LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI SEL INTERAKSI PROTEIN-LIGAN

Tanggal Praktikum Nama NIM Kelompok Asisten

: 17 November 2011 : Dinia Rizqi D : 105090100111005 :4 : Moch Hardi Baramada

LABORATORIUM FISIOLOGI KULTUR JARINGAN TUMBUHAN DAN MIKROTEKNIK JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2011

LEMBAR PERNYATAAN

INTERAKSI PROTEIN-LIGAN Dinia Rizqi Dwijayanti Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang Abstrak Proses biologi dalam tubuh organisme senantiasa melibatkan protein dengan ikatan yang bersifat ikatan spesifik. Salah satu contoh ikatan yang spesifik tersebut adalah ikatan antara protein dan ligan. Interaksi protein dengan ligan merupakan sebuah interaksi antar molekul yang membentuk makromolekul. Tujuan praktikum ini adalah untuk mempelajari dinamika pengikatan CBB sebagai ligan pada ovalbumin sebagi makromolekul untuk memperoleh pemahaman tentang sifat fisiokimiawi interaksi ligan-makromolekul. Metode yang dilakukan adalah mereaksikan ovalbumin sebagi protein dengan CBB G-250 sebagai ligan dengan inkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Selanjutnya larutan diukur nilai absorbansinya. Berdasarkan pengukuran nilai absorbansi diperoleh hasil bahwa hubungan antara kadar ovalbumin dengan nilai absorbansi adalah berbanding lurus. Hal tersebut dapat terjadi karena ikatan yang terbentuk antara ovalbumin dan CBB G-250 semakin banyak sehingga nilai absorbansinya juga semakin tinggi. Interaksi ini terbentuk karena adanya reseptor pada permukaan sel dari ovalbumin. Reseptor ini mampu mendeteksi suatu sinyal yang berasal dari lingkungan sekitarnya. Deteksi ini dapat terjadi apabila terbentuk ikatan antara reseptor dengan suatu ligan tertentu. Ligan ini bersifat spesifik karena baik ligan maupun reseptor memiliki sisi yang saling berkomplemen. Kesimpulan dari praktikum ini adalah besarnya ikatan antara protein ligan dipengaruhi oleh jumlah protein maupun ligan tersebut. Semakin banyak jumlahnya maka ikatan yang terbentuk juga semakin banyak. Ikatan yang terbentuk antara CBB G-250 dengan ovalbumin merupakan ikatan lemah seperti ikatan hidrogen, ikatan hidrofobik maupun gaya Van der Walls. Kata kunci : CBB G-250, interaksi, ligan, ovalbumin, protein

BAB I PENDAHULUAN 1.1 Dasar Teori Protein merupakan senyawa organik kompleks yang memiliki berat molekul tinggi. Protein adalah salah satu bio-makromolekul yang penting perananya bagi semua organisme. Protein juga berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel makhluk hidup dan virus. Molekul protein mengandung karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen dan kadang kala sulfur serta fosfor. Keistimewaan lain dari protein ini adalah strukturnya yang mengandung N (15,30-18%), C (52,40%), H (6,90-7,30%), O (21-23,50%), S (0,8-2%), disamping C, H, O (seperti juga karbohidrat dan lemak), dan S kadang-kadang P, Fe dan Cu (sebagai senyawa kompleks dengan protein) (Sudarmaji, 1989). Ligan adalah suatu mikromolekul yang memiliki kemampuan mengikat molekul yang lebih besar. Hal tersebut menyebabkan molekul ini mengalami perubahan konformasi. Ligan yang sama dapat menyebabkan perubahan konformasi berbeda pada tiap makromolekul yang mengikatnya (Kavraki, 2007). Proses biologi dalam tubuh organisme senantiasa melibatkan protein dengan ikatan yang bersifat ikatan spesifik. Salah satu contoh ikatan yang spesifik tersebut adalah ikatan antara protein dan ligan. Interaksi protein dengan ligan merupakan sebuah interaksi antar molekul yang membentuk makromolekul. Interaksi ini juga merupakan metode komunikasi antar sel. Interaksi antara protein dengan ligan terjadi melalui 2 mekanisme. Pertaman, interaksi yang terbentuk karena adanya ikatan nonkovalen dan ikatan lemah. Kedua, ikatan antar molekul yang berinteraksi sangat dekat, selektif dan spesifik. Interaksi antara protein dengan ligan dan dikendalikan oleh pengaturan interaksi intermolekular yang bersifat kompleks. Interaksi tersebut bergantung pada dua interaksi spesifik, yaitu interaksi pada daerah binding pocket atau disebut direct docking, dan interaksi yang terjadi pada daerah yang bukan merupakan binding pocket disebut blind docking (Kavraki, 2007). Contoh interaksi antara protein dan ligan menurut Campbell, dkk. (2002), antara lain: 1. Asetilkolin sebagai ligan berikatan dengan heart muscle cell sebagai reseptor sehingga mengakibatkan heart muscle cell mengalami relaksasi. 2. Limfotoksin sebagai ligan berikatan dengan reseptor sebagai protein sehingga menyebabkan sel terinduksi untuk melakukan apoptosis. 3. TNF- sebagai ligan berikatan dengan permukaan sel sebagai protein sehingga sel terinduksi untuk melakukan apoptosis. Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, interaksi antara protein dan ligan pada umumnya merupakan awal dari terjadinya komunikasi antarsel . Selanjutnya, di dalam sel akan terjadi serangkaian proses biokimia yang akan merespon induksi. Respon tersebut sesuai dengan jenis ligan yang mengikat reseptor pada sel yang bersangkutan. Proses tersebut menghasilkan respon yang bersifat lokal dan terkadang juga diinduksikan kepada sel yang lainnya. Interaksi antara protein

