Struktur RNA Molekul RNA mempunyai bentuk yang berbeda dengan DNA.

RNA memiliki bentuk rantai tunggal dan tidak berpilin. Tiap rantai RNA merupakan polinukleotida yang tersusun atas rangkaian ribonukleotida. Tiap ribonukleotida tersusun atas gula ribosa, basa nitrogen, dan gugusan fosfat. Basa nitrogen RNA juga dibedakan menjadi basa purin dan basa pirimidin. Basa purinnya sama dengan DNA tersusun atas adenin (A) dan guanin (G), sedangkan basa pirimidinnya berbeda dengan DNA yaitu tersusun atas sitosin (C) dan urasil (U).

Gambar 36. Struktur RNA (Sumber : www.uic.edu) Tulang punggung RNA tersusun atas deretan ribosa dan fosfat. Ribonukleotida RNA terdapat secara bebas dalam nukleoplasma dalam bentuk nukleosida trifosfat, seperti adenosin trifosfat (ATP), guanosin trifosfat (GTP), sistidin trifosfat (CTP), dan uridin trifosfat (UTP). RNA disintesis oleh DNA di dalam inti sel dengan menggunakan DNA sebagai cetakannya. Berikut merupakan perbandingan antara struktur DNA dan struktur RNA

Gambar 37. Struktur DNA (kiri) dan RNA (kanan) Tabel 5. Perbedaan DNA dan RNA DNA (Deoxyribo Nukleat Acid) RNA (Ribo Nukleat Acid) Dalam inti sel, mitokondria,Dalam inti sel, sitoplasma dan kloroplas, senriol. ribosom. Polinukleotida ganda yang terpilin Polinukleotida tunggal dan panjang pendek Deoxyribosa Ribosa Golongan purin : adenine dan Golongan purin : adenine dan guanineGolongan pirimidin : guanineGolongan pirimidin : cytosine dan timin cytosine dan urasil mengontrol sifat yang sintesis protein menurun sintesis protein sintesis RNA Tidak dipengaruhi sintesis Dipengaruhi sintesis protein.Letak basa nitrogen dari protein.Macam RNA : kedua pita DNA saling berhadapan dengan pasangan yang tetap yaitu RNA duta Adenin selalu berpasangan dengan

Letak Bentuk Gula Basanya

Fungsi

Kadarnya

Timin, Cytosin dengan Guanin. Kedua pita itu diikatkan oleh ikatan RNA transfer hidrogen. RNA ribosom Dna dan fungsinya Hampir setiap orang mengetahui bahwa gen mengawasi hereditas dari orangtua ke anakanak mereka, tetapi sebagian besar orang tidak menyadari bahwa gen yang sama mengawasi reproduksi dan fungsi semua sel sehari-hari. Gen mengawasi fungsi sel dengan menentukan zat (struktur, enzim, dan zat kimia) yang akan disintesis di dalam sel. Gen yang merupakan asam nukleat dinamakan asam deoksiribonukleat (DNA) yang secara otomatis mengawasi pembentukan asam ribonukleat (RNA), yang menyebar ke seluruh sel dan mengawasi pembentukan protein. Sebagian protein berjenis protein struktural, yang berhubungan dengan berbagai lipid (lemak) untuk membentuk struktur berbagai organel, dan protein jenis enzim yang berfungsi sebagai katalisator berbagai reaksi kimia dalam sel, seperti enzim untuk menggiatkan semua reaksi oksidatif yang memberi energi pada sel, sehingga menggiatkan sintesis berbagai zat kimia (lipid, glikogen, ATP, dan sebagainya). DNA mempunyai bentuk dasar yang terdiri dari: 1. Asam fosfat 2. Deoksiribosa (gula) 3. Empat basa nitrogen (Adenin, Guanin, Timin, dan Sitosin) Asam fosfat dan deoksiribosa membentuk dua utas heliks DNA, serta basa nitrogen terletak di antara utas dan menghubungkannya.Sedangkan Nukleotida dibentuk dari penggabungan satu molekul asam fosfat, satu molekul deoksiribosa, dan salah satu dari empat basa nitrogen. Sehingga terbentuk empat nukleotida terpisah, yang masing-masing mengandung salah satu dari empat basa nitrogen. Nukleotida dibagi atas dua pasangan komplementer, yaitu: 1. pasangan yang dibentuk dari asam adenilat dan asam timidiloat 2. pasangan yang dibentuk dari asam guanilat dan asam sitidilat. Basa nitrogen pada tiap-tipa pasangan dapat berikatan secara longgar satu sama lainnya, sehingga memberikan dua utas heliks DNA saling berikatan. Nukleotida tersebut berikatan sedemikian rupa sehingga asam fosfat dan deoksiribosa saling bergantian satu sama lain dalam dua utas yang terpisah, dan utas tersebut diikat yang kekuatannya lemah bersama-sama oleh pasangan basa komplementer masing-masing. Untuk meletakkan DNA diperlukan pengangkatan kedua ujung dan memutarnya menjadi bentuk heliks. Sepuluh pasang nukleotida terdapat pada setiap putaran heliks sempurna dalam molekul DNA. Kepentingan DNA terletak pada kemampuannya untuk mengawasi pembentukan zat-zat

lain dalam sel, yang disebut dengan kode genetik. Bila kedua utas molekul DNA saling berpisahan, rangkaian basa purin dan piramidin yang terpapar ini menonjol ke samping tiap-tiap utas untuk membentuk kode. Kata kode terdiri atas triplet basa (tiga basa yang berurutan). Rangkaian katakata kode mengawasi rangkaian asam amino dalam molekul protein selama sintesis protein dalam sel. Tiap molekul DNA berutas dua membawa kode genetiknya sendiri-sendiri, misalnya utas yang mempunyai kode genetik GGC, AGA, CTT. Kata-kata kode ini bertanggung jawab untuk meletakkan tiga asam amino(prolin, serin, dan asam glutamat) dalam molekul protein. Selanjutnya ketiga asam amino ini akan berbaris dalam molekul protein asam seperti barisan kode genetik dalam utas DNA. Karena hampir semua DNA terletak di dalam inti sel dan sebagian besar fungsi sel dilangsungkan di dalam sitoplasma, harus terdapat beberapa cara pada gen inti untuk mengawasi rekai-reaksi kimia sitoplasma. Untuk itu, pengawasannya dilakukan dengan melalui perantaraan asam ribonukleat (RNA), dimana pembentukan RNA diawasi oleh DNA inti, proses ini disebut transkripsi. RNA kemudian ditranspor ke dalam ruang sitoplasma tempat ia mengawasi sintesis protein. Tiga jenis RNA yang penting pada sintesais protein adalah: 1. Messenger RNA (mRNA), yang berfungsi sebagai pembawa kode genetik 2. Transfer RNA (tRNA), yang berfungsi membawa asam amino aktif ke ribosom 3. Ribosomal RNA (rRNA), yang berfungsi untuk pembentukan ribiosom. Salah satu utas molekul DNA yang mengandung gen, bekerja sebagai template untuk tempat mensintesis molekul RNA. Kata kode dalam DNA menyebabkan pembentukan kata-kata kode komplementer yang dinamakan kodon dalam RNA. Tahapan dalam sintesis RNA sebagai berikut: 1. Bahan dasar pembentuk RNA hampir sama dengan bahan dasar pembentuk DNA, kecuali ada dua keadaan yang berbeda, yaitu: a. Gula deoksiribosa tidak digunakan dalam pembentukan RNA, sebagai gantinya adalah gula yang sedikit berbeda susunannya (ribosa). b. Timin diganti oleh basa lain (urasil). 2. Bahan dasar pembentuk RNA mula-mula membentuk nukleotida persis sama dengan sintesis DNA. Empat jenis nukleotida digunakan dalam pembentukan RNA. Urasil menggantikan timin yang terdapat dalam empat nukleotida yang membentuk DNA. 3. Pengaktifan nukleotida, terjadi dengan menambahkan pada tiap-tiap nukletida dua rantai fosfat (difosfat) untuk membentuk trifospat. Dua fosfat yang terkahir ini bergabung ke nukleotida dengan ikatan fosfat berenergi tinggi yang berasal dari ATP sel. Hasil dari proses pengaktifan ini adalah dibentuknya energi dalam jumlah besar pada tiap nukleotida, dan energi ini digunakan untuk meningkatkan reaksi-reaksi kimia yang mengakhiri pembentukan rantai RNA.

