RINGKASAN

Puding merah (Gruptophyllum pictum L Griff) merupakan tumbuhan perdu atau pohon kecil yang banyak dimanfaatkan oleh masyarakat untuk berbagai keperluan seperti untuk obat berbagai penyakit dan pelembut kulit. Dari uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak daun Puding merah (Graptophyllum pictum L Griff) mengandung senyawa fenolik. Atas dasar pertimbangan ini maka dilakukan isolasi dan penentuan struktur senyawa fenolik dari tumbuhan ini dan uji bioassay senyawa tersebut terhadap larva Artemia salina. Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol. Pemisahan dan pemurnian lebih lanjut terhadap ekstrak etanol dilakukan dengan cara kromatografi kolom dan diperoleh kristal sebanyak 37 mg. Karakterisasi struktur dilakukan dengan spektroskopi IR dan 1H-NMR, Spektrum IR senyawa hasil isolasi memperlihatkaan pita serapan pads angka gelombang 3431, 3121, 3057, 1618, 1462, 1340, 1060, 970 dan 800 cm-1. Spektrum 1H-NMR memperlihatkan pergeseran kimia pada 1,5 ; 6,3 dan 7,6 ppm. Berdasarkan uji fitokimia dan analisis spektrum 1R dan 1H-NMR maka disimpulkan bahwa senyawa hasil isolasi merupakan senyawa fenolik yaitu suatu jenis senyawa flavonoid. Uji bioassay senyawa hasil isolasi menunjukkan aktifitas biologis terhadap larva Artemia salina yang memberikan harga LC50 sebesar 124,08 g/ml.

ii
USU Repository2006
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

DAFTAR ISI

Halaman LEMBAR IDENTITAS DAN PENGESAHAN .................................................. i RINGKASAN ......................................................................................................ii KATA PENGANTAR ......................................................................................... iii DAFTAR ISI ....................................................................................................... iv DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................v I. PENDAHULUAN ............................................................................................1 II. TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................................3 III. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN .................................................15 IV. METODE PENELITIAN ..............................................................................16 V. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................................19 VI. KESIMPULAN DAN SARAN .....................................................................21

DAFTAR PUSTAKA...22 LAMPIRAN ........................................................................................................23

iv
USU Repository2006
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Spektrum IR Senyawa Hasil Isolasi.. 23 Lampiran 2. Spektrum 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi........... 24

v
USU Repository2006
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

1 I. PENDAHULUAN Bahan-bahan hayati telah digunakan oleh manusia untuk memenuhi berbagai keperluan hidup. Indonesia yang beriklim tropis memiliki sumber daya alam hayati yang sangat beranekaragam yang memproduksi beraneka ragam senyawa kimia karbon alami. Hutan tropik Indonesia terdapat tumbuh-tumbuhan yang peranannya dalam era teknologi tidak kalah pentingnya dengan sumber daya alam lainnya seperti gas, batu bara, mineral dan lain-lain. Dari segi kimia, sumber daya alam hayati ini merupakan sumber-sumber senyawa kimia yang tak terbatas jenis maupun jumlahnya. Dengan demikian keanekaragaman hayati dapat diartikan sebagai keanekaragaman kimiawi yang mampu menghasilkan bahan-bahan kimia baik untuk kebutuhan manusia maupun untuk organisme lain seperti untuk obat-obatan, insektisida, kosmetika dan sebagai bahan dasar sintesa senyawa organik yang lebih bermanfaat. Dalam pengobatan secara tradisional sebagian besar ramuan berasal dari tumbuh-tumbuhan baik berupa akar, kulit batang, kayu, daun, bunga atau bijinya. Agar pengobatan secara tradisional dapat dipertangggung jawabkan maka diperlukan penelitian ilmiah seperti penelitian di bidang farmakologi, toksikologi, identifikasi dan isolasi zat kimia aktif yang terdapat dalam tumbuhan. Tumbuhan puding merah (Graptophyllum pictum L griff) sering ditemukan tumbuh liar di pedesaan atau ditanam sebagai tanaman hias atau tanaman pagar. Daun berkhasiat sebagai peluruh kencing (diuretik), mempercepat pemasakan bisul, pencahar ringan dan pelembut kulit dan bunganya sebagai pelancar haid. (Dalimartha, 1999). Tumbuhan umumnya mengandung senyawa aktif dalam bentuk metabolit sekunder seperti alkaloid, flavonoid, steroid, triterpenoid, kumarin dan lain-lain. Senyawa bioaktif hampir selalu toksik pada dosis tinggi. Oleh karena itu daya bunuh in vivo dari senyawa terhadap organisme hewan dapat digunakan untuk menapis ekstrak tumbuhan yang mempunyai bioaktifitas.

USU Repository2006

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

2 Salah satu organisme yang sangat sesuai untuk hewan uji tersebut adalah brine shrimp (udang laut). Brine shrimp test sudah digunakan untuk berbagai sistem bioassay yaitu untuk menganalisa residu pestisida, mikotoksin, polutan pada air sungai, ananstetik, toksin dinofagelata, senyawa yang berupa morfin, toksisitas pada dispersant minyak dan kokarsinogenik ester phorbol. Dalam fraksinasi yang diarahkan dengan bioassay, metoda brine shrimp telah digunakan untuk memonitor fraksi aktif mikotoksin dan antibiotik pada ekstrak jamur. (Dharma. A,2001) Kebanyakan kandungan kimia utama yang diisolasi dari tumbuhan akhir-akhir ini aktifitas biologisnya belum terungkap karena belum diteliti. Potensi ini perlu untuk didayagunakan untuk kemanusiaan dan juga untuk menjaga kelestarian tumbuhan tersebut dengan menggali potensi bahan alam untuk bahan obat, untuk mengontrol hama tumbuhan dan lain-lain. Berdasarkan hal tersebut maka penelitian ini dimaksudkan untuk mengisolasi kandungan kimia utama Puding Merah (Graptophyllum pictum L griff) dan menentukan bioaktifitasnya melalui uji brine shrimp.

