PERCOBAAN IV

Judul Tujuan

: Pemisahan Pigmen dari Tanaman : Pada akhir percobaan ini Mahasiswa harus paham mengenai 1. Cara kerja dan teknik-teknik isolasi tumbuhan. 2. Pengenalan isolasi bahan alam yang bermolekul besar. 3. Analisa senyawa tumbuhan berwarna dengan

menggunakan KLT dan kromatografi kolom Hari/tanggal Tempat : Selasa / 5 April 2011 : Laboratorium kimia FKIP UNLAM Banjarmasin

I.

DASAR TEORI

1.1 Daun dan Pigmen Tanaman Daun merupakan salah satu organ tumbuhan yang tumbuh dari batang, umumnya berwarna hijau daun dan terutama berfungsi sebagai penangkap energi cahaya matahari melalui fotosintesis. Bentuk daun sangat beragam namun biasanya berupa helaian, bisa tipis atau tebal. Daun juga bisa bermodifikasi menjadi duri (misalnya kaktus) dan berakibat daun kehilangan fungsinya sebagai organ fotosintetik. Warna hijau pada daun berasal dari kandungan klorofil pada daun. Daun seringkali mengandung beberapa senyawa yang berwarna (pigmen) antara lain klorofil (hijau), karoten (kuning) dan xantofil (kuning). Meskipun klorofil mengandung bagian yang polar, akan tetapi secara keseluruhan strukturnya adalah non polar, seperti hidrokarbon, sehingga klorofil mudah larut dalam pelarut non polar seperti eter atau petroleum eter. Ada dua jenis klorofil yaitu klorofil a dan klorofil b, yang membedakan kedua jenis klorofil ini adalah adanya gugus aldehid pada struktur klorofil b yang menyebabkan klorofil b ini bersifat sedikit lebih polar dibandingkan klorofil a. Adapun struktur dari kedua jenis klorofil ini adalah sebagai berikut.

Gambar 1. Struktur klorofil a

Gambar 2. Struktur klorofil b

Karoten C40H56 adalah senyawa alkena dengan rantai panjang dari sistem ikatan rangkap terkonjugasi. Daun hijau mengandung sekitar 90% betakaroten dan 10 % alpha karoten. Meskipun secara keseluruhan molekul karoten adalah non polar, akan tetapi mempunyai sifat dapat mengubah bidang polarisasi. Karoten juga ada dua jenis yaitu a-karoten dan -karoten, yang membedakan kedua struktur ini adalah posisi ikatan rangkap pada cincin ujung. Adapun strukturnya adalah sebagai berikut.

Gambar 3. Struktur -karoten

Gambar 4. Struktur -karoten

Xantofil C40H50O2 adalah bentuk karoten yang terhidroksilasi, kandungan xantofil dalam daun hijau selalu dua kali lebih besar dari karoten. Xantofil lebih larut dalam alkohol dan sedikit larut dalam petroleum eter dibandingkan karoten. Xantofil memiliki struktur yang mirip dengan karoten, hanya bedanya xantofil memiliki gugus OH pada struktur sikliknya. Adapun struktur dari xantofil adalah sebagai berikut.

Gambar 5. Struktur xantofil

Selain itu, di dalam daun juga mengandung antosianin yang berwarna merah, biru atau ungu tergantung derajat keasamannya. Untuk mengekstraksi pigmen dari daun, terlebih dahulu dilakukan penggerusan dengan mortar terhadap daun kering sampai halus. Pelarut yang dapat mengekstraksi pigmen secara bertahap dengan urutan kepolaran yaitu petroleum eter, kloroform, etanol, dan metanol. Adapun struktur umum dari antosianin adalah sebagai berikut.