4. Pemisahan kedua utas molekul DNA, salah satu utas digunakan sebagai template tempat dibentuk molekul RNA yang merupakan utas yang mengandung gen, sedangkan utas lainnya secara genetik tetap tidak aktif. Pembentukan molekul RNA dibawah pengaruh enzim RNA polimerase, dimana langkahnya sebagai berikut: a. Pengikatan sementara basa RNA dengan setiap basa DNA b. Pengikatan basa-basa RNA satu sama lain c. Pemecahan utas RNA dari utas DNA. Perlu diingat bahwa terdapat empat jenis basa DNA dan empat jenis basa nukleotida RNA. Basa-basa ini selalu berikatan satu sama lain dengan kombinasi khusus. Oleh karena itu, kode yang terdapat pada utas DNA dipindahkan dalam bentuk komplementer ke molekul RNA. Ribosa basa nukleotida selalu berikatan dengan basa deoksiribosa dengan kombinasi sebagai berikut: Puluhan ribu protein enzim yang dibentuk pada hakekatnya mengawasi semua reaksirekasi kimia lain yang berlangsung dalam sel. Enzim-enzim ini meningkatkan 1. sintesis lipid, 2. glikogen, 3. purin, 4. pirimidin, 5. beratus zat lainnya. Dalam proses pengawasan fungsi genetik dan aktivitas biokomia sel, pada dasarnya terdapat dua cara pengawasan aktivitas biokimia sel yang berbeda, yaitu : 1. Pengaturan genertik, tempat aktivitas gen itu sendiri diawasi 2. Pengaturan enzimatik, tempat kecepatan aktivitas enzim dalam sel diawasi. Pertumbuhan dan pembiakan sel biasanya terjadi secara bersama-sama, dimana pertumbuhan dalam keadaan normal mengakibatkan replikasi DNA inti, beberapa jam kemudian diikuti oleh mitosis (pembelahan sel). Pada tubuh manusia normal, pengaturan pertumbuhan dan pembiakan sel sebagai suatu peristiwa ajaib. Sel-sel tertentu tumbuh dan berbiak terus-menerus, seperti pada sel-sel yang membentuk darah pada sumsum tulang, lapisan germinativum kulit, dan epitel usus. Bila terdapat ketidakcukupan pada beberapa jenis sel dalam tubuh, sel-sel ini akan tumbuh dan berkembang biak dengan amat cepat sampai jumlah semula/asal. Misalnya 7/8 bagian organ hati dibuang sehingga tersisa 1/8 bagian saja, sel yang tersisa akan tumbuh dan berkembang biak sampai bentuk hati kembali seperti semula. Peristiwa ini terjadi di hampir semua sel (kelenjar, sumsum tulang, jaringan Guanin Sitosin subkutis, epitel usus).

Mekanisme yang mempertahankan jumlah yang tetap berbagai jenis sel dalam tubuh disebabkan oleh adanya zatzat pengawas perkembang-biakan yang disebut chalone yang disekresi oleh berbagai sel yang menyebabkan efek umpan balik untuk menghentikan atau memperlambat pertumbuhan dan mitosis sel. Adapun penyakit kanker yang sering terjadi pada saat ini adalah penyakit yang menyerang proses dasar kehidupan sel, yang hampir semuanya mengubah genom sel (komplemen genetik total sel) serta mengakibatkan pertumbuhan liar dan penyebaran sel kanker. Penyebab perubahan genom ini adalah: 1. Mutasi (perubahan) salah satu gen atau lebih 2. Mutasi sebagian besar segmen utas DNA yang mengandung banyak gen, 3. Pada beberapa keadaan, penambahan atau pengurangan sebagian besar segmen kromosom. Dalam tubuh manusia terjadi pembentukan bermilyaran sel baru yang dibentuk pada setiap tahun. Pembentukan sel tidak terjadi bila utas kromosom DNA mengadakan replikasi dengan tepat sebelum berlangsung mitosis, dan walaupun sudah terbentuk utas baru, ketelitian proses replikasi dikoreksi beberapa kali. Bila ada suatu kesalahan, utas yang baru dipotong dan diperbaiki sebelum proses mitosis berlangsung. Walaupun terdapat semua pencegahan seperti ini, mungkin salah satu dari ratusan ribu sampai jutaan sel yang baru dibentuk tetap mempunyai sifat mutan. Setiap gen pada manusia mempunyai kemungkinan 1 dalam 100.000 merupakan suatu mutan bila dibandingkan dengan gen orangtuanya. Sehingga hanya dibutuhkan kesempatan saja agar mutasi dapat berlangsung. Akan tetapi, faktor-faktor lain yang menambah kemungkinan mutasi adalah (1) Radiasi ionisasi, (2) Zat kimia tertentu (karsinogen), (3) Beberapa virus, (4) Iritasi fisik, (5) Prediposisi herediter. Dua perbedaan utama antara sel kanker dan sel normal adalah: 1. Sel kanker tidak mematuhi batas-batas pertumbuhan sel yang umum, karena ia tidak mensekresi cholone yang sesuai. 2. Sel kanker jauh kurang adhesif satu sama lain dibandingkan sel normal, mempunyai kecenderungan mengembara melalui jaringan, memasuki aliran darah, dan ditranspor keseluruh tubuh tempat mereka membentuk banyak nodus untuk pertumbuhan kanker baru. Karena jaringan kanker bersaing dengan jaringan normal dalam memperoleh makanan, dan sel kanker terus menerus melakukan proliferasi sehingga jumlahnya makin lama semakin banyak. Hal ini berkibat jaringan normal kekurangan nutrisi sehinga mengalami

