TEORI KESALAHAN DAN PENGOLAHAN DATA

I M. A. Gelgel Wirasuta

Major steps in solving an analytical problem

Langkah pekerjaan analisis

Tetapkan tujuan analisis Langkan analisis Penerokan Pemisahan Pengukuran Pengolahan data Komunikasi hasil analisis
Data diolah secara statistik agar diperoleh hasil yang berarti.

Accuracy and Precision

Kecermatan (accuracy); Ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya. Dinyatakan dalam persen perolehan kembali (%recovery) Keseksamaan (precision) Menyatakan ukuran yang menunjukkan kedekatan hasil analisis masing-masing terok yang sama pada penetapan paralel atau penetapan berulang kali. Dinyatakan sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif

kecermatan vs keseksamaan

Hasil analisis dengan baik kecermatan dan keseksamaan tinggi

Hasil analisis dengan kecermatan kurang dan hanya keseksamaan tinggi

Kesalahan (Galat) dalam analisis kuantitatif

Galat dapat mengakibatkan ketidaktepatan hasil analisis
Ketidaktepatan:
perbedaan hasil pengukuran dengan nilai sebenarnya
Miller (1991) statistika untuk kimia: tidak ada hasil kuantitatif yang bermakna kecuali hasil itu disertai suatu taksiran galat yang memang tak terpisahkan darinya

Sumber Galat dalam analisis

Setiap proses analisis Alat dan instrumen yang digunakan Manusia (operator, analis)

Contoh sumber galat dari peralatan gelas

Jenis Galat Analisis

Galat gamblang:
Galat yang sudah jelas, menyebabkan kita mengabaikan percobaan yang telah dilakukan dan memulai lagi dari awal secara menyeluruh

Galat acak
Galat yang tidak pasti (munculnya acak) yang menyebabkan setiap hasil berbeda satu dengan yang lainnya

Galat sistematik atau procedural error

menyebabkan penyimpangan hasil dari hasil yang diharapkan yang muncul secara konstan (ajeg) galat ini adalah pasti dan bersifat ajeg (dapat positif atau negatif)

Galat acak
Timbul oleh sebab yang tidak teratur tetapi selalu menyertai setiap penetapan
termasuk ganguan instrumen maupun kondisi percobaan menyebabkan penetapan paralel sedikit saling berbeda dari hasil rata-rata

Diperlukan model matematik yang sesuai untuk mengambarkan distribusi probabilitas galat acak: (distribusi Gaussian) Galat acak dinyatakan dengan:

Er x

Percent of measurements falling within a given range (assuming a Gaussian distribution)

Galat sistematik
Mempengaruhi kecermatan yaitu kedekatannya pada nilai sebenarnya Merupakan gabungan antara
galat tetap dari satu terok ke terok yang lain galat proporsional tergantung pada ukuran terok

Gs = Gt + Gp
Gs: galat sistem; Gt: galat tetap Gp: galat proporsional

Sumber galat sistematik

instrumen personal, dan metode

Instrumental errors
Intrumental error Drift in electronic circuit, Leakage in vacuum system Temperature effects on detector Currents induced in circuits from ac power lines Decrease voltages of batteries with use Calibration errors in meters, weights, and volumetric equipment Commonly detected and corrected by calibration with suitable standard Periodic calibration instruments is always desirable because response most instruments changes with time as a consequence of wear, corrosion, or mistreatment

Personal error
Jenis kesalahan personal
Penetapan/penglihatan batas akhir Penentuan warna indikator pada titrasi Pembacaan sekala buret atau sekala ukur lainnya Kelalaian dalam mencatat

Diatasi dengan membuat

standard operasional prosedur Dokumentasi setiap langakah pengerjaan

Methods Error
Penggunaan reagen kimia yang tidak edial Sifat fisika dari reagen, dan Reaksi yang terjadi selama analisis

Diatasi dengan melakukan prosedur validasi pada metode yang digunakan

Validasi metode analisis

I M A Gelgel Wirasuta

Validasi Metode Analisis

1. 2. 3. 4. Kecermatan Accuracy Keseksamaan Precision Kekhasan Specificity Linieritas dan rentang Linearity and Range 5. Batas Deteksi Limit of Detection 6. Batas Kuantisasi Limit of Quantitation 7. Ketangguhan Raggedness

Validasi Metode Analisis

Langkah pertama harus disiapkan sebelum dilakukan validasi:
Menyediakan Bahan Baku Pembanding Kimia Bersertifikat Certified reference material (CRM), atau Bahan pembanding kimia standard reference material (SRM) CRM dan SRM disediakan oleh badan resmi yang kemurnian dan homogenitasnya terjamin dan telah dibakukan oleh badan resmi SRM untuk bahan kimia farmasi dikeluarkan oleh PPOMN (Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional-BPOM-RI)

