi bisa terjadi karena berbagai faktor seperti sumber geografis. Chinensis Franch ini ditunjukkan pada gambar 2 dan hasil dari alkaloid individu dirangkum dalam tabel 11.5. Hasil kita menunjukkan bahwa kandungan dari tiga alkaloid utama dalam tujuh sampel C. Kromatogram yang mewakili dari ekstrak C. Di antara tiga alkaloid. budidaya. panen. penyimpanan dan pemrosesan dari ramuan.3. Chinensis Franch. konsisten dengan laporan sebelumnya. .

Metode kromatografi fingerprint menjadi salah satu yang sering diterapkan. Dengan demikian pola distribusi dari kedelapan alkaloid diharapkan menjadi representasi yang lebih baik dari keseluruhan bioaktivitas dari C. tetapi variasi besar dari puncak intensitas relative tampak jelas. Jika dibandingkan waktu kerja dari UPLC memiliki waktu yang Sembilan kali lebih cepat dibandingkan dengan HPLC (7 menit : 60 menit). Pada Gambar berikut diungkapkan bahwa distribusi dari kedelapan puncak alkaloid adalah mirip disekitar sample tersebut . Tidak hanya menyediakan profil senyawa yang ditandai tetapi juga komponen aktif lainnya.6 Fingerprint analysis of representative C. karena Fingerprint UPLC dari kedelapan senyawa alkaloid dihasilkan untuk pembuktian atau tujuan control kualitas.3.Cjininsis Franch. Penilaian kualitas obat – obatan herbal selalu menjadi tantangan karena keragaman multi komponen matriks. . chinensis Franch samples using UPLC Alkaloid – alkaloid yang berbeda diketahui memiliki perbedaan bioaktivitas yang luas.

Hasil yang diperoleh dalam tulisan ini dan dua referensi lain menunjukkan bahwa UPLC merupakan alat yang sangat berguna dalam aplikasi kromatografi fingerprint. .

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->