kematian bagi sel, dan selanjutnya Kematian bagi organ, dan akhirnya kematian bagi tubuh manusia. RNA dibedakan menjadi dua kelompok utama yaitu RNA genetik dan RNA non-genetik. RNA genetik RNA genetik memiliki fungsi yang sama dengan DNA, yaitu sebagai pembawa keterangan genetik. RNA genetik hanya ditemukan pada makhluk hidup tertentu yang tidak memiliki DNA, misalnya virus. Ketika virus ini menyerang sel hidup, RNA yang dibawanya masuk ke sitoplasma sel korban, yang kemudian ditranslasi oleh sel inang untuk menghasilkan virus-virus baru. Dalam hal ini fungsi RNA menjadi sama dengan DNA, baik sebagai materi genetik maupun dalam mengatur aktivitas sel. RNA non-genetik RNA non-genetik tidak berperan sebagai pembawa keterangan genetik sehingga RNA jenis ini hanya dimiliki oleh makhluk hidup yang juga memiliki DNA. Berdasarkan letak dan fungsinya, RNA non-genetik dibedakan menjadi mRNA, tRNA, dan rRNA. 1) mRNA (messenger RNA) atau RNAd (RNA duta) RNAd merupakan RNA yang urutan basanya komplementer (berpasangan) dengan salah satu urutan basa rantai DNA. RNA jenis ini merupakan polinukleotida berbentuk pita tunggal linier dan disintesis di dalam nukleus. Panjang pendeknya RNAd berhubungan dengan panjang pendeknya rantai polipeptida yang akan disusun. Urutan asam amino yang menyusun rantai polipeptida itu sesuai dengan urutan kodon yang terdapat di dalam molekul RNAd yang bersangkutan. RNAd bertindak sebagai pola cetakan pembentuk polipeptida. RNAd membawa kode-kode genetik komplemen dari DNA di inti sel menuju ke ribosom di sitoplasma. RNAd ini dibentuk bila diperlukan dan jika tugasnya selesai, maka akan dihancurkan dalam plasma.

Gambar 38. Struktur RNAd 2) tRNA (transfer RNA) atau RNAt (RNA transfer) RNA jenis ini dibentuk di dalam nukleus, tetapi menempatkan diri di dalam sitoplasma. RNAt merupakan RNA terpendek dan bertindak sebagai penerjemah kodon pada RNAd. Fungsi lain RNAt adalah mengikat asam-asam amino di dalam sitoplasma yang akan disusun menjadi protein dan mengangkutnya ke ribosom. Bagian RNAt yang berhubungan dengan kodon RNAd dinamakan antikodon.

Gambar 39. Struktur RNAt 3) rRNA (ribosomal RNA) atau RNAr (RNa ribosomal) RNA ini disebut ribosomal RNA karena terdapat di ribosom meskipun dibuat di dalam nukleus. RNAr bersama protein membentuk ribosom, ialah benda-benda berbentuk butirbutir halus di dalam sitoplasma. Lebih dari 80% RNA merupakan RNAr. Ribosom bertindak sebagai mesin perakit dalam sintesis protein yang bergerak ke satu arah sepanjang RNAd. Di dalam ribosom, molekul RNAr ini mencapai 30-46%.

Namun demikian, peran penting RNA terletak pada fungsinya sebagai perantara antara DNA dan protein dalam proses ekspresi genetik karena ini berlaku untuk semua organisme hidup. Ekspresi genetik merupakan proses penerjemahan informasi genetik (dalam bentuk urutan basa) menjadi protein, dan lebih jauh lagi: karakter. Informasi yang dibawa bahan genetik tidak bermakna apa pun apabila tidak diekspresikan menjadi fenotipe. Dalam peran ini, RNA diproduksi sebagai salinan kode urutan basa nitrogen DNA dalam proses transkripsi. Kode urutan basa ini tersusun dalam bentuk triplet, tiga urutan basa N, yang dikenal dengan nama kodon. Setiap kodon berelasi dengan satu asam amino (atau kode untuk berhenti), monomer yang menyusun protein.

Gambar 41. Hubungan tiga macam RNA sebagai perantara antara DNA dan protein dalam proses ekspresi genetik

Apa itu transkripsi?

Transkripsi merupakan pembentukan/sintesis mRNA dari fragmen salah satu rantai DNA, sehingga terjadi proses pemindahan informasi genetik dari DNA ke mRNA. Transkripsi adalah bagian dari rangkaian ekspresi genetik (proses penerjemahan informasi genetik dalam bentuk urutan basa menjadi protein). Pengertian asli transkripsi adalah alih aksara atau penyalinan. Di sini, yang dimaksud adalah mengubah teks DNA menjadi RNA. Sebenarnya, yang berubah hanyalah basa nitrogen timin di DNA yang pada RNA digantikan oleh urasil.

Mengapa DNA melakukan transkripsi?

DNA berperan sebagai materi genetik; artinya DNA menyimpan cetak biru bagi segala aktivitas sel. Ini berlaku umum bagi setiap organisme. DNA melakukan transkripsi agar gen asli tetap terlindung di dalam inti sel, sementara hasil kopinya ditugaskan untuk melaksanakan pesan-pesan yang dikandungnya dalam proses sintesis protein. Jika RNA rusak, maka akan segera diganti dengan hasil kopian yang baru.

Di mana terjadinya transkripsi?

Proses transkripsi ini terjadi di dalam inti sel (nukleus). DNA tetap berada di dalam nukleus, sedangkan hasil transkripsinya dikeluarkan dari nukleus menuju sitoplasma dan melekat pada ribosom. Namun pada sel tumbuhan, transkripsi terjadi di dalam matriks pada mitokondria dan plastida.

Bagaimana proses terjadinya transkripsi?

Pada proses transkripsi, rantai DNA digunakan untuk mencetak rantai tunggal mRNA dengan bantuan enzim RNA polimerase. Enzim tersebut menempel pada bagian yang disebut promoter, yang terletak sebelum gen. Pertama-tama, ikatan hidrogen di bagian DNA yang akan disalin terbuka. Akibatnya, dua rantai DNA berpisah. Salah satu DNA berfungsi sebagai pencetak atau sense, yang lain sebagai antisense. Misalnya pencetak memiliki urutan basa G-A-G-A-C-T, dan pasangan komplemen memiliki urutan C-T-CT-G-A. Karena pencetaknya G-A-G-A-C-T, maka mRNA hasil cetakannya C-U-C-U-GA. Jadi, mRNA C-U-C-U-G-A merupakan hasil kopian dari DNA C-T-C-T-G-A, dan merupakan komplemen dari pencetak. 1. Inisiasi (permulaan) Daerah DNA di mana RNA polimerase melekat dan mengawali transkripsi disebut sebagai promoter. Suatu promoter menentukan di mana transkripsi dimulai, juga menentukan yang mana dari kedua rantai heliks DNA yang digunakan sebagai cetakan. 2. Elongasi (pemanjangan) Saat RNA bergerak di sepanjang DNA, RNA membuka rantai heliks ganda DNA dengan bantuan enzim polimerase, sehingga terbentuklah molekul RNA yang akan lepas dari cetakan DNA-nya. 3. Terminasi (pengakhiran) Transkripsi berlangsung sampai RNA polimerase mentranskripsi urutan DNA yang disebut terminator. Terminator yang ditranskripsi merupakan suatu urutan RNA yang berfungsi sebagai kodon terminasi (kode stop) yang sesungguhnya. Pada sel prokariotik, transkripsi biasanya berhenti tepat pada akhir kodon terminasi, yaitu ketika polimerase mencapai titik terminasi sambil melepas RNA dan DNA. Sebaliknya, pada sel eukariotik polimerase terus melewati sinyal terminasi, suatu urutan AAUAAA di dalam mRNA.