Validasi metode analisis

Tujuan;
Untuk memastikan bahwa metode analisis yang digunakan memenuhi persyaratan untuk penerapan analitik

1) Kecermatan Accuracy
Definisi:
Ukuran yang menunjukkan kedekatan hasil analisis dengan kadar yang sebenarnya Diyatakan dengan persen perolehan kembali analit yang titambahkan

Kecermatan bergantung pada

Seluruh galat dalam analisis

Upaya mencapai derajat kecermatan tinggi:

Mengurangi galat sistematik: Mengkalibrasi peralatan, mengontrol suhu, dan pelakasanaan yang cermat dan taat asas sesuai dengan prosedur,

1) Kecermatan Accuracy
Ditentukan dengan dua cara:
Cara simulasi spiked-placebo recovery method Menentukan kadar analit dalam terokan simulasi yaitu mencampurkan analit dalam jumlah tertentu dalam bahan pembantu tertentu. Analit yang digunakan merupakan bahan baku pembanding kimia (CRM atau SRM) Cara penambahan baku standard addition method Sejumlah tertentu analit ditambahkan ke dalam terokan yang mengandung analit sama yang akan ditentukan

1) Kecermatan Accuracy
Cara simulasi spiked-placebo recovery method

Perolehan kembali:
Ratio antara hasil yang diperoleh terhadap hasil yang sebenarnya % perolehan kembali = (Xr / Xa) 100 Xr = jumlah analit yang diperoleh kembali Xa = jumlah analit yang ditambahkan % perolehan kembali ditentukan dengan cara membuat sampel plasebo (ekspien obat, cairan biologis) menambahkan analit dengan konsentrasi tertentu (80% s/d 120% dari kadar analit yang akan diperkirakan) analisis dengan metode yang akan divalidasi

1) Kecermatan Accuracy
Penambahan baku standard addition method

Bila tidak memungkinkan membuat sampel plasebo karena matriknya tidak diketahui maka dapat dipakai metode adisi Dilakukan dengan menambahkan sejumlah analit dengan konsentrasi tertentu pada sampel yang diperiksa, lalu dianalisis dengan metode tersebut Teknik penambahan baku dapat dilakukan secara seri atau tunggal

1) Kecermatan Accuracy
Penambahan baku standard addition method

Perhitungan %perolehan sampel

1) Kecermatan Accuracy
Penambahan baku standard addition method

Jumlah optimum analit yang ditambahkan:

2 s/d 4 kali kadar analit yang ada pada terok tanpa penambahan baku

Kelemahan metode penambahan baku:

Tidak dapat digunakan jika analit yang ditambahkan menimbrung reaksi utama: Analit yang ditambahkan menyebabkan kekurangan pereaksi yang digunakan, Ketidaksetimbangan massa, Mengubah pH atau kapasitas dapar

Evaluasi kecermatan
Kecermatan bergantung pada:
Konsentrasi analit dalam matrik sampel, dan Keseksamaan metode (RSD = relative standard deviation)

Vander Willen menyatakan:

Selisih kadar Xd pada berbagai penetapan harus kurang dari 5% Harga rata-rata selisih secaran statistik < 1,5% S = RSD, I = nilai t pd tabel t studen pada aras 95% n = jumlah sampel

Evaluasi kecermatan
Rentang kesalahan yang dijinkan pada setiap konsentrasi analit pada matriks

1) Kecermatan Accuracy
Jika bahan pembanding kimia (SRM atau CRM) tidak ada makan uji kecermatan dapat diukur dengan membandingkan metode yang divalidasi dengan methode yang sudah divalidasi atau yang tercantum dalam buku acuan seperti farmakofe Kadang-kadang dibandingkan dengan metode penentuan absolut: Volumetri, gravimetri, analisis kuantitatif dengan NMR

2) Keseksamaan
Definisi:
Ukuran yang menunjukkan kedekatan hasil pengukuran masing-masing terok yang sama terhadap hasil pengukuran paralel atau pengukuran berulang kali.

Ekspresi
Dinyatakan sebagai:
Simpangan baku (SD) Simpangan baku relatif (RSD) Koefisien variansi (CV)

2) Keseksamaan
Pengujian:
Dilakukan dengan analisis terokan yang sama secara berulang kali Edward: 10 kali terokan paralel dan RSD < 2% Buick: RSD < 10% untuk matrik biologi Shah: minimum 5 kali setiap konsentrasi dengan harga CV 15%, kecuali pada LOQ, CV 10% Sebaiknya ditentukan terhadap terokan sebenarnya, yaitu terokan berupa produk farmasi yang senyaja dibuat: tablet, sirop, dll Pada tahap pengembangan metode sebelumnya, Keseksaman ditentukan dengan cara penetapan kadar secara berulang dalam sediaan simulasi