USU Repository2006

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

3 II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Tinjauan Botani Tumbuhan (Graptophyllum pictum L Griff) Tumbuhan puding merah (Graptophyllum pictum L griff) sering ditemukan tumbuh liar di pedesaan atau ditanam sebagai tanaman hias atau tanaman pagar. Tumbuhan ini berupa perdu atau pohon kecil, tinggi 1,5 - 3 m, batang berkayu, kulit dan daun berlendir dan buahnya kurang enak. Cabang bersudut tumpul, berbentuk galah dan beruas rapat. Daun tunggal bertangkai pendek letaknya berhadapan bersilang, bulat telur sampai lanset, ujung dan pangkal runcing, tepi bergelombang, pertulangan menyirip, panjang 8 - 20 cm, lebar 3 - 13 cm, permukaan atas warnanya ungu mengkilap. Perbungaan majemuk, keluar dari ujung batang, tersusun dalam rangkaian berupa tandan yang panjangnya 3 12 cm, warna merah keunguan. Buahnya buah kotak, bentuknya lonjong, warnanya ungu kecoklatan. Daun berkhasiat sebagai peluruh kencing (diuretik), mempercepat pemasakan bisul, pencahar ringan dan pelembut kulit dan bunganya sebagai pelancar haid. (Dalimartha, 1999)

2.2. Teknik Isolasi Senyawa Metabolit Sekunder Untuk mengisolasi suatu senyawa kimia yang berasal dari bahan alam hayati pada dasarnya menggunakan metode yang sangat bervariasi, seperti yang diaplikasikan dalam proses industri. Metode pengempaan digunakan pada senyawa katecin dari daun gambir juga isolasi CPO dari buah kelapa sawit. Metode ini umum digunakan karena senyawa organik yang diperoleh dengan kuantitas yang cukup banyak. Tetapi berbeda dengan senyawa bahan alam hasil proses metabolit sekunder lainnya yang pada umumnya dengan kandungan yang relatif kecil, maka metode-metode dalam proses industri tersebut tidak dapat digunakan. Berdasarkan hal diatas maka metode yang umum dalam isolasi senyawa metabolit sekunder dapat digunakan. Metode standar laboratorium dengan kuantitas sampel terbatas dan perlunya menentukan metode yang paling sesuai dengan maksud tersebut. (Darwis.D, 2000) Dari identifikasi awal, maka dapat diamati kandungan senyawa dari tumbuhan sehingga untuk isolasi dapat diarahkan pada suatu senyawa yang lebih dominan dan salah
USU Repository2006
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

4 satu usaha mengefektifkan isolasi senyawa tertentu maka dapat dimanfaatkan pemilihan pelarut organik yang akan digunakan pada isolasi tersebut, dimana pelarut polar akan lebih mudah melarutkan senyawa polar dan sebaliknya senyawa non polar lebih mudah larut dalam pelarut non polar. (Harborne, 1987)

2.2.1. Identifikasi Kandungan Kimia Sebelum melakukan isolasi terhadap suatu senyawa kimia yang diinginkan dalam suatu tumbuhan maka perlu dilakukan identifikasi pendahuluan kandungan senyawa metabolit sekunder yang ada pada masing-masing tumbuhan, sehingga dapat diketahui kandungan senyawa yang ada secara kualitatif dan mungkin juga secara kuantitatif golongan senyawa yang dikandung oleh tumbuhan tersebut. untuk tujuan tersebut maka diperlukan metoda persiapan sampel dan metoda identifikasi pendahuluan dari senyawa metabolit sekunder sebagai berikut (Darwis.D, 2000) a. Senyawa Alkaloid Metode yang cukup dikenal adalah metode identifikasi pandahuluan Culvenor Fitgerald yaitu 4 gram sampel dipotong halus, digerus dengan lumpang dengan bantuan pasir yang bersih dan dibasahi dengan 10 ml kloroform. ditambah dengan kloroforrn amoniak 0,05 M, digerus kembali dan disaring kedalam tabung reaksi, ditambah 0,5 ml asam sulfat 2 N, kocok dan biarkan terjadi dua lapisan. Ambil lapisan asam sulfat dan masukkan kedalam tabung` reaksi dan kemudian tambahkan satu tetes pereakksi meyer. Terbentuknya endapan putih menandakan positif alkaloid. b. Senyawa Terpenoid, steroid, fenolik, flavonoid dan saponin 4 gram sampel segar dirajang halus dan dididihkan dengan 25 ml etanol selama lebih kurang 25 menit, disaring dalam keadaan panas, kemudian pelarut diuapkan sampai kering. Ektrak dikocok kuat dengan kloroform lulu ditambahkan air suling, biarkan sampai terbentuk dua lapisan. - Lapisan kloroform diteteskan pada plat tetes dan biarkan kering, tambahkan beberapa tetes asam asetat anhidrat dan asam sulfat pekat (pereaksi Liebermann Burchard). Terbentuknya warna merah atau pink menandakan positif untuk senyawa terpenoid dan terbentuknya warna biru atau hijau positif untuk steroid.
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

5 - Lapisan air * 1 ml lapisan air dikocok selama satu menit, terbentuknya busa yang tidak hilang selama 5 menit menandakan adanya saponin. * Beberapa tetes ditempatkan dalam tabung reaksi ditambahkan besi (III) klorida, timbul warna hijau sampai ungu menandakan positif fenolik * Beberapa tetes ditempatkan dalam tabung reaksi, ditambahkan asam klorida pekat dan serbuk magnesium dan timbulnya warna merah menunjukkan adanya flavonoid.