Pada titik yang jauh kira-kira 10 hingga 35 nukleotida, mRNA ini dipotong hingga terlepas dari enzim tersebut. Sejumlah ATP diperlukan untuk membuat RNA polimerase mulai bergerak dari ujung 3 (ujung karboksil) berkas templat ke arah ujung 5 (ujung amino). RNA yang terbentuk dengan demikian berarah 5 3. Pergerakan RNA polimerase akan berhenti apabila ia menemui urutan basa yang sesuai dengan kodon berhenti. Setelah proses selesai, RNA polimerase akan lepas dari DNA. Berikut merupakan ilustrasi terjadinya transkripsi :

Gambar 44. Transkripsi (Sumber : www.bio.miami.edu) Beginilah proses transkripsi yang terlihat dengan menggunakan mikroskop :

Gambar 45. Proses transkripsi yang dilihat dengan menggunakan mikroskop. (Sumber : www.utexas.edu) Berikut merupakan animasi terjadinya proses transkripsi KLIK DI SINI UNTUK MELIHAT ANIMASI FLASH PROSES TRANSKRIPSI Atau lihatlah video terjadinya transkripsi berikut :

Apa hasil dari proses transkripsi?

Hasil transkripsi adalah segmen mRNA yang masih mentah. Di dalamnya terdapat segmen yang membawa informasi genetik yang nantinya akan mengatur dan membantu sintesis protein (translasi) yang disebut sebagai ekson. Selain itu ada pula segmen yang tidak mengandung informasi genetik yang nantinya akan dipotong yang disebut sebagai intron. Berkas RNA ini selanjutnya akan mengalami proses yang disebut sebagai proses pascatranskripsi (post-transcriptional process). Proses ini terjadi di dalam nukleus dengan jalan melepaskan segmen-segmen intron dan merangkaikan segmen-segmen ekson. Gabungan segmen-segmen ekson membentuk satu rantai/utas mRNA yang mengandung sejumlah kodon untuk penyusunan polipeptida. Rantai mRNA ini dikenal sebagai sistron.

Gambar 46. Proses pematangan mRNA dengan membuang bagian intron Replikasi merupakan peristiwa sintesis DNA. Pada setiap sel, kecuali sel gamet, pembelahan diri harus disertai dengan replikasi DNA supaya semua sel turunan memiliki informasi genetik yang sama. Pada dasarnya, proses replikasi memanfaatkan fakta bahwa DNA terdiri dari dua rantai dan rantai yang satu merupakan komplemen dari rantai pasangannya. Dengan kata lain, dengan mengetahui susunan satu rantai, maka susunan rantai pasangan dapat dengan mudah dibentuk. Prinsip dari replikasi itu sendiri adalah memasangkan nukleotida triposphat baru pada rantai tunggal/single strand DNA. Replikasi DNA sangat penting agar DNA kita tidak termutasi, dimana DNA menyimpan cetak biru bagi segala aktivitas sel. Pada proses replikasi terdapat pos-pos pengecekan, sehingga jika ada kode yang salah tercetak, dapat langsung dikenali dan langsung diperbaiki. Ada beberapa teori yang mencoba menjelaskan bagaimana proses replikasi DNA ini terjadi, yaitu konservatif, semikonservatif, dan dispersif.

Gambar 32. Tiga kemungkinan terjadinya replikasi DNA

1. Model konservatif, yaitu dua rantai DNA lama tetap tidak berubah, berfungsi sebagai cetakan untuk dua rantai DNA baru. Replikasi ini mempertahankan molekul dari DNA lama dan membuat molekul DNA baru. 2. Model semikonservatif, yaitu dua rantai DNA lama terpisah dan rantai baru disintesis dengan prinsip komplementasi pada masing-masing rantai DNA lama. Akhirnya dihasilkan dua rantai DNA baru yang masing-masing mengandung satu rantai cetakan molekul DNA lama dan satu rantai baru hasil sintesis. 3. Model dispersif, yaitu beberapa bagian dari kedua rantai DNA lama digunakan sebagai cetakan untuk sintesis rantai DNA baru. Oleh karena itu, hasil akhirnya diperoleh rantai DNA lama dan baru yang tersebar pada rantai DNA lama dan baru. Replikasi ini menghasilkan dua molekul DNA lama dan DNA baru yang saling berselang-seling pada setiap untai. Setelah berhasil membuat model struktur DNA, Watson dan Crick memprediksi bahwa DNA bereplikasi dengan cara semikonservatif. Kemudian pada tahun 1958, Matthew Meselson dan Franklin Stahl melakukan percobaan untuk menguji ketiga alternatif hipotesis replikasi DNA tersebut dengan menggunakan DNA bakteri Eschericia coli. Hasilnya ternyata mendukung model replikasi semikonservatif yang telah diprediksi oleh Watson dan Crick. Berikut ini merupakan animasi proses replikasi DNA :

Gambar 33. Animasi replikasi DNA (Sumber : http://ancala.hostjournalbook.eu)

Siapakah yang berperan dalam proses replikasi DNA? Bagaimanakah prosesnya?

Proses replikasi memerlukan protein atau enzim pembantu; salah satu yang terpenting dikenal dengan nama DNA polimerase, yang merupakan enzim pembantu pembentukan rantai DNA baru yang merupakan suatu polimer. Proses replikasi diawali dengan pembukaan untaian ganda DNA pada titik-titik tertentu di sepanjang rantai DNA. Proses pembukaan rantai DNA ini dibantu oleh enzim helikase yang dapat mengenali titik-titik tersebut, dan enzim girase yang mampu membuka pilinan rantai DNA. Jika dianalogikan, dua rantai DNA heliks ganda yang terpisah berbentuk seperti ritsleting terbuka. Setelah cukup ruang terbentuk akibat pembukaan untaian ganda ini, DNA polimerase masuk dan mengikat diri pada kedua rantai DNA yang sudah terbuka secara lokal tersebut. Proses pembukaan rantai ganda tersebut berlangsung disertai dengan pergeseran DNA polimerase mengikuti arah membukanya rantai ganda. Setiap rantai DNA yang lama akan berfungsi sebagai cetakan yang menentukan urutan nukleotida di sepanjang rantai DNA komplementer baru yang bersesuaian dengan cara mendeteksi basa komplemennya. Monomer DNA yang berupa nukleotida ditambahkan di kedua sisi rantai yang membuka setiap kali DNA polimerase bergeser. Setelah mendapatkan pasangan yang sesuai, nukleotida yang baru tersebut disambung satu sama lain untuk membentuk tulang punggung gula-fosfat rantai DNA yang baru. Jadi, setiap molekul DNA terdiri atas satu rantai DNA lama dan satu rantai DNA baru. Setelah seluruh rantai benar-benar terpisah, maka,terdapat dua molekul DNA yang sama persis dengan satu molekul DNA induk. Enzim DNA polimerase memiliki fungsi lain, yaitu mengoreksi DNA yang baru terbentuk, membetulkan setiap kesalahan replikasi, dan memperbaiki DNA yang rusak. Adanya fungsi tersebut menjadikan rangkaian nukleotida DNA sangat stabil dan mutasi jarang terjadi.

