LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UMUM PEWARNAAN SEL (BAKTERI DAN JAMUR) DAN PEWARNAAN ENDOSPORA

KELOMPOK I Ahmad Soni 0810910002

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2010

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Selain itu bakteri yang hidup akan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Sedangkan, untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitianpenelitian mikrobiologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu, bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan merah sedangkan yang positif berwarna ungu (Levine, 2000). Praktikum persiapan pembuatan apusan dan teknik pewarnaan gram sangat penting dilakukan karena untuk pengamatan biakan dari koloni mikroba dan biakan jamur dapat dilakukan dengan mudah dan baik. Pewarnaan ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospora yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Pelczar dan Chan, 2007).

2 Tujuan Tujuan dilakukannya praktikum mengenai pewarnaan sel (bakteri dan jamur) dan pewarnaan endospora ini antara lain : 1) Mempelajari teknik pembuatan sediaan apusan (preparat) 2) Mempelajari proses pewarnaan struktur sel bakteri 3) Mempelajari bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri 4) Memahami tersebut 5) Mempelajari proses pewarnaan struktur sel jamur (kapang) 6) Mempelajari bentuk-bentuk dan struktur sel jamur (kapang) 7) Memahami tersebut 1. pentingnya setiap langkah dalam prosedur pewarnaan dan memahami reaksi kimiawi di dalam prosedur pentingnya setiap langkah dalam prosedur pewarnaan dan memahami reaksi kimiawi di dalam prosedur .1.3 Manfaat Manfaat yang diperoleh setelah mengikuti praktikum mengenai pewarnaan sel bakteri dan pewarnaan endospora ini adalah praktikan akan mempunyai keterampilan dan keahlian dalam hal pewarnaan sel bakteri dan pewarnaan endospora yang banyak dilakukan dalam laboratorium-laboratorium mikrobiologi dengan metode yang disesuaikan dengan alat dan biaya yang ada.

2007). sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. 2007). bentuk. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran. Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop. susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. atau spiral (heliks) (Pelczar & Chan. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif.BAB II TINJAUAN PUSTAKA Bakteri merupakan organisme prokariot. Sel sel individu bakteri dapat berbentuk seperti bola/elips. pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. batang (silindris). serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. Bentuk bakteri bermacam – macam yaitu elips. Sel bakteri memiliki panjang yang beragam. Umumnya ukuran bakteri sangat kecil.3 µm.1 sampai 0. bulat. 2004). atau olesan. Pemberian warna pada bakteri atau jasad. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola. dinamakan pewarnaan sederhana. menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna. . batang dan spiral. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1. memperjelas ukuran dan bentuk bakteri. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana.jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis. Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna.000 X atau lebih (Waluyo. yang sudah difiksasi.

pewarnaan diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. SO4-. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Jadi. netral red. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. peluntur warna. Terdapat tiga mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana. . jika bakteri itu diwarnai. dan lainlain. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi. Sebaliknya zat pewarna asam ditolak oleh muatan negatif bakteri menyeluruh. maka disebut zat warna basa. intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo. muatan negatif dalam asam nukleat bakteri akan bereaksi dengan ion positif zat pewarna basa. safranin dan metilin blue adalah beberapa zat pewarna basa yang biasa digunakan. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-. warna terdapat pada ion positif (zat pewarna+ Cl-) dan pada pewarna asam. 1993). warna akan terdapat pada ion negatif (zat pewarna. Pewarnaan gram merupakan metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Umsl. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif. 2008). Hubungan antara bakteri dengan zat pewarna basa yang menonjol disebabkan terutama oleh adanya asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. maka disebut zat warna asam. Jika warna terdapat pada ion negatif. Kristal violet. safranin. pewarnaan diferensial dan pewarnaan gram. CH3COO-. Jadi. Pada zat warna yang bersifat basa. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal. mewarnai bakteri dengan zat pewarna asam akan menghasilkan hanya pewarnaan pada daerah latar belakang saja. Contoh zat warna basa adalah methylen blue. substrat. COOHCOO?. Karena sel bakteri tak berwarna di atas latar belakang yang berwarna (Volk & Wheeler.Na+). 1991). salah satu di antaranya berwarna.Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa.

