Haematologi Ikan Hilal Anshary

Darah Ikan
Jaringan ikan memiliki sel-sel sirkulatori dalam bentuk medium cairan, plasma, pada invertebrata disebut haemolimf Peranan darah: pembawa oksigen, bahan makanan, produk ekskresi melalui tubuh pada jaringan dan organ yang berbeda Darah disirkulasi oleh aksi mekanis organ khusus yang disebut jantung Darah terdiri atas plasma darah dan sel-sel darah

Plasma darah
Plasma terdiri atas 90% air dan 10% bahan organik dan inorganik terlarut Bahan organik dalam darah: protein seperti globulin (alfa, beta, gamma, dan imunoglobulin), albumin, clotting factor, dan antibodi Serum adalah cairan warna kekuningan yang tertinggal setelah darah membeku. Jadi komposisinya sama dengan plasma darah, hanya tidak mengandung clotting factor Clotting factor adalah protein yang terlibat dalam perubahan fibrinogen terlarut menjadi fibrin Serum adalah fraksi cairan darah atau haemolimf yang tidak mengandung fibrinogen. Pada invertebrata, darah pertama-tama dibiarkan membeku (fibrinogen diubah menjadi fibrin tidak terlarut), kemudian disentrifus untuk menghilangkan sel darah dan fibrin

SEL DARAH
Sel darah ikan dikelompokkan menjadi dua kategori:
Sel darah Merah (Eritrosit) Sel darah putih (Leukosit)

Eritrosit merujuk pada sel darah yang memiliki inti dan mengandung protein yang berwarna Haemoglobin Haemoglobin: protein yang memiliki pigmen merah pada sel darah vertebrata dan lainnya dalam dunia hewan. Haemoglobin bergabung dengan oksigen membentuk oxyhaemoglobin yang berfungsi untuk membawa oksigen pada seluruh sistem darah Haemoglobin tersusun atas protein yang tidak berwarna Globin, dan pigmen merah kuning, haeme, yang mengandung besi

SEL DARAH
Leukosit: istilah leukosit merujuk pada sel darah berinti yang tidak memiliki pigmen dan berfungsi untuk melawan infeksi dan fagositosis. Berbeda dengan eritrosit, leukosit dapat meninggalkan sistem vascular untuk melaksanakan fungsinya dengan cara keluar dari saluran darah kecil

FUNGSI ERITROSIT
Mengangkut oksigen dan karbondioksida Molekul oksigen dibawa oleh molekul haemoglobin dalam sel Heamoglobin adalah protein berukuran besar yang terdiri atas 4 subunit protein yang lebih kecil, 2 rantai alfa dan 2 rantai beta, yang masing-masing membawa 1 molekul oksigen

Sumber Eritrosit
Eritrosit dibentuk pada sel embryonik dalam periferi darah, erythroblast. Erithroblast mengalami serangkaian mitosis, meningkatkan jumlah haemoglobin, dan akhirnya berkembang menjadi eritrosit Pada ikan yang sudah lebih berkembang, Osteichthyes, ginjal merupakan tempat berlangsungnya eritropoiesis, sedangkan pada ikan primitif, Agnatha, dan ikan bertulang rawan, Condrichthyes, darah merupakan tempat utama sintesa eritrosit Eritropoiesis adalah pembentukan sel darah merah, eritrosit

Jumlah Eritrosit pada Ikan

Eritrosit adalah jenis sel darah yang paling penting/utama pada ikan Terdapat variasi jumlah yang sangat besar antara ikan-ikan yang berbeda, bahkan variasi pada jenis ikan yang sama tergantung kondisi kesehatannya Ikan rainbow trout jumlah eritrosit dapat bervariasi dari 0.77 sampai 1.58 x 106 cells /mm3 Persentase eritrosit pada ikan sea bass (Dicentrarchus labrax) 96,5%, White Bream (Diplodus sargus) 96,5%, dan Saupe (Sarpa salpa) 98%.