Gambar 34. Replikasi Semikonservatif (Sumber : http://kentsimmons.uwinnipeg.ca) Yang berikut ini merupakan awal dari proses replikasi DNA yang diambil dengan menggunakan mikroskop. Enzim DNA polimerase memisahkan dua rantau DNA heliks ganda :

Gambar 35. Penampakan peristiwa membelahnya dua rantai DNA heliks ganda akibat aktivitas enzim DNA polimerse. (Sumber : www.gmicheli.it)

Apa itu translasi?

Translasi adalah proses penerjemahan urutan nukleotida atau kodon yang ada pada molekul mRNA menjadi rangkaian asam-asam amino yang menyusun suatu polipeptida atau protein. Transkripsi dan translasi merupakan dua proses utama yang menghubungkan gen ke protein. Translasi hanya terjadi pada molekul mRNA, sedangkan rRNA dan tRNA tidak ditranslasi. Molekul mRNA yang merupakan salinan urutan DNA menyusun suatu gen dalam bentuk kerangka baca terbuka. mRNA membawa informasi urutan asam amino.

Di mana terjadinya translasi?

Tempat translasi ini ialah ribosom, partikel kompleks yang memfasilitasi perangkaian secara teratur asam amino menjadi rantai polipeptida. Asam amino yang akan dirangkaikan dengan asam amino lainnya dibawa oleh tRNA. Setiap asam amino akan dibawa oleh tRNA yang spesifik ke dalam kompleks mRNA-ribosom

Bagaimana proses terjadinya translasi?

Proses translasi berupa penerjemahan kodon atau urutan nukleotida yang terdiri atas tiga nukleotida berurutan yang menyandi suatu asam amino tertentu. Kodon pada mRNA akan berpasangan dengan antikodon yang ada pada tRNA. Setiap tRNA mempunyai antikodon yang spesifik. Tiga nukleotida di anti kodon tRNA saling berpasangan dengan tiga nukleotida dalam kodon mRNA menyandi asam amino tertentu. Translasi menjadi tiga tahap (sama seperti pada transkripsi) yaitu inisiasi, elongasi, dan terminasi. Semua tahapan ini memerlukan faktor-faktor protein yang membantu mRNA, tRNA, dan ribosom selama proses translasi. Inisiasi dan elongasi rantai polipeptida juga membutuhkan sejumlah energi. Energi ini disediakan oleh GTP (guanosin triphosphat), suatu molekul yang mirip dengan ATP. 1. Inisiasi

Tahap inisiasi terjadi karena adanya tiga komponen yaitu mRNA, sebuah tRNA yang memuat asam amino pertama dari polipeptida, dan dua sub unit ribosom. Tahap inisiasi dari translasi terjadi dengan adanya mRNA, sebuah tRNA yang memuat asam amino pertama dari polipeptida, dan dua sub unit ribosom. Dalam kompleks inisisasi, ribosom membaca kodon pada mRNA. Pembacaan dilakukan untuk setiap 3 urutan basa hingga selesai seluruhnya. Sebagai catatan ribosom yang datang untuk membaca kodon biasanya tidak hanya satu, melainkan beberapa ribosom yang dikenal sebagai polisom membentuk rangkaian mirip tusuk sate, di mana tusuknya adalah mRNA dan daging adalah ribosomnya. Dengan demikian, proses pembacaan kodon dapat berlangsung secara berurutan. Ketika kodon I terbaca ribosom (misal kodonnya AUG), tRNA yang membawa antikodon UAC dan asam amino metionin datang. tRNA masuk ke celah ribosom. Berikut merupakan animasi terjadinya proses inisiasi :

Ribosom di sini berfungsi untuk memudahkan perlekatan yang spesifik antara antikodon tRNA dengan kodon mRNA selama sintesis protein. Sub unit ribosom dibangun oleh protein-protein dan molekul-molekul RNA ribosomal. 2. Elongasi Pada tahap elongasi dari translasi, asam amino-asam amino ditambahkan satu per satu diawali dari asam amino pertama (metionin). Ribosom akan terus bergerak dan membaca kodon-kodon di sepanjang mRNA. Masing-masing kodon akan diterjemahkan oleh tRNA yang membawa asam amino yang dikode oleh pasangan komplemen antikodon tRNA tersebut. Di dalam ribosom, metionin yang pertama kali masuk dirangkaikan dengan asam amino yang di sampingnya membentuk dipeptida. Ribosom terus bergeser, membaca kodon berikutnya. Asam amino berikutnya dirangkaikan dengan dipeptida yang telah terbentuk sehingga membentuk tripeptida. Demikian seterusnya proses pembacaan kode genetika itu berlangsung di dalam ribobom, yang diterjemahkan ke dalam bentuk asam amino guna dirangkai menjadi polipeptida.

Kodon mRNA pada ribosom membentuk ikatan hidrogen dengan antikodon molekul tRNA yang baru masuk yang membawa asam amino yang tepat. Molekul mRNA yang telah melepaskan asam amino akan kembali ke sitoplasma untuk mengulangi kembali pengangkutan asam amino. Molekul rRNA dari sub unit ribosom besar berfungsi sebagai enzim, yaitu mengkatalisis pembentukan ikatan peptida yang menggabungkan polipeptida yang memanjang ke asam amino yang baru tiba. 3. Terminasi Tahap akhir translasi adalah terminasi. Elongasi berlanjut hingga ribosom mencapai kodon stop. Triplet basa kodon stop adalah UAA, UAG, dan UGA. Kodon stop tidak mengkode suatu asam amino melainkan bertindak sebagai sinyal untuk menghentikan translasi. Polipeptida yang dibentuk kemudian diproses menjadi protein.