dll. Klebesiella. Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian kristal violet. dan karakteristik bakteri. yang akan memudahkan untuk identifikasi. yaitu bakteri gram positif . setelah 1 menit dibilas dan kemudian akan diberikan pewarna yodium. Bacillus. Beberapa bakteri akan melepaskan zat pewarna dengan mudah apabila dicuci dan beberapa bakteri yang lain zat pewarna akan bertahan walaupun dicuci dengan alkohol 95%. Bakteri gram positif akan terwarna ungu (kristal violet) dan bakteri gram negatif akan terwarna merah (safranin) (Umsl. Corynebacterium Sedangkan dhypteriae. kemudian dibilas dan diberi pewarna safranin atau bismarck (untuk buta warna merah) selama 1 menit. Setelah di tambahkan safranin. struktur. Zat pewarna kristal violet dan yodium akan membentuk senyawa yang kompleks. Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan Gram dan Ziehl‐Nelsen. 2008). dll (Cappuccino & Sherman. Contoh bakteri Gram negative adalah Neisseria. Clostridia.Pewarnaan gram ditemukan pada tahun 1884 oleh seorang dokter kebangsaan Denmark Christian Gram (membuat zat pewarna khusus) pewarna tersebut merupakan pewarna differensial karena dapat membagi bakteri menjadi dua kelompok fisiologi. Gram Peptococcus. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi. Prosedur pertama dari pewarnaan gram ini adalah memberi pewarna kristal violet. Stapilococcus. bakteri terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian safranin akan memberikan warna merah pada bakteri Gram negatif. Hemophillus. Proses pewarnaan gram ini memerlukan 4 jenis reagen. Shigella. negatif akan Peptostreptococcus. Vellonella. Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi penyakit infeksi. Bakteri Gram positif membentuk kompleks Kristal iodine yang berwarna biru. 1983). Salmonella. Contoh bakteri Gram positif adalah Streptococcus. setelah satu menit dibilas dan kemudian akan diberi laputan alkohol 95% selama 30 detik. setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri akan berwarna biru. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini. Setelah itu ditambah alkohol. bakteri Gram positif akan berwarna ungu.

jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Pewarnaan ZN digunakan untuk mengidentifikasi infeksi yang disebabkan oleh bakteri tahan asam. Aquades). Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi pada dinding sel bakteri Gram negatif. Reagen terakhir adalah warna pembanding. Reagen pertama disebut warna dasar. bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat. Nocardia. Alcohol). Sedangkan bakteri Gram positif akan mengalami denaturasi selama pemberian alcohol. Gordonia / . Rhodococcus. bila komponen dinding sel kuat mengikat warna. Mycobacterium atypical seperti Mycobacterium avium intraseluler / Mycobacterium avium complex yang tumbuh pada 41C yang menyerang sistem imun. berupa pewarna basa. Legionella mycdatci. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Sehingga jika lipid dilarutkan dalam pemberian alcohol. Alcohol. Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel. Gram B (cokelat) (Iodium. yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar. maka pori‐pori akan membesar dan tidak mengikat pewarna. Gram C (Aseton. Sedangkan bakteri Gram negatif hanya memiliki 1‐2 lapisan peptidoglikan sehingga memiliki permeabilitas dinding sel yang lebih besar. Aquades). alkohol dan safranin (Tracy. Tsukamurella. Hal ini menyebabkan bakteri menjadi tidak berwarna. maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat mengikat warna dasar. Pewarnaan Gram terdiri atas Gram A (violet) (Kristal violet. Kalium iodide. Gram D (merah) (Safranin. maka warna akan tercuci. Ammonium oksalat. conttohnya adalah Micobacteriom tuberculosis.dan bakteri gram negatif. Aquades). Micobacterium leprae. Aalkohol. Larutan yang biasa dipakai adalah ungu kristal. Hal ini akan mengecilkan pori‐pori sehingga menghasilkan kompleks kristal iodium. Mycobacterium marinum dan Mycobacterium ulcerans yang tumbuh pada 31C dan menginfeksi kulit. lartan iodium. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang kuat dan lapisan peptidoglikan sebanyak 30 lapisan sehingga permeabilitas dinding selnya menjadi berkurang. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. 2005).