Gambar 6. Struktur umum antosianin 1.2 Kromatografi Kolom dan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Kromatografi adalah prinsip pemisahan campuran senyawa atas komponenkomponen berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi komponen pada dua fase, yakni fase diam dan fase gerak. Perbedaan kemampuan masing-masing komponen diadsorpsi dan perbedaan distribusi dua fase yang tidak saling bercampur (partisi). Pemisahan suatu campuran secara kromatografi dapat dilakukan

kromatografi kolom, kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis (KLT). Pemisahan berdasarkan kromatografi adsorpsi, sangat tergantung pada distribusi pada kedua fase cair dan padat. Untuk pemisahan pigmen dari tumbuhan, dapat dilakukan dengan kromatografi kolom. Alat yang digunakan yaitu kolom yang di dalamnya berisi fase stasioner (padat atau cair). Campuran ditambahkan ke kolom dari satu ujung dan campuran akan bergerak dengan bantuan pengembang yang cocok (fase gerak). Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom, yang ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara fase gerak dan fase diam (stationer). Kromatografi kolom bertujuan untuk mengisolasi komponen dari

campurannya. Pada kromatogarfi kolom digunakan kolom dengan adsorben sillika gel karena kolom yang dibentuk dengan silika gel memiliki tekstur dan struktur yang lebih kompak dan teratur. Silika gel memadat dalam bentuk tetrahedral raksasa, sehingga ikatannya kuat dan rapat. Dengan demikian, adsorben silika gel mampu menghasilkan proses pemisahan yang lebih optimal.

Silica gel dapat membentuk ikatan hidrogen di permukaannya, karena pada permukaannya terikat gugus hidroksil. Oleh karenanya, silica gel sifatnya sangat polar. Jika fasa gerak yang digunakan sifatnya non-polar, maka pada saat campuran dimasukkan, senyawa-senyawa yang semakin polar akan semakin lama tertahan di fasa stasioner, dan senyawa-senyawa yang semakin tidak (kurang) polar akan terbawa keluar kolom lebih cepat. Kromatografi kolom dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya dapat dibedakan menjadi dua, yaitu : 1) Kromatografi fase normal Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya normal bersifat polar, misalnya silica gel, sedangkan fase geraknya bersifat non polar. 2) Kromatografi fase terbalik Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar, sedangkan fase geraknya bersifat polar; kebalikan dari fase normal. Dalam proses pemisahan dengan kromatografi kolom, adsorben silika gel harus senantiasa basah karena, jika dibiarkan kering, kolom yang terbentuk dari silika gel bisa retak, sehingga proses pemisahan zat tidak berjalan optimal. Selain itu, kondisi yang senantiasa basah berperan untuk memudahkan proses elusi (larutan melewati kolom) dalam kolom. Kolom yang digunakan dalam kromatografi kolom dapat berupa gelas, plastik atau nilon. Ukuran kolom yang lazim digunakan mempunyai diameter dalam 2 cm dan panjang 45 cm. Ujung bagian bawah dilengkapi dengan kran untuk mengatur laju alir eluen. Untuk menahan fasa diam (adsorben) biasanya digunakan kapas gelas (glass wool) atau gelas berpori (fritted glass). Sorben yang digunakan dalam kromatografi kolom diantaranya arang, magnesium silikat, alumina, silika gel, kalsium sulfat dan serbuk selulosa. Berikut ini beberapa golongan solutnya misalnya alkana, alkena, aromatis, eter, ester, keton, aldehid dan alkohol.

Berikut ini gambar-gambar bagan dalam kromatografi kolom :

Gambar 7. Bagan kolom kromatografi

Gambar 8. Kolom berisi sampel

Gambar 9. Proses pemisahan pigmen tanaman

Dalam pemisahan biasanya kromatografi kolom diikuti pemeriksaan secara kualitatif dengan KLT untuk memonitor apakah pemeriksaan dengan cara kromatografi kolom berhasil atau tidak. Dalam kromatografi lapis tipis (KLT) fase diamnya biasanya adalah serbuk silika gel, alumina, tanah diatome, selulosa dan lainnya yang mempunyai ukuran butir sangat kecil yaitu 0,063 0,125 mm dilapiskan pada kaca, lembaran aluminium maupun plastik dengan tebal tertentu. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending) atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending). Pada prakteknya, sampel ditotolkan pada plat KLT lalu dimasukkan ke dalam chamber yang sudah jenuh oleh eluen. Ketika eluen sudah mencapai batas pada plat yang telah dibuat sebelumnya, plat diangkat dan dikeringkan. Setelah

daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi, maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa. Metoda identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan harga Rf. Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi lapis tipis. Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi yang konstan merupakan besaran yang

karakteristik dan reprodusibel. Berikut ini gambar-gambar bagan dalam kromatografi lapis tipis (KLT).

Gambar 10. Bagan kromatografi lapis tipis (KLT)

Gambar 11. Pigmen dalam sampel menuju batas atas plat KLT

Gambar 12. Perbandingan untuk perhitungan Rf

Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan lebih murah dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikian juga peralatan yang digunakan. Dalam kromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih sederhana dan dapat dikatakan hampir semua laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat. Beberapa keuntungan dari kromatografi planar ini adalah :

Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.

Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi.

Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.

1.3 Beberapa Jenis Tumbuhan a) Daun Puring (Codiaeum variegatum) Puring atau kroton adalah tumbuhan hias pekarangan populer berbentuk perdu dengan bentuk dan warna daun yang sangat bervariasi. Beragam kultival telah

dikembangkan dengan variasi warna hijau, kuning, jingga, merah, ungu, serta campurannya. Bentuk daunnya

bermacam-macam, memanjang, oval, tapi bergelombang

10

helainya terputus-putus dan sebagainya. Secara botani, puring adalah kerabat jauh singkong serta kaksuba. Ciri yang sama adalah batangnya menghasilkan biloks berwarna putih pekat dan lengket, yang merupakan ciri khas suku Euphobaceae. b) Daun sirih hijau (Piper crocatum) Daun sirih hijau (Piper crocatum) termasuk dalam family piperaceae, yang tumbuh merambat dengan bentuk daun menyerupai hati dan bertangkai yang tumbuh berselang-seling dari batangnya serta penampakan daun yang berwarna merah keperakan dan mengkilap. Dalam daun sirih hijau terkandung senyawa fitokimia yakni alkaloid, saponin, tannin dan flavonoid. Sirih hijau sejak dahulu telah digunakan oleh masyarakat sebagai obat untuk menyembuhkan berbagai jenis penyakit. Penggunaan sirih hijau dapat digunakan dalam bentuk segar, maupun ekstrak kapsul. Secara empiris sirih hijau dapat menyembuhkan berbagai jenis penyakit, seperti diabetes, hepatitis, batu ginjal dan sebagainya. Daun sirih hijau berasa pahit dan getir, namun beraroma lebih wangi dibandingkan dengan sirih hijau. Warna daun sirih hijau memang merah kepekatan, namun masih juga mengandung warna hijau yaitu berada pada bagian dalam. Warna hijau pada daun berasal dari kandungan klorofil. Klorofil adalah senyawa pigmen yang berperan dalam menyeleksi panjang gelombang cahaya yang energinya diambil dalam fotosintesis. Pigmen lain yang terkandung dalam daun adalah karoten, xantofil dan antosianin. c) Daun seledri (Apium graveolens) Seledri adalah sayuran dan tumbuhan obat yang biasa digunakan sebagai bumbu masakan. Beberapa negara termasuk Jepang, Cina dan Korea

mempergunakan bagian tangkai daun sebagai bahan

11

makanan. Di Indonesia tumbuhan ini diperkenalkan oleh penjajah Belanda dan digunakan daunnya untuk menyedapkan sup atau sebagai lalapan. Penggunaan seledri paling lengkap adalah di Eropa: daun, tangkai daun, buah, dan umbinya semua dimanfaatkan. Kandungan utamanya adalah butilftalida dan butilidftalida sebagai pembawa aroma utama. Terdapat juga sejumlah flavonoid seperti graveobiosid A (1-2%)dan B (0,1 - 0,7%), serta senyawa golongan fenol. Komponen lainnya apiin, isokuersitrin, furanokumarin, serta isoimperatorin. Kandungan asam lemak utama adalah asam petroselin (40-60%). Daun dan tangkai daun mengandung steroid seperti stigmasterol dan sitosterol. d) Daun kemangi (Ocimum sanctum) Daun kemangi memiliki kandungan klorofil yang paling rendah. Hal ini dikarenakan kemangi merupakan tanaman semusim, daun berukuran kecil dengan helaian daun yang tipis. Selain itu, daun kemangi hanya tersusun dari selapis jaringan palisade, mesofil. Khususnya jaringan palisade yang mengandung klorofil. Umur daun, morfologi daun dan tahapan fisiologis suatu tanaman merupakan faktor yang menentukan kandungan klorofil. e) Daun katuk (Sauropus androgynus) Sifat kimia daun katuk dapat dilihat dari kadar kalsium yang tinggi. Kandungan vitamin C pada daun katuk jauh lebih tinggi daripada jeruk maupun jambu biji. Terdapat tujuh senyawa aktif yang dapat

merangsang produksi hormon-hormon steroid (seperti progesteron, estradiol, terstosteron, glukokortikoid) dan senyawa eikosanoid (diantaranya prostaglandin,

prostasiklin, tromboksan, lipoksin dan leukotrien). Sifat fisika pada klorofil daun katuk dapat dilihat pada semakin tinggi suhu pengeringan, kadar klorofil semakin tinggi dan intensitas warna semakin hijau. Daun katuk dapat mengandung hampir 7 % protein dan serat kasar 19 %. Daun ini

12

kaya akan vitamin K, selain itu pro-vitamin A ( -karoten), B dan C. Mineral yang dikandungnya adalah kalsium (hingga 2,8 %), besi, kalium, fosfor dan magnesium. f) Daun singkong (Manihot utilisima L) Daun singkong memiliki kandungan klorofil a dan klorofil b yang tinggi. Hal ini menunjukkan bahwa kemampuan singkong dalam menangkap energi radiasi cahaya lebih efisien, sehingga laju fotosintesisnya juga lebih tinggi. Klorofil a dan klorofil b berperan dalam proses fotosintesis. Klorofil b berfungsi sebagai antena fotosintetik yang mengumpulkan cahaya kemudian ditransfer ke pusat reaksi. Pusat reaksi tersusun dari klorofil a. Energi cahaya akan diubah menjadi energi kimia di pusat reaksi yang kemudian dapat digunakan untuk proses reduksi dalam fotosintesis. g) Daun kangkung (Ipomoea aquatica) Kangkung memiliki kandungan klorofil yang relatif rendah yaitu setara dengan daun kemangi. Hal ini diduga klorofil pada tanaman kangkung tersebar, tidak hanya pada organ daun saja namun juga dijumpai pada bagian batang. Hal ini menyebabkan laju fotosintesis berlangsung lama karena tidak efisien dalam menangkap energi radiasi cahaya. h) Daun bayam (Amaranthus spp) Kandungan besi pada bayam relatif lebih tinggi daripada sayuran lain (besi merupakan

penyusun sitokrom, protein yang terlibat dalam proses fotosintesis) sehingga berguna bagi penderita anemia. Daun bayam mempunyai kandungan klorofil yang tinggi, sehingga laju fotosintesisnya juga tinggi.

13

i) Daun pandan (Pandanus amaryllifolius Roxb) Daun pandan mengandung klorofil yang sangat tinggi yang sering digunakan sebagai pewarna alami. Semakin tinggi kandungan klorofilnya maka semakin cepat laju fotosintesisnya dan lebih efisien dalam menangkap energi radiasi cahaya.