GRANULOCYTE
Sel ini memiliki struktur yang jelas dan kadangkadang disebut leukosit Polymorphonuclear (PMN) Sitoplasma mengandung banyak granule/butiran yang halus Terdapat 3 jenis granulosit pada ikan
Netrophil Eosinophil Basophil

Granulosit basophil tidak ditemukan pada ikan salmon

 Neutrophil: leukosit yang tidak memiliki afinitas terhadap pewarnaan asam atau basa, tetapi terwarnai oleh pewarnaan netral. Leukosit yang paling melimpah dalam darah, mampu keluar dari dalam darah dan menuju jaringan tubuh untuk menelan bakteri yang menyerang Eosinophil: sel darah putih khusus (polymorphonuclear leucocyte), yang dapat diwarnai dengan pewarnaan asam seperti eosin. Sel-sel ini terlibat dalam penghancuran parasit-parasit internal dan modulasi reaksi inflamatori alergi Basophil: substansi atau elemen jaringan (e.g.sel darah putih) yang memiliki afinitas terhadap pewarnaan basa. Merupakan granulosit yang dapat mencerna mikroorganisma. Jumlahnya sangat rendah dalam darah ikan, sehingga menimbulkan pertanyaan apakah sel ini ada dalam ikan.

FUNGSI GRANULOSIT
Terlibat pada sistem pertahanan nonspesifik, yaitu mengenal bahan asing yang datang, tetapi tidak mengenal antigen spesifik Sel ini bermigrasi ke bagian tubuh dimana invasi terjadi dan menghancurkan partikel asing dengan fagositosis atau dengan respon cytotoksik. Proses ini disebut respon inflamasi

 Antigen: setiap agent yang dapat memunculkan respon imun. Antigen dapat merujuk pada individu makromolekul atau populasi makromolekul antigenik homogen atau heterogen. Antigen tertentu biasanya mengandung sejumlah situs dimana kombinasi dengan bermacam-macam antibodi dapat terjadi (determinant). Antigen dapat terlarut (toksin mikroba, ekstrak) atau partikulat. Antigen yang paling efektif adalah protein dan polisakarida Respon inflamasi: reaksi jaringan terhadap luka atau adanya antigen yang dicirikan oleh adanya panas, pembengkakan, kemerahan, dan rasa sakit, vasodilation, hyperaemia, akumulasi leukosit.

Sumber Granulosit
Granulosit dibentuk pada sel embryonik yang disebut Granuloblast dalam jaringan Haemopoietik ginjal

Jumlah Granulosit
Jumlah granulosit pada ikan 4 60 % dari leukosit darah Jumlah sangat bervariasi pada spesies ikan yang berbeda Granulosit 1 9 % dari total sel darah putih pada ikan rainbow trout (Oncorhynchus mykiss).

% of WBCs Sea Bass (Dicentrarchus labrax) White Bream (Diplodus sargus) Saupe (Sarpa salpa) 8%

% of all blood cells 0.28%

28% 12%

0.98% 0.24%

LIMFOSIT
Sel berbentuk bulat Limfosit immature yang besar kadang-kdang terlihat Ada dua jenis
T-Limfosit B-Limfosit

Fungsi memediasi respon humoral dan selular Pada saat kontak dengan antigen akan terjadi perbanyakan limfosit, kemudian mensekresi sejumlah besar antibodi imunoglobulin

 B-limfosit: berasal dari bone marrow dan terlibat dalam produksi antibodi T-Limfosit: limfoid sel yang perkembangannya tergantung pada keberadaan thymus; berperan dalam sel mediated immunity

Sumber Limfosit
Thymocytes yang berasal dari thymus akan berkembang menjadi T-Limfosit Sejumlah besar limfosit-limfosit kecil jugan ditemukan pada ginjal dan limfa T-sel diduga bersal dari thymus B-sel berasal dari ginjal

Jumlah Limfosit
Proporsi leukosit yang merupakan limfosit adalah 85% pada beberapa ikan Limfosit dengan jumlah 89 98 % leukosit ditemukan pada juvenil rainbow trout.

