ANALISIS DALAM COPTIS CHINENSIS FRANCH DENGAN EKSTRAKSI PELARUT YANG DIPERCEPAT DIKOMBINASIKAN DENGAN ANALISIS ULTRA PERFORMANCE

LIQUID CHROMATOGRAPHY DENGAN FOTODIODA ARRAY DAN DETEKSI SPEKTROMETRI MASSA

Makalah

Disusun oleh : Kelompok VII Maulida Eka Rista Agita Raka P Yuda Anggi Pradista Putri Zakiah B (091810301031) (101810301013) (101810301025) (101810301035)

Andika Ade Kurniawan (101810301048)

JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS JEMBER 2013

BAB 1. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Pengobatan tradisional Cina (TCM) telah menarik lebih dan lebih perhatian dalam beberapa tahun terakhir karena efek terapinya yang dapat saling melengkapi dengan pengobatan barat (western medicine) serta kemampuannya dalam menangani berbagai

masalah penting yang belum terpecahkan oleh obat konvensional. Huanglian (Rhizoma Coptidis) adalah obat herbal yang sering digunakan dalam TCM, memiliki khasiat dapat menekan demam, menghilangkan toxicocis dan detoxifikasi. Akar kering dari Coptis chinensis Franch, Coptis deltoidea C.Y. Cheng et Hsiao and Coptis teeta Wall adalah sumber utama dari Huanglian. Penyusun aktif dari C. chinensis Franch adalah sejumlah alkaloid diantaranya yang utama yaitu alkaloid protoberberine dari berberin, palmatine, coptisine, dan lain-lain dan sebuah aporphinoid alkaloid dari magnoflorine. Alkaloid ini menunjukkan aktivitas antimikroba yang signifikan terhadap berbagai organisme termasuk bakteri, virus, jamur, protozoa, helminthes, dan Chlamydia serta aktivitas anti kanker yang ditunjukkan dengan sifat antineoplastiknya. Aplikasi utama dari berberine adalah untuk pengobatan diare, infeksi parasitus usus, infeksi okular trakoma dan lain-lain. Dalam Official Chinese Pharmacopoeia (edisi 2005), berberine sendiri ditetapkan sebagai spesies penanda untuk evaluasi kualitas Huanglian. Namun, kita percaya bahwa praktek kontrol kualitas untuk Huanglian harus mencakup uji dari serangkaian alkaloid utama daripada spesies tunggal. Selama beberapa dekade terakhir, beberapa metode dapat digunakan untuk penentuan alkaloid dalam ekstrak Rhizoma Coptidis diantaranya Kolorimetri, Thin Layer

Chromatography (TLC), Capilary Electrophoresis, Micellar Electrokinetic Chromatography (MEC), High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) dengan berbagai detertor yang berbeda termasuk spektrometri massa. Metode Kolorimetri hanya menentukan total kandungan alkaloid tapi nonspesifik terhadap alkaloid individu. Metode scanning Micellar Thin Layer Chromatographic telah digunakan untuk kontrol kualitas dari Rhizoma coptidis, tapi metode ini mampu menganalisis hanya tiga dari di alkaloid di atas. HPLC dengan sistem deteksi yang berbeda adalah metode yang paling banyak dipraktekkan untuk analisis alkaloid. Namun dengan metode KCKT, pemisahan alkaloid yang berbeda dalam Rhizoma Coptidis masih memiliki peluang besar untuk dikembangkan. Laporan dalam analisis spectrometri massa dari alkaloid dalam Rhizoma Coptidis telah langka, dengan hanya dua makalah yang

