[Type the document subtitle]

PEMERIKSAAN BAKTERI YANG MENIMBULKAN KERACUNAN MAKANAN (FOOD POISONING) DAN BAKTERI YANG MENIMBULKAN SAKIT LEWAT MAKANAN (FOOD BORNE DESEASES)
BAKTERI DAN JAMUR YANG DIPERIKSA A. Food Poisoning 1. Vibrio para haemolyticus (mulai 300.000/gram) 2. Staphylococcus aureus (500.000/gram) 3. Bacillus cereus (1.000.000/gram) 4. Clostridium botulinum, Cl. perfringens (lebih 1.000.000/gram) 5. Aspergillus flavus (60 mg racun / 1 kg sampel) 6. Pseudomonas coccovenenans B. Food Borne Deseases 1. Vibrio cholerae, Vibrio El Tor, Vibrio NAG 2. Salmonella 3. Shigella 4. Escherichia coli (EPEC, ETEC, EIEC, EHEC) 5. Yersinia enterocolitica 6. Campylobacter sp. 7. Aeromonas sp. ISOLASI DAN DIAGNOSE a. Untuk bakteri lihat cara isolasi dan diagnose pada masing-masing bakteri b. Untuk jamur lihat cara pemeriksaan jamur SPESIMEN a. Makanan, minuman, air, muntahan dan feses b. Tempe bongkrek, tempe gembus dan oncom CATATAN a. Di dalam isolasi dan diagnose, apabila diketemukan bakteri lain, harus juga dilaporkan b. Hanya untuk spesimen berupa tempe dan terutama yang berasal dari daerah aliran sungai Serayu, Banyumas dan sekitarnya

Laboratorium Mikrobiologi Kesehatan

Fakultas Kedokteran dan Ilmu-ilmu Jurusan Kedokteran Unsoed-Purwokerto

PEMERIKSAAN MAKANAN, MINUMAN DAN AIR SECARA BAKTERIOLOGIS

PENATALAKSANAAN SPESIMEN A. Pembukaan kaleng/botol tempat makanan/minuman 1. Kalau kaleng tutup plastik, plastiknya diambil dahulu kemudian tutup kaleng dibasahi dengan alkohol, terus dibakar. Begitu pula kalau minuman di dalam botol, tutupnya dibasahi alkohol terus dibakar. 2. Setelah dingin dibuka dengan alat pembuka kaleng/botol, yang sudah dibakar. Kalau kalengnya sudah dilengkapi dengan tarikan pembuka kaleng, tinggal ditarik dengan pinset steril. 3. Setelah dibuka, bahan yang diambil untuk pemeriksaan adalah yang ada dibawah permukaan atau dibagian tengah (spesimen padat). Untuk spesimen cair, sebelum dibuka dikocok dahulu 25 kali. B. Pengambilan spesimen Pada dasarnya pengambilan spesimen harus dilaksanakan secara aseptis dengan alat yang steril. Tangan dibersihkan dengan kapas beralkohol, sendok disteril dengan dibakar menggunakan alkohol; pipet, gelas ukur, labu erlenmeyer disteril dengan oven 180 OC selama 1 jam atau 120 OC selama 12 jam. PEMERIKSAAN MAKANAN DAN MINUMAN Yang diperiksa yaitu : a. Angka kuman (TPC) b. MPN coliform c. MPN E. coli d. Vibrio cholera, El Tor, Parahaemolyticus e. Salmonella f. Shigella g. E. coli patogen h. Staphylococcus aureus i. Bacillus cereus j. Clostridium perfringens, Cl. botulinum, Cl. deficille k. Enterococci l. Mould dan Yeast PEMERIKSAAN AIR Yang diperiksa, yaitu : a. Angka kuman (tidak selalu) b. MPN coliform c. MPN coliform tinja d. Kadang-kadang juga pH dan sisa chlor