% of WBCs Sea Bass 90% (Dicentrarchus labrax) White Bream 70% (Diplodus sargus) Saupe (Sarpa 88% salpa)

% of all blood cells 3.15%

2.45%

1.76%

MONOSIT
Sel berukuran besar dan inti yang besar menempati 1/3 dan dari sel Sitoplasma mengandung granul-granul kecil yang menyebar Fungsi: prekursor makrofage Jauh lebih fagositik dari pada granulosit Monosit ditemukan dalam jumlah besar pada ginjal, sehingga diduga berasal dari organ ginjal

Jumlah Monosit
Pada ikan, darah mengandung monosit yang bervariasi, biasanya jumlahnya kecil Pada ikan plaice, hanya 0.1% dari total jumlah leukosit, pada catfish 1-8% dari total leukosit

% of WBCs Sea Bass (Dicentrarchus labrax) White Bream (Diplodus sargus) Saupe (Sarpa salpa) 2%

% of all blood cells 0.07%

2%

0.07%

0%

0%

THROMBOCYTE
There are four morphological forms of thrombocytes which are commonly seen; oval, spindle-shaped, spiked and fragmented. The oval or spindle-shaped cells are thought to be the normal forms of thrombocytes in vivo, and these are easily confused with lymphocytes because they look very similar. Thrombocytes also sometimes appear in preparations as spiked or fragmented forms

Fungsi Thrombocyte
Pembekuan darah Fagositosis, tetapi bukan fagositosis sejati karena partikel tidak ditelan secara utuh

Cara Koleksi Darah

Parameter darah dapat menduga status kesehatan ikan Beberapa teknik berbeda dapat digunakan untuk mengambil darah:
severing the caudal peduncle puncturing the caudal vessel a cardiac puncture a dorsal aorta puncture

Pengambilan darah umumnya tabung dan jarum diberikan antikoagulan; heparin, EDTA Kalau yang diinginkan serum, tidak perlu menggunakan antikoagulan karena darah akan menggumpal (fibrinogen dirubah menjadi fibrin yang tidak terlarut) dalam tabung dan disentrifus untuk menghilangkan sel darah dan fibrin

Severing the Caudal Peduncle

Severing the Caudal Peduncle

Teknik ini cocok untuk ikan kecil (< 10 cm) karena pembuluh darah kecil dan volume darah sedikit Kadang-kadang sulit mendapatkan darah secara efisien dengan metode ini karena darah cepat menggumpal Darah harus sesegera mungkin dikumpulkan setelah ekor dipotong Dengan teknik ini, ikan sampel dimatikan dengan obat bius, tricane methane sulfonate (MS-222), benzocaine, dan quinaldine untuk air tawar, Ethylenglycolmonophenylether untuk ikan air laut. Obat bius biasanya digunakan dengan cara perendaman Potong bagian peduncle dengan pisau dan bersihkan kotoran bagian ekor untuk menghindari kontaminasi dari lendir maupun air laut

Darah diambil menggunakan tabung eppendorf atau tabung kapiler yang telah diberi heparin pada bagian ujung pembuluh darah yang telah dipotong. Tabung yang digunakan tergantung pada teknik hematologi yang akan dilakukan selanjutnya

Letakkan ujung tabung kapiler yang telah diberi heparin pada bagian ujung pembuluh darah yang telah dipotong, darah akan mengalir sepanjang tabung kapiler.

Puncturing the Caudal Peduncle

Teknik ini dapat digunakan secara berulang-ulang untuk mengambil darah dari ikan besar (> 10 cm) Darah dapat diambil sebanyak 0,5 1 mL setiap minggu Darah diambil dengan terlebih dahulu membius ikan

Pasang jarum pada alat pengisapnya

Bilas jarum dengan larutan heparine, biarkan tertinggal larutan heparine sebanya 50 100 L pada bagian dasar jarum. Setelah membilas dengan heparine, heparine tertinggal pada dinding jarum sehingga mencegah darah membeku

Tusuk bagian mid-ventral line belakang sirip anal. Dorong jarum kedalam otot sampai mencapai tulang belakang, perlahan-lahan tarik darah dengan memutar-mutar jarum suntik sampai darah masuk pada jarum suntik.

Prosedur ini memerlukan latihan untuk dapat menguasai teknik ini. Pada saat mengambil darah tidak boleh ada gelembung udara

Perlahan jarum suntik dikeluarkan dari ikan, lalu disimpan pada tabung yang disimpan dalam keadaan dingin

Darah dicampur dengan memutar tabung bolak-balik

Cardiac Puncture
Teknik ini dapat digunakan secara berulang-ulang untuk mengambil darah dari ikan besar (> 10 cm) Darah diambil dengan terlebih dahulu membius ikan

Ikan dalam posisi menghadap ke atas, lalu jarum dimasukkan pada bagian anterior sirip pektoral

Teknik hematologi
Haematocrit Haemoglobin Determination Erythrocyte Count Leucocyte Count Differential Cell Counts

Haematocrit
Hematokrit digunakan untuk menetukan volume susunan sel darah Hemastokrit bervariasi tergantung kondisi kesehatan dan fisiologis ikan Sentuhkan tabung kapiler pada sampel darah dan biarkan tabung terisi darah sampai bagian. Segel ujung tabung dengan sealen yang sesuai, yaitu plasticine. Sentrifus darah pada sentrifus khusus untuk hematokrit pada 10500 rpm 5 menit. Ukur nilai hematokrit dengan alat rotoreader

Haemoglobin Determination
Menghitung kadar haemoglobin darah, untuk menentukan kondisi anemia Ada berbagai metode yang dapat digunakan untuk mengukur hemoglobin, keakuratan setiap mode sangat berbeda Metode cyanohemoglobin selama ini telah menjadi metode standar selama beberapa dekade, namun metode baru alkaline haematin D-575 telah digunakan Metode lama diketahui hanya menghasilkan hemoglobin yang jumlahnya kecil dibanding metode baru yang digunakan Kelemahan lain metode lama adalah reagennya mengandung sianida yang toksik

 Tambahkan 20 L kedalam 5 L Drabkins solution dalam tabung dan campur secara merata masukkan 2 mL larutan kedalam cuvette, baca nilai absorbance pada spectropotometer 540 nm Konsentrasi hemoglobin dihitung dari kurva yang telah dibuat dengan menggunakan standar

DRABKINS SOLUTION:

200 mg Potassium ferricyanide 50 mg Potassium cyanide 140 mg Potassium dihydrogen phosphate Distilled water made up to 1 Litre

Erythrocyte Count
Metode ini bisa digunakan untuk mengetahui kondisi kesehatan ikan, karena sel darah abnormal berasosiasi dengan penyakit Larutan pengencer yang digunakan adalah Hendricks diluting solution (1:200 dilution of blood) dan formal citrate solution (1:200 dilution of blood). Metode Blaxhall and Daisleys umum digunakan, metode ini juga digunakan pada leucocyte count Buat pengenceran 1:50 darah pada Dacies fluid

DACIES FLUID:

Formaldehyde: Trisodium citrate: Brilliant cresyl Blue: Distilled water

10 ml 31.3g 1.0g 1 litre

Dacies fluid should be filtered immediately before use.

Mix the diluted blood by tilting the sealed tube gently to avoid destroying the cells

Place a cover slip over a Neubauer haemocytometer. This is a special type of slide which is designed to act as a blood cell counting chamber.

Draw some of the diluted blood solution into a Pasteur pipette and touch the tip of the pipette to the edge of the cover slip. Capillary action will draw the diluted blood into the chamber.

