2009

Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

Disusun Oleh : Drs. Ali Kusrijadi, M.Si.

Jurusan Pendidikan Kimia Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

UPI 2009

Praktikum Mikrobiologi

Page 1

2009

Tata Tertib
Untuk kelancaran dan keberhasilan pelaksanaan praktikum mikrobiologi, setiap orang diwajibkan mematuhi tata tertib sebagai berikut: 1. Sebelum bekerja setiap orang wajib mempelajari petunjuk praktikum dan dituangkan dalam suatu jurnal praktikm. 2. Diwajibkan menggunakan jas lab selama praktikum berlangsung. 3. Tidak diperkenankan menyimpan tas di meja kerja. 4. Setiap kelompok diwajibkan membawa : Lap tangan, sabun cair atau sabun desinfektan, korek api. 5. Setiap akan melakukan kegiatan wajib membersihkan dan mensucihamakan tempat dan lemari kerja dengan desinfektan. 6. Mencuci tangan dengan sabung sebelum dan setelah praktikum. 7. Mikroorganisme yang ditangani selama praktikum tidak boleh tercecer di sembarang tempat. 8. Apabila bekerja dengan api, jauhkan barang dan bahan yang mudah terbakar. 9. Jika memecahkan alat gelas yang berisi mikroorganisme, tuangka desinfektan ke atasnya, kumpulkan dan buang ke tempat yang telah tersedia. 10. Apabila terjadi kesalahan atau kecelakaan lab laporkan secepatnya kepada pembimbing praktikum. 11. Alat-alat yang sudah dipakai dibersihkan dan disterilisasi kembali. 12. Setiap kali selesai praktikum, buatlah laporan sementara dalam jurnal dan tanda tangankan pada pembimbing praktikum. 13. Setiap kelompok diwajibkan membuat laporan akhir praktikum.

Praktikum Mikrobiologi

Page 2

2009

Sterilisasi

Tujuan :
Mengetahui cara sterilisasi

Teori Dasar
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum mikrobiologi dan proses pembuatan medium harus diawali dengan proses sterilisasi. Proses ini ditujukan untuk mematikan semua organism yang terdapat dalam alat atau wadah yang akan digunakan dalam pembuatan media. Pemilihan cara sterilisasi didasarkan pada sifat bahan yang akan disterilisasi. Cara sterilisasi yang biasa digunakan adalah dengan pemanasan yang terbagi menjadi dua jenis pemanasan yaitu : sterilisasi panas lembab yaitu pemanasan dengan bantuan uap air dan sterilisasi panas kering bila tanpa bantuan uap air. Autoklap adalah alat yang digunakan untuk proses sterilisasi panas lembab. Pada proses sterilisasi terdapat hal-hal yang perlu diperhatikan, yaitu : Sterilisasi bergantung pada uap, karena itu udara dalam autoklap harus benar-benar dikosongkan dari alat tersebut. Semua bahan-bahan yang disterilkan harus terkena uap. Bahan-bahan yang berfori atau berbentuk cair harus permeable terhadap uap. Pada umumnnya sterilisasi dilakukan pada suhu 1200C selama 15 menit.

Sterilisasi panas kering dapat dilakukan dengan menggunakan oven. Peralatan gelasyang akan digunakan atau media yang tidak rusak oleh panas dapat disterilisasi dengan teknik ini. Waktu dan suhu yang seringkali digunakan untuk proses ini adalah: Suhu 170 160 150 140 Waktu (jam) 1,0 2,0 2,5 3,0

Alat dan Bahan

Cawan petri, tabung reaksi, autoklap

Praktikum Mikrobiologi

Page 3

2009

Cara Kerja :
Sterilisasi dengan menggunakan autoklap Isi autoklap dengan air di bagian tapisan atau air jangan sampai kurang dari permukaan kumparan pemanas. Masukkan bahan yang akan disterilisasi kemudian tutup dengan bantuan sekrup penguat tutup. Pasangkan steker ke pusat listrik, nyalakan tombol (lampu akan menyala) Klep pengaman dibuka sampai terlihat tetesan air, lalu tutup. Perhatikan tekanan dari autoklap, setelah mencapai tekanan 1,5 atm hitung waktu sterilisasi sampai 15 menit. Setelah sterilisasi selesai, matikan listrik biarkan tekanan autoklap kembali ke nol. Buka tutup autoklap keluarkan bahan yang disterilikan, keringkan kembali autoklapnya.

Praktikum Mikrobiologi

Page 4

2009

Pembuatan Media Agar

Tujuan :
Mengetahui cara membuat media Mengetahui macam dan kegunaan media

Teori Dasar
Mikroorganisme dapat ditumbuhkembangkan pada sustu substrat yang disebut sebagai medium. Medium mengandung nutrient atau makanan yang merupakan senyawa dengan berat molekul rendah dan mudah larut dalam air yang merupakan hasil degradasi dari molekul yang lebih kompleks. Nutrient dalam suatu medium dapat bervariasi namun mempunyai sifat umum yang merupakan kebutuhan dasar mikroorganisme, meliputi : air, mineral, sumber energy (C dan N) dan factor tumbuh. Berdasarkan fungsinya medium dibagi menjadi tiga jenis, yaitu : medium umum, selektif dan diferensial. Sedangkan berdasarkan komposisi kimianya dikenal medium alami, semi sintetis dan sintetis.

Alat dan Bahan

Alat : Gelas Kimia, Gelas ukur, Batang Pengaduk, Tabung reaksi, pH indicator, Corong, Kertas saring, kapas, pembakar, cawan petri, statif corong, lumpang alu, Magnetik stirer, dan autoklap. Bahan : Daging tanpa lemak, Tauge, Pepton, Agar-agar, NaCl, Sukrosa

Langkah Kerja
Pembuatan Media A. Kaldu Nutrisi Agar (KNA) - Buat ekstrak daging (0,5 Kg direbus dalam air 1 L hingga volume air menjadi setengahnya, atau direbus selama 1-2 jam). - Saring ekstrak daging, kemudian tambahkan aquades hingga volumenya menjadi 1 L. - Masukkan 10,0 g pepton, 5,0 g NaCl, dan 15,0 g Agar-agar. Panaskan hingga mendidih selama 15 menit sambil diaduk dalam magnetic stirrer. - Ukur pH (usahakan ph=6,8-7,3)
Praktikum Mikrobiologi Page 5

2009

Buat agar diri : masukkan 12-15 mL suspense agar ke dalam tabung reaksi. Buat agar miring; masukkan 3-5 mL suspense agar ke dalam tabung reaksi. Tutup semua tabung reaksi dengan kapas, sterilkan semua tabung dalam autoklap pada suhu 121oC selam 15 menit. Setelah disterilkan, untuk agar diri biarkan dalam keadaan tegak dan untuk agar miring letakkan miring, biarkan sampai dingin. Tauge Agar Buatlah ekstrak Tauge (100,0 g tauge digerus atau dihaluskan dan diambil airnya) Saring ekstrak tauge, tambahkan aquades hingga volume 1L. Tambahkan 60,0 g sukrosa dan 15 g agar-agar, panaskan hingga mendidih selama 20 menit. Buat agar diri, lalu sterilkan. Simpan semua media hasil sterilisasi dalam suatu incubator pada suhu kamar.

B. -

Pertanyaan .
1. Apa yang dimaksud dengan media umum, selektif dan diferensial ? 2. Jelaskan fungsi dari agar diri dan agar miring ! 3. Tuliskan beberapa jenis komposisi media selain yang anda buat dan jelaskan fungsinya!

Praktikum Mikrobiologi

Page 6

2009

Pembiakan Bakteri
Tujuan : Mempelajari cara pembiakan bakteri Mempelajari sifat-sifat koloni bakteri

Alat dan Bahan Media agar Cawan Petri, pembakar Bunsen.

Cara Kerja : Siapkan KNA dari agar diri, cairkan dengan cara merendam dalam air panas, lalu tuangkan ke dalam cawan petri, biarkan hingga memadat kembali. (dilaksanakan dekat api). Kelompok 1 (mikroorganisme dari udara) : Biarkan cawan terbuka selama 10 menit lalu tutup Kelompok 2 (mikoorganisme dari mulut) : salah seorang praktikan mengucapkan beberapa kata dihadapan cawan petri yang terbuka dengan jarak 15-20 cm, segera tutup kembali. Kelompok 3 (mikoorganisme dari debu) : ambil cotton bud steril, ambil debu dari suatu permukaan kemudian goreskan pada lempeng agar sehingga terbentuk goresan yang makin tipis dan cawan segera tutup kembali. Kelompok 4 (mikoorganisme dari telapak tangan ) : Oleskan salah satu jari tangan di atas permukaan agar, kemudian cawan segera tutup kembali. Kelompok 5 (mikoorganisme dari rambut) : Masukkan satu-dua helai rambut di atas permukaan agar dan segera tutup kembali. Masing-masing cawan di inkubasikan pada suhu kamar selama 3x24 jam. Amati setiap hari yang meliputi : jumlah koloni, macam koloni, bentuk koloni, warna koloni, ukuran koloni, jenis permukaan (rata, cembung, cekung), mengkilap atau suram, kepekatan.

Pertanyaan 1. Bandingkan hasil amatan anda, dan simpulkan apakah ada perbedaan jenis koloni yang tumbuh untuk setiap perlakuan ? 2. Apakah ada pengaruh lamanya inkubasi dengan jumlah koloni yang tumbuh ?

Praktikum Mikrobiologi

Page 7

2009

Pembiakan Jamur
Tujuan : Mempelajari sifat-sifat koloni jamur Mengidentifikasi jenis jamur yang tumbuh

Alat dan Bahan :

Mikroskop, objek gelas dan penutup gelas, jarum inokulasi, pipet tetes Media tauge agar, oncom/tempe/tape, aquades

Cara Kerja :
Siapkan agar tauge, cairkan dengan cara merendam dalam air panas, lalu tuangkan ke dalam cawan petri, biarkan hingga memadat kembali. (dilaksanakan dekat api). Kelompok 1 (jamur dari udara), bukalah cawan tauge di atas meja selama 1 jam kemudian tutup kembali. Kelompok 2 (jamur dari makanan), haluskan bahan makanan kemudian taburkan di atas agar tauge kemudian tutup kembali. Inkubasi pada suhu kamar selama 3x24 jam. Amati setiap hari jenis koloni yang tumbuh. Ambil objek gelas dan penutupnya yang sudah dibersihkan, teteskan air satu tetes di atas ojek gelas tersebut. Kemudian ambil sedikit koloni jamur dengan menggunakan jarum inokulasi (usahakan bagian spora dan hifanya terambil). Amati di bawah mikroskop lalu gambar hasil pengamatan anda!

Praktikum Mikrobiologi

Page 8

2009

Isolasi Biakan Murni

Tujuan :
Mempelajarai cara memisahkan satu macam mikroorganisme

Alat dan Bahan :

Lempeng agar yang telah ditumbuhi mikroorganisme Agar miring yang steril Jarum inokulasi Pembakar Bunsen Alkohol

Cara Kerja :
Siapkan alat dan bahan yang akan digunakan dekat dengan api. Bakar jarum inokulasi di atas api sampai seluruh kawatnya pijar, biarkan jarum dingin (selama 30 detik) Dengan jarum inokulasi tersebut, ambil sedikit koloni mikroorganisme dari satu macam koloni. Ambil tabung yang berisi agar miring yang sumbatnya telah dibuka, masukkan jarum inokulasi dan goreskan di permukaan agar miring secara zigzag (seluruh kegiatan dilakukan dekat api). Panaskan kembali mulut tabung kemudian tutup dengan sumbatnya. Pijarkan jarum inokulasi, setelah dingin celupkan ke dalam alcohol dan pijarkan kembali simpan untuk digunakan kembali. Berilah etiket tabung saudara sesuai dengan jenis koloninya. Inkubasikan pada suhu kamar selama 2X24 jam.

Praktikum Mikrobiologi

Page 9

2009

Pewarnaan Gram

Tujuan :
Mempelajari cara pewarnaan Gram Mengamati reaksi bakteri terhadap pewarnaan

Teori Dasar :
Pewarnaan gram digunakan untuk mengidentifikasi bakteri, terutama yang berkaitan dengan kesehatan. Hasil pewarnaan ini ada dua macam yaitu : gram positif yang ditandai dengan terbentuknya warna ungu dan gram negative yang ditandai dengan warna merah. Pewarnaan gram menggunakan 4 pereaksi yang berbeda dan dilakukan melalui empat tahap kerja : 1. Warna dasar kristel violet di mana semua sel akan memberikan warna ungu 2. Pengikat warna dasar dengan pereaksi iodine atau lugol (penguat warna atau mordant) akan tebentuk kompleks Kristal violet-iodine (CV-I) yang sukar larut dan sel akan memberikan warna ungu kehitaman. Pada bakteri gram positif CV-I berikatan dengan Mg- asam Ribonukleat dari komponen dinding sel yang tidak larut dalam alcohol. 3. Alkohol 96 % sebagai dekoloran dan pelarut lemak. Pada bakteri gram positif kandungan lemaknya sedikit sehingga mudah terbuka membentuk pori yang kemudian dapat tertutup oleh protein yang terdehidrasi alcohol. Hal ini mengakibatkan komplek CV-I dengan Mg-asam Ribonukleat tetap dalam dinding sel. Pada bakteri gram negative lemaknya banyak, sehingga meninggalkan pori yang besar dan mengakibatkan tercucinya kompleks CV-I dan sel kehilangan warna. 4. Safranin sebagai zat warna lawan digunakan untuk menggantikan warna dasar yang telah hilang tercuci alcohol. Bakteri gram negative akan berwarna sedangkan gram positif tidak menghasilkan warna.

Praktikum Mikrobiologi

Page 10

2009

Alat dan Bahan

Mikroskop, pembakar, botol semprot, objek gelas, jarum inokulasi. Biakan bakteri, Kristal violet, larutan iodium, safranin, alcohol 96%, aquades

Cara Kerja :
A. Membuat Olesan Bakteri - Bersihkan objek gelas dengan kapas beralkohol sampai bebas lemak - Teteskan aquades ke atas kaca objek - Pijarkan jarum inokulasi dan dinginkan - Ambil biakan bakteri dengan jarum inokulasi tersebut, kemudian campurkan dengan tetesan aquades di objek gelas. Sebarkan suspense tersebut sehingga dihasilkan lapisan tipis. - Keringkan di udara terbuka. - Panaskan bagian bawah kaca objek di atas api sebanyak 3 kali fiksasi panas. B. Pewarnaan gram - Tuangi sediaan olesan bakteri dengan Kristal violet, biarkan selama 3 menit. - Buang kelebihan zadet warna tersebut. - Tuangi dengan larutan Lugol biarkan selama 45-60 detik. - Masukkan ke dalam alcohol 96% dalam suatu beker gelas, goyang-goyangkan selama 1 menit. - Bilas dengan aquades dan keringkan dengan bantuan kertas tisu - Tuangi dengan safranin, biarkan selama 3 menit. - Cuci dengan air dan birakan mongering - Amati sediaan tersebut dengan mikroskop

Praktikum Mikrobiologi

Page 11

2009

Menghitung Koloni
Tujuan :
Menghitung jumlah bakteri dengan metode pengenceran cawan tuang

Teori Dasar :
Metode yang digunakan untuk menghitung jumlah mikroorganisme bermacammacam disesuaikan dengan tingkat ketelitian dan peruntukannya. Metode pengemcera cawan tuang digunakan untuk mengetahui perkiraan jumlah sel yang hidup, yaitu melalui penanaman suspense pada agar cawan. Kemudian koloni yang tumbuh dihitung. Jumlah ini menunjukkan jumlah sel dengan anggapan satu koloni berasal dari satu sel.

Alat dan Bahan :

Tabung reaksi, pipet volume 1 mL, cawan petri, pembakar, penangas air KNA, sampel air (air sumur), aquades.

Cara Kerja :
Siapkan 10 mL air sumur Sediakan 6 tabung reaksi yang telah diisi 9 mL aquades beri tanda 1-6. Buatlah pengenceran sampel dari 10-1 sampai 10-6 dengan cara memasukkan 1 mL sampel ke dalam tabung reaksi 1 lalu kocok hingga homogen. Selanjutnya ambil 1 mL campuran dari tabung 1 masukkan ke tabung 2 kocok. Ulangi cara tersebut dari tabung 2 ke tabung 3 dan selanjutnya. Sediakan tiga cawan petri beri tanda 10-4, 10-5 dan 10-6. Masukkan kedalamnya secara berurutan masing-masing 1 mL campuran dari tabung 4, 5 dan 6. Siapkan tiga buah KNA dengan volume 9 mL yang telah dicairkan pada suhu 40450C. Masukkan KNA cair ke dalam cawan petri tersebut, goyangkan hingga homogeny dengan cara memutar cawan petri se arah dan berlawanan jarum jam. Inkubasi pada suhu kamar selama 24-48 jam. Hitung jumlah koloni Untuk menentukan jumlah bakteri per mL sampel, jumlah koloni dikalikan dengan pengenceran. Misal pada pengenceran 10-4 terdapat jumlah koloni sebanyak 100 maka jumlah bakteri per mL adalah 100 x 10 -4.
Page 12

Praktikum Mikrobiologi

2009

Praktikum Mikrobiologi

Page 13