Laboratorium Mikrobiologi Kesehatan

Fakultas Kedokteran dan Ilmu-ilmu Jurusan Kedokteran Unsoed-Purwokerto

PEMERIKSAAN SALMONELLA MAKANAN

STANDART MUTU Di dalam minimal 50 gram makanan yang diperiksa tidak boleh ada Salmonella PELAKSANAAN PEMERIKSAAN 1. Minimal 50 gram makanan sampel dimasukkan ke dalam 250 ml enrichment media (Selenite Broth, Tetrathionat Broth, Rapport medium) 2. Dari enrichment media ditanam pada Salmonella Shigella Agar dan Mc Conkey Agar. Masuk inkubator 37 OC selama 24 jam 3. Koloni yang tersangka Salmonella ditanam pada gula-gula pendek TSIA, SIM dan Simmons Citrat Agar. Masuk inkubator 37 OC selama 24 jam. 4. Di baca dan dicatat pertumbuhan pada TSIA, Sim dan SC, dicocokkan dengan tabel serum biokimia Salmonella. Kalau cocok diteruskan dengan slide agglutinasi dengan serum anti Salmonella polyvalent dan monovalen. Seterusnya boleh ditanam pada media gula-gula panjang dan media identifikasi yang lainnya.

PERHITUNGAN BAKTERI ENTEROPATOGENIK DAN BAKTERI INDIKATOR DI DALAM MAKANAN DENGAN METODE PLATE A. BAKTERI YAN DIHITUNG 1. Bakteri Indikator a. Coliform b. Escherichia coli c. Enterococci 2. Bakteri Enteropatogenik a. Vibrio parahaemolyticus b. Staphylococcus aureus c. Bacillus cereus d. Clostridium perfringens 3. Mould dan Yeast B. PENGENCERAN SAMPEL Dilakukan seperti pada pemeriksaan angka kuman, atau sisa pengenceran untuk angka kuman boleh juga digunakan. C. PENUANGAN MEDIA DAN MEDIA YANG DIGUNAKAN 1. Tiap-tiap pengenceran sampel 10 x, 100 x dan 1000 x diambil masing-masing 1ml dimasukkan ke dalam petri dish steril (1 seri pengenceran ada 3 dish) 2. Kepada 1 seri pengenceran dituang media sesuai dengan jenis pemeriksaan yang akan dilakukan. Jumlah media yang dituang adalah 15 20 ml per dish. 3. Dicampur sampai homogen, diamkan di atas meja sampai media memadat. 4. Kemudian diinkubasi dengan posisi terbalik, pada suhu 37 OC selama 48 jam. 5. Jenis media yang dituang untuk pemeriksaan :
Laboratorium Mikrobiologi Kesehatan Fakultas Kedokteran dan Ilmu-ilmu Jurusan Kedokteran Unsoed-Purwokerto

6.

Violet Red Bile Agar Tergitol 7 Agar Thiosulfat Citrat Bile Sukrosa Agar + NaCl 6 % Mannitol Salt Agar + 5 % Egg Yolk Bacillus cereus Agar Egg Yolk Handfort Agar modified KF Streptococci Agar Potato Dextrose Agar (inkubasi 30 - 37 OC selama 4 5 hari) Contoh sterilitas dibuat 1 petri dish steril diisi dengan 1 ml pelarut, dituang media yang akan digunakan sesuai dengan jenis pemeriksaan.

a. b. c. d. e. f. g. h.

Coliform Escherichia coli Vibrio parahaemolyticus Staphylococcus aureus Bacillus cereus Clostridium perfringens Enterococci Mould dan Yeast

: : : : : : : :

D. PERHITUNGAN KOLONI Perhitungan seperti angka kuman, hanya saja koloni yang dihitung adalah koloni yang sesuai dengan ciri-ciri bakteri yang dihitung. E. ISOLASI I. ISOLASI E. coli a. Diambil sampel air kemih 5 ml atau feses sebanyak 5 gr b. Lakukan pengenceran sampai 10-6 ; pada dua pengenceran terakhir (10-5 dan 10-6) diambil 0,1 ml dengan mikropipet masukkan dalam medium Mac Conkey atau EMBA dan diratakan dengan drugalsky c. Inkubasi pada suhu 37 OC selama 2 x 24 jam d. Amati pertumbuhan koloni yang terbentuk : E. coli pada medium Mac Conkey akan tampak berwarna merah tua dengan koloni besar dan EMBA akan tampak berwarna merah tua dengan kilap logam. PERHITUNGAN JUMLAH BAKTERI COLIFORM a. b. c. d. e. Siapkan 3 tabung berisi LBDS dan 6 tabung LBSS (dibagi dua) Inokulasi tabung LBDS dengan 10 ml air sampel, 3 tabung LBSS diinokulasi dengan 1 ml dan 3 tabung LBSS yang lain diinokulasi dengan 0,1 ml Inkubasi pada suhu 37 OC selama 1 x 24 jam. Amati terbentuknya gas yang terperangkap pada tabung durham. Jumlah gas pada masing-masing kelompok medium dicocokan dengan tabel MPN untuk mengetahui jumlah bakteri coliform dalam sampel.

II. ISOLASI Salmonella dan Shigella a. Sampel mutahan diambil 1 gram dan dihaluskan b. Masukkan dalam medium Lactose Broth (LB) dan diinkubasi selama 1 x 24 jam, 37 OC c. Setelah inkubasi selesai, masukkan dalam medium Selenith Broth (SB) dan diinkubasi selama 1 x 24 jam, 37 OC d. Setelah inkubasi selesai : d.1. dengan menggunakan jarum ose, inokulasikan pada medium SSA secara streak atau kuadran; atau d.2. 0,1 ml dengan mikropipet masukkan dalam medium SSA dan diratakan dengan drugalsky e. Inkubasi pada suhu 37 OC selama 2 x 24 jam
Laboratorium Mikrobiologi Kesehatan Fakultas Kedokteran dan Ilmu-ilmu Jurusan Kedokteran Unsoed-Purwokerto

f. Amati pertumbuhan koloni yang terbentuk : koloni warna merah atau bening keruh dan pada bagian tengahnya berwarna hitam menunjukkan adanya koloni Salmonella, sedangkan Shigella koloni warna merah atau bening keruh dan pada bagian tengahnya tidak berwarna hitam. III.ISOLASI Bacillus cereus a. Spesimen di lakukan pengenceran sampai tingkatan tertentu b. Pengenceran terakhir dilakukan pemanasan pada air mendidih (membunuh bakteri selain Bacillus) c. Dilakukan penanaman pada media Agar plate d. Inkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 37 OC e. Amati pertumbuhan koloni yang terbentuk : bulat, keping, putih, tepi tidak rata, menjalar IV. ISOLASI Staphylococcus aureus a. Spesimen di lakukan pengenceran sampai tingkatan tertentu b. Pengenceran terakhir dilakukan penanaman secara streak plate dan spread plate pada media MSA atau MSA-darah c. Inkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 37 OC d. Amati pertumbuhan koloni yang terbentuk : pada media MSA : bulat, cembung, berwarna kuning dengan zona kuning disekeliling koloni, sedangkan pada MSAdarah : bulat, cembung, putih sampai abu-abu dengan zona jernih disekeliling koloni (hemolisis). F. IDENTIFIKASI I. IDENTIFIKASI E. coli 1. Koloni yang di duga E. coli hasil isolasi disiapkan. 2. Masukan dalam medium LB + indikator warna (preenrichment) yang didalamnya terdapat tabung durham, inkubasi pada suhu 37 OC selama 1 x 24 jam. Amati terbentuknya gas pada tabung durham (+) dan perubahan warna media (asam) (+). 3. Hasil positif dimasukan sebanyak 1 ose ke dalam medium IMViC (Indole Methyl Red Voges Proskauer Kosers Citrat). Kemudian diinkubasi pada suhu 37 OC, untuk Indole dan Voges Proskauer selama 2 x 24 jam sedangkan Methyl Red dan Kosers Citrat 4 x 24 jam. 4. Amati perubahan warna pada masing-masing medium : a. Indole : ditambah covak indole reagent, (+) apabila terbentuk cincin warna merah (terbentuk indole) b. Methyle red : ditambah indikator methyle red, (+) apabila berwarna merah (terbentuk asam) c. Voges Proskauer : ditambah KOH dan naftol, (+) apabila terbentuk warna merah (terbentuk asetil methyl karbinol) d. Kosers Citrat : (+) apabila terjadi kekeruhan (bakteri tumbuh dengan memanfaatkan citrat sebagai satu-satunya sumber karbon). II. IDENTIFIKASI Salmonella dan Shigella 1. Koloni yang terbentuk Salmonella pada media SSA (koloni berwarna merah atau bening keruh dan pada bagian tengahnya berwarna hitam) dan Shigella koloni warna merah atau bening keruh dan pada bagian tengahnya tidak berwarna hitam.

Laboratorium Mikrobiologi Kesehatan

Fakultas Kedokteran dan Ilmu-ilmu Jurusan Kedokteran Unsoed-Purwokerto

2. 3. 4.

Koloni kemudian dilakukan pewarnaan gram. Apabila pengamatan menunjukkan batang gram negatif maka dilanjutkan ke uji biokimia. Koloni tersebut kemudian ditumbuhkan pada media tegak miring TSIA (goresan dan tusukan), SIMA (tusukan) dan UA (tusukan) untuk identifikasi jenis Salmonella. Inkubasi pada suhu 35 OC selama 1 x 24 jam. Amati pertumbuhan koloni dan perubahan media identifikasi. Salmonella : (1). TSIA lereng merah (alkalis), dasar kuning (asam) dan gas (+ / -), (2). SIMA : hidrogen sulfida (H2S) positif, indole (-) dan motiliti (aktif / +), (3). UA negatif (tidak terjadi perubahan warna media). Shigella : (1). TSIA lereng merah (alkalis), dasar kuning (asam) dan gas (+ / -), (2). SIMA : hidrogen sulfida (H 2S) negatif, indole (+ / -) dan motiliti (tidak motil / -) (3). UA negatif (tidak terjadi perubahan warna media).

III.IDENTIFIKASI Bacillus cereus 1. Koloni yang tersangka Bacillus kemudian dilakukan pewarnaan gram. Apabila dijumpai gram positif berbentuk batang dilanjutkan ke media uji 2. Inkubasi pada suhu 37 OC selama 1 x 24 jam 3. Dibaca dan dicatat pertumbuhan pada media uji 4. Dicocokan dengan table ciri-ciri Bacillus IV. IDENTIFIKASI Staphylococcus aureus 1. Koloni yang tersangka Staphylococcus dilakukan pewarnaan gram 2. Jika Staphylococcus gram positif, dilanjut katalase test, staphylase test, D-Nase test test, koagulase test (inkubasi 37 OC selama 24 jam) dan oksidase test. 3. Hasil pengamatan menunjukkan, uji positif : katalase test, staphylase test, D-Nase test test, koagulase test (inkubasi 37 OC selama 24 jam) dan uji negatif : oksidase test. Tabel Identifikasi Bacillus :
No. 1 2 3 4 Spesies B. antrachis B. cereus B. subtilis B. thuringensis Mo Lec Glu Lac Man Mal Suc G 6% Sta Nit AnO2 GL + + + + + + + + + + + +/+/+/++ + +/+ + + + + + + + + + + + + Keterangan : ON : oval tidak mengembang Mo : motilitas Lec : lecitinase Glu : glukosa Lac : lactose Man : manitol Mal : maltosa Suc : sukrosa G 6% : kaldu NaCl 6% Sta : starch Nit : reduksi nitrat AnO2 : pertumbuhan pada nutrient agar anaerob GL : globule lipid BS ON ON ON ON

Laboratorium Mikrobiologi Kesehatan

Fakultas Kedokteran dan Ilmu-ilmu Jurusan Kedokteran Unsoed-Purwokerto

Tabel MPN per 100 ml sampel menggunakan 3 seri tabung untuk setiap pengenceran 10 ml 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ml 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0,1 ml 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 MPN per 100 ml 3 6 9 3 6.1 9.2 12 6.2 9.3 12 16 9.4 13 16 19 3.6 7.2 11 15 7.3 11 15 19 11 15 20 24 16 20 24 29 10 ml 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 ml 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0,1 ml 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 MPN per 100 ml 9,1 14.1 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 53 23 39 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 >1100

Laboratorium Mikrobiologi Kesehatan

Fakultas Kedokteran dan Ilmu-ilmu Jurusan Kedokteran Unsoed-Purwokerto

UJI SEROLOGI
Serologi adalah telaah ilmu tentang reaksi antara antigen dengan antibodi di dalam serum. Reaksi serologi dapat digunakan sebagai : 1. Menentukan antigen atau antibodi apabila salah satu dari hal tersebut telah diketahui 2. Mengukur titer atau kadar Tes serologi berdasarkan pada terjadinya ikatan antigen antibodi. Serum penderita yang diduga mengandung suatu antibodi, direaksikan dengan antigen yang sudah diketahui jenisnya. Apabila terjadi reaksi (reaksi positif), berarti penderita sebel;umnya telah pernah terinfeksi oleh antigen tersebut. Jumlah antibodi (titer antibodi) yang terdapat di dalam serum penderita dapat dipakai sebagai dasar untuk diagnosa penyakitnya. Contoh, reaksi Widall dipakai untuk mendiagnosis penyakit typus abdominalis yang disebabkan oleh Salmonella typhi. Selain dapat dipakai untuk menentukan jenis kuman yang diasingkan dari penderita, juga dapat digunakan untuk menentukan golongan darah sebelum melakukan transfusi darah, memilih donor yang tepat pada transplantasi jaringan. Salmonella typhi mempunyai tiga macam antigen, yaitu : O antigen (somatik antigen), H antigen (flagellar antigen) dan Vi antigen (virulensi antigen) ada juga pustaka menambahkan K antigen (kapsul antigen). Pada reaksi aglutinasinya : 1. Aglutinasi O berbentuk butir-butir pasir yang tidak hilang apabila dikocok 2. Aglutinasi H berbentuk butir-butir pasir yang hilang apabila dikocok 3. Aglutinasi Vi berbentuk awan Reaksi Widall adalah reaksi serum (sero-test) untuk mengetahui ada tidaknnya antibodi terhadap Salmonella typhi, dengan jalan mereaksikan serum seseorang dengan antigen O, H, dan Vi dari laboratorium. Apabila terjadi aglutinasi, dikatakan reaksi Widall positif berarti serum orang tersebut mempunyai antibodi terhadap S. typhi, baik setelah vaksinasi, setelah sembuh dari penyakit tifus ataupun sedang menderita tifus. Reaksi Widall negatif artinya tidak memiliki antibodi terhadap S. typhi. Reaksi Widall dipakai untuk menegakkan diagnosis penyeakit tifus abdominalis. Peninggian titer aglutinin O menunjukkan adanya infeksi yang aktif, peninggian titer aglutinin H disebabkan vaksinasi dan peninggian titer aglutinin Vi menunjukkan karier. Antigen adalah zat yang dapat merangsang terbentuknya antibodi apabila dimasukkan dalam jaringan tubuh Antibodi adalah zat yang dihasilkan tubuh setelah dimasuki suatu antigen. Antibodi ini dapat berupa antibakteri, antivirus maupun antitoksin, bergantung dari antigen yang masuk. Sifat antigen : 1. selalu berupa protein yang mempunyai berat molekul lebih dari 10.000 2. tidak mudah hancur dan terurai oleh cairan-cairan tubuh (darah, limfa dan sebagainya) Sifat antibodi : 1. terdiri dari suatu zat yqang menempel pada gamma globulin 2. berada dalam keadaan larut dalam cairan badan (serum) 3. dapat direaksikan dengan antigen secara spesifik 4. dibuat dalam reticulo endothelial system (sumsum tulang, kelenjar limfa, liver) 5. antibodi bersifat thermolabil dan tidak tahan apabila kena sinar matahari, karena itu harus disimpan pada tempat yang dingin dan gelap. Sel bakteri, virus maupun toksinnya yang terdiri atas protein akan bertindak sebagai antigen apabila sehingga merangsang dibentuknya antibodi. Beberapa jenis karbohidrat dan lemak, apabila masuk dalam jaringan tubuh tidak akan bersifat antigen, tetapi apabila berikatan dengan suatu protein akan bersifat antigen, sehingga merangsang terbentuknya
Laboratorium Mikrobiologi Kesehatan Fakultas Kedokteran dan Ilmu-ilmu Jurusan Kedokteran Unsoed-Purwokerto

antibodi. Karbohidrat atau lemak yang dapat berikatan dengan protein dan bersifat antigen disebut HAPTEN. Obat-obat tertentu apabila diberikan kepada seseorang yang sensitiv, dapat merupakan hapten karena berikatan dengan protein tubuh sehingga merangsang dibentuknya antibodi. Misalnya, seseorang menjadi alergi terhadap obat sulfa atau penisilin. Istilah Reaksi Antigen dengan Antibodi Antigen Antibodi Reaksi Aglutinogen Aglutinin Aglutinasi Precipinogen Precipitin Precipitasi Sel bakteri Bakteriolysin Bakteriolisis Toksin Antitoksin Flokulasi Weil Felix (1971) menemukan bahwa antigen badan kuman (antigen O, antigen somatik) berlainan dengan antigen dari flagel (antigen H) dan hasil aglutinasinya jelas berbeda. Antibodi H, didapat dengan cara menyuntikan kuman yang masih bergerak dalam bentuk suspensi kuman hidup atau dimatikan dan antigen somatiknya dirusak dengan formalin, ke dalam tubuh binatang percobaan. Titer yang didapat biasanya tinggi karena antibodi H mempunyai afinitas tinggi terhadap flagela dan mudah menyebabkan bergerombolnya flagela. Pada manusia, titer yang tinggi menunjukkan adanya infeksi atau pernah divaksinasi, tetapi tidak ada hubungannya dengan derajat kekebalan tubuh karena antigen H tidak berhubungan dengan virulensi. Antibodi O, didapat dengan cara menyuntikan kuman yang flagelanya telah dirusak dengan mencampur alkohol dan dieram pada suhu 37 OC selama 24-36 jam. Biasanya titer yang diperoleh tidak begitu tinggi karena aglutinasi sel kuman diperlukan lebih banyak molekul antibodi. Antibodi Vi, hanya terdapat pada kuman yang baru diasingkan dan terbatas pada Salmonella typhi serta beberapa jenis salmonella lainnya dan kuman enterik non patogen. Vi, kependekan dari virulensi, pada mulanya dianggap sebagai faktor penting untuk menentukan virulensi kuman, tetapi kemudian ternyata antigen Vi tidak sepenting reaksi aglutinasi dengan serum yang mengandung antibodi O. Antigen Vi dapat dihilangkan dengan cara pembiakkan berulangkali. Tujuan Bahan Alat : Menguji secara serologi mikroba patogen yang menyebabkan penyakit : Antigen Salmonella typhi H, serum darah penderita tyfus : Objeck glass, mikropipet segala ukuran, pipet tetes

Prosedur : 1. Titer 1/80 Ambil 20 l serum (antibodi) + 40 l (1 tetes) reagen Widall (antigen S. typhi H) 2. Titer 1/160 Ambil 10 l serum (antibodi) + 40 l (1 tetes) reagen Widall (antigen S. typhi H) 3. Titer 1/320 Ambil 5 l serum (antibodi) + 40 l (1 tetes) reagen Widall (antigen S. typhi H) 4. Amati masing-masing, apabila terjadi aglutinasi maka reaksi positif, dan apabila tidak terjasi aglutinasi (tidak ada antigen Salmonella typhi H pada serum penderita) maka reaksi negatif 5. Pekerjaan diteruskan hingga reksi negatif. Untuk titernya dihitung kelipatannya.

Laboratorium Mikrobiologi Kesehatan

Fakultas Kedokteran dan Ilmu-ilmu Jurusan Kedokteran Unsoed-Purwokerto