II. ALAT DAN BAHAN 2.1 Alat yang digunakan 1. Kolom kaca 2. Gelas ukur 10 ml 3. Corong biasa 4. Batang pengaduk 5. Gelas kimia 250 ml 6. Tabung reaksi 7. Rak tabung reaksi 8. Pipet tetes 9. Lumpang dan alu 10. Statif dan klem 11. Cawan porselin 12. Bunsen + kaki tiga + kain kasa 2.2 Bahan yang digunakan 1. Sampel daun : Puring, sirih hijau, Seledri, kemangi, katuk, singkong, kangkung, bayam, dan pandan. 2. Etanol 3. Glass wool 4. Sebuk Al2O3 ( alumina ) : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 36 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah

14

5. Kertas saring 6. Petroleum eter 7. Kloroform 8. Metanol

III. PROSEDUR KERJA 3.1 Ekstraksi Sampel 1. Melumatkan 10-15 lembar sampel daun dengan lumpang dan alu. 2. Menambahkan 20 mL etanol, mengaduk sampai merata. 3. Menyaring larutan sampel dengan kertas saring melalui corong. 4. Memekatkan larutan dengan menggunakan pembakar bunsen sampai larutan tinggal setengah mL.

3.2 Pembuatan Kromatografi Kolom 1. Menyiapkan kolom gelas 50 mL, tinggi 20 cm dan diameternya 1,5 cm yang bagian bawahnya telah dilengkapi dengan kran. 2. Memasukkan glass wool ke dalam kolom gelas hingga setinggi 1 cm. 3. Melalui corong menuangkan etanol ke dalam kolom hingga setinggi 1 cm. 4. Membuat adonan dari 25 g alumina (Al2O3) dengan 25 mL etanol. 5. Memasukkan adonan tersebut ke dalam kolom hingga setinggi 10 cm sambil mengetuk-ngetuk dengan kran dalam keadaan terbuka, serta secara sedikit demi sedikit (jangan ada gelembung udara). 6. Mengelusi kembali kolom dengan pelarut hingga mencapai permukaan alumina dalam kolom dan memasukkan glass woll.

3.3 Pemisahan Pigmen dari Tumbuhan 1. Memasukkan larutan sampel daun setinggi 2 cm setelah permukaan pelarut etanol turun mendekati penyerap (adonan Al2O3).

15

2. Segera mengelusikan kolom dengan pelarut secara bertahap sesuai dengan kepolarannya yaitu petroleum eter, kloroform, etanol dan metanol. Jika permukaan sampel telah mendekati permukaan penyerap. 3. Menampung tetesan yang keluar dari kolom dengan beberapa tabung reaksi yang bersih. 4. Menghentikan pemberian pelarut bila semua warna telah keluar dari kolom kaca.

IV. HASIL PENGAMATAN No. Perlakuan 1. Menggerus sampel daun + 20 ml etanol 2. Menyaring campuran 3. 4. 5. Hasil Pengamatan Campuran Filtrat: larutan hijau tua Residu: ampas daun Tinggi glass wool 1 cm

6. 7. 8.

Memasukkan glass wool dalam kolom + 1 ml etanol Al2O3 + 25 ml etanol Glass wool dan etanol dalam kolom Memasukkan adonan alumina + Adonan alumina, campuran glass wool kedalam kolom + 2 ml etanol +larutan sampel Mendiamkan sampai larutan sampel menetes Menambahkan petroleum eter Larutan sampel menyebar dan menetes Sampel yang digunakan: A. Daun singkong:
Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau kekuningan larutan kuning

B. Daun Pandan:
Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau kekuningan

16

 Tabung IV + metanol

larutan hijau muda

C. Daun Bayam:
Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau tua larutan hijau tua

D. Daun Kemangi:
Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol

larutan hijau bening larutan hijau kekuningan larutan hijau kekuningan larutan kuning

E. Daun Puring:
Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol

larutan kuning jernih larutan hijau muda larutan hijau muda larutan hijau muda

F. Daun Kangkung:
Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol

larutan hijau tua larutan hijau muda larutan hijau kekuningan larutan hijau bening