2.2.2. Ekstraksi dan Isolasi Secara umum ekstraksi senyawa metabolit sekunder dari seluruh bagian tunbuhan seperti bunga, buah, daun, kulit batang dan akar menggunakan sistem maserasi menggunakan pelarut organik polar seperti metanol. Beberapa metode ekstraksi senyawa organik bahan alam yang umum digunakan antara lain: (Darwis. D,2000) 1. Maserasi Maserasi merupakan proses perendaman sampel dengan pelarut organik yang digunakan pada temperatur ruangan. Proses ini sangat menguntungkan dalamisolasi senyawa bahan alam karena dengan perendaman sampel tumbuhan akan terjadi pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan antara didalam dan diluar sel sehingga metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik dan ekstraksi senyawa akan sempuma karena dapat diatur lama perendaman yang dilakukan. Pemilihan pelarut untuk proses maserasi akan memberikan efektifitas yang tinggi dengan memperhatikan kelarutan senyawa bahan alam alam pelarut tersebut. Secara umum pelarut metanol merupakan pelarut yang paling banyak digunakan dalam proses isolasi senyawa organik bahan alum, karena dapat melarutkan seluruh golongan metabolit sekunder. 2. Perkolasi Merupakan proses melewatkan pelarut organik pada sampel sehingga pelarut akan membawa senyawa organik bersama-sama pelarut. Tetapi efektifitas dari proses ini hanya akan lebih besar untuk senyawa organik yang sangat mudah larut dalam pelarut yang digunakan.
USU Repository2006
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

6 3. Sokletasi Menggunakan soklet dengan pemanasan dan pelarut akan dapat dihemat karena terjadinya sirkulasi pelarut yang selalu membasahi sampel. Proses ini sangat baik untuk senyawa yang tidak terpengaruh oleh panas 4. Destilasi Uap Proses destilasi lebih banyak digunakan untuk senyawa organik yang tahan pada suhu yang cukup tinggi, yang lebih tinggi dari titik didih pelarut yang digunakan. Pada umumnya lebih banyak digunakan untuk minyak atsiri. 5. Pengempaan Metode ini lebih banyak digunakan dalam proses industri seperti pada isolasi CPO dari buah kelapa sawit dan isolasi katecin dari daun gambir. Dimana pada proses ini tidakmenggunakan pelarut. Hasil yang diperoleh berupa ekstrak yang mana seluruh senyawa bahan alam yang terlarut dalam pelarut yang digunakan akan berada pada ekstrak ini. Penentuan jumlah komponen senyawa dapat dideteksi dengan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan menggunakan plat KLT yang sudah siap pakai. Terjadinya pemisahan komponen-komponen pada KLT dengan Rf tertentu dapat dijadikan sebagai panduan untuk memisahkan komponen kimia tersebut dengan menggunakan kolom kromatografi dan sebagai fasa diam dapat digunakan silika gel dan eluen yang digunakan berdasarkan basil yang diperoleh dari KLT dan akan lebih baik kalau kepolaraan eluen pada kolom kromatografi sedikit dibawah kepolaran eluen pada KLT.

'F Pemilihan eluen sebaiknya dimulai dari pelarut organik yang tidak polar seperti heksana dan peningkatan kepolaran dengan etil asetat atau pelarut yang lebih polar lainnya masing-masing pelarut (Harbone, 1987).

USU Repository2006

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

7 2.2.3 Identifikasi Senyawa dan Penentuan Struktur Suatu senyawa bahan alam hasil isolasi akan diidentifikasi berdasarkan kimia, fisika dan identifikasi dengan spektroskopi. Dari isolasi yang dengan menggunakan metoda standar tidak semua senyawa akan secara utuh seperti yang terdapat dalam tumbuhan tersebut, karena sebagian senyawa ada yang terlarut dan terpecah selama proses isolasi dan hasil terjadi seperti putusnya ikatan glikosida membentuk aglikon dan gula dengan adanya air. Identifikasi senyawa metabolit sekunder dan elusidasi struktur senyawa ditemukan merupakan pekerjaan yang sangat menentukan dalam proses mengenal, mengetahui dan pada akhirnya menetapkan rumus molekul yang aebenarnya dari senyawa tersebut. Diantara metode identifikasi dan elusidasi struktur yang diperoleh dapat dilakukan dengan metoda standar yang sudah dikenal untuk menentukan senyawa kimia dan termasuk derivat-derivatnya antara lain : (Silverstein, 1991) 1. Metoda Spektroskopi Metoda spektroskopi saat ini sudah merupakan metoda standar dalam penentuan struktur senyawa organik pada umumnya dan senyawa metabolit sekunder pada khususnya. Metoda tersebut terdiri dari beberapa peralatan dan mempunyai hasil pengamatan yang berbeda, yaitu a. Spektroskopi UV Merupakan metoda yang akan memberikan informasi adanya kromofor dari senyawa organik dan membedakan senyawa aromatik atau senyawa ikatan rangkap yang berkonjugasi dengan senyawa alifatik rantai jenuh. b. Spektroskopi IR Metoda yang dapat menentukan serta mengidentifikasi gugus fungsi yang terdapat dalam senyawa organik, yang mana gugus fungsi dari senyawa organik akan dapat ditentukan berdasarkan ikatan dari tiap atom dan merupakan bilangan frekuensi yang spesifik. c. Nuklir Magnetik Resunansi Proton Metoda ini akau mengetahui posisi atom-atom karbon yang mempunyai proton atau tanpa proton. Disamping itu akan dikenal atom-atom lainnya yang berkaitan dengan proton d. Nuklir Magnetik Kesonansi Isotop Karbon 13
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