dan ligan juga menyebabkan adanya perubahan sinyal di dalam sel. Sinyal molekul ektraselular yang berikatan akan mengaktifkan protein kinase dan second messenger. Second messenger berguna untuk mengubah kegiatan enzim khususnya protein kinase, meningkatkan ion kalsium intrasel, menggiatkan kanal ion tertentu. Fosforilasi protein atau kegiatan ion kalsium akan mengubah fungsi sel sebagai respon sel (Ibrahim, 2005). Ovalbumin adalah protein albumin yang terdapat pada putih telur. Ovalbumin memiliki kadar protein sekitar 60-65% dari total protein yang terdapat pada telur. Fungsi ovalbumin bagi telur itu sendiri adalah sebagai cadangan makanan bagi embrio yang sedang mengalami perkembangan. Pada beberapa penelitian, ovalbumin biasanya digunakan sebagai penanda berat molekul pada gel elektroforesis. Disamping itu dapat juga dimanfaatkan untuk menstimulasi reaksi alergi dan penanda pada subyek yang mengandung logam berat (Sambrook dan Russell, 2000). CBB atau Commassie Briliant Blue merupakan suatu senyawa kimia aminotryarilmetahne yang memiliki ikatan kuat. Ikatan pada CBB merupakan kombinasi antara gaya Van Der Walls dan ikatan elektrostatis dari gugus NH3. CBB berfungsi untuk pewarnaan protein yang telah diberi perlakuan elektroforesis dengan gel polyacrylamide. CBB memiliki niilai absorbansi 575-625 nm. Hasil pewarnaan didasarkan pada pernyataan hukum Lambert-Beer dimana hasil tersebut diperoleh sebanding dengan jumlah protein pada sampel (Sambrook dan Russell, 2000). 1.2 Tujuan Tujuan dilaksanakannnya praktikum yang berjudul Interaksi Protein-Ligan ini adalah untuk mempelajari dinamika pengikatan CBB sebagai ligan pada ovalbumin sebagi makromolekul untuk memperoleh pemahaman tentang sifat fisiokimiawi interaksi ligan-makromolekul. BAB II METODE 2.1 Waktu dan Tempat Praktikum Biologi Sel yang berjudul Interaksi Protein-Ligan dilaksanakan pada hari Kamis, 17 November 2011, pukul 10.15-13.00 WIB, dan bertempat di Laboratorium Fisiologi Kultur Jaringan Tumbuhan dan Mikroteknik, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang. 2.2 Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah larutan ovalbumin (20 mg/ml) dalam aquades, Commasie Briliant Blue G-250 dan pelarutnya serta plastic warp. Peralatan yang digunakan meliputi mikropipet dan tip, cuvet 3 ml berbahan dasar gelas, spektrofotometer UV-Vis, dan tabung reaksi.