G. Daun Sirih:
Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol

larutan kuning bening larutan kuning tua larutan kuning larutan kuning

H. Daun Katuk:
Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol

larutan hijau muda larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau tua

17

I. Daun Seledri:
Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol

larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau muda larutan hijau tua

V. ANALISIS DATA Pada percobaan ini dilakukan pemisahan pigmen dari beberapa sampel daun, yaitu daun Puring, sirih hijau, Seledri, kemangi, katuk, singkong, kangkung, bayam, dan pandan menggunakan kromatografi kolom dengan beberapa pelarut yaitu petroleum eter, kloroform, metanol, dan etanol. Setelah itu menguji masingmasing ekstrak pelarut dari masing-masing sampel daun dengan metode KLT untuk menentukan jenis pigmen yang terkandung dalam daun tersebut.

5.1 Ekstraksi Sampel Daun Pertama-tama menumbuk sampel daun dengan lumpang dan alu, lalu mengekstraksinya dengan menggunakan pelarut etanol. Penumbukan ini bertujuan menghaluskan daun sehingga senyawa yang terkandung di dalamnya mudah larut dalam pelarut etanol, sebab semakin halus daun maka semakin luas permukaan untuk terjadi kontak dengan pelarut maka semakin banyak zat yang dapat terekstrak. Etanol efektif untuk mengekstrak pigmen tumbuhan karena sebagian besar pigmen tumbuhan seperti klorofil, karoten dan xantofil memiliki sifat diantara polar dan non polar sehingga dapat larut dalam etanol yang merupakan pelarut semipolar. Namun proses ekstrasi ini harus dilakukan dengan cepat karena enzim klorofilasi yang terkandung dalam daun segar akan mengkatalisis reaksi antara klorofil dengan etanol sehingga jumlah klorofil dalam daun akan berkurang. Reaksinya adalah sebagai berikut. Etanol + klorofil fitol + etil klorofilida

18

Setelah itu dilakukan penyaringan agar diperoleh filtrat yang mengandung pigmen tanaman, sedangkan residunya dibuang. Larutan hasil ekstrak dengan etanol ini, selanjutnya diuapkan hingga separuh volume mula-mula.

19

5.2 Penyiapan Kolom Kromatografi Selanjutnya membuat kolom kromatografi, dimana langkah pertama yang dilakukan adalah membuat adonan Al2O3 dengan pelarut etanol sehingga terbentuk bubur alumina. Penggunaan etanol ini dikarenakan alumina mengandung titik aktif Al-OH sehingga etanol yang juga mengandung gugus OH akan dapat terikat kuat dengan alumina jadi bubur alumina yang merupakan fase diam akan lebih homogen. Bubur alumina dimasukkan ke dalam kolom sambil mengetuk-ngetuk kolomnya agar tidak terbentuk gelembung udara, kolom harus bebas dari gelembung gas karena bila ada gelembung udara maka proses pemisahan yang terjadi tidak akan sempurna sehingga akan terjadi penyebaran noda ketika hasil kromatografi kolom di uji KLT. Dalam hal ini alumina Al2O3 yang digunakan sebagai adsorben atau fase diamnya, karena Al2O3 lazim digunakan untuk senyawa organik stabil. Selain itu, sebelum dimasukkan alumina, bagian bawah kolom ditutupi dengan glass woll, hal ini bertujuan untuk menahan fase diam (adsorben) alumina agar tidak turun dari kolom karena glass woll merupakan gelas yang masih berpori sehingga dapat menahan alumina, tetapi ekstrak daun masih bisa mengalir. Saat mengisi kolom, kran dibuka agar pelarut etanol dapat keluar sehingga diperoleh fase diam (alumina) yang padat. Setelah itu bagain atas kolom juga diberi glass woll agar ekstrak daun yang akan dimasukkan ke dalam kolom dapat tersaring. Selanjutnya memasukkan kembali etanol untuk mengelusi kolom dan setelah selesai, kran kolom ditutup. 5.3 Pemisahan Pigmen Tanaman Setelah kolom kromatografi siap dipakai, ekstrak sampel daun di masukkan ke dalam kolom. Lalu memasukkan pelarut ke dalam kolom dan membuka krannya. Di sini terlihat bahwa pigmen dari sampel daun mulai bergerak turun dan mulai menetes. Tetesan yang keluar dari kolom ini ditampung dalam tabung reaksi dan mengganti tabung reaksinya ketika warna yang keluar dari kolom berubah. Larutan berawarna ini adalah pigmen dari daun sampel. Adapun pelarut yang digunakan adalah berdasarkan kepolaran yang paling kecil

20

yaitu petroleum eter, kloroform, etanol dan metanol. Pelarut ini digunakan pada kromatografi kolom secara berurutan. Prinsip pemisahan dalam kolom tersebut adalah sebagai berikut. Kita misalkan di dalam suatu ekstrak daun terdapat klorofil, ketika petroleum eter kita masukkan ke dalam kolom, klorofil dalam ekstrak daun akan larut di dalamnya dengan kecepatan yang sama dengan fase geraknya (petroleum eter) dan keluar paling pertama, berarti klorofil tidak teradsorpsi dengan kuat pada alumina. Ini dapat terjadi karena alumina adalah senyawa polar sedangkan klorofil adalah senyawa yang tergolong non polar. Karoten yang merupakan senyawa yang lebih polar daripada klorofil, akan keluar dari kolom lebih lambat dibandingkan klorofil karena karoten akan teradsorbsi lebih kuat dari pada klorofil. Untuk itulah digunakan pelarut berikutnya yang lebih polar dibandingkan petroleum eter yaitu kloroform agar karoten dapat keluar dari kolom dengan lebih cepat namun dengan catatan klorofil sudah keluar seluruhnya. Begitu pula seterusnya digunakan pelarut etanol dan metanol untuk mengeluarkan pigmen yang lebih polar seperti xantofil. Adapun struktur dari senyawa-senyawa yang terkandung dalam daun adalah :

Gambar struktur klorofil a

21

Gambar struktur klorofil b

Gambar struktur -karoten

Gambar struktur -karoten

22

Gambar struktur antosianin Dari penjelasan di atas dapat dikatakan bahwa urutan keluarnya pigmen dari kolom sesuai dengan urutan kepolaran dari pigmen yang paling non polar yaitu klorofil, karoten, baru kemudian xantofil. Walaupun demikian belum dapat dipastikan dalam pelarut apa pigmen-pigmen tersebut terkandung, apakah dalam petroleum eter, kloroform, etanol atau metanol. a. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Puring Dari proses kromatografi kolom dihasilkan empat fraksi. Pada tabung I dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna kuning bening. Sedangkan pada tabung lainnya dengan pelarut kloroform, etanol dan metanol menghasilkan larutan berwarna hijau muda. Warna hijau yang dihasilkan menunjukkan bahwa sampel daun seledri mengandung klorofil karena klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau dengan semua pelarut. Klorofil mengandung sifat nonpolar sehingga dapat larut dalam petroleum eter yang dan kloroform yang juga bersifat nonpolar. Kenonpolaran klorofil dapat dilihat dari strukturnya di mana walaupun klorofil mengandung bagian yang polar namun secara keseluruhan strukturnya adalah nonpolar. Sesuai dengan literatur daun seledri mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan berwarna hijau muda). b. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Kemangi Dari proses kromatografi kolom dihasilkan tiga fraksi ekstrak sesuai dengan pelarutnya, dengan warna yang sedikit berbeda, karena uji KLT tidak

23

dilakukan maka analisis dilakukan berdasarkan harga Rf menurut literatur dan perbedaan warna yang dihasilkan. Untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter berwarna hijau sehingga dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah klorofil. Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen karoten karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar tetapi kepolarannya agak rendah jika dibandingkan dengan petroleum eter. Fraksi ini berwanra hijau kekuningan (warna kuning dominan). Hasil ini sesuai dengan literatur bahwa pigmen karoten memang senyawa yang berwarna kuning. Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung xantofil (C40H50O2) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol dibandingkan dengan karoten. Di samping itu, larutan pada fraksi ini berwarna kuning dan hal ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang berwarna kuning. Dalam hal ini, xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar. c. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Seledri Dari proses kromatografi kolom dihasilkan empat fraksi. Pada tabung I dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna hijau muda. Pada tabung II dengan pelarut kloroform menghasilkan larutan berwarna hijau tua. Tabung III dengan pelarut etanol menghasilkan larutan berwarna hijau muda dan pada tabung IV dengan pelarut metanol menghasilkan larutan yang berwarna hijau. Warna hijau yang dihasilkan menunjukkan bahwa sampel daun seledri mengandung klorofil karena klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau dengan semua pelarut. Klorofil mengandung sifat nonpolar sehingga dapat larut dalam petroleum eter yang dan kloroform yang juga bersifat nonpolar. Kenonpolaran klorofil dapat dilihat dari strukturnya di mana walaupun klorofil mengandung bagian yang polar namun secara keseluruhan strukturnya adalah nonpolar. Sesuai dengan literatur daun seledri mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan berwarna hijau muda).

24

d. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Singkong Dari proses kromatografi kolom diperoleh empat fraksi. Untuk pelarut petroleum eter menghasilkan ekstrak warna hijau muda menunjukkan adanya pigmen klorofil b (C55H70O6N4Mg). Pelarut kloroform menghasilkan ekstrak warna hijau tua menunjukkan adanya pigmen klorofil a (C55H72O6N4Mg). Klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau dengan sifat nonpolar sehingga mudah larut dalam petroleum eter maupun kloroform. Pelarut etanol menghasilkan ekstrak berwarna hijau kekuningan menunjukkan adanya pigmen karoten. Meskipun karoten bersifat nonpolar, tetapi kepolarannya agak rendah sehingga dapat larut dalam etanol. Untuk pelarut metanol menghasilkan ekstrak berwarna kuning menunjukkan adanya pigmen xantofil. Untuk uji KLT, harga Rf yang besar menunjukkan bahwa komponen tersebut lebih larut dalam eluennya. Berbanding terbalik dengan harga Rf yang kecil, artinya komponen tersebut kurang larut dalam pelarut etanol. Karena pelarut yang digunakan adalah etanol yang bersifat polar, maka bila harga Rf kecil, larutan tersebut memiliki komponen yang bersifat nonpolar, dan sebaliknya apabila harga Rf besar, komponen yang terkandung bersifat lebih polar. Berdasarkan hal tersebut maka dapat diketahui bahwa harga Rf xantofil terhadap metanol lebih besar daripada harga Rf karoten terhadap etanol. Harga Rf karoten terhadap etanol lebih besar daripada harga Rf klorofil a terhadap kloroform, dan harga Rf klorofil b terhadap petroleum eter paling kecil. e. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Bayam Dari proses kromatografi kolom diperoleh tiga fraksi ekstrak sesuai pelarutnya. Dengan pelarut petroleum eter terdapat klorofil dengan warna larutan hijau. Namun pada pelarut metanol dan kloroform masih menghasilkan klorofil, dimana seharusnya untuk pelarut kloroform dapat menghasilkan pigmen karoten dan untuk pelarut metanol menghasilkan pigmen xantofil. Pigmen xantofil dihasilkan dari pelarut petroleum eter dan etanol. f. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Katuk

25

Dari proses kromatografi kolom dihasilkan tiga fraksi ekstrak sesuai dengan pelarutnya, dengan warna yang sedikit berbeda, karena uji KLT