arabinogalaktan. Hasilnya berwarna merah. Contoh bakteri than asam yang tidak cocok pada pewarnaan ZN tetapi cocok pada Kinyoun adalah Nycordia. Pewarnaan ZN terdiri dari ZN‐ A (merah) (Basic fusion. Isospora. Asam mikolat merupakan asam lemak ranai panjang yang terdiri atas 34‐90 karbon. 2009) . Cyclospora. pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri (pewarnaan Neisser (granula volutin). Sarcocytis. dan Gordonia. dan ZN ‐C (biru) (Methylen blue. Bakteri tahan asam Bakteri tahan asam baru akan terkarakterisasi setelah pewarnaan setelah pemberian asam‐ alkohol. Etil alcohol).1 Pewarnaan Sederhana (Gozali. Hasil pewarnaan ZN akan mengidentifikasikan : 1. pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel. pewarnaan spora. pewarnaan yodium (granula glikogen) dan pewarnaan negatif (Gozali. pewarnaan kapsul. pewarnaan differensial (pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam). 2009) Gambar 2. Sifat tahan asam pada bakteri tahan asam disebabkan karena dinding selnya terdiri atas peptidoglikan. Fenol. Bakteri tidak tahan asam Hasilnya adalah berwarna biru karena dekolorisasi pada pewarnaan pertama oleh asam‐alkohol. Aquades) (Madigan.Gordona. Tsukamurella. Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut: pewarnaan sederhana. 2. dan lipid (50%‐ nya tersusun atas asam mikolat). Aquades). Rhodococcus. jadi perlu diberi pewarnaan kedua berupa counter stain. Alcohol. dll. ZN‐B (tidak berwarna) (HCl. 2003). Cryptosporidium.

Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia. metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. 1990) . maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. 1990) Gambar 2.Pewarnaan negatif. Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina (Hadiotomo.2 Pewarnaan Negatif (Hadiotomo.

Setelah perlakuan malachite green. tetapi sekali diwarnai. Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya. Endospora merupakan struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri. maka endospra berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop. 2009).3 Pewarnaan Gram (Jason. Bakteri yang menghasilkan spora pada umumnya tahan terhadap pewarnaan. sedangkan bakteri yang tidak memiliki spora dan hanya memiliki sel vegetatif tidak tahan terhadap pewarnaan (Partic. pemanasan dan keadaan asam. Karena kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan dengan sel vegetatifnya. Endospora merupakan struktur yang tahan terhadap keadaan lingkungan yang ekstrim misalnya kering.Gambar 2. Larutan ini merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan spora secara umum. sehingga harus menggunakan pewarnaan spesifik. 2008). endospora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses pemanasan. Teknik ini akan . Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora. Struktur endospora sangat bervariasi pada setiap spesies. zat warna tersebut akan sulit hilang. Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarnaan biasa. biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin.

Kondisi yang terus memburuk membuat endospora dibebaskan dari degenerasi sel vegetatif dan menjadi sel independen yang disebut spora yang diakibatkan komposisi lapisan kimia spora bersifat tahan terhadap efek-efek merusak. Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarnapewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofil (suka akan basa). misalnya malachite green. Untuk pewarnaan selanjutnya. dan agent kimia lainnya sehingga diperlukan pewarnaan khusus secara mikrobiologi dan ketika kondisi lingkungan kembali normal. Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromofornya bersifat positif). pengeringan. 1992). Bakteri . radiasi. Bakteri penghasil spora tahan terhadap pewarnaan. setelah diwarnai oleh suatu warna. Disebut demikian karena hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme. Sporogenesis dan germinasi tidak dimaksudkan untuk reproduksi tetapi hanya mekanisme yang menjamin ketahanan sel dibawah kondisi lingkungan (Suriawiria. spora bebas kembali untuk aktif secara metabolik dan sel vegetatif berkurang resisten melalui germinasi. Pewarnaan sederhana. basillus. 2005). misalnya pemanasan berkelebihan. sehingga harus digunakan pewarna spesifik dan yang biasa digunakan adalah malachite green. Karena kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan dengan sel vegetatifnya. akan mengikat kuat senyawa pewarna. merupakan pewarna yang paling umum digunakan. pembekuan. vibrio. 1990). Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarna biasa. Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacammacam tipe morfologi (coccus. Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri. cat tersebut (misalnya safranin) sel spora tidak dapat menerimanya karena sudah terikat dengan cat pertama. maka endospora berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop.menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya (Fardiaz. dsb) dari bahan-bahan lainnya yang ada pasa olesan yang diwarnai (Hadiotomo. Akhirnya warna bakteri spora adalah hijau. Oleh karena itu.

Setelah pewarnaan selanjutnya dengan safranin. Oleh karena itu. Saat diwarnai oleh malachite. 1994). sel vegetatif dapat mengikat warna tetapi dapat luntur setelah dilunturkan karena ikatannya tidak kuat. sel vegetatif mudah mengikat warna kembali.yang tidak berspora cenderung tidak tahan pengecatan karena hanya memiliki sel vegetatif. hasil pewarnaan akhir adalah merah muda dari safranin (Assani. .

Universitas Brawijaya. Preparat apusan siap diwarnai dan diamati.1 Waktu dan Tempat Praktikum mengenai “Pewarnaan Sel (Bakteri dan Jamur) dan Pewarnaan Endospora” dilaksanakan pada hari Kamis 15 April 2010 pada pukul 13. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Kemudian preparat siap diamati dibawah mikroskop .35 WIB. Jurusan Biologi.1 Pembuatan Apusan Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70%. apusan digenangi dengan cat gram D selama 1 menit. Setelah kering. Setelah kering.2 Cara Kerja 3. apusan ditetesi dengan cat gram C selama 30 detik. Kemudian di fiksasi secukupnya hingga kering. Malang.2 Teknik Pewarnaan Gram Apusan dicat dan digenangi dengan cat gram A selama 1 menit. Setelah kering.BAB III METODE PRAKTIKUM 3. 3. kemudian bakteri hasil isolasi diambil menggunakan jarum ose sebanyak satu kali pengambilan yang telah di tehnik aseptis dan diletakkan di atas kaca obyek yang telah terdapat aquades steril sebanyak satu kali yang pengambilannya dengan jarum ose. cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. 3. sisa cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan.2.2. bertempat di Laboratorium Mikrobiologi.00 – 16. apusan digenangi dengan cat gram B selama 1 menit. cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan.

3. selanjutnya preparat di cuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan.2. endospora akan tampak berwarna hijau dan sel vegetatif akan tampak berwarna merah. Kemudian di fiksasi secukupnya hingga kering. Preparat ditiriskan dengan kertas saring dan diamati di bawah mikroskop. . kemudian bakteri yang akan dikonfirmasi diambil sebanyak satu ose dan diletakkan pada gelas obyek yang telah terdapat larutan KOH sebanyak satu jarum ose. Setelah itu dinginkan preparat sebentar.4 Pewarnaan Endospora Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70%. Selanjutnya gelas obyek dipanaskan di atas air mendidih dengan menutup preparat dengan kertas saring dan ditetesi dengan malakit hijau selama 10 menit. di cuci dengan air mengalir. Kemudian genangi preparat dengan pewarna safranin selama 1 menit.2.3. kemudian B.3 Konfirmasi Hasil Cat Gram Dengan KOH Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70%. Kemudian campurkan dengan mengaduknya. kemudian jarum ose diangkat beberapa sentimeter untuk mengetahui apakah cairan berlendir atau tidak. subtilis diambil menggunakan jarum ose sebanyak satu kali pengambilan yang telah di tehnik aseptis dan diletakkan di atas kaca obyek yang telah terdapat aquades steril sebanyak satu kali pengambilan dengan jarum ose.

2003). agar tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat pembuatatn apusan dan diletakkan di atas kaca obyek yang telah terdapat aquades steril sebanyak satu kali pengambilan dengan jarum ose. apabila preparat bakteri merupakan gram negative. sisa cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. apusan digenangi dengan cat gram D selama 1 menit.1. agar bakteri yang akan digunakan mati namun organ dan struktur tidak rusak (Madigan.1 Analisa Prosedur 4. maka preparat akan berwarna bening. apusan digenangi dengan cat gram B selama 1 menit. agar pewarna sebelumnya tidak bercampur dengan pewarna yang lain yang akan digunakan (Umsl. Setelah kering. kemudian bakteri hasil isolasi diambil menggunakan jarum ose sebanyak satu kali pengambilan yang telah di tehnik aseptis. 2008).BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4. sedangkan bakteri gram positif akan berwarna ungu. Cat gram C akan melarutkan warna sebelumnya. cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan.2 Teknik Pewarnaan Gram Apusan dicat dan digenangi dengan cat gram A selama 1 menit. Setelah kering. cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Kemudian preparat siap diamati dibawah mikroskop. Cat gram B akan menguatkan ikatan antara pewarna dengan dinding sel bakteri. . Kemudian di fiksasi secukupnya hingga kering.1. 4. Bakteri gram negative akan berwarna kemerahan.1 Pembuatan Apusan Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70% agar tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat pembuatatn apusan. apusan ditetesi dengan cat gram C selama 30 detik. Setelah kering. cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan.

1.4. konfirmasi dilakukan untuk memastikan bakteri tersebut gram negatif atau positif. agar bakteri yang akan digunakan mati namun organ dan struktur tidak rusak. kemudian B. Setelah itu dinginkan preparat sebentar. Selanjutnya apusan bakteri dengan pewarna malakit hijau. masuknya pewarna dalam endospora di bantu dengan.1. gelas obyek dipanaskan dengan diletakkan pada ram kawat di atas air mendidih hingga timbul uap air dengan menutup preparat dengan kertas saring dan ditetesi dengan malakit hijau agar endospora yang berkembang dapat terwarna hijau dan agar endospora tidak mati (menjaga agar tetap lembab (tidak kekeringan)) selama 10 menit. Kemudian campurkan dengan mengaduknya. 2008). di cuci dengan air mengalir agar endospora dapat terwarna dengan baik. Jika cairan tersebut berlendir maka bakteri tersebut merupakan bakteri gram negatif dan jika cairan tersebut tidak berlendir maka bakteri tersebut bakteri gram positif (Umsl. selanjutnya preparat di cuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. 4. Kemudian di fiksasi secukupnya hingga kering.3 Konfirmasi Hasil Cat Gram Dengan KOH 3% Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70% agar tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat perlakuan. agar endospora dapat berkembang (memudahkan pengamatan).4 Pewarnaan Endospora Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70% agar tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat perlakuan. kemudian jarum ose diangkat beberapa sentimeter untuk mengetahui apakah cairan berlendir atau tidak. . subtilis diambil menggunakan jarum ose sebanyak satu kali pengambilan yang telah di teknik aseptis dan diletakkan di atas kaca obyek yang telah terdapat aquades steril sebanyak satu kali pengambilan dengan jarum ose. Kemudian genangi preparat dengan pewarna safranin selama 1 menit. kemudian bakteri yang akan dikonfirmasi diambil sebanyak satu ose dan diletakkan pada gelas obyek yang telah terdapat larutan KOH sebanyak satu jarum ose.

tidak rapat Ujung : Tumpul Ada Hifa Sporan giofor Ada . Data hasil pewarnaan bakteri dan endospora No Isolat kel Bentuk Gram Perbesaran Uji KOH 3% Endospora B.subtilis 1 BP 1.3 1 2 2 BNP 1.Preparat ditiriskan dengan kertas saring dan diamati di bawah mikroskop. Data hasil pewarnaan kapang No Isolat Kelompok Spora Sporan gium 1 KNP 6. cabang. 2008). cabang.1 1 Bentuk : Bulat Ada Tidak bersekat. tidak rapat Ujung : Tumpul Jenis : Satu 2 Bentuk : Bulat Ada Tidak bersekat.2.1 7 8 Basil Basil Basil Basil Basil Basil Basil Basil + + 1000x 1000x 1000x 1000x 1000x 1000x 1000x 1000x Ada Ada Tidak ada Tidak ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Ada Tabel 2. endospora akan tampak berwarna hijau dan sel vegetatif akan tampak berwarna merah (Scienceprofonline. 4. 5 6 4 BP 8.3 Data Hasil Pengamatan Tabel 1.1 3 4 3 BNP 3.

Jenis : Satu 2 KP 5. cabang. tidak rapat Ujung : Tumpul Jenis : Satu 3 KP 4. cabang. tidak rapat Ujung : Tumpul Jenis : Satu 4 Bentuk : Bulat Tidak ada Tidak bersekat. rapat Tidak ada Tidak ada Tidak ada . cabang.1 5 Bentuk : Lonjong Tidak ada Ujung : Lancip Jenis : Dua : Besar dan Kecil 6 Bentuk : Lonjong Tidak ada Ujung : Lancip Jenis : Dua : Besar dan Kecil 4 KP 5. 7 Bentuk : Bulat Ada Tidak bersekat. tidak rapat Ujung : Tumpul Jenis : Satu 8 Bentuk : Bulat Ada Tidak bersekat.3 3 Bentuk : Bulat Tidak ada Tidak bersekat. cabang.1. cabang. rapat Tidak ada Bersekat. cabang. tidak rapat Ada Ada Bersekat.

baik yang tercemar maupun yang tidak tercemar pestisida akan mempunyai karakteristik yang sama berdasarkan hasil pewarnaan yang telah dilakukan. Data hasil pengamatan pada pewarnaan kapang menunjukkan bahwa terdapat variasi bentuk pada kapang tersebut antara lain bentuk spora yang bulat dan lonjong. ujung tumpul dan lancip. aquades 80ml. terdiri atas satu macam atau dua macam spora. Bakteri dan kapang. Hifa ada yang bersekat dengan cabang yang tidak rapat. Kristal violet merupakan bahan kimia dengan rumus kimia C18H15N3O3. akuades 300ml. Hal ini menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan morfologi yang berarti antara bakteri dan kapang yang tercemar maupun yang tidak tercemar.Ujung : Tumpul Jenis : Satu 4. dimana bakteri ini mempunyai endospora yang ditandai dengan warna hijau.8 gram. dan gram D. BNP 3. Preparat BNP 1. 2007). Gram A merupakan cat yang terdiri dari campuran kristal violet 2 gram.1 merupakan bakteri gram negatif dan berbentuk basil jika diamati pada mikroskop dengan perbesaran 1000x. Ada yang memiliki sporangium dan ada pula yang tidak mempunyai sporangium. etil alkohol 95% 20 ml.2 dan BP 8.3. ammonium oksalat 0. gram B.3 Analisa Hasil Data hasil pengamatan menunjukkan bahwa isolate BP 1. Pewarnaan endospora menggunakan bakteri Bacillus subtilis.1 merupakan bakteri gram positif. gram C. Pada pewarnaan Gram yang dilakukan digunakan gram A. Gram B merupakan merupakan cat yang terdiri dari campuran yodium 1 gram. namun terdapat bentuk yang berbeda yang dikarenakan kurang telitinya praktikan dalam mengamati bentuk bakteri. Gram B merupakan larutan mordan yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh . ada pula hifa yang bersekat dengan cabang rapat. kalium yodida 2 gram. dan biasa digunakan dalam teknik pewarnaan microscopy Certistain (Merck. bukan merupakan bahan kimia berbahaya. Ada yang memiliki sporangiofor dan ada pula yang tidak memiliki sporangiofor.

Pada bakteri gram negatif penambahan safranin akan menyebabkan warna bakteri berubah menjadi merah karena warna ungu yang dihasilkan oleh kristal violet-yodium telah luntur dengan lisisnya membran sel sehingga safranin dapat terikat. Gram C merupakan larutan pemucat . Perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif (Filzahazny. zat warna kristal violet akan larut saat penambahan larutan pemucat. Gram D merupakan cat yang terdiri dari campuran safranin 0. penambahan larutan mordan menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks kristal violet-yodium. etil alkohol 95% 10ml. memperjelas warna dari zat warna tersebut. 2008) No. Pada pewarnaan gram . Tanpa penambahan larutan mordan. Safranin pada gram D tidak akan menyebabkan perubahan warna pada bakteri positif karena persenyawaan kompleks kristal violet-yodium tetap terikat pada dinding sel. Gram C merupakan cat yang terdiri dari campuran aseton 50ml dan etil alkohol 95%50ml. dan akuades 90ml. larutan pemucat berfungsi untuk melarutkan lipida pada membrane bakteri gram negative yang akan menyebabkan pori-pori sel membesar sehingga meningkatkan daya larut persenyawaan kristal violet-yodium. Oleh sebab itu.bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri lebih kuat. gram D atau zat pewarna kedua berfungsi sebagai pembeda terhadap zat warna kristal violet (Lay. 25 gram . mempersulit pelarutan zat warna. 1994). Tabel 3. 1 2 3 Perbedaan Dinding sel Kadar lipid Resistensi terhadap alkali (1% KOH) 4 Kepekaan terhadap Yodium Toksin yang dibentuk 5 Lebih peka Eksotoksin Kurang peka Endotoksin Bakteri Gram Positif (+) Lapian peptidoglikan tebal 1-4% (Lebih rendah) Lebih pekat Bakteri Gram Negarif (-) Lapian peptidoglikan lebih tipis 11-22% (Lebih tinggi) Larut .

Identifikasi dapat dilakukan dengan melihat morfologi. Endospora merupakan . Spora ini memiliki resistensi yang tinggi terhadap pewarnaan. dimana sel tersebut akan nampak menggembang pada letak endosporanya. Tipe utama diantara terminal. Tipe terminal memiliki pengertian letak sel vegetatif diantara ujung dan pinggir dari sel vegetatif. yang terdiri dari cross-linked keratin. yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik. lokasi. Endospora dapat berukuran lebih besar ataupunkecil dari sel vegetatif yang terdiri dari lapisan protein yang terbuat dari keratin. Beberapa endospora mempunyai diameter lebih besar daripada sel. Tipe subterminal berarti lokasi endosporanya diantara tengah dan pinggir dari sel vegetatif.6 Resistensi terhadap tellurit Lebih tahan Lebih peka 7 Sifat tahan asam Ada yang tahan asam Tidak ada yang tahan asam 8 Kepekaan terhadap penisilin Lebih peka Kurang peka 9 10 11 12 Kepekaan terhadap streptomisin Penghambatan warna Ketahanan terhadap fisik Kebutuhan nutrien Tidak peka Peka Lebih dihambat Kurang dihambat Lebih tahan Kurang tahan Kompleks Relatif Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi. Komponen endospora mempunyai resistan terhadap agen kimia yang kuat pada spore coat. Tipe sentral atau tengah merupakan lokasi dari sel vegetatif yang letaknya tepat di tengah. dan ukuran endospora. Letak endospora yang berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi. prosedur pewarnaan dengan malakit hijau adalah dengan pemanasan. subterminal dan sentral.

Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis. Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat gram mempunyai makna dignostik. sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan kepekaan bakteri terhadap antibiotik). kristal fenol + air panas 70oC untuk membunuh jamur. Komposisi dari Lactophenol Cotton Blue yaitu kristal.075 g berfungsi untuk memberi warna pada sel kapang. 2001): Kelebihannya adalah: pengecatan gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik. 2007). gliserol 40 ml berfungsi menjaga fisiologi sel dan menjaga sel terhadap kekeringan. Contohnya Bacillus subtilis memiliki endospora yang terletak di subterminal (Scienceprofonline. cotton blue 0. Kelebihan dan kekurangan pengecatan gram (Nirwati. Hal ini dikarenakan bakteri gram positif dan negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika. maka memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi gonoro. asam laktat 20 ml yang berfungsi untuk menjernihkan latar belakang dan mempertajam struktur kapang. . memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal. Kekurangannya adalah pengecatan gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari 104 ml per ml. 2008). dan air suling 40 ml (Waluyo. uretral. Misalnya pada pemeriksaan gram ditemukan gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus (nana).metode pertahanan hidup yang bukan bertujuan untuk reproduksi.

Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi penyakit infeksi. Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan Gram dan Ziehl‐Nelsen. 5. Setelah di tambahkan safranin. bakteri Gram positif akan berwarna ungu. dan karakteristik bakteri. Bakteri Gram positif membentuk kompleks Kristal iodine yang berwarna biru. tipe utama diantaranya ialah terminal. setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri akan berwarna biru. Setelah itu ditambah alkohol. subterminal dan sentral. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi. . struktur.BAB V PENUTUP 5. Letak endospora yang berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi. yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik. kemudian difiksasi.1 Kesimpulan Teknik pembuatan sediaan apusan (preparat) dapat dilakukan dengan mensuspesikan biakan bakteri dengan aquades.2 Saran Diharapkan praktikan teliti dan hati-hati dalam pemurnian sebab dikhawatirkan dapat terjadi kontaminasi. Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian kristal violet.

html . Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. 2008. . Diakses pada tanggal 26 April 2010 Gozali. Gramedia. 1983.temple. S. Levine. Diakses pada tanggal 26 April 2010 Lay. Merck .com/gram/pewarnaan-gram-prinsip. S. 1990. Pearson Education.. G. J. Cresyl Violet Acetate. New York. 2007. pada tanggal 26 April 2010 Nirwati. Jakarta.edu/~jasoncg/ID/ microreporting. United State of America. Brock Biology of Microorganism. 2001. B. http://astro. Pembuatan preparat dan pengecatan dalam petunjuk praktikum mikrobiologi Fakultas kedokteran Universitas Gadjah Mada. 2009. An Introduction to Laboratory Technique in Bacteriology. inc. PT Raja Grafindo Persada. Analisis Mikroba di Laboratorium. http:/wordpress. Yogyakarta.gozali.W.DAFTAR PUSTAKA Assani. Jason.si d=2XfBHZapUlXHHd9B9vTSj5pCnREAl69HlgSHhO2CnREAkWqXGgJCVGG. 2003. Mikrobiologi Pangan I. 2009. Ratna Siri. New York.id/cresyl-violetacetate/MDA_CHEM105235/p_zyOb.. Madigan.merckchemicals.blogspot. Microbiology A Laboratory Manual. http://www.htm. McMillan Company. Hera. & Natalie.htm. diakses . M. Diakses pada tanggal 26 April 2010 Hadiotomo. 1992. 1994. Jakarta. Universitas Gadjah Mada press. http://www. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek.com/Penganta-tentang-bakteri. Pewarnaan gram. Amir. M. 1994.T. Fardiaz. S. The Gram Stainning. Jakarta Filzahazny.s1LZb0AAAEWZuEfVhTl. Mikrobiologi Kedokteran. Addison-Wesley Publishing Company. Jakarta : Pt Gramedia.co. 2000. Cappuccino.

Mikrobiologi Dasar. Mikrobiologi Dasar. Mc Graw Hill Book Company.. New York. Rineka Cipta. Diakses pada tanggal 26 April 2010 Umsl. Pewarnaan endospora. Li. Diakses www.k12. U. http://www. Suriawiria.pdf. Tracy. Gram Staining. 2008. 2005. 1991.tracy. Universitas Muhammadiyah Malang Press. 1993.ca. Sutedjo.umsl. Chan.Partic. pada tanggal 26 April 2010 Volk & Wheeler.S. M. Malang. Jakarta Waluyo.blogspot. M. 2008. L . 2005. . 2007 . www.us/thsadvbio/pdfs/gram %20stain. E. J. Penerbit Erlangga.com/2008/08/pewarnaan endospora. Diakses pada tanggal 26 April 2010 Pelczar. Papas Sinar Sinanti. Jakarta. Staining Bacteria. Elements of Microbiology. Jakarta. Mikrobiologi Umum .C. 2007.dunia- mikro.edu/~microbes/pdf/stainingbacteria.pdf. Mikrobiologi Tanah.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful