BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bakteri berasal dari kata latin bacterium, untuk jamaknya bacteria yang artinya adalah kelompok organisme yang tidak memiliki membran inti sel. Organisme ini termasuk ke dalam domain prokariota dan berukuran sangat kecil (mikroskopik), serta memiliki peran besar dalam kehidupan di bumi. Beberapa kelompok bakteri dikenal sebagai agen penyebab infeksi dan penyakit, sedangkan kelompok lainnya dapat memberikan manfaat dibidang pangan, pengobatan, dan industri.

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung (Dwidjoseputro, 2005).

Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri yang merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro, 2005).

Bakteri umumnya tidak memiliki pigmen sehingga tidak berwarna dan hampir tidak kelihatan karena tidak kontras dengan medium dimana mereka hidup. Oleh karena itu, perlu dilakukan pewarnaan agar bakteri tampak jelas bila diamati dengan mikroskop.

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan.

Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa (Dwidjoseputro, 2005).

Pewarnaan dikelompokkan menjadi pewarnaan langsung dengan pewarnaan basa, pewarnaan tak langsung atau pewarnaan negatif dan pewarnaan gram. Pewarnaan basa adalah pewarnaan yang langsung mewarnai bakteri. Pewarnaan negatif adalah pewarnaan yang tidak langsung mewarnai bakteri, melainkan mewarnai latar belakang preparat bakteri tersebut. Pewarnaan ini dilakukan dengan menggunakan pewarna yang bersifat asam seperti tinta cina. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan umum dalam bidang bakteriologi. Dengan pewarnaan ini, kelompok bakteri dibedakan menjadi dua yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Hasil akhir dari pewarnaan gram adalah bakteri gram positif akan berwarna ungu/biru, sementara bakteri gram negatif akan berwarna merah.

Oleh karena itu

dilakukan percobaan

untuk

mengetahui teknik

pewarnaan

mikroorganisme sehingga mempermudah dalam melihat bagian-bagian bakteri.

1.2 Tujuan Percobaan

a. Mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri. b. Mengetahui fungsi dari pewarnaan bakteri. c. Mengetahui perbedaan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.

Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan asam (Dwidjoseputro.1998).

Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.

Untuk melihat struktur digunakan pewarnaan flagela, pewarnaan kapsul, pewarnaan spora, dan pewarnaan nukleus. Pewarnaan Neisser atau Albert digunakan untuk melihat granula metakromatik (volutin bodies) pada Corynebacterium diphtheriae. Untuk semua prosedur pewarnaan mikrobiologi dibutuhkan pembuatan apusan lebih dahulu sebelum melaksanakan beberapa teknik pewarnaan yang spesifik (Pelczar, 1986).

Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif (Trie, 2012).

Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan didinding sel, membran sel dan sitoplasmasewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas terlihat (Dwidjoseputro, 1998).

Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan. Zat warna asam yang bermuatan negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada struktur sel. Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk mewarnai bagian sel yang bermuatan positif, perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat warna terhadap struktur sel dapat berubah bergantung pada pH sekitarnya sewaktu proses pewarnaan (Dwidjoseputro, 1998).

Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang berumur 24 - 48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpangan hasil pewarnaan gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dindingdinding selnya. Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan lartan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan dinding sel yang rusak tidak lagi dapat memertahankan crystal violet sehingga terlihat sebagai bakteri gram negatif.

Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan ini kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak sehingga dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang sering kali dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat terutama bila suspensi tersebut berasal adari bukan media padat. Sebaliknya pada suatu suspensi bakteri bila terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada preparatnya.

Untuk pewarnaan yang mengamati morfologi sel mikroorganisme maka seringkali setelah pembuatan preparat ulas dilakukan fiksasi diikuti oleh pewarnaan. Fiksasi dapat dilakukan dengan cara melewatkan preparat diatas api atau merendamnya dengan metanol. Fiksasi digunakan untuk: 1. Mengamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah diwarnai 2. Melekatkan bakteri pada glass objek 3. Mematikan bakteri

Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut : 1. Pewarnaan sederhana Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya

bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen dan ungu kristal. 2. Pewarnaan differensial a. Pewarnaan gram Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Dengan metode pewarnaan gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteri-bakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat berlemak didalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau gram. b. Pewarnaan Tahan Asam Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi zat warna khusus misalnya karbol-fukhsin melalui proses pemanasan, maka akan menyerap zat warna dan akan tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun seperti asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA). Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk

mendiagnosa keberadaan bakteri penyebab tuberkulosis yaitu Mycobacterium tuberculosis . 3. Pewarnaan khusus a. Pewarnaan Spora Spora bakteri tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunakan. Spora bakteri sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan spora, perlu dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau bisa masuk ke dalam spora, seperti halnya pada pewarnaan Basil Tahan Asam dimana cat karbol-fukhsin harus dipanaskan untuk bisa menembus lapisan lilin asam Mycolic dari Mycobacterium. b. Pewarnaan flagel Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel. c. Pewarnaan kapsul Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang yang berwana biru gelap. 4. Pewarnaan negatif Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan tinta cina. Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti tinta cina. Pewarna asam memiliki negative charge kromogen, tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan bakteri. Oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna. (Kesuma, 2013).

BAB III METODOLOGI PERCOBAAN

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Senin tanggal 29 April 2013 pukul 16.00 18.30 WITA di Laboratorium Rekayasa Lingkungan bertempat di Fakultas Teknik Universitas Mulawarman Samarinda.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat-alat 1. Pipet tetes 2. Jarum ose 3. Lampu bunsen 4. Cawan petri 5. Object glass 6. Mikroskop 7. Tabung reaksi 8. Gelas kimia 1000 ml 9. Botol semprot 10. Cover glass 11. Rak tabung reaksi 12. Botol semprot 13. Botol spray 14. Korek api 15. Sarung tangan 16. Masker

3.2.2 Bahan-bahan 1. Sabun cuci 2. Larutan zat warna crystal violet 3. Larutan zat warna tinta cina 4. Alkohol 5. Larutan lugol 6. Larutan zat warna safranin 7. Larutan malachite green 8. Aquades 9. Bakteri E. coli 10. Tisu 11. Kertas saring

3.3 Cara Kerja

3.3.1 Pewarnaan sederhana 1. Dibersihkan object glass dengan menggunakan alkohol sampai bebas lemak, lalu dibersihkan lagi dengan tisu. 2. Difiksasi diatas nyala lampu bunsen. 3. Diambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri dan diratakan diatas kaca preparat. 4. Dikeringkan kaca preparat dengan diangin-anginkan hingga terbentuk noda. 5. Difiksasi dengan dipanaskan diatas nyala lampu bunsen. 6. Didinginkan lalu diteteskan larutan zat warna crystal violet sebanyak 1 atau 2 tetes, dan dibiarkan selama 1 atau 2 menit. 7. Dicuci dengan aquades sampai sisa-sisa zat warna tercuci seluruhnya. 8. Dikeringkan dengan diangin-anginkan. 9. Diamati dengan menggunakan mikroskop. 10. Digambar bentuk bakteri.

3.3.2 Pewarnaan negatif 1 Dibersihkan object glass dengan menggunakan alkohol sampai bebas lemak, lalu dibersihkan lagi dengan tisu.

2 Difiksasi diatas nyala lampu bunsen. 3 Diambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri dan diratakan diatas object glass. 4 Difiksasi dengan cara dipanaskan diatas nyala lampu bunsen. 5 Diteteskan larutan zat warna tinta cina diatas object glass hingga merata. 6. Dikeringkan dengan diangin-anginkan. 7. Diamati dengan menggunakan mikroskop. 8. Digambar bentuk bakteri.

3.3.3 Pewarnaan gram 1 Dibersihkan object glass dengan menggunakan alkohol sampai bebas lemak, lalu dibersihkan lagi dengan tisu. 2 Difiksasi diatas nyala lampu bunsen. 3 Diambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri dan diratakan diatas object glass. 4 Dikeringkan object glass dengan diangin-anginkan hingga terbentuk noda. 5 Difiksasi dengan dipanaskan diatas lampu bunsen. 6 Didinginkan, lalu diteteskan zat warna crystal violet sebanyak 2 atau 3 tetes dan dibiarkan selama 1 menit. 7 Dicuci dengan aquades sampai sisa-sisa zat warna tercuci seluruhnya. 8 Dikeringkan dengan cara diangin-anginkan. 9 Diteteskan larutan lugol dan dibiarkan selama 1 menit. 10 Dicuci dengan aquades dan dikeringkan dengan diangin-anginkan. 11 Dicuci dengan alkohol selama 30 detik. 12 Diteteskan larutan zat warna safranin sebanyak 2 atau 3 tetes. 13 Dicuci dengan aquades. 14 Diamati dengan menggunakan mikroskop. 15 Digambar bentuk bakteri.

3.3.4 Perwarnaan spora 1 Dibersihkan object glass dengan menggunakan alkohol sampai bebas lemak, lalu dibersihkan lagi dengan tisu. 2 Difiksasi diatas nyala lampu bunsen. 3 Diambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri dan diratakan diatas object glass.

4 Dikeringkan object glass dengan diangin-anginkan hingga terbentuk noda. 5 Ditutup object glass dengan kertas saring. 6 Diteteskan malachite green sebanyak 2 atau 3 tetes. 7 Dilewatkan diatas api lampu bunsen hingga terlihat uap, jangan sampai zat warna mendidih dan mengering. 8 Didiamkan 1 menit lalu dibuang kertas saring. 9 Dicuci dengan aquades dan dibiarkan selam 30 detik. 10 Diteteskan safranin dan dibiarkan selama 30 detik. 11 Difiksasi tanpa dipanaskan. 12 Diamati dengan menggunakan mikroskop. 13 Digambar bentuk bakteri.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

Tabel Hasil Pengamatan Bakteri Yang Terbentuk

No 1.

Gambar Pewarnaan Sederhana 1. Bakteri

Keterangan

Bentuk: basil (tongkat) Warna: ungu Perbesaran okuler: 10x Perbesaran objektif: 40x Perbesaran total: 400

2.

Pewarnaan Negatif

1. Bakteri Bentuk: coccus (bulat) Warna: transparan Perbesaran okuler: 10x Perbesaran objektif: 40x Perbesaran total: 400

3.

Pewarnaan Gram

1. Bakteri Bentuk: spirillum Warna: merah Perbesaran okuler: 10x Perbesaran objektif: 40x Perbesaran total: 400

4.

Pewarnaan Spora

1. Spora bakteri Warna: merah Perbesaran okuler: 10x Perbesaran objektif: 40x Perbesaran total: 400

4.2 Pembahasan
Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya. Pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pada umumnya antara lain kristal violet, metylen blue, karbol, fuchsin, dan safranin (Trie, 2012).

Pewarnaan negatif yaitu pewarnaan yang ditujukan terhadap bakteri yang sulit diwarnai, dimana bakterinya tidak diwarnai melainkan latar belakangnya, metode pewarnaan negatif merupakan suatu metode perwarnaan umum, dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap kedalam sel-sel bakteri melainkan melatarbelakangi sehingga kelihatan atau nampak sebagai bentuk-bentuk kosong tak berwarna atau negatif (Trie, 2012).

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokan bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna

crystal violet dan akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna air fukhsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara lain crystal violet, alkohol, safranin, dan iodine (Trie, 2012). Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malachite green dan safranin, yang dalam hasil pewarnaannya akan muncul warna hijau pada sporanya (Trie, 2012).

Prinsip pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut yang merupakan suatu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum (Trie, 2012).

Prinsip pewarnaan negatif yaitu suatu metode pewarnaan tidak langsung dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap kedalam sel bakteri melainkan ke dalam latar belakangnya (Trie, 2012).

Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri, sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pencuci (Trie, 2012).

Prinsip pewarnaan spora yaitu suatu metode pewarnaan yang menggunakan malachite green dan safranin, yang dalam hasilnya pewarnaan akan muncul warna hijau pada sporanya dan warna merah pada sel vegetatifnya (Trie, 2012).

Crystal violet adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini digunakan sebagai histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri. Crystal violet memiliki sifat-sifat anti bakteri, jamur dan obat cacing. Crystal violet dipakai sebagai zat warna primer dikarenakan mampu melekatkan bakteri pada kaca dan mencegah autolisis pada sel, membuat sel-sel lebih kuat atau keras, mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel, mempertinggi sifat reaktif gugusan-gugusan, membunuh bakteri secara

cepat dengan tidak mengubah bentuk dan strukturnya, dan mengubah afinitas cat (Trie, 2012).

Nigrosin (tinta cina) adalah campuran dari pewarna sintesis hitam yang dibuat dengan memanaskan campuran nitrobenzena, anilin, dan hidroklorida. Industri utamanya adalah sebagai pewarna untuk pernis, dan tinta penanda pena. Didalam biologi, nigrosin digunakan untuk pewarnaan negatif bakteri. Bentuk dan organisme yang terlihat

sebagai warna bebas menguraikan terhadap latar belakang gelap. Keuntungan dari menggunakan metode ini daripada noda positif biasa seperti fuchsin, metilen blue, atau carbol, ialah bahwa fiksasi sebelumnya oleh panas atau alkohol tidak diperlukan sehingga organisme terlihat. Selain itu pewarnaan negatif dengan nigrosin dapat mengungkapkan beberapa mikroorganisme yang tidak dapat diwarnai dengan metode biasa (Trie, 2012). Lugols iodide, juga dikenal sebagai solusi lugol, merupakan solusi dari iodium dan iodida dalam air. Larutan yodium lugol digunakan sebagai antiseptik dan desinfektan, dan untuk desinfikasi darurat air minum, dan pewarnaan dan tes medis. Fungsi larutan lugol, yaitu meningkatkan aktifitas peningkatan zat warna oleh bakteri, untuk memperjelas zat warna, dan mempersulit kelarutan zat warna (Trie, 2012). Safranin adalah pewarna biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi. Safranin digunakan sebagai counterstain dalam beberapa protokol pewarnaan. Mewarnai seluruh inti sel darah merah. Hal ini juga dapat digunakan untuk deteksi tulang rawan. Safranin biasanya memilki struktur kimia, juga trimetil safranin kedua senyawa berperilaku dasarnya identik dan aplikasi pewarnaan biologi dan kebanyakan prosedur safranin tidak membedakan diantara keduanya. Persiapan safranin komersial sering mengandung campuran dari kedua jenis. Safranin juga digunakan sebagai indikator redoks dalam kimia analitik. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, memberikan warna pada mikroorganisme non target (Trie, 2012). Alkohol yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan

terjadinya dua kemungkinan yaitu, mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu, bakteri menjadi tidak berwarna (Kesuma, 2013).

Pewarnaan malachite green adalah pewarnaan yang biasanya digunakan untuk melihat bakteri batang pembentuk spora. Untuk membuat larutan malachite green dapat digunakan bahan kimia dari malachite green oxalate (Kesuma, 2013).

Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna ungu setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak (Kesuma, 2013).

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25 50 nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogannya tipis (1 - 3 nm). Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar. Jadi bahan zat warna yang di pakai dalam pewarnaan gram, yaitu kristal violet, larutan iodin, alkohol 90%, dan larutan safranin. Sifat bakteri terhadap pewarnaan gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. (Kesuma, 2013).

Tabel Perbedaan Bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif

Sifat Komposisi dinding sel

Gram positif Kandungan

Gram Negatif

lipid Lipid tinggi

rendah Ketahanan terhadap penisilin Penghambatan warna basa Kebutuhan nutrien Ketahanan terhadap perlakuan fisik Lebih sensitif Lebih dihambat Kompleks Lebih tahan Lebih tahan Kurang dihambat Relatif sederhana Kurang tahan

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu: 1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer. 2. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11 - 22%), peptidoglikan terdapat didalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat. 3. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin. 4. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet. 5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana. 6. Tidak resisten terhadap gangguan fisik. 7. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat.

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu: 1. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15 - 80 nm, berlapis tunggal atau monolayer. 2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1 - 4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat. 3. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin. 4. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal. 5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit. 6. Lebih resisten terhadap gangguan fisik. 7. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut. (Kesuma, 2013).

Mikroskop adalah alat yang di gunakan untuk melihat, atau mengenali benda-benda renik yang terlihat kecil menjadi lebih besar dari aslinya.

Gambar 4.2 Mikroskop

Berikut adalah bagian-bagian mikroskop beserta fungsinya:

1. Lensa okuler, yaitu lensa yang dekat dengan mata pengamat lensa ini berfungsi

untuk membentuk bayangan maya, tegak, dan diperbesar dari lensa objektif.
2. Lensa objektif, lensa ini berada dekat pada objek yang diamati, lensa ini

membentuk bayangan nyata, terbalik, dan diperbesar. Dimana lensa ini diatur oleh revolver untuk menentukan perbesaran lensa objektif.
3. Tabung mikroskop, tabung ini berfungsi untuk mengatur fokus dan menghubungan

lensa objektif dengan lensa okuler.

4. Pemutar kasar (Makrometer), makrometer berfungsi untuk menaik turunkan tabung

mikroskop secara cepat.

5. Pemutar halus (Mikrometer), pengatur ini berfungsi untuk menaikkan dan

menurunkan mikroskop secara lambat, dan bentuknya lebih kecil daripada makrometer.
6. Revolver, revolver berfungsi untuk mengatur perbesaran lensa objektif dengan cara

memutarnya.
7. Reflektor, terdiri dari dua jenis cermin yaitu cermin datar dan cermin cekung.

Reflektor ini berfungsi untuk memantulkan cahaya dari cermin kemeja objek melalui lubang yang terdapat dimeja objek dan menuju mata pengamat. Cermin datar digunakan ketika cahaya yang dibutuhkan terpenuhi, sedangkan jika kurang

cahaya maka menggunakan cermin cekung karena berfungsi untuk mengumpulkan cahaya.
8. Diafragma, berfungsi untuk mengatur banyak sedikitnya cahaya yang masuk. 9. Kondesor, kondensor berfungsi untuk mengumpulkan cahaya yang masuk, alat ini

dapat putar dan di naik turunkan.

10. Meja mikroskop, berfungsi sebagai tempat meletakkan objek yang akan diamati. 11. Penjepit kaca, penjepit ini berfungsi untuk menjepit kaca yang melapisi objek agar

tidak mudah bergeser.

12. Lengan mikroskop, berfungsi sebagai pegangang pada mikroskop. 13. Kaki mikroskop, berfungsi untuk menyangga atau menopang mikroskop. 14. Pengatur sudut, untuk mengatur sudut atau tegaknya mikroskop.

(Indriani, 2010).

Pada percobaan kali ini dilakukan beberapa jenis pewarnaan yaitu, pewarnaan sederhana, pewarnaan negatif, pewarnaan gram, dan pewarnaan spora. Langkah pertama adalah membersihkan object glass dengan alkohol agar bebas dari mikroba pengganggu, lalu dibersihkan dengan aquades agar alkohol tidak menggangu proses pewarnaan nantinya. Selanjutnya difiksasi, fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik dengan menggunakan grutaldehid dengan proses pembakaran. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya.

Pada pewarnaan sederhana digunakan zat warna crystal violet. Dari percobaan yang dilakukan pada pewarnaan sederhana didapatkan bakteri dengan bentuk basil dengan menggunakan perbesaran 400. Pada pewarnaan negatif digunakan zat warna tinta cina. Dari percobaan yang dilakukan pada pewarnaan negatif didapatkan bakteri dengan bentuk coccus yang tampak transparan dengan menggunakan perbesaran 400. Pada pewarnaan gram digunakan dua zat warna yaitu crystal violet dan safranin. Crystal violet ini merupakan zat warna utama dalam pewarnaan gram, dan safranin merupakan zat warna kedua karena safranin digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan zat warna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Sedangkan lugol digunakan untuk mengintensifkan warna utama atau warna dari crystal violet. Dan

alkohol yang merupakan larutan pencuci digunakan untuk melunturkan zat warna utama. Pada perwarnaan spora digunakan zat warna malachite green karena spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa. Untuk pewarnaan endospora, perlu dilakukan pemanasan supaya zat warna malachite green bisa masuk ke dalam spora. Untuk itulah dilakukan pemanasan diatas api bunsen dengan ditutup dengan kertas saring hingga terlihat uap. Pemanasan ini agar pori-pori bakteri membesar sehingga zat warna malachite green dapat masuk dan dengan pencucian pori-pori kembali mengecil menyebabkan zat warna malachite green tidak dapat dilepas walaupun dilunturkan dengan alkohol, sedangkan pada badan bakteri zat warna dilepaskan dan mengambil warna merah dari safranin. Pada percobaan ini didapatkan spora yang seharusnya berwarna hijau, tetapi pada hasil pengamatan yang terlihat hanya warna merah dari safranin.

Beberapa faktor kesalahan pada praktikum antara lain pemberian zat warna yang berlebihan sehingga sel bakteri tidak nampak, kurang maksimalnya dalam proses fiksasi sehingga masih ada bakteri yang belum mati, dan faktor yang lain adalah pada proses pencucian terlalu deras dalam membilas zat warna dengan air sehingga dapat menyebabkan bakteri larut terbawa air.

BAB V PENUTUP

5.1 Kesimpulan

a. Pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan warna,

substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup.
b. Fungsi dari pewarnaan bakteri adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk

bakteri, mengamati struktur dalam dan luar bakteri, dan reaksi terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia bakteri dapat diketahui. c. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna ungu setelah dicuci dengan alkohol pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna ungu setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak.

5.2 Saran

Sebaiknya untuk praktikum selanjutnya dilakukan jenis-jenis pewarnaan yang lebih beragam, misalnya pewarnaan tahan asam dan pewarnaan flagel.

DAFTAR PUSTAKA

1. Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang. Djambatan. 2. Indriani, Sulistya. 2010. Bagian-Bagian Mikroskop dan Fungsinya.

http://sulistyaindriani.wordpress.com/2010/07/12/bagian-bagian-mikroskop-danfungsinya.html, diakses pada tanggal 30 April pukul 20.15 WITA. 3. Kesuma, Widi Indra. 2013. Praktikum Mikrobiologi Pewarnaan Bakteri. http://widiindrakesuma.blogspot.com/2013/03/praktikum-mikrobiologipewarnaan-bakteri.html, diakses pada tanggal 30 April 2013 pukul 19.23 WITA. 4. Pelczar, Michael. 1986. Dasar Dasar Mikrobiologi. Jakata. U dan D. 5. Trie, Ita. 2012. Laporan Mikrobiologi Pewarnaan Bakteri.

http://itatrie.blogspot.com/2012/10/laporan-mikrobiologi-pewarnaan.html, diakses tanggal 24 April 2013 pukul 16.53 WITA.