Berikut merupakan ilustrasi secara umum terjadinya sintesis protein (transkripsi dan translasi):

Gambar 47. Sintesis Protein (Sumber : http://stemcells.nih.gov) Pengertian Teknologi DNA Rekombinan Secara klasik analisis molekuler protein dan materi lainnya dari kebanyakan organisme ternyata sangat tidak mudah untuk dilakukan karena adanya kesulitan untuk memurnikannya dalam jumlah besar. Namun, sejak tahun 1970-an berkembang suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah tersebut melalui isolasi dan manipulasi terhadap gen yang bertanggung jawab atas ekspresi protein tertentu atau pembentukan suatu produk. Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah yang lebih populer rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel alaminya sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning gen. Banyak definisi telah diberikan untuk mendeskripsikan pengertian teknologi DNA rekombinan. Salah satu di antaranya, yang mungkin paling representatif, menyebutkan bahwa teknologi DNA rekombinan adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang. Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat. Pertama, dengan mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional. Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu (Gambar 9.1). Tahapan-tahapan

tersebut adalah isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon, pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran, isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan. Isolasi DNA Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl (lihat Bab II). Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom. Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian, perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan. Enzim Restriksi Tahap kedua dalam kloning gen adalah pemotongan molekul DNA, baik genomik maupun plasmid. Perkembangan teknik pemotongan DNA berawal dari saat ditemukannya sistem restriksi dan modifikasi DNA pada bakteri E. coli, yang berkaitan dengan infeksi virus atau bakteriofag lambda (l). Virus l digunakan untuk menginfeksi dua strain E. coli, yakni strain K dan C. Jika l yang telah menginfeksi strain C diisolasi dari strain tersebut dan kemudian digunakan untuk mereinfeksi strain C, maka akan

diperoleh l progeni (keturunan) yang lebih kurang sama banyaknya dengan jumlah yang diperoleh dari infeksi pertama. Dalam hal ini, dikatakan bahwa efficiency of plating (EOP) dari strain C ke strain C adalah 1. Namun, jika l yang diisolasi dari strain C digunakan untuk menginfeksi strain K, maka nilai EOP-nya hanya 10-4. Artinya, hanya ditemukan l progeni sebanyak 1/10.000 kali jumlah yang diinfeksikan. Sementara itu, l yang diisolasi dari strain K mempunyai nilai EOP sebesar 1, baik ketika direinfeksikan pada strain K maupun pada strain C. Hal ini terjadi karena adanya sistem restriksi/modifikasi (r/m) pada strain K. Pada waktu bakteriofag l yang diisolasi dari strain C diinfeksikan ke strain K, molekul DNAnya dirusak oleh enzim endonuklease restriksi yang terdapat di dalam strain K. Di sisi lain, untuk mencegah agar enzim ini tidak merusak DNAnya sendiri, strain K juga mempunyai sistem modifikasi yang akan menyebabkan metilasi beberapa basa pada sejumlah urutan tertentu yang merupakan tempat-tempat pengenalan (recognition sites) bagi enzim restriksi tersebut. DNA bakteriofag l yang mampu bertahan dari perusakan oleh enzim restriksi pada siklus infeksi pertama akan mengalami modifikasi dan memperoleh kekebalan terhadap enzim restrisksi tersebut. Namun, kekebalan ini tidak diwariskan dan harus dibuat pada setiap akhir putaran replikasi DNA. Dengan demikian, bakteriofag l yang diinfeksikan dari strain K ke strain C dan dikembalikan lagi ke strain K akan menjadi rentan terhadap enzim restriksi. Metilasi hanya terjadi pada salah satu di antara kedua untai molekul DNA. Berlangsungnya metilasi ini demikian cepatnya pada tiap akhir replikasi hingga molekul DNA baru hasil replikasi tidak akan sempat terpotong oleh enzim restriksi. Enzim restriksi dari strain K telah diisolasi dan banyak dipelajari. Selanjutnya, enzim ini dimasukkan ke dalam suatu kelompok enzim yang dinamakan enzim restriksi tipe I. Banyak enzim serupa yang ditemukan kemudian pada berbagai spesies bakteri lainnya. Pada tahun 1970 T.J. Kelly menemukan enzim pertama yang kemudian dimasukkan ke dalam kelompok enzim restriksi lainnya, yaitu enzim restriksi tipe II. Ia mengisolasi enzim tersebut dari bakteri Haemophilus influenzae strain Rd, dan sejak saat itu ditemukan lebih dari 475 enzim restriksi tipe II dari berbagai spesies dan strain bakteri. Semuanya sekarang telah menjadi salah satu komponen utama dalam tata kerja rekayasa genetika. Enzim restriksi tipe II antara lain mempunyai sifat-sifat umum yang penting sebagai berikut: 1. mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di dalam molekul DNA 2. memotong kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di dekat tempat pengenalannya 3. menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan urutan basa. Sebagian besar enzim restriksi tipe II akan mengenali dan memotong urutan pengenal yang mempunyai sumbu simetri rotasi. Gambar 11.3 memperlihatkan beberapa enzim restriksi beserta tempat pengenalannya. Pemberian nama kepada enzim restriksi mengikuti aturan sebagai berikut. Huruf pertama adalah huruf pertama nama genus bakteri sumber isolasi enzim, sedangkan huruf kedua dan ketiga masing-masing adalah huruf pertama dan kedua nama petunjuk spesies bakteri sumber tersebut. Huruf-huruf tambahan, jika ada, berasal dari nama strain bakteri, dan

angka romawi digunakan untuk membedakan enzim yang berbeda tetapi diisolasi dari spesies yang sama. Tempat pemotongan pada kedua untai DNA sering kali terpisah sejauh beberapa pasang basa. Pemotongan DNA dengan tempat pemotongan semacam ini akan menghasilkan fragmen-fragmen dengan ujung 5 yang runcing karena masing-masing untai tunggalnya menjadi tidak sama panjang. Dua fragmen DNA dengan ujung yang runcing akan mudah disambungkan satu sama lain sehingga ujung runcing sering pula disebut sebagai ujung lengket (sticky end) atau ujung kohesif. Hal itu berbeda dengan enzim restriksi seperti Hae III, yang mempunyai tempat pemotongan DNA pada posisi yang sama. Kedua fragmen hasil pemotongannya akan mempunyai ujung 5 yang tumpul karena masing-masing untai tunggalnya sama panjangnya. Fragmen-fragmen DNA dengan ujung tumpul (blunt end) akan sulit untuk disambungkan. Biasanya diperlukan perlakuan tambahan untuk menyatukan dua fragmen DNA dengan ujung tumpul, misalnya pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3. Ligasi Molekul molekul DNA Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor menggunakan enzim restriksi harus menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel. Artinya, fragmen-fragmen DNA genomik nantinya harus dapat disambungkan (diligasi) dengan DNA vektor yang sudah berbentuk linier. Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in vitro. Pertama, ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri. Kedua, ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau lazim disebut sebagai enzim T4 ligase. Jika cara yang pertama hanya dapat digunakan untuk meligasi ujung-ujung lengket, cara yang kedua dapat digunakan baik pada ujung lengket maupun pada ujung tumpul. Sementara itu, cara yang ketiga telah disinggung di atas, yaitu pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3. Dengan untai tunggal semacam ini akan diperoleh ujung lengket buatan, yang selanjutnya dapat diligasi menggunakan DNA ligase. Suhu optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya 37C. Akan tetapi, pada suhu ini ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket akan menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut. Oleh karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara 4 dan 15C dengan waktu inkubasi (reaksi) yang diperpanjang (sering kali hingga semalam). Pada reaksi ligasi antara fragmen-fragmen DNA genomik dan DNA vektor, khususnya plasmid, dapat terjadi peristiwa religasi atau ligasi sendiri sehingga plasmid yang telah dilinierkan dengan enzim restriksi akan menjadi plasmid sirkuler kembali. Hal ini jelas akan menurunkan efisiensi ligasi. Untuk meningkatkan efisiensi ligasi dapat dilakukan beberapa cara, antara lain penggunaan DNA dengan konsentrasi tinggi (lebih dari 100g/ml), perlakuan dengan enzim alkalin fosfatase untuk menghilangkan gugus fosfat dari ujung 5 pada molekul DNA yang telah terpotong, serta pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3 seperti telah disebutkan di atas.