2.3 Prosedur Kerja Cara kerja pada praktikum ini dimulai dengan persiapan spektrofotometri. Prosedur ini diawali dengan dinyalakannya tombol ON pada spektrofotometer dan Zeroing Pertama dijalankan. Panjang gelombang yang digunakan diganti dengan 596 nm. Setelah itu, spektrofotometer dibiarkan sambil menunggu penggunaan. Untuk pengukuran absorbansi, sampel disiapkan terlebih dahulu yaitu CBB G-250, ovalbumin, dan aquadest. Sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 3 ml dengan proporsi ovalbumin dan aquadest yang berbeda-beda. Tabung reaksi ditutup dengan plastic warp dan digoyang-goyang pelan beberapa kali (tidak sampai terbentuk busa). Tabung reaksi yang telah ditutup tersebut diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Setelah itu, dimulai pengukuran dengan spektrofotometer. BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1 Analisa Prosedur Prosedur dalam praktikum kali ini dimulai dengan pelabelan tabung reaksi. Hal ini dikarenakan tabung dengan label berbeda dapat mempermudah dalam identifikasi sampel. Setelah tabung diberi label, setiap tabung ditambah dengan CBB-G250 sebanyak 2 ml. CBB atau Commassie Briliant Blue merupakan suatu senyawa kimia aminotryarilmetanhe yang berikatan cukup kuat akibat adanya kombinasi antara gaya Van Der Walls dan ikatan elektrostatis dari gugus NH3 (Sambrook dan Russell, 2000). Selanjutnya, tabung yang telah berisi ditambah aquades dengan volume berbeda (0,975, 0,95, 0,90, 0,80, 0,60, 0,40, dan 0,20 ml). Aquadest berfungsi pelarut sebagai pelarut dan untuk menzeroing spektrofotometer. Tabung yang telah berisi aquades tersebut selanjutnya ditambah ovalbumin dengan volume yang berbeda pula ( 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, dan 1 ml). Ovalbumin ini merupakan protein albumin yang terdapat pada putih telur. Dalam praktikum ini ovalbumin berperan sebagai protein yang akan berikatan dengan suatu ligan (Biology, 2009). Dalam praktikum ini ovalbumin berfungsi sebagai ligan yang membentuk ikatan dengan ovalbumin. Tiap larutan dibuat duplo sebagi perbandingan. Tabung yang telah ditambah ovalbumin kemudian ditutup dengan plastic warp dan digoyang perlahan beberapa kali. Cara ini berfungsi untuk memaksimalkan percampuran antara ovalbumin dan CBB- G250. Tabung digoyang secara perlahan agar protein dalam ovalbumin tidak mengalami denaturasi. Denaturasi merupakan perubahan struktur alami dari protein yang mengakibatkan protein tidak dapat lagi berfungsi sebagaimana mestinya (Clark, 1964). Tabung tersebut kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit untuk memaksimalkan pengikatan CBB dengan ovalbumin. Setelah itu, masing-masing tabung dimasukkan dalam spektrofotometer untuk pengukuran absorbansi dari masing-masing tabung. Nilai

absorbansi ini menunjukkan banyaknya ovalbumin yang berikatan dengan CBBG250. 3.2 Analisa Hasil Berdasarkan hasil pengamatan dan pengukuran nilai absorbansi pada masing-masing tabung dengan kadar ovalbumin berbeda diperoleh hasil bahwa semakin tinggi kadar ovalbumin maka semakin tinggi nilai absorbansinya. Sebaliknya, semakin kecil kadar ovalbumin maka semakin rendah nilai absorbansinya. Dapat dikatakan bahwa terdapat hubungan yang berbanding lurus antara kadar ovalbumin dengan nilai absorbansinya. Berikut akan disajikan grafik hungan antara kadar ovalbumin dengan nilai absorbansi.

Gambar 1. Hubungan kadar ovalbumin dengan nilai absorbansi Ovalbumin merupakan protein albumin yang terdapat pada putih telur. Protein ini memiliki kadar sekitar 60-65% dari total protein yang ada pada telur. Ovalbumin dalam tabung reaksi akan berikatan dengan CBB yang ditambahkan. Dalam hal ini, ovalbumin berperan sebagai protein yang akan berikatan dengan ligan. Ovalbumin yang telah berikatan dengan ligan, yaitu CBB G-250, akan membentuk warna yang akan menunjukkan nilai absorbansi dalam spektrofotometri. Semakin banyak kadar protein maka akan semakin banyak interaksi ligan-protein yang terjadi. Hal ini akan menyebabkan nilai absorbansi dari suatu sampel juga akan meningkat. Timbulnya ikatan ini disebabkan adanya reseptor pada permukaan sel dari ovalbumin. Reseptor ini mampu mendeteksi suatu sinyal yang berasal dari lingkungan sekitarnya. Deteksi ini dapat terjadi apabila terbentuk ikatan antara reseptor dengan suatu ligan tertentu. Ligan ini bersifat spesifik karena baik ligan

maupun reseptor memiliki sisi yang saling berkomplemen. Ligan yang digunakan dalam praktikum ini ialah CBB G-250. CBB G-250 merupakan ligan yang memiliki rumus molekul C47H50N3O7S2. Berikut merupakan rumus struktur dari CBB G250 (Campbell, dkk., 2007).