2) Keseksamaan
Koefesian Variasi / RSD akan meningkat seiring dengan penurunnya konsentrasi analit
Kadar 1% atau lebih maka RSD < 2,5% Kadar 1%o maka RSD < 5% Kadar satu persejuta maka RSD < 16% Kadar perbilion maka RSD < 32%

Secara umum diterima apabila RSD 2%

2) Keseksamaan
Perhitungan SD X1, X2, X3, X4, ..Xn

Perhitungan RSD atau koefisien variansi (KV)

Keseksamaan ketertiruan keterulangan

Rancangan keseksamaan dapat digunakan untuk mengukur ketertiruan dan keterulangan Ketertiruan (reproducibility):
Diperiksa oleh laboratorium yang berbeda

Keterulangan (repeatability):
Diperiksa oleh satu laboratorium dengan menggunakan alat, pereaksi, instrumen dan waktu yang sama tetapi operator atau analisnya berbeda

3) Kekhasan / selektivitas
(selectivity) Definisi:
Kemampuan metode yang hanya menentukan analit tertentu saja secara cermat dan seksama dalam terokan yang mengandung komponen lain

Penentuan
Penetapan kadar analit dalam terokan yang mengandung pengotor, hasil urai, atau senyawa lain yang sengaja ditambahkan dan dibandingkan dengan analisis terokan yang mengandung analit saja Selisih kadar menunjukkan derajat kekhasan metode tersebut

4) Linieritas dan rentang

Definisi: Liniertas: kemampuan metode analisis memberikan respon baik secara langsung maupun dengan bantuan transformasi matematik yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam terokan Rentang: batas terrendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan dan linieritas yang dapat diterima Linieritas diuji untuk: Membuktikan adanya hubungan linier antara konsentrasi analit dengan respon detektor instrumen Penentuan: Dilakukan penetapan kadar pada rentang konsentrasi tertentu, kemudian dibuat hubungan linieritas melalui kurva kalibrasi Koefesien korelasi (r) pada analisis regresi linier digunakan sebagai parameter liniertas

4) Linieritas dan Rentang

Parameter lain yang dihitung selain koefisien korelasi (r)
Simpangan baku residual (Sy)

Rentang pengujian linieritas dilakukan pada

rentang konsentrasi 25 s/d 200% dari kadar analit dalam terokan

5) Batas Deteksi (LOD) dan Batas kuantisasi (LOQ)

Definisi LOD adalah jumlah analit terkecil yang dapat memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko LOQ adalah jumlah analit terkecil yang dapat ditentukan dengan derajat kecermatan dan keseksamaan terentu sesuai dengan kondisi percobaan Penentuan Tergantung pada teknik analisis yang digunakan

5) Batas Deteksi (LOD) dan Batas kuantisasi (LOQ)

Penentuan:
Menggunakan prosedur instrumental:
LOD ditentukan melalui ratio signal/noise (S/N) dari terukan yang diketahui kadarnya dibandingkan terhadap blangko Mengukur sejumlah tertentu terokan blanko lalu dihitung simpangan baku (SD) dari respon yang diberikan
LOD = 3 SD LOQ = 10 SD

5) Batas Deteksi (LOD) dan Batas kuantisasi (LOQ)

Penentuan:
Menggunakan prosedur instrumental:
Dihitung secara statistik dari kurva regresi linier Y = ax +b Simpangan baku blanko = simpangan baku residual (Sy/x)

6) Ketangguhan ruggedness
Definisi Menunjukkan derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari analisis terokan yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratirum, analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, hari yang berbeda dll. Ketangguhan biasanya dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh perbedaan operasi atau lingkungan kerja pada hasil uji Merupakan ukuran ketertiruan pada kondisi operasi normal antar lab dan antar analis, pereaksi sama, Ketangguhan dikaji secara studi kolaboratif (antar lab)

7) Kekuatan (Robustness)
Untuk memvalidasi kekuatan suatu metode perlu dibuat perubahan metodologi yang kecil dan terus menerus dan mengevaluasi respon analitik dan efek keseksamaan dan kecermatan. Contoh: pada HPLC perubahan komposisi fase gerak (1%) pH fase gerak ( 0,2 unit) Perubahan temperatur kolom ( 2-3 oC)

SELEKSI PARAMETER VALIDASI

Pemilihan parameter validasi tergantung pada tipe prosedur analitik: USP XXII Kategori I: Metode yang digunakan untuk kuantitas komponen maupun substansi bahan baku obat atau bahan aktif (termasuk pengawet) pada hasil akhir farmasetika Katagori II: Metode yang digunakan untuk menentukan campuran dalam substansi bahan baku obat atau komponen sisa pada produk akhir farmasetika. Metode ini termasuk perhitungan kembali secara kuantitatif dan tes batas Katagori III Metode yang digunakan untuk menevaluasi sediaan farmasi, seperti pada uji disolusi dan keseragaman kandungan

SELEKSI PARAMETER VALIDASI