Transformasi Sel Inang Tahap berikutnya setelah ligasi adalah analisis terhadap hasil pemotongan DNA genomik dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut. menggunakan teknik elektroforesis (lihat Bab X). Jika hasil elektroforesis menunjukkan bahwa fragmen-fragmen DNA genomik telah terligasi dengan baik pada DNA vektor sehingga terbentuk molekul DNA rekombinan, campuran reaksi ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat. Dengan sendirinya, di dalam campuran reaksi tersebut selain terdapat molekul DNA rekombinan, juga ada sejumlah fragmen DNA genomik dan DNA plasmid yang tidak terligasi satu sama lain. Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang ini dinamakan transformasi karena sel inang diharapkan akan mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan. Teknik transformasi pertama kali dikembangkan pada tahun 1970 oleh M. Mandel dan A. Higa, yang melakukan transformasi bakteri E. coli. Sebelumnya, transformasi pada beberapa spesies bakteri lainnya yang mempunyai sistem transformasi alami seperti Bacillus subtilis telah dapat dilakukan. Kemampuan transformasi B. subtilis pada waktu itu telah dimanfaatkan untuk mengubah strain-strain auksotrof (tidak dapat tumbuh pada medium minimal) menjadi prototrof (dapat tumbuh pada medium minimal) dengan menggunakan preparasi DNA genomik utuh. Baru beberapa waktu kemudian transformasi dilakukan menggunakan perantara vektor, yang selanjutnya juga dikembangkan pada transformasi E.coli. Hal terpenting yang ditemukan oleh Mandel dan Higa adalah perlakuan kalsium klorid (CaCl2) yang memungkinkan sel-sel E. coli untuk mengambil DNA dari bakteriofag l. Pada tahun 1972 S.N. Cohen dan kawan-kawannya menemukan bahwa sel-sel yang diperlakukan dengan CaCl2 dapat juga mengambil DNA plasmid. Frekuensi transformasi tertinggi akan diperoleh jika sel bakteri dan DNA dicampur di dalam larutan CaCl2 pada suhu 0 hingga 5C. Perlakuan kejut panas antara 37 dan 45C selama lebih kurang satu menit yang diberikan setelah pencampuran DNA dengan larutan CaCl2 tersebut dapat meningkatkan frekuensi transformasi tetapi tidak terlalu esensial. Molekul DNA berukuran besar lebih rendah efisiensi transformasinya daripada molekul DNA kecil. Mekanisme transformasi belum sepenuhnya dapat dijelaskan. Namun, setidak-tidaknya transformasi melibatkan tahap-tahap berikut ini. Molekul CaCl2 akan menyebabkan selsel bakteri membengkak dan membentuk sferoplas yang kehilangan protein periplasmiknya sehingga dinding sel menjadi bocor. DNA yang ditambahkan ke dalam campuran ini akan membentuk kompleks resisten DNase dengan ion-ion Ca2+ yang terikat pada permukaan sel. Kompleks ini kemudian diambil oleh sel selama perlakuan kejut panas diberikan. Seleksi Transforman dan Seleksi Rekombinan Oleh karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan, maka kita harus melakukan seleksi untuk memilih sel inang transforman yang membawa DNA rekombinan. Selanjutnya, di antara sel-sel transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Cara seleksi sel transforman akan diuraikan lebih rinci pada penjelasan tentang plasmid (lihat Bab XI). Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan, yaitu (1) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti

transformasi gagal, (2) sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan (3) sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Untuk membedakan antara kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang memperlihatkan dua sifat marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan kedualah yang terjadi. Selanjutnya, untuk membedakan antara kemungkinan kedua dan ketiga dilihat pula perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang hanya memperlihatkan salah satu sifat di antara kedua marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan ketigalah yang terjadi. Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction (PCR). Penjelasan lebih rinci tentang teknik PCR dapat dilihat pada Bab XII. Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui cara yang dinamakan hibridisasi koloni (lihat Bab X). Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membran nilon, dilisis agar isi selnya keluar, dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga tinggal tersisa DNAnya saja. Selanjutnya, dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di dalam larutan pelacak. Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak dicocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate). Dengan demikian, kita bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan. Apa Itu Kloning? Kata clone berasal dari bahasa Yunani twig yang memiliki arti grup yang memiliki kesamaan secara identik. Kloning sendiri memiliki definisi penggunaan teknologi untuk membuat kopi genetik yang persis sama seperti induknya pada organisme hidup. Kloning manusia adalah penciptaan secara genetik kopi identik dari manusia, sel manusia, atau jaringan pada manusia. Kloning manusia terdiri atas kloning terapeutik (penyembuhan) dan kloning reproduksi. Kloning terapeutik melibatkan kloning sel dari manusia dewasa untuk tujuan pengobatan dan saat ini merupakan salah satu penelitian yang sedang sangat berkembang. Sedangkan kloning reproduksi adalah suatu metode membuat klon manusia ataupun klon hewan (organisme hidup). Kloning reproduksi manusia saat ini masih ilegal dan dianggap melanggar etik bagi sebagian besar negara. Metode Kloning Kloning Reproduksi adalah teknologi untuk menciptakan individu (hewan, manusia) yang memiliki nukleus DNA (inti sel) sama seperti induknya. Dolly, domba kloning tersebut diciptakan melalui teknologi kloning dalam proses yang disebut dengan Somatic Cell Nuclear Transfer, (SCNT). SCNT merupakan metode dimana para peneliti mentransfer materi genetik dari nukleus (inti sel) donor sel dewasa ke dalam telur yang sudah diambil baik nukleus maupun materi genetiknya. Telur hasil rekonstruksi yang mengandung DNA dari sel donor tersebut, harus dirangsang dengan zat kimia atau aliran listrik untuk merangsang terjadinya pembelahan sel.

Ketika embrio klon tersebut mencapai tahapan yang lebih stabil, embrio dimasukkan ke rahim host (induk) wanita dimana embrio tersebut dapat tumbuh dan berkembang sampai lahir nanti. Kesuksesan dolly sangatlah mengagumkan karena hal tersebut membuktikan bahwa materi genetik dari sel dewasa yang spesifik, dapat diprogram ulang untuk menciptakan organisme yang baru. Penelitian yang dilakukan dengan hewan mamalia sendiri juga membuktikan bahwa kloning belum tentu menghasilkan mamalia yang identik. Program SCNT membuktikan bahwa kloning akan memberkan individu yang memiliki DNA yang sama namun bukan berarti mereka akan identik secara fisik maupun kepribadian karena perkembangan individu tersebut dipengaruhi oleh interaksi antara gen dan lingkungannya. Hal ini berlaku seperti juga layaknya individu kembar identik. Kloning Terapeutik atau disebut juga Kloning Embrio, merupakan produksi embrio manusia untuk digunakan di dalam penelitian. Tujuan dari penelitian ini bukan untuk menciptakan manusia klon, namun lebih bertujuan untuk menghasilkan stem cell yang dapat digunakan untuk mempelajari perkembangan manusia dan untuk terapi penyakit. Stem cell disebut sel punca atau sel induk adalah sel yang masih belum matang dan belum berdiferensiasi (berubah) menjadi sel atau jaringan tertentu. Nantinya sel ini dapat bereplikasi menjadi sel yang serupa atau menjadi sel lain yang sama sekali berbeda yang dapat digunakan sebagai terapi penyakit. Etika dan Legal Konsensus internasional beredar luas diantara masyarakat umum, peneliti, dan politikus mengenai kloning reproduksi ini. Argumen pro dan kontra bergaung di berbagai sudut. Argumen utama yang kontra terhadap kloning reproduksi manusia ini diantaranya menyangkut beberapa hal : * Kelainan fisik atau kecacatan yang membahayakan : pengalaman melakukan kloning dengan hewan menunjukkan adanya kemungkinan kecacatan atau kondisi yang fatal di dalam teknik membentuk kloning reproduksi * Autonomy : seorang anak yang diciptakan melalui proses SCNT tidak dapat memberi ijinnya (informed consent) mengenai eksperimen yang akan dikerjakan. Hak otonomi ini juga akan muncul apabila DNA seseorang digunakan untuk membuat satu atau lebih kopi individu tanpa ijin dari orang yang bersangkutan * Conflict of interest : Masalah etika akan terjadi apabila para peneliti memiliki kepentingan keuangan di dalam penelitian ini * Gangguan psikologis atau psikis individu klon : Individu hasil klon akan rentan mengalami gangguan psikologis akibat dari statusnya sebagai genetik kopi dari orang lain. Individu klon tersebut dapat didominasi oleh orang yang menciptakannya * Martabat Manusia : The Universal Declaration on Human Genome and Human Rights (UNESCO 1997) menyatakan bahwa kloning manusia bertentangan dengan martabat

manusia berdasarkan pertimbangan etika : * Kepala Clonaid, B. Boisselier, mengemukakan klaim telah lahirnya Eve, bayi yang lahir melalui proses cloning di Israel, pada sidang 2009 lalu di Amerika Serikat. o Kloning merupakan metode reproduksi aseksual yang bertentangan dengan cara reproduksi manusia. Individu hasil klon hanya memiliki genetik dari 1 orang tua, satu generasi keturunan o Kloning membatasi variasi genetik (individu berbeda-beda satu sama lain) o Pemilik gen kloning akan mengharapkan sifat dan sikap tertentu dari hasil kloning tersebut dimana seakan kloning tersebut dibuat dengan tujuan melayani keinginan dari pihak lain sehingga kebebasan dari individu klon tersebut dapat terhambat o Kloning berisiko mengubah manusia menjadi objek manufaktur. Hal ini berlawanan dengan harga diri dan hak asasi manusia * Justice : Sumber daya kesehatan sebaiknya dialokasikan untuk kebutuhan penelitian lainnya yang lebih mendesak dibandingkan dengan kloning reproduksi. Seandainya kloning reproduksi ini berhasil, hanya sebagian kecil individu yang mampu yang dapat merasakan manfaatnya, * Argumen yang diungkapkan bahwa kloning membawa kebaikan bagi manusia : * Beneficence : Pilihan terapi kloning ini dapat merupakan solusi bagi pasangan infertil (gangguan kesuburan) yang ingin memiliki anak dari genetik mereka * Autonomy : Individu memiliki kebebasan untuk menentukan pilihan reproduksi mereka. Negara atau organisasi internasional tidak memiliki hak mencampuri autonomi reproduksi Kloning Manusia? Pada tahun 1997, Clonaid, perusahaan yang mendeklarasikan dirinya sebagai Perusahaan Kloning Manusia Pertama, yang didirikan oleh Sekte Raelian, sebuah sekte yang mempercayai kehidupan di bumi diciptakan mahluk angkasa luar melalui rekayasa genetika, mengumumkan kelahiran Manusia Kloning Pertama pada 26 Desember 2003 yang diberi nama Eve. Clonaid menggunakan teknik yang sama seperti Dolly untuk mengkloning Eve. Clonaid mengumumkan kelahiran manusia kloning kedua pada awal Januari 2003 dimana ibu yang mengandung merupakan wanita lesbian di Belanda. Kelahiran manusia kloning ketiga berasal dari pasangan di Jepang dan masih terdapat 2 bayi hasil kloning lainnya. Kelima bayi tersebut dalam keadaan sehat namun sampai saat ini belum ada verifikasi dari Clonaid mengenai hasil kloning ini. Pemeriksaan genetic untuk Eve dan temantemannya akan dilakukan untuk melakukan verifikasi kloning yang diakui oleh Clonaid. Eve, bayi manusia hasil proses kloning pertama di dunia.

Kebanyakan ilmuwan setuju, reproduksi manusia dengan cara kloning memang memungkinkan. Namun mereka menekankan, eksperimen seperti itu tidak bisa dipertanggungjawabkan karena tingginya resiko kematian dan gangguan pasca kelahiran. Kloning pada binatang menunjukkan adanya kelemahan. Dolly, mamalia pertama yang berhasil dikloning terbukti memiliki arthritis pada usianya yang masih muda. Walau dikatakan berhasil, prosedur kloning ini tidaklah sempurna. Diperlukan 227 percobaan sebelum akhirnya tercipta dolly. Kloning pada manusia lebih rumit dengan risiko besar dan sangat potensial terjadi kesalahan. Dikhawatirkan bahwa penggunaan teknik kloning pada manusia akan memunculkan kecacatan atau malformasi. Clonaid's Boisselier, Kepala Clonaid. National Bioethics Advisory Commission mengemukakan, penggunaan binatang guna memahami proses-proses biologi seperti dalam kasus Dolly, memberikan harapan besar bagi kemajuan dunia medis di masa depan. Namun tidak ada pembenaran untuk riset dengan tujuan menghasilkan anak manusia melalui teknik kloning ini. Mengacu pada berbagai resiko yang mungkin terjadi, banyak negara melarang dilakukannya riset-riset kloning pada manusia. Presiden AS kala itu Bill Clinton mengeluarkan rekomendasi moratorium atau penghentian riset kloning manusia selama 5 tahun. Namun selain memiliki sisi gelap, penelitian kloning pada manusia sebenarnya memberikan harapan bagi masa depan dunia kedokteran. Teknik kloning terapeutik memungkinkan dokter mengidentifikasi penyebab keguguran spontan, memberikan pemahaman pertumbuhan cepat sel kanker, penggunaan sel stem untuk meregenerasi jaringan syaraf, kemajuan dalam penelitian masalah penuaan, genetika dan pengobatan.