Gambar 2. CBB G-250 (Roe, 2001) Ikatan yang terbentuk antara CBB G-250 dengan ovalbumin merupakan ikatan lemah seperti ikatan hidrogen, ikatan hidrofobik maupun gaya Van der Walls. CBB G-250 yang telah terikat akan memberi warna pada ovalbumin dan akan meningkatkan absorbansi dari CBB itu sendiri. Sehingga peningkatan nilai absorbansi tersebut berbanding lurus dengan banyaknya ikatan yang terjadi antara CBB G-250 dengan ovalbumin (Campbell, dkk., 2002). Menurut Kavraki (2007), interaksi antara protein dengan ligan dan protein lain dikendalikan oleh pengaturan interaksi intermolekular yang kompleks. Interaksi tersebut bergantung pada dua interaksi spesifik, yaitu interaksi pada daerah binding pocket atau disebut direct docking, dan interaksi yang terjadi pada daerah yang bukan merupakan binding pocket disebut blind docking. Interaksi antara protein ligan ditentukan oleh beberapa parameter antara lain, besar energi bebas pengikatan, konstanta inhibisi, dan interaksi fingerprinting kompleks protein ligan yang terbentuk. Energi bebas pengikatan dapat mengindikasikan spontanitas reaksi. Konstanta inhibisi merupakan kestabilan kompleks yang terbentuk antara protein dengan ligan. Sedangkan interaksi fingerprinting merupakan ciri khas yang dibentuk oleh interaksi elektrostatik, ikatan hidrogen, maupun ikatan van der walls pada sisi katalitik protein oleh ligan. Beberapa contoh mekanisme interaksi sel yang diperantarai protein dan ligan adalah sebagai berikut: 1. Sinaps Sinaps adalah titik temu antara satu neuron dengan neuron lainnya. Diantara titik temu tersebut terdapat celah sinaps. Celah sinaps merupakan tempat terjadinya pemindahan impuls. Contoh: nourotransmitter dalam syaraf sebagai ligan ditangkap oleh reseptor sel jaringan sebagai protein dimana

interaksi tersebut menyebabkan terbukanya gerbang pada membran sel dan impuls syaraf dapat masuk dan diterima sel pada jaringan tersebut (Universe, 2011).

Ligan Protein

Gambar 3. Mekanisme impuls saraf pada sinaps (Universe, 2011) 2. Endokrin Sistem endokrin adalah sistem kontrol kelenjar tanpa saluran yang menghasilkan hormon. Hormon tersebut tersirkulasi di tubuh melalui aliran darah untuk mempengaruhi organ-organ lain. Hormon berperan sebagai ligan sedangkan reseptor sel terget merupakan protein. Contoh: sekresi hormon Insulin oleh sel pankreas sebagai ligan yang akan dibawa melalui sirkulasi darah ke organ targetnya yaitu reseptor sel-sel hepar sebagai protein (Indah, 2004).

Ligan

protein

Gambar 4. Mekanisme endokrin (Stevens dan Lowe, 2009) 3. Autokrin Autokrin merupakan sekresi hormon oleh sel dimana hormon tersebut bertugas untuk mempengaruhi sel itu sendiri. Hormon berperan sebagai ligan sedangkan reseptor sel itu sendiri berperan sebagai protein. Contoh: secara khusus kerja autokrin pada sel kanker yang mensintesis berbagai produk onkogen sebagi ligan yang bertindak dalam sel yang sama dan diterima oleh reseptor sel tersebut sebagai protein untuk merangsang pembelahan sel dan meningkatkan pertumbuhan kanker secara keseluruhan (Indah, 2004).

Ligan

Protein

Gambar 5. Mekanisme autokrin (Stevens dan Lowe, 2009)

4.

Parakrin Parakrin merupakan sekresi hormon oleh sel dimana hormon tersebut akan membengaruhi sel-sel disekitarnya. Hormon berperan sebagai ligan sedangkan reseptor sel yang berada disekitarnya berperan sebagai perotein. Contoh: Steroid seks sebagai ligan yang diterima oleh reseptor sel-sel disekitarnya sebagai protein dalam ovarium, insulin sebagai ligan yang diproduksi oleh sel pankreas yang diterima oleh resptor sel-sel disekitarnya sebagi protein sehingga menstimulasi sel yang lain untuk ikut memproduksi insulin (Indah, 2004).

Ligan

Protein

Gambar 6. Mekanisme parakrin (Stevens dan Lowe, 2009) Berdasarkan nilai absorbansi ikatan protein dengan ligan diketahui bahwa nilai absorbansi meningkat seiring meningkatnya kadar protein yang diberikan. Umumnya peningkatan tersebut akan sampai pada suatu titik yang disebut titik jenuh. Titik jenuh merupakan titik tertinggi nilai absorbansi dimana jika kadar protein yang diberikan melebihi titik tersebut, maka nilai absorbansi akan turun. Namun melihat grafik hubungan nilai absorbansi dengan kadar protein yaitu ovalbumin, nilai absorbansi meningkat karena jumlah ikatan antara protein dengan ligan. Semakin banyak jumlah protein maupun ligan maka jumlah ikatan akan semakin banyak dan nilai absorbansi akan semakin tinggi. Berdasarkan hal tersebut, diduga bahwa titik jenuh interaksi protein ligan tidak ditemukan. Kesalahan yang mungkin terjadi dalam praktikum ini ialah kurangnya ketelitian dalam melakukan penambahan aquades, ovalbumin maupun CBB G250 dalam tabung reaksi. Hal ini tentunya akan mempengaruhi nilai absorbansi yang dihasilkan dari pada sampel. Kesalahan lain ialah perlakuan yang terlalu keras saat membolak-balik tabung yang telah berisi CBB G-250 dan ovalbumin, sehingga protein dari ovalbumin dapat mengalami denaturasi. Ini dapat

menyebabkan kurangnya interaksi yang terjadi antara ovalbumin dan CBB G-250 sehingga akan berpengaruh pula pada nilai absorbansi yang dihasilkan. Disamping itu lamanya waktu inkubasi juga akan mempengaruhi hasil absorbansi. BAB IV PENUTUP 4.1 Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan dapat disimpulkan bahwa, interaksi antara CBB G-250 sebagi ligan dan ovalbumin sebagai protein dapat terjadi karena adanya reseptor pada permukaan sel ovalbumin. Reseptor sel mampu mendeteksi suatu sinyal yang berasal dari lingkungan sekitarnya apabila sel berikatan dengan ligan yang spesifik. Ikatan yang terbentuk antara CBB G-250 dengan ovalbumin merupakan ikatan lemah seperti ikatan hidrogen, ikatan hidrofobik maupun gaya Van der Walls. 4.2 Saran Disarankan untuk praktikum selanjutnya agar penambahan CBB G-250 ke dalam ovalbumin pada tiap kelompok diberi jarak minimal 5 menit, mengingat perhitungan absorbansi dilakukan satu persatu dan membutuhkan waktu yang tidak sedikit. Hal tersebut dimaksudkan agar waktu inkubasi tiap larutan tidak melebihi 15 menit.

DAFTAR PUSTAKA Biology. 2009. Ovalbumin. http://www.biology-online.org/ovalbumin.html. Diakses 29 November 2011 Campbell, N. A., J. B. Reece, dan L. G. Mitchell. 2002. Biology 6th Edition. Pearson Education, Inc. New York Clark, J. M. 1964. Experimental Biochemistry. W. H. Freeman Company. USA Ibrahim, N. 2005. Fisiologi Komunikasi Antar dan Intra sel. Departemen FKUI. Jakarta Indah, M. 2004. Mekanisme Kerja Hormon. http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/3541/1/biokimia-mutiara2.pdf. Diakses 30 November 2011 Kavraki, L. E. 2007. Protein-Ligand Docking, Including Flexible Ligand Docking (online). http:// cnx. org/ content /m11456/ latest/. Diakses 29 November 2011 Roe, S. 2001. Protein Purification Techniques: A Practical Approach. Oxford University Press. Oxford Sambrook, J dan D. W. Russell. 2000. The Condensed Protocol for Molecular Cloning: A Laboratory Manual. CSHL Press. USA Stevens, dan Lowe. 2009. Autocrine, Paracrine, and Endocrine. http://paper6textcube.com/2009/10/autocrine-paracrine-endocrine.html. Diakses 30 November 2011 Sudarmaji, S, dkk. 1989. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Penerbit Liberty. Yogyakarta Universe. 2011. Neurons and Nerves. http://universe-review.ca/R10-16-ANS.htm. Diakses 30 November 2011