diterbitkan baru-baru ini pada penjabaran struktural dan identifikasi dari empat alkaloid dalam Rhizoma Coptidis dengan electrospray ionization-tandem mass spectrometry. Baru-baru ini, telah ada minat yang besar dalam penerapan sistem UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography). Sistem ini memanfaatkan kecepatan linear tinggi dengan kolom yang dikemas dengan partikel berpori 1.7 m. Ketika digabungkan ke spektrometer massa tandem, sistem ini menawarkan peningkatan resolusi puncak, kepekaan dan kecepatan analisis. UPLC atau UPLC-MS/MS baru diterapkan untuk analisis komposisi produk alam dan sistem metabolit dalam biologi, dan lain-lain, tetapi penerapannya pada analisis alkaloid belum dilaporkan lebih jelas. ASE umumnya beroperasi di bawah suhu tinggi, dan pada temperatur yang lebih tinggi di atas titik didih dari ekstraksi pelarut. Suhu tinggi meningkatkan efisiensi ekstraksi karena itu mengurangi viskositas dari pelarut, sehingga memungkinkan penetrasi yang lebih baik dari molekul pelarut ke dalam matriks sampel. Penggunaan ASE mengurangi waktu total ekstraksi dan meningkatkan efisiensi ekstraksi melalui manipulasi parameter seperti suhu, waktu, siklus dan pelarut. Terbaru, ASE telah ditemukan hanya terbatas pada aplikasi dalam analisis TCM, meskipun teknik ini telah banyak diterapkan untuk ekstraksi bahan alam. Dalam makalah ini, metode UPLC-PDA dikombinasikan dengan ekstraksi ASE telah dikembangkan untuk penentuan kuantitatif tiga alkaloid utama berberine, palmatine dan jatrorrhizine dalam ekstrak kasar C. chinensis Franch. ESI-MS/MS dikombinasi dengan UPLC juga telah diterapkan untuk quantifikasi tiga alkaloid utama dan identifikasi alkaloid individu dalam ekstrak C. chinensis Franch. Selain itu, studi perbandingan telah dibuat antara kinerja dari teknik UPLCESI-MS/MS and HPLCESI-TOF-MS. Akhirnya, UPLC berbasis meetode fingerprinting memanfaatkan pola distribusi dari delapan alkaloid utama dalam sampel telah dikembangkan untuk evaluasi kualitas C. chinensis Franch. Abstrak Sebuah metode baru berdasarkan akselerasi ekstraksi pelarut (ASE) dengan analisis Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) telah dikembangkan untuk identifikasi dan kuantifikasi sebagian besar alkaloid dari ekstrak Coptis chinesis. sistem UPLC terdiri dari sistem deteksi dual photodioda (PDA) dan spektrometri massa dengan tandem ion positif elektrospray ionisasi dalam konfigurasi sekuen. Parameter operasional dari ASE adalah pelarut ekstraksi, temperatur ekstraksi, waktu ekstraksi yang stabil, dan cara ekstraksi yang

optimum. Analisis UPLC yang digunakan adalah kolom ACQUITY UPLC BEC C18 yang dielusi oleh fase gerak asetonitril dengan larutan buffer yang terdiri dari 0,50% asam asetat dan 20 mmol/L amonium asetat. Sebuah tandem qudropole spektrometer beroperasi dalam modus scan penuh baik dan mode MS/MS untuk multiple reaction monitoring (MRM) digunakan untuk identifikasi dan analisis kuantitatif 8 alkaloid utama pada ekstrak C. chinensis Franch. Sampel juga dianalisis dengan sistem HPLC-ESI-TOF-MS untuk mengkonfirmasi hasil identifikasi. Tiga dari delapan alkaloid utama yakni berberine, palmatine dan jatrorrhizine telah terdeteksi oleh UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS. Hasilnya mengindikasikan bahwa dari kedua metode UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS sensitif dan dapat diandalkan untuk penentuan alkaloid dalam C. chinensis Franch. Tujuh sampel Huanglian dari lokasi yang berbeda dianalisis menggunakan metode yang digunakan. Fingerprint UPLC berdasarkan distribusi 8 alkaloid utama dapat menyediakan metode yang cepat dan diandalkan untuk pembuktian dan evaluasi kualitas dari obat herbal tradisional cina. 1.2 Tujuan BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA BAB 3. METODOLOGI PERCOBAAN 2.1 Material dan Reagen Tujuh sampel C. chinesis franch dibeli dari toko obat yang berbeda di daerah Qingdao, China. Standar dari Berberine Hidroklorida, Palmatine Hidroklorida dan Jatrorhizhine Hidroklorida diperoleh dari National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products of China. Amonium asetat dan asam asetat didapat dari Fluka ( Buch, Swiss). Asetonitril untuk HPLC berasal dari Fisher Chemicals (Pittsburg, PA, Amerika Serikat). Bahan kimia lainnya seperti metanol, etanol dan lainya didapatkan dari Shanghai Chemical Factory ( Shanghai, China). Air dimurnikan menggunakan sebuah sistem pemurnian air Milli-Q

(Milipore,Bedfore, MA, Amerika Serikat). 2.2. Preparasi Sampel

C. Chinensis Franch kering digiling menggunakan penumbuk dan mortar. Setelah halus serbuk tersebut diayak dengan pengayak baja 0,3 mm sebelum ekstraksi. 2.2.1. Ekstraksi Refluks Pemanasan Refluks Ekstraksi dilakukan dalam kondensor dingin dan labu alas bulat 100 mL. Etanol 80% dengan 0,5 % HCl digunakan sebagai pelarut. Satu gram sampel bubuk ditambahkan dan 35 mL pelarut ditambahkan dalam labu alas bulat. Suspensi diekstraksi selama 1 jam pada suhu 90 C dengan perendaman dan penyaringan. Ekstraksi diulangi dengan penambahan waktu 2 kali dan ekstrak yang dihasilkan digabung. Ekstrak gabungan tersebut disaring, dan dievaporasi hingga kering menggunakan rotary evaporator pada suhu 50 C. Residunya dilarutkan dalam 50 mL etanol dan disaring menggunakan filter membran nilon 0,45 m. 2.2.2. Ekstraksi Ultrasonik Ekstraksi ultrasonik dilakukan dengan menyampurkan 1 g sampel bubuk dan 35 mL larutan 80% ethanol dengan 0,5% HCl dalam labu alas, dimana ditempatkan pada ultrasonik bath selama 30 menit. Ekstraksi diulangi dengan penambahan waktu 2 kali dan ekstrak yang dihasilkan digabung. Residunya dilarutkan dalam 50 mL etanol dan disaring menggunakan filter membran nilon 0,45 m.

2.2.3. Percepatan Ekstrasksi Pelarut Sebuah sistem ASE 100 (Dionex, Sunnyvale, CA, Amerika Serikat) dilengkapi bejana baja berukuran 34 mL digunakan untuk ekstraksi cairan bertekanan. Sekitar 1 gram bubuk C. Chinensis Franch dihomogenasi menggunakan diatomaceous earth pada berat yang sama dan ditempatkan pada sebuah sel ekstraksi. Sel ekstraksi ditempatkan dalam korsel dan sampel diekstraksi dalam kondisi tekanan rendah. Ekstrak dievaporasi hingga kering menggunakan rotary evaporator pada suhu 50 C. Residu dilarutkan kembali dengan 50 metanol dan disaring dengan filter membran nilon 0,45 m sebelum diinjekkan ke sistem UPLC. 2.3. Preparasi Larutan Standar dan Kurva Kalibrasi Stok larutan standar berberin hidroklorida, palmatin hidroklorida dan jatrorhisin hidroklorida secara berurutan disiapkan dengan melarutkan kira-kira 10 mg setiap senyawa

murni dalam 10 mL metanol. Campuran larutan standar yang terdiri dari 1,29 mg/L Berberin hidroklorida, 0,45 mg/L palmatin hidroklorida dan 0,30 mg/L jatrorrhisin hidroklorida dipreparasi dengan cara melarutkan setiap senyawa murni (yang ditimbang secara akurat) dalam 10 ml metanol. Larutan standar untuk kalibrasi dipreparasi dengan mengencerkan larutan standar menggunakan metanol untuk konsentrasi yang diinginkan. Setiap kurva kalibrasi dibentuk oleh larutan standar dengan enam konsentrasi berbeda dalam 3 kali pengulangan. 2.4 Ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry Analisis dilakukan pada sistem perairan ACQUITY UPLCTM (Milford, MA, USA). Pemisahan ini dilakukan dengan menggunakan kolom ACQUITY UPLC BEH C18 (1,7m;2.1mm50 mm). Pada 200C dan laju alir 0,2 Fase gerak mengandung pelarut A (0,5% asam asetat dan 20mmol/L NH4CH3COO) dan B (asetonitril) dengan perbandingan 80% A dan 20% B. Sistem UPLC digabungkan dengan Quattro premier XE tandem quadrupole mass spectrometer (Waters, Milford, MA,USA) lengkap dengan sumber ESI Z-Spray. Sumber elektrospray dijalankan dalam bentuk ion positif. Potensial kapiler di set pada 3,5kV. Pada analisis rutin, spektrometri massa di scan pertama kali dari nilai m/z 100 hingga 500 dalam mode full scan untuk menentukan informasi berat molekul alkaloid dalam C,Chinensis Franch. C,Chinensis Franc ini dianalisis dalam multiple reaction monitoring (MRM) mode, cone voltages dan energy tumbukan dioptimasi pada dua fragmentasi. 2.5 High-performance liquid chromatography-electrospray ionization-time of flight mass spectrometry Analisis HPLC telah dilakukan dengan sebuah alat 1100HPLC, sebuah kolom (Alltima C18) yang dielusi secara isocratic dengan campuran biner dari Asetonitril dan 0,5% CH3COOH dengan 20mM NH4CH3COO (32:68) pada kecepatan laju alir 1.0 mL/min. Elusi dimonitor oleh detector sinar diode. Volume yang diisikan pada proses injeksi berkisar 10 L dan pemisahan dilakukan pada 25oC dalam ruang pemanasan secara isothermal. Spektroskopi massa yang digunakan ialah G1969A TOF . spektro ini digunakan untuk menganalisis alkaloid dalam C ,Chinensis Franch. Software yang digunakan dalam analisis ini ialah QS Software analysis. Kondisi spektrometer massa dioptimasi untuk deteksi alkaloid, mengikuti beberapa ketentuan berikut : suhu 3300C, aliran gas 11 L/min,

tekanan gas 50 psi, fragmentor 100 V, potensial kapiler 4000V. Larutan standar (reff) digunakan m/z 121.050873 untuk kalibrasi massa untuk menghilangkan sistem bias. 2.6 Metode validasi UPLC Kurva kalibrasi dibangun dengan menjalankan enam campuran standar konsentrasi yang berbeda dalam triplicate. Hubungan koefisien ditentukan menggunakan sebuah model regresi linier. Batas deteksi diartikan sebagai tiga kali tingkat keramaian (Noisy) yang diperoleh, dan batas quantifikasi (LOQ) diartikan sebagai sepuluh kali tingkat keramaian (Noise) dari blank sampel matriks yang bekerja. Ketepatan dari waktu retensi UPLC dan pengukuran area puncak untuk berberine, palmatine and jatrorrhizine dihitung sebagai standar deviasi relative dari enam pengulangan kerja. Reprodusibilitas dari metode ditinjau dengan menjalankan enam replikasi sampel. Stabilitas sampel dipantau dalam analisis sampel selama 3 hari pada interval setiap 12 jam. Standar deviasi relative dari pengukuran tiga alkaloid diambil sebagai indicator untuk stabilitas system. Penemuan alkaloid ditentukan dengan metode standar addisi. Tiga alkaloid dalam campuran standar dimasukkan dalam sampel dan hasil penemuan dihitung dengan perbedaan antara sampel yang dimasukkan dengan yang tidak.

3. Hasil dan Pembahasan 3.1. Optimasi UPLC-PDA-MS/kondisi MS Kondisi kromatografi telah dioptimasi menggunakan larutan standard alkaloid dan sampel real C.Chinensis Franch. Fasa terbalik (reversed phase) UPLC dengan gradien elusi yang digunakan berdasarkan pada kondisi yang telah diberikan dalam literatur laporan. Variasi pada rasio air untuk asetonitril pada fase gerak dapat meningkatkan pemisahan. Namun peningkatan di puncak resolusi dan peak shape yang cukup besar dapat terpantau (diamati) setelah penambahan asam trifluoroasetat atau asam fosfat ke dalam fase gerak. Agar metode pemisahan dapat kompatible dengan menggunakan ESI-MS/MS, maka dalam penelitian berikut digunakan asam asetat. Co-elusi epiberine, jatrorhizine, dan columbamine telah menjadi permasalahan umum yang telah dilaporkan dalam penelitian sebelumnya[3,5]. Dalam penelitian ini menggunakan gradien elusi dan asam asetat-ammonium asetat additive,dan resolusi terbaik dari delapan alkaloid telah didapatkan. Hal tersebut menunjukkan bahwa penambahan ammonium asetat

sangat mempengaruhi pemisahan dari jatrorhizine dan columbamine. Penambahan asam asetat 0,5% dan 20 mm amonium asetat kedalam fase gerak memberikan resolusi dan sinyal /noise rasio terbaik jika dibandingkan dengan sistem yang telah dilaporkan dalam laporan sebelumnya [3,15,17]. Metode ini lebih kompatible dengan menggunakan ESI/MS dan meningkatkan pemisahan alkaloid, terutama untuk jatrrorhizine dan columbanie. Juga supaya optimasi kondisi deteksi UPLC- PDA tiga panjang gelombang yang berbeda yakni pada panjang gelombang 230, 265, dan 350 telah diamati dan dibandingkan hasilnya. Noise terendah untuk barberin telah diamati dengan menggunakan panjang gelombang 350 nm, dan oleh sebab itu panjang gelombang tersebut digunakan untuk semua percobaan selanjutnya.

Gambar 2. Keterangan Kromatogram UPLC-PDA berberine, palmatine dan jatrorrhizine standar (A); ekstrak dari Coptis chinensis Franch (B); (1) magnoflorine, (2) tetrahidroscoulerine/tetradehydrocheilanthifolinium,(3) Columbamine; (4)Epiberberine, (5) Jatrorrhizine, (6)Coptisine, (7) Palmatine, (8) berberine.

Gambar 2 menunjukkan bahwa kedelapan senyawa alkaloid telah dipisahkan dengan baik dibawah kondisi optimal. Penggunaan metode UPLC-PDA menghasilkan peningkatan kapasitas puncak yang signifikan. Lebih dari delapan puncak telah terdeteksi dalam 5 menit pada kromatogram UPLC-PDA dari ekstrak etanol. Lebar puncak khas yang dihasilkan oleh sistem UPLC berada di urutan 5 hingga 10 s, yang menghasilkan resolusi kromatografi dan peningkatan rasio sinyal-to-noise. Selain itu waktu yang berlangsung antara waktu equlibrasi kolom sampel telah dipersingkat. Dalam spektroskopi massa tandem, spektrum massa elektrospay dari alkaloid bervariasi dengan cone volt dan tegangan energi tumbukan. Untuk analisis scan UPLC-MS dari sampel real C.Chinensis Franch, kedelapan alkaloid dapat dihasilkan hanya dalam

muatan ion tunggal [M+] dengan mild cone volt. Dalam spektroskopi massa tandem, cone volt selalu disetel untuk menghasilkan respon terkuat , sementara energi tumbukan telah disetel untuk ion prekursor yang lebih sensitif dan produk ion stabil di kedua modus scan massal. Dalam penelitian ini energi tumbukan yang berbeda ditentukan melalui percobaan optimasi yang telah diterapkan kepada kedelapan alkaloid. Pemantauan beberapa reaksi sering digunakan untuk kuantifikasi pada MS quadrupole tandem. Energi tumbukan dan cone volt digunakan untuk akuisisi yang dievaluasi untuk respon terbaik dibawah modus positif ESI dengan menambahkan larutan standar berberin dan palmatin.

Gambar 3. Keterangan: UPLC-ESI-MS/MS kromatogram total arus ion pada ekstrak Coptis chinensis Franch dan MRM UPLC-MS/MS kromatogram dari berberine, palmatine dan jatrorrhizine

Keterangan tabel (1) total ion kromatogram dan kromatogram MRM dari sampel C.chinensis Franch yang ditunjukkan pada gambar 3.

3.4.2. Optimasi kondisi ekstraksi dengan desain ortogonal Percobaan ortogonal dilakukan dalam rangka mengoptimalkan kondisi ekstraksi. Adapun empat faktor yang terlibat dalam proses ini adalah : (A) temperatur ekstraksi (B) waktu ekstraksi (C) Ekstraksi pelarut (D) jumlah sampel. Faktor eksperimental, tingkat yang sesuai dengan desain ortogonal L9 (34) ditunjukkan pada tabel 5.

Jangkauan terbesar dari tiga faktor adalah 0,87 dari faktor A, sedangkan terkecil adalah 0,36 faktor D. Ini berarti bahwa faktor A adalah faktor utama dalam kondisi ekstraksi alkaloid di C.Chinensis Franch. Tingkat ketiga faktor A memiliki nilai rata-rata sebesar (k3 adalah 8,73)dibandingkan dengan dua tingkat lainnya. Hal ini menunjukkan bahwa tingkat ketiga adalah kondisi terbaik dari faktor A dengan analogi tingkat kedua Faktor B, dan tingkat ketiga adlah faktor C tingkat kedua faktor D merupakan kondisi terbaik, dan untuk kondisi optimum ekstraksi ditetapkan sebagai berikut: 1 gram bubuk sampel kering di ekstrak dengan

etanol 80 5 ( dengan 0,50 % HCl), suhu ekstraksi 130 C dan waktu ekstraksi selama 10 menit. Pengaruh dari waktu ekstraksi ditentukan dengan tiga kali ekstraksi secara berturutturut pada sampel yang sama. seperti yang terlihat pada tabel 6, dua kali ekstraksi sudah cukup untuk mengekstrak komponen target sepenuhnya dari Chinensis C. Franch. Untuk mengevaluai pengulangan dari prosedur ekstraksi, dilakukan serangkaian pengulangan sebanyak enam kali yang telah dilakukan pada hari yang sama dan hari yang berbeda. Hasil yang diperoleh untuk semua senyawa target berada dalam

3.2 identifikasi alkaloid pada ekstrak sampel menggunakan UPLC-PDA-ESI-MS Electrospray ionization-mass spectrometry (ESI-MS) adalah teknik ionisasi yag menghasilkan puncak molekul ion yang menonjol tepat di bawah arus. Pada jurnal ini, kedelapan alkaloid tersebut menghasilkan ion [M]+ dalam jenis ion positif. Pada deteksi menggunakan photodiode, panjang gelombang serapan maksimum dari puncak target akan teridentifikasi berdasarkan pada perbandingan dari informasi online UV dan MS dengan data literature atau standar. Dalam hal ini untuk memperkuat unsur pokok dan penyelidikan pola pemisahan, collision-induced dissociation (CID) MS/MS spectrum akan terekam. Proses pengurangan struktur dari data MS/MS puncak 1, 2, 3, dan 5 diperlihatkan di bawah. Spektrum UV pada puncak 1 menunjukkan tiga pita serapan kuat pada 225-235, 270280, dan 315-335, yang mencirikan jenis alkaloid aporphinoid. Untuk puncak 2-8, semua spektrum menunjukkan serapan alkaloid protoberberine yang khas pada 225-245, 260-270, dan 335-355. Pemeriksaan dari spektra UV dan data MS memungkinkan identifikasi sementara dari 8 komponen yang disusun pada Tabel 2. Daftar tabel berisis waktu retensi (Rt), panjang gelombang serapan maksimum (), dan MS ion molekul dll. Sifat pemecahan ion dari semua alkaloid diperoleh dengan analisis MS2 yang tertera pada Tabel 2. Keterangan tersebut memberikan informasi struktur lebih lanjut untuk identifikasi.

Puncak 1 dapat diamati pada Gambar 2 dan massa yang terdeteksi adalah 342. Dengan perbandingan menggunakan data literatur dan massa molekul yang alkaloid yang diketahui dalam Coptidis Rhizoma, puncak tersebut diidentifikasi sebagai Magnoflorin. Pada spektra MS2, ions 342,5 ([M]+), 297,1 ([M--CH4--NHCH2]+), 281,8 ([M--CH4--NHCH2-CH3]+), 265,0 ([M--CH4--NHCH2--CH3--OH]+, 237,0 ([M--CH4--NHCH2--CH3--OH--CO]+) teramati, sesuai dengan struktur alkaloid aporphinoid. Oleh karena itu, puncak 1 diidentifikasi sebagai Magnoflorin dengan karakteristik pola fragmentasi tersebut. Berat molekul pada puncak 2 adalah 322 dan hal itu bisa diidentifikasi sementara sebagai berberrubine, tetradehydroscoulerine or tetradehydrocheilanthifolinium berdasarkan pada hasil literatur. Tidak ada laporan mengenai identifikasi berberrubine menggunakan ESIMS. Pada percobaan MS2, ion yang dominan muncul pada m/z 307,2 [M-15]+, 279,2 [M-1528]+, 277,8 [M-15-29]+, dan 250,2 [M-15-29-28]+. Ion dominan muncul pada m/z 307,2 dan 279,2 yang sesuai dengan penghapusan metil radikal diikuti dengan hilangnya fragmen netral dengan massa molekul 28 Da (CO) dari ion molekular (m/z 322). Selanjutnya, dua ion fragmen menarik terlihat pada m/z 277,8 dan 250,2. Ion dengan m/z 277,8 dihasilkan oleh hilangnya radikal metil, radikal hidrogen, dan fragmen netral CO dengan massa molekul 44 Dadari ion molekular (m/z 322), sementara ion dengan m/z 250,2 dihasilkan oleh hilagnya fragmen netral CO yang lain dari ion m/z 277,8. Dengan menggabungkan hasil spektrum serapan UV dan karakterisasi pola fragmentasi MS dengan hasil lain pada referensi, puncak 2 sementara dapat diidentifikasi sebagai tetradehydroscoulerine or tetradehydro-

cheilanthifolinium. Puncak 2 dan puncak 5 dengan waktu retensi berturut-turut 3,19 dan 3,45 menit (Gambar 2b) memiliki massa molekul yang sama berdasarkan pada analisi MS. Dua senyawa tersebut memiliki struktur isomer yang mirip dengan komposisi penyusun yang sama. Sifat fragmentasi ion dari dua puncak dalam analisis yang MS2 tercantum pada Tabel 2 sangat mirip. Fragmen ion yang teramati 322,2 ([M-CH3-H]+), 308,2 ([M-CH3-CH3]+), 294,2 ([M-

CH3-H-CO]+), and 279,7 ([M-CH3-CH3-CO]+). Dua puncak

teridentifikasi sebagai

Columbamine dan Jatrorrhizine. Akhirnya puncak 5 dengan tegas teridentifikasi sebagai Jatrorrhizine dengan menggabungkan waktu retensi dengan Jatrorrhizine standar, dan puncak 3 teridentifikasi sebagai Columbamine. 3.3 Perbandingan dengan LC-DAD-ESI-TOF-MS Perbandingan pembelajaran dihasilkan antara teknik HPLC dengan UPLC. Pemisahan HPLC isocratic membutukan sebuah kolom (250 mm x 4,6 mm) dan waktu total 20 menit. Sebaliknya UPLC menghasilkan perbandingan puncak pemisahan tetapi membutuhkan waktu kerja hanya 5 menit. Selain itu system UPLC memerlukan pelarut yang sedikit karena digunakan dalam laju aliran yang lebih kecil (0,2 mL/menit). Sampel dijalankan oleh HPLC-ESI-TOF-MS untuk mengidentifikasi spesies tujuan. Tipe kromatogram massa (Total Ion Chromatography (TIC))dari ekstraksi Rhizoma Coptidis dengan HPLC-ESI-TOF-MS yang ditunjukkan dalam gambar berikut :

Ionisasi permukaan electrospray dalam positif mode juga digunakan dan dari semua sample menunjukkan kelimpahan ion [M+] seperti dalam table berikut :

Kesalahan keakuratan pengukuran masa kurang dari 2 ppm dalam semua kasus. Pada analisis TOF-MS, ambang batas akurasi yang diterima secara luas untuk konfirmasi komposisi unsur adalah 5 ppm. Dengan demikian keakuratan pengukuran massa memungkinkan untuk puncak komposisi unsur. Analisis Berberin dan homologinya, unsur C, H, O, N dipilih sebagai unsur yang memungkinkan, selain pengukuran massa, distribusi massa isotropic juga

menginformasikan tentang komposisi unsur. Dibandingkan dengan perlakuan lainyang mungkin , C20H18NO4 memiliki massa error yang lebih sedikit, terlebih lagi distribusi massa isotropic secara teori cocok dengan pengukuran oleh TOF-MS pada kedua intensitas dan posisi m/z yang ditunjukkan dalam gambar (B) :

Dengan mengkombinasikan informasi tersebut dengan Double Bond Equivalent (DBE), analit dapat diidentifikasi dengan jelas sebagai berberin. Kedelapan senyawa yang dideteksi dan diidentifikasi secara sukses dengan UPLCESIMS/MS begitu pula dengan HPLCESI-MS/MS.

3.4.1. Pengembangan Metode Ekstraksi Kondisi ekstraksi seperti pelarut ekstraksi, temperatur, waktu ekstraksi statis, volume pembilasan dan siklus ekstraksi adalah parameter yang penting untuk mengontrol hasil ekstraksi. Parameter tersebut dapat dioptimasi dengan pendekatan univariate , yakni menggunakan total hasil ekstraksi dan rasio relatif ekstraksi berberin, palmatin dan jathorisin sebagai indikator hasil.

Efisiensi ekstraksi dari tiga pelarut yakni metanol, metanol terlarut dan etanol terlarut adalah yang pertama kali ditaksir. Kondisi ASE yang digunakan antara lain : 100 C untuk temperatur ekstraksi, 10 menit untuk waktu statis ekstraksi, 60% volume pembilasan dengan dua siklus ekstraksi. Sistem dari enam komposisi pelarut dibandingkan dalam Table 4 :

Jumlah relatif dari berberin, palmatin dan jathorisin yang diekstrak dalam 60% (v/v) etanol terlarut (dengan 0,50% HCl) adalah yang tertinggi diikuti dengan penurunan tingkatan yakni 80% etanol (v/v) terlarut (dengan 0,50% HCl) dan 60% metanol (v/v) terlarut (dengan 0,5% HCl). Salah satu problem yang ditemukan dalam ASE adalah material yang berupa tanaman mempunyai kecenderungan dalam menyerap air selama perlakuan ekstraksi. Saat 60% (v/v) etanol terlarut (dengan 0,50% HCl) digunakan sebagai pelarut ekstraksi, ditemukan hambatan dalam sistem ASE. Masalah dapat diatasi dengan menggunakan rasio pengurangan air dalam sistem pelarut, e.g., 80% etanol terlarut (dengan 0,50% HCl). Sejak temperatur sangat berpengaruh pada efisiensi ekstraksi, rangkaian eksperimen pada temperatur yang berbeda (70-170 C) ditunjukkan untuk menentukan temperatur ekstraksi yang paling baik. Eksperimen ekstraksi dilakukan menggunakan 80% etanol terlarut (dengan 0,50% HCl) sebagai pelarut dengan 10 menit untuk waktu statis ekstraksi, 60% volume pembilasan dengan dua siklus ekstraksi. Hasil ditunjukkan dengan Gambar 6.

Efisiensi ekstraksi dari semua tiga alkaloid utama tetap konstan hingga suhu 130 C dan menurun pada temperatur yang lebih tinggi. Penurunan yang terjadi pada efisiensi ekstrasi kemungkinan berkaitan dengan degradasi dari ketiga senyawa tersebut pada saat temperatur diatas 130 C. Dengan demikian ,130 C ditentukan sebagai temperatur ekstraksi. Untuk menentukan jika waktu statis ekstraksi dapat mempengaruhi efisiensi ekstraksi alkaloid dalam C. Chinensis Franch, perbedaan waktu ekstraksi ( 5, 7, 10, 13, 15 menit ) ditunjukkan dengan mengikuti kondisi ASE : 130 C untuk temperatur ekstraksi, 60% untuk volume pembilasan dengan dua siklus ekstraksi. Hasilnya ditunjukkan pada Gambar 7.

Kenaikan waktu statis ekstrasi dari 7 hingga 10 menit tidak mempengaruhi ekstraksi senyawa target. Saat waktu statis ekstrasi diatas 10 menit, efisisensi ekstraksi dari ketiga alkaloid utama menurun secara signifikan. Jadi waktu statis ekstraksi yang digunakan adalah 10 menit dalam satu kali siklus ekstraksi. Volume pembilasan ( 20, 40, 60, 80% ) tidak memberikan pengaruh yang signifikan terhadap efisiensi ekstrasi senyawa target dalam C. Chinensis Franch. Jadi, volume pembilasan yang dipakai adalah 60%. 3.5 Validasi dari UPLC-PDA-MS/MS 3.5.1. Linearitas dan Limit Deteksi Hasil studi kalibrasi, LOQs dan LODs dengan UPLC-PDA-MS/MS untuk 3 alkaloid dari berberine, palmatine dan jatrorrizine dirangkum dalam tabel 8. Linearitas dari kurva kalibrasi telah diverifikasi dengan studi korelasi dan koefisien korelasi adalah semua lebih baik dari 0,9984. Rentang dinamis linear kurva kalibrasi untuk kedua penentuan UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS melebihi dua order besaran. Setiap deteksi batas dari teknik UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS adalah dalam rentang 6075 and 1.21.5 gL-1 untuk 3 alkaloid yang lebih baik daripada yang dilaporkan menggunakan HPCE-UV. Kedua prosedur memungkinkan kuantitasi dalam studi kisaran mempelajari meskipun batas kuantifikasi untuk UPLC-PDA dan UPLC-MS/MS dibedakan. LOQs dan LODs diperoleh dengan UPLC-MS/MS lebih kecil

dengan

UPLC-PDA

untuk

alkaloid.

3.5.2. Presisi, Reprodusibilitas, dan Stabilitas Presisi masing-masing daerah puncak pengukuran PDA dan MS/MS yang ditemukan lebik baik dari 1,63 % (R.S.D., n=6) dan waktu retensi lebih baik dari 0,11 % dari semua alkaloid target. Presisi (R.S.D) dari metoda yang diusulkan berdasarkan enam suntikan replikasi, berada di kisaran dari 2,58-2,72 % untuk PDA dan 3,47-3,68 % untuk analisis MS/MS (tabel 9). Variasi dari waktu retensi dari semua puncak adalah kurang dari 0,14 % dari enam injeksi replikasi. Stabilitas penyimpanan (R.S.D) dari pengukurang tiga alkaloid adalah 2,18-2,52 % (n=6) untuk analisis PDA dan 2,94-3,11 % (n=6) untuk penentuan MS/MS.

Tabel 9 menunjukkan bahwa metode UPLC dengan masing-masing PDA (350 nm) dan deteksi MS/MS menunjukkan presisi yang baik untuk ketiga alkaloid tetapi presisi yang pertama tinggi. Rentang dinamis linear dari quantitasi dua teknik juga berbeda. MS/MS lebih cocok untuk penentuan alkaloid pada rentang konsentrasi rendah karena sensitivitasnya lebih dari 50 kali lipat. 3.5.3. Recovery Perolehan kembali dari tiga alkaloid ditentukan dengan UPLC-MS/MS menggunakan metode standart tambahan dimana tiga level analisis dari sampel yang berduri (tajam) dilakukan dalam hari yang sama. Hasil ringkasan dalam tabel 10. Perolehan kembali berada dalam rentang 94,2-103,0% dan nilai R.S.D dari ketiga alkaloid dari 3 injeksi replikasi adalah lebih baik dari 5,0 %, menunjukkan metode recovery dan presisi yang baik.

3.5.4. Kuantifikasi MS dari alkaloid Eningkatan metode UPLC-MS/MS diaplikasikan untuk penentuan tiga alkaloid dalam sampel C. Chinensis Franch yang berbeda. Masing-masing sampel diekstraksi dan dianalisis tiga rangkap. Kromatogram yang mewakili dari ekstrak C. Chinensis Franch ini ditunjukkan pada gambar 2 dan hasil dari alkaloid individu dirangkum dalam tabel 11. Di antara tiga alkaloid, berberin adalah alkaloid yang paling melimpah dalam C. Chinensis Franch, konsisten dengan laporan sebelumnya. Hasil kita menunjukkan bahwa kandungan dari tiga alkaloid utama dalam tujuh sampel C. Chinensis Franch terasa berbeda. Variasi bisa terjadi karena berbagai faktor seperti sumber geografis, budidaya, panen, penyimpanan dan pemrosesan dari ramuan.

3.6 Fingerprint analysis of representative C. chinensis Franch samples using UPLC Alkaloid alkaloid yang berbeda diketahui memiliki perbedaan bioaktivitas yang luas. Dengan demikian pola distribusi dari kedelapan alkaloid diharapkan menjadi representasi yang lebih baik dari keseluruhan bioaktivitas dari C.Cjininsis Franch, karena Fingerprint UPLC dari kedelapan senyawa alkaloid dihasilkan untuk pembuktian atau tujuan control kualitas. Pada Gambar berikut diungkapkan bahwa distribusi dari kedelapan puncak alkaloid adalah mirip disekitar sample tersebut , tetapi variasi besar dari puncak intensitas relative tampak jelas.

Jika dibandingkan waktu kerja dari UPLC memiliki waktu yang Sembilan kali lebih cepat dibandingkan dengan HPLC (7 menit : 60 menit). Penilaian kualitas obat obatan herbal selalu menjadi tantangan karena keragaman multi komponen matriks. Metode kromatografi fingerprint menjadi salah satu yang sering diterapkan. Tidak hanya menyediakan profil senyawa yang ditandai tetapi juga komponen aktif lainnya.

Hasil yang diperoleh dalam tulisan ini dan dua referensi lain menunjukkan bahwa UPLC merupakan alat yang sangat berguna dalam aplikasi kromatografi fingerprint.