 Place the haemocytometer under the microscope Count the erythrocytes occuring in five small squares at the centre of the grid (3 Blood Fig. 3.4.2), a total area of 0.02mm3 (1/50 of 1mm3). Erythrocytes are a great deal more numerous than leucocytes in fish. In order for an erythrocyte count to be considered statistically accurate a minimum of 200 cells (but preferably 400-500) must be counted. The total area counted here (0.02mm3, at a dilution of 1:50) should be sufficient for an accurate count to be obtained The dilution is 1:50, therefore the number of cells occurring per mm3 may be calculated as follows:
Number of cells occurring per mm3 = Number of cells counted in 0.02mm3 X 50 (area counted) X 50 (dilution).

Leucocyte Count
Place the haemocytometer under the microscope Count the leucocytes occuring in the four corner squares marked (3 Blood Fig. 4.4.2) on the grid, a total area of 0.1 mm3. Leucocytes are not nearly as abundant as erythrocytes in fish. In order for a leucocyte count to be considered statistically accurate a minimum of 200 cells (but preferably 400-500) must be counted. The total area counted here (0.1mm3, at a dilution of 1:50), should be sufficient for an accurate count to be obtained.

 The dilution is 1:50, therefore the number of cells occurring per mm3 may be calculated as follows: Number of cells occurring per mm3 = Number of cells counted in 0.1mm3 X 10 (area counted) X 50 (dilution).

Differential Cell Counts

Microscopic examination of different cell types as revealed by differential staining can be carried out by making a blood smear The purpose of this method is to obtain a single layer of cells on a microscope slide, which is then fixed and stained in the appropriate dyes Different types of cell (erythrocytes, lymphocytes, etc.) and components within the cell, take up different stains, and this allows cells to be identified and counted

Place a small drop of blood on one end of a clean dry microscope slide. Use a slide which has been cleaned in detergent and stored in absolute methanol or ethanol. Place this slide on a table top.

Hold the smearing slide at an angle of 35 to 40 to the other slide and allow the drop of blood to flow along the interface between the slides

Push the smearing slide firmly along the microscope slide, away from the drop of blood in order to avoid distorting or crushing the blood cells, maintaining uniform pressure, to create a thin film of blood

Dry the slide rapidly in air and fix for 1-2 min. in 95% methanol.

The smear can be stored for some weeks before staining, if needed

MAY-GRUNWALD/GIEMSA STAIN: Eosine-methylene blue, solution modified for microscopy. This is among the more widely used solutions used in histological staining of blood smears Different types of cell (erythrocytes, lymphocytes, etc.) and components within the cell, are distinguishable from one another by their colour and shape when viewed under a microscope

MAY-GRUNWALD/GIEMSA STAINING:
Erythrocytes: Round/oval shaped cells with a centrally situated nucleus and a well defined outline. Stain pink/brown with May-Grunwald/Giemsa. Lymphocytes: Round cells with large round nucleus. Considerable size range. Nucleus stains a deep red/violet colour, while the cytoplasm is either a dark blue ring or not visible.

 Neutrophils: Round/oval cells with granulated cytoplasm and eccentric nuclei, which may appear two- or three- lobed. Nucleus stains a deep red/violet colour, while the cytoplasm is either a dark blue ring or not visible. Eosinophils: Round cells with a round, sometimes eccentrically located nucleus. Nucleus stains pink/orange. Cytoplasm stains pale pink with abundant red/pink shining granules.

 Monocytes: Large cells. Cytoplasm sometimes shows extended processes giving the cells an irregular outline. Nucleus stains dark blue/purple with pale blue cytoplasm. Thrombocytes: Cells may be round, oval, elongate or spindle shaped, and they tend to appear singly or in clusters. Large nucleus. Nucleus stains deep purple, and cytoplasm remains unstained. Basophils: The occurrence of basophils in fish blood is disputed. If they do occur it is possible that they do not stain sufficiently with MayGrunwald/Giemsa to be recognised.

 Prepare the stain as directed by the manufacturer/supplier. Place the blood smear (which has been air dried and fixed in methanol) in the stain for five minutes. Wash the slide and allow to dry.