8 Digunakan untuk mengetahui jumlah atom karbon dan menentukan jenis atom karbon pada senyawa tersebut. e. Spektroskopi massa mengetahui berat molekul senyawa dan ditunjang dengan adanya fragmentasi ion molekul yang menghasilkan pecahan-pecahan spesifik untuk suatu senyawa berdasarkan m/z dari masing-masing fragmen yang terbentuk. Terbentuknya fragmen-framen dengan terjadinya pemutusan ikatan apabila disusun kembali akan dapat menentukan kerangka struktur senyawa yang diperiksa. 2. Kromatografi Penggunaan kromatografi sangat membantu dalam pendeteksian senyawa metabolit sekunder dan dapat dijadikan sebagai patokan untuk proses pengerjaan berikutnya dalam menentukan struktur senyawa. Berbagai jenis kromatografi yang umum digunakan antara lain (Darwis.D,2000) a. Kromatografi Lapisan Tipis (KLT) Merupakan salah satu metoda identifikasi awal untuk menentukan kemurnian senyawa yang ditemukan atau dapat menentukaan jumlah senyawa dari ekstrak kasar metabolit sekunder.. Cara ini sangat sederhana dan merupakan suatu pendeteksian awal dari basil isolasi. b. Kromatografi Kolom Digunakan untuk pemisahan campuran beberapa senyawa yang diperoleh dari isolasi tumbuhan. Dengan menggunakan fasa padat dan fasa cair maka fraksi-fraksi senyawa akan menghasilkan kemurnian yang cukup tinggi. c. Kromatografi Gas Pemisahan campuran senyawa yang cukup stabil pada pemanasan, karena sampelyangdigunakan akan dirobah menjadi fasa gas dan dengan adanya perbedaan keterikatan senyawa pada fasa padat yang digunakan terhadap senyawa organik sehingga terjadi pemisahan musing-musing senyawa dari campurannya. d. Kromatografi Cair

USU Repository2006

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

9 Lebih dikenal dengan HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) dan lebih dari 75 % dari pemakaiaan HPLC menggunakan fasa padat ODS (Oktadesil Sifane) atau C-18 sedangkan fasa cair sebagai pefarut pembawa senyawa dapat diganti kepolarannya pada saat digunakan dan kondisi seperti itu dikenal sebagai fasa gradien. Pada kondisi gradien, senyawa non polar akan diadsorpsi lebih lemah oleh fasa padat dan akan dielusi dengan pelarut non polar dan sebaliknya senyawa polar akan diadsorpsi lebih kuat dan membutuhkan pelarut polar. Jika sampel mempunyai polaritas yang luas, pemisahan harus dilakukan dengan merubah kepolaran pelarut yang digunakan. efisiensi penggunaan HPLC ditentukan dengan pengaturan dan penggunaan peralatan sebagai pembantu dalam pemakaian HPLC. 2.3. Uji Bioaktifitas Senyawa Metabolit Sekunder Dipermukaan bumi ini terdapat ratusan ribu spesies yang masing-masing berpotensi mengandung metabolit sekunder yang unik. Dengan demikian jumlah senyawa metabolit sekunder pun menjadi sangat banyak. Di antaranya ada yang mempunyai aktifitas biologis dan ada pula yang tidak aktif biologis. Untuk penapisan senyawa berkhasiat dari sumber alam maupun dari bahansintetik yang jumlahnya ribuan diperlukan suatu metode penapisan yang cepat dan akurat. Untuk mempersempit jumlah bahan yang akan ditapis secara bioassay bisa juga dilakukan penapisan etnofarmasi terlebih dahulu. Dalam hal ini bahan yang akan diuji hanyalah yang secara tradisional digunakan oleh masyarakat sebagai obat. Penemuan bahan berkhasiat dari bahan alam maupun dari perpustakaan senyawa yang dihasilkan dari program "Combinatorial Chemistry" memerlukan teknologi penapisan senyawa khasiat dan teknologi isolasi dengan tuntunan uji bioekatifitas. Bioassay bisa dilakukan in vivo maupun in vitro. Tetapi untuk penapisan senyawa dengan aktifitas tertentu diperlukan suatu bioassay yang sederhana dan cepat sehingga dapat menapis banyak senyawa dalam waktu yang lama dan tidak memerlukan banyak biaya. Untuk penapisan bahan khasiat, dilakukan dengan dua kelompok assay yaitu selular dan molekular assay. Uji bioaktifitas selular menggunakan sel utuh dengan target random yaitu apa saja yang menghambat pertumbuhan sel. Sedangkan uji bioaktifitas molekuler menggunakan sistem terisolasi seperti enzim, reseptor, DNA dan lain-lain dengan target subseluler tunggal. (Dharma. A,2001)
USU Repository2006
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

10 Dalam hal ini bioassay terhadap senyawa bahan alam dilakukan dengan mengukur daya hambat senyawa terhadap aktifitas enzim farnesil transperase. Prosedur bioassay dari senyawa alam maupun sintetis sangat tergantung pada aktifitas biologis apa yang dicari atau ditapis dari perpustakaan senyawa yang ada. Bioassay sangat murah, mudah dan cepat merupakan pilihan untuk menapis senyawa bahan alam, baik penapisan esktrak kasar maupun dalam penapisan fraksi-fraksi sewaktu isolasi, diantaranya adalah : (Dharma. A,2001) 1. Aktivitas racun terhadap ikan (Piscidal Activity). Salah satu bioassay berdasarkan brine shrimp bioassay. Tumbuhan yang mempunyai aktititas racun bagi ikan juga ditemukaan mempunyai aktifitas lain seperti insektisida, berguna untuk bioaktifitas lainnya. 2.Aktifitas untuk menghambat pertumbuhaaan mikroba seperti pada uji antimikroba dan anti jamur. Bioassay untuk anti mikroba dapat dilakukan dengan menguji daya hambat pertumbuhan mikroba dalam medium padat oleh senyawa yang diuji dan menguji daya hambat senyawa uji terhadap enzim yang berfungsi dalam sintesis protein, DNA atau dinding sel. Metoda yang paling sederhana adalah dengan melakukan uji daya hambat senyawa uji terhadap pertumbuhan mikroba tersebut pada medium padat. 3. Uji Antifeedant untuk mendeteksi dan mengisolasi senyawa metabolit sekunder tumbuhan yang bersifat aktif biologis terhadap Serangga. ekstrak tumbuhan yang diuji ditambahkan kedalam makanan serangga, kemudian beberapa jenis serangga uji diberi makan dengan diet yang telah dicampur dengan ekstrak uji dan kemudian serangga tersebut dianalisa. inhibitor pertumbuhan tumbuhan, co-karsinogen atau irritant. Dalam hal ini, aktifitas piscidal merupakan marker yang

USU Repository2006

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

11 2.3.1. Uji Antimikroba Pemakaian antibakteri yang berlebihan menyebabkan mikroba yang semula sensitif terhadap antibiotik menjadi resisten. Oleh karena itu, senyawa antibakteri diperlukan untuk mengatasi bakteri resisten tersebut. Disamping itu juga perlu pengembangan antiseptik dan desinfektan baru yang lebih aman bagi kulit dan jaringan manusia. Umumnya antibiotik yang ada sekarang adalah metabolit sekunder yang dihasilkan oleh mikroorganisme sedangkan antibiotik dari tumbuhan tingkat tinggi masih dalam pencarian. Metode uji anti mikroba dari tumbuhan:(Hostettmann. K, 1991) 1. Sampel (bagian tumbuhan) diekstrak dengan cara dan pelarut yang sesuai. Ektraksi bisa dilakukan dengan perendaman, soklet dan lainnya. Pelarut yang digunakan akan bisa bervariasi tergantung dengan senyawa target dan biasanya etanol. Ekstrak dipekatkan dan dikeringkan. 2. Larutan stock (dalam air atau etanol 85 %) dengan konsentrasi 1000 mg/ml disiapkan. Larutan stock adalah larutan ekstrak yang akan diuji bioaktifitasnya. Larutan ini nantinya akan diencerkan dengan air hingga diperoleh konsentrasi yang diketahui. 3. Persiapan biakan bakteri atau jamur uji. Bakteri dibiakan pada medium nutrien agar slant dan ragi/jamur pada sabouroud agar slant. Inolukasi ini dinkubasi pada 37C untuk bateri dan 30C untuk jamur. 4. Persiapkan medium agar pada cawan petri untuk uji bioaktifitas 5. Uji bioaktifitas antibiotik dari esktrak dapat dilakukan dengan tiga metode yaitu : - Metode difusi. Dengan metode difusi ini, ekstrak uji yang diserap dengan kertas saring dimasukkan ke dalam silinder atau dimasukkan ke dalam lubang, dikontakkan dengan media yang telah diinokulasi. Kemudian setelah diinkubasi, diameter daerah bening di sekitar reservior diukur. Diameter daerah bening ini merupakan daerah inhibisi dari kestrak sampel terhadap mikroba uji. Untuk menurunkan limit deteksi, sistem dibiarkan pada suhu rendah selama beberapa jam sebelum diinokulasi, yaitu untuk memberikan kesempatan kepada antibiotik untuk berdifusi sebelum mikroba tumbuh. -Metoda Pengenceran Pada metoda pengenceran, Sampel yang akan diuji dicampur dengan medium yang cocok
USU Repository2006
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

12 yang sebelumnya telah diinokulasi dengan mikroba uji. Setelah inkubasi, pertumbuhan mikroba dapat ditentukan dengan cara visual atau dengan perbandingan turbidimetri dari kultur uji dengan kultur kontrol. Kurtul kontrol adalah kultur yang tidak diberi sampel yang akan diuji bioaktifitasnya. -Metoda Bioautografi Merupakan metoda untuk menentukan tempat (posisi) senyawa yang mempunyai aktifitas mikroba pada kromatogram. Caranya adalah dengan memindahkan senyawa uji dari kromatogram lapis tipis atau kertas ke medium agar yang sudah diinokulasi dengan mikroba uji. Daerah inhibisi kemudian dilihat dengan cara yang sesuai.

2.3.2. Uji Brine Shrimp Lethality Senyawa bioaktif hampir selalu toksik pada dosis tinggi. Oleh karena itu daya bunuh in vivo dari senyawa terhadap organisme hewan dapat digunakan untuk menapis ekstrak tumbuhan yang mempunyai bioaktifitas dan juga untuk memonitor fraksi bioaktif selama fraksinasi dan pemurnian . (Meyer, 1982). Salah satu organisme yang sangat sesuai untuk hewan uji tersebut adalah brine shrimp (udang laut). Brine shrimp test sudah digunakan untuk berbagai sistem bioassay yaitu untuk menganalisa residu pestisida, mikotoksin, polutan pada air sungai, ananstetik, toksin dinoflagelata senyawa yang berupa morfin, toksisitas pada dispersant minyak dan kokarsinogenik ester phorbol. Dalam fraksinasi yang diarahkan dengan bioassay, metoda brine shrimp telah digunakan untuk memonitor fraksi aktif mikotoksin dan antibiotik pada ekstrak jamur. (Abdi,2001) Metoda uji aktifitas brine shrimp adalah: (Hostettman, 1991) 1. Air laut dimasukkan kedalam tanki kecil dan masukkan telur udang ke dalam salah satu bagian dari tanki, tutup bagian ini. Lampu yang terletak pada sisi lain dihidupkan untuk rnenarik udang melalui lubang pembatas. Larva udang siap untuk digunakan setelah berumur dua hari. 2. Setiap fraksi diuji pada konsentrasi 1000, 100, 10 l/ml. Setiap perlakuan dilakukan dengan tiga kali ulangan.
USU Repository2006
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

13 3. Penyiapan sampel dapat dilakukan dengan salah satu dari dua cara berikut : a. 20 mg sampel dilarutkan dengan 2 ml pelarut (20 mg/2 ml). Dengan menggunakan syringe, larutan sampel dipindahkan ke dalam botol masing-masing 500, 50 dan 5 L. Pelarut diuapkan di bawah nitrogen dengan vakum tinggi selama 12 jam. b. Sampel dilarutkan dengan DMSO, maksimum 50 L DMSO per 5 ml larutan garam. Konsentrasi DMSO yang lebih tinggi dari 50 L/5 ml berakibat toksik pada larva udang. Untuk kontrol, larutan sampel diganti dengan pelarut saja. 4. Ke dalam masing-masing hotel yang sudah berisi larutan sampel dimasukkan 5 ml larutan air garam dan 10 larva udang. 5. Setelah 24 jam kemudian, dihitung jumlah larva yang masih hidup. Kemudian tentukan LC50 dari hewan uji. 2.3.3. Uji Aktifitas Terhadap Serangga Kebanyakan metabolit sekunder tumbuhan dapat mempengaruhi tingkah laku, pertumbuhan dan reproduksi serangga sehingga dapat digunakan untuk mengontrol serangga hama. Cara uji aktifitas serangga adalah sebagai berikut : (Arbain.D,1995) 1. Pilih serangga uji dengan pertimbangan yaitu kepentingan ekonomis, kecenderungan untuk bertelur atau membentuk koloni, sensitif terhadap banyak bahan kimia dan lainlain. 2. Ekstraksi tumbuhan dan uapkan pelarutnya. Siapkan 10 % larutan ekstrak dalam etanol sebagai larutan contoh 3. Siapkan tiga wadah dan kctiganya dihubungkan dengan slang plastik. Dengan hati-

hati tempatkan 12 ekor serangga uji dalam salah satu wadah. Pada wadah kedua tempatkan kertas saring lembab dan pada wadah ketiga tempatkkan kertas saring yang Lelah ditetesi sampel. Kemudian dikeringkan diudara sampai tidak tercium ball etanol. Amati yang terjadi selang satu jam selama satu malam. 4. Jika semua serangga uji berkumpul pada wadah sampel dan masih hidup maka diduga sampel mengandung senyawa yang bersifat penarik "atractant'" serangga., jika berada pada wadah sampel tetapi mati maka diduga sampel mengandung senyawa yang bersifat
USU Repository2006
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

14 insektisida, jika tidak satupun berada pada wadah sampel maka diduga sampel mengandung senyawa yang bersifat penolak "repellent" serangga. Jika tidak terlihat perbedaan nyata dapat dikatakan bahwa sampel uji tidak aktif terhadap serangga.

USU Repository2006

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

15 III. TUJUAN DAN MANFAAT 3.1. Tujuan Penelitian Puding Merah (Graptophyllum pitum L griff) merupakan tumbuhan perdu atau pohon keci! yang sering ditemukan tumbuh liar di pedesaan atau ditanam sebagai tanaman hias atau tanaman pagar. Tumbuhan ini banyak dimanfaatkan oleh masyarakat untuk berbagai keperluan terutama sebagai obat. Oleh karena itu dalam penelitian ini dilakukan pemisahan komponen kimia utama tumbuhan ini dan dilakukan uji bioassay terhadap larva Artemia salina untuk mengetahui aktifitas biologisnya melalui metode uji brine shrimp 3.2. Manfaat Penelitian Dari hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi baru mengenai kandungan kimia utama dan aktifitas biologis daun Purling Merah (Graptophyllum pictum L grill) dan diharapkan dapat memberikan konstribusi dalam pengembangan kimia bahan alami

USU Repository2006

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

16 IV. METODE PENELITIAN 4.1. Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia Bahan Alam Jurusaan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara medan. 4.2. Bahan dan Alat yang Digunakan 4.2.1. Bahan-bahan Bahan-Bahan yang digunakan adalah etanol, n-heksana, etil asetat, butanol, metanol, asam klorida pekat, serbuk magnesium, asam sulfat, silika gel, plat kromatografi lapis tipis, larva Artemia salina 4.2.2. Peralatan Peralatan yang digunakan adalah bejana maserasi, rotary evaporator, kolom kromatografi, tanki biakan larva dan peralatan gelas.

4.3. Prosedur Penelitian Penelitian ini dimulai dari pengumpulan daun tumbuhan puding merah (Graptophyllum pictum L Griff) dan determinasi. Kemudian dikeringkan dan digiling menjadi serbuk kering, dilanjutkan dengan isolasi kandungan kimia utamanya dengan metoda ekstraksi dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol. Pemisahan dilakukan dengan kromatografi kolom. 4.3.1. Ekstraksi dan Pemisahan a. Ekstraksi Daun tumbuhan puding merah (Graptophyllum pictum L Griff) yang telah dikeringkan sebanyak 1 kg dihaluskan, kemudian sampel yang telah berbentuk serbuk tersebut dimaserasi dengan menggunakan pelarut etanol selama dua hari sambil sekali-kali dikocok. Selanjutnya sari etanol dipisahkan dengan cara penyaringan. Ekstrak etanol dipekatkan dengan rotary evaporator, kemudian dilakukan skrining fitokimia untuk mengetahui kandungan kimia utamanya. Kemudian ekstrak etanol di fraksinasi berturut-turut dengan n-heksana dan etil asetat. Terhadap
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

17 masing-masing fraksi dilakukan kromatografi lapis tipis untuk mengetahui jumlah komponen senyawa kimia dalam fraksi tersebut. Fraksi yang memberikan kandungan senyawa kimia paling banyak dilakukan . pemisahan komponennya lebih lanjut. Dimana pada daun puding merah (Graptophyllum pictum L Griff) fraksi yang mempunyai kandungan kimia paling banyak adalah fraksi etil asetat. c. Pemisahan Pemisahan kandungan kimia dari fraksi etanol dilakukaan dengan kromatografi kolom dengan fasa diam silika gel 60. Silika gel yang telah disuspensikan dengan n-heksana dimasukkan kedalarn kolom. Ekstrak etanol pekat dilarutkan dan ditambahkan silika gel dengan berat yang sama dan diuapkan sampai kering. Hasil preabsorpsi dimasukkan kedalam kolom lalu dielusi dengan n-heksana, kemudian kepolaran eluen ditingkatkan dengan menambahkan etil asetat secara bertahap. Komposisi eluen yang digunakan adalah n-heksana - etil asetat (90: 10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70 dan 20:80) dengan volume masing-masing eluen tersebut adalah 100 m1. Fraksi yang keluar dari kolom ditampung dengan menggunakan botol vial dengan volume 10 ml dan dimonitor dengan kromatografi lapis tipis. Fraksi dengan nilai Rf yang sama digabung yaitu fraksi dengan nomor vial 124 - 131 dan diuapkan pelarutnya. Fraksi ini direkristalisasi sehingga diperoleh kristal mumi.

4.3.2. Uji Bioaktifitas Larva Artemia salina a. Penyiapan larva artemia salina Larva udang disiapkan dengan cara menetaskan telur Artemia salina dua hari sebelum dilakukan pengujian. Penetasan dilakukan dengan cara merendam telur udang tersebut kedalam air laut buatan yang mengandung NaCl 2% (b/v) sebanyak 200 m1. Setelah 24 jam perendaman, telur menetas dan menghasilkan larva Artemia salina

USU Repository2006

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

18 b. Penyiapan sampel Sampel dengan berat 20 mg dilarutkan dengan 2 ml pelarut. Larutan sampel dipindahkan masing-masing sebanyak 500, 50 dan 5 l ke dalam botol. Pelarut diuapkan sampai betul-betul kering. c. Pelaksanaan uji Kedalam masing-masing botol yang telah berisi sampel dimasukkan air laut buatan dan 10 larva udang yang telah berumur 2 hari. Setelah 24 jam kemudian dihitung jumlah larva yang mati.

4.3.3. Analisis data Terhadap senyawa hasil isolasi dilakukan analisis spektroskopi IR dan 1H NMR. Untuk analisis data uji hayati dilakukan dengan analisis probit (Koestoni, 1985) untuk menghitung LC50. Barga LC50 dibawah 1000 g/ml dinyatakan sebagai sanyawa bioaktif, apabila diatas 1000 g/ml dinyatakan sebagai senyawa tidak bioaktif.

USU Repository2006

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

19 V. HASIL DAN PEMBAHASAN 5.1. Hasil Penelitian Ekstraksi terhadap 1000 gram serbuk daun puding merah (graptophyllum pictum L Griff) dengan menggunakan etanol diperoleh ekstrak kasar etanol. Setelah dilakukan uji fitokimia dengan menambahkan serbuk magnesium dan asam klorida pekat maka ekstrak tersebut menghasilkan Warna merah yang menunjukkan bahwa ekstrak tersebut mengandung senyawa flavonoid. Dari hasil pemisahan dengan menggunakan kromatografi kolom diperoleh. kristal sebanyak 37 mg dan dari kromatografi lapis tipis memberikan noda tunggal dengan berbagai eluen. Karakterisasi Inframerah senyawa spektrum (IR) hasil_isolasi memperlihatkan pita serapan pada angka gelombang 3431, 3111, 3057, 1618, 1462, 1340, 1060, 970 dan 800 cm-1 (Iampiran 1) dan spektrum 1H-NMR memperlihatkan adanya pergeseran kimia pada 1,5 ; 6,3 dan 7,6 ppm (lampiran 2). Uji bioassay senyawa hasil isolasi menunjukkaan aktifitas biologis terhadap larva Artemia salina yang memberikan LC50 sebesar 124,08 g/ml.

5.2. Pembahasan Analisis spektrum Inframerah (IR) senyawa hasil isolasi (lampiran 1)memperlihatkan adanya pita serapan pada angka gelombang 3431 cm-1 yang merupakan serapan dari regang O-H dengan bentuk pita yang agak lebar. Pita serapan di atas 3000 cm-1 menunjukkan adanya regang C-H aromatis dimana pada spektrum senyawa hasil isolasi muncul pada angka gelombang 3111 dan 3057cm-1 Pita serapan pada angka gelombang 1618 cm-1 menunjukkan adanya regang C=O dengan pita serapan yang kuat. Pita serapan pada angka gelombang 1475 1300 cm-1 merupakan lentur C-H alifatik dan pita serapan pada angka gelombang 1462 cm-1 menunjukkan absorpsi dari metil dan metilena. Daerah pada angka gelombang 1000 - 650 cm-1 memberikan informasi tentang sifat khas alkena dan posisi substitusi pada cincin aromatis dimana pada spektrum IR muncul pita serapan pada angka gelombang 970 cm-1 yang menandakan adanya alkena dalam bentuk trans dan pita serapan pada angka gelombang 800 cm-1 menandakan adanya aromatik meta. Analisis spektrun 1H-NMR senyawa hasil isolasi (lampiran 2) terlihat adanya beberapa
USU Repository2006
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

20 kelompok proton dengan pergeseran kimia yang berbeda-beda. Pada pergeseran kimia 1,5 ppm muncul sinyal multiplet yang menunjukkan proton alifatik atau proton OH yang diperkuat oleh spektrum IR pada angka gelombang 3431 cm-1. Adanya sinyal multiplet pada pergeseran kimia 6,3 ppm menunjukkaan adanya alkena disertai pembelahan jarak jauh. Pada pergeseran kimia 7,6 ppm muncul sinyal multiplet yang menunjukkan proton-proton cincin aromatik. Sinyal-sinyal yang muncul pada pergeseran kimia 6,0 - 8,0 ppm merupakan sinyal untuk proton-proton aromatik. Dari analisis spektrum IR dan 1H-NMR serta hasil uji fitokimia dengan menggunakan perekasi serbuk magnesium dan asam klorida pekat yang menghasilkan warna merah maka disimpuIkan bahwa senyawa hasil isolasi merupakan senyawa aromatis atau fenolik dan diperkirakan merupakan suatu jenis senyawa flavonoid. Uii bioassay senyawa hasil isolasi : Jumlah larva yang mati tiap konsentrasi (g/ml) Nomor vial 10 1 2 3 Jumlah kematian Jumlah larva % kematian Log konsentrasi Nilai probit 2 2 3 7 30 23,3 1 4,2710 100 4 5 5 14 30 46,7 2 4,9172 1000 7 7 8 22 30 73,3 3 5,6219 kontrol 0 0 0 0 30 i ' r I

Uji bioassay senyawa hasil isolasi dilakukan terhadap larva Artemia salina dan analisis data uji dilakukan dengan analisis probit yang memberikan LC50 sebesar 124,08 g/ml.

USU Repository2006

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

21 VI. KESIMPULAN DAN SARAN 6.1. Kesimpulan Dari hasil penelitian dan pembahasan yang dilakukan maka dapat disimpulkan : 1. Isolasi terhadap 1000 gram daun puding merah (Graptophyllum pictum L Griff) diperoleh kristal sebanyak 37 mg dan dari analisis spektrum IR dan 1H-NMR serta uji fitokimia maka senyawa hasil isolasi diperkirakan merupakan senyawa aromatik atau fenolik yaitu suatu jenis senyawa flavonoid. 2. Pengujian aktifitas biologis senyawa hasil isolasi terhadap larva Artemia salina menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi termasuk senyawa bioaktif dengan LC50 sebesar 124,08 g/ml.

6.2. Saran Untuk meperoleh informasi tentang jenis dan struktur senyawa flavonoid hasil isolasi maka disarankan untuk melakukan analisis spektroskopi analisis lainnya.
13

C NMR dan MS serta analisis-

USU Repository2006

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

22 DAFTAR PUSTAKA Arbain.D, 1995, Uji Bioaktifitas dan Penelitian Kimia Bahan Alam, Workshop Isolasi Senyawa Aktif Biologis, FMIPA Universitas Andalas Padang Dalimartha.S, 1999, Atlas Tumbuhan Obat Indonesia Jilid I, Cetakan 1, Trubus Jakarta Agriwidya,

Darwis.D, 2000, Teknik Dasar Laboratorium Dalam Penelitian Senyawa Bahan Alam Hayati, Workshop Pengembangan Sumber Daya Manusia Dalam Bidang Kimia Organik Bahan Alam Hayati, FMIP A Universitas Andalas Padang Dharma.A, 2001, Uji Bioaktifitas Metabolit Sekunder, Workshop Peningkatan Sumber Daya Manusia Untuk Pemanfaatan Sumber Daya Alam Hayati dan Rekayasa Bioteknologi, FMIPA Universitas Andalas Padang HarborneJ.B, 1987, Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata., lTB Bandung Heyne.K, 1987, Tumbuhan Berguna Indonesia, Jilid II, Badan Penelitian dan Pengembangan Kehutanan, Departemen Kehutanan, Diterjemahkan oleh Badan Litbang Kehutanan, Jakarta Hosettmann.K, 1991, Methods in Plant Biochemistry, Vol 6, Academic press, New York Koestoni.T, 1985, Analisis probit, Kelompok Peneliti Hama, Balai Penelitian Hortikultura, Lembang Mc.Laughlin.J.L, 1991, The Unesco Regional Workshop on The Bioassay of Natural Product with Special Emphasis on Anticancer Agents, Institute Advanced Studies, University of Malaysia Meyer.B.N, 1982, Brine Shrimp Agregaat Convenient General Bioassay For Active Plant Constituens, Planta Med, 45,31-34 Silverstein.R.M, 1991, Spectrometric Identification of Organic Compounds, edisi ke-5, Jhon Willey & Sons

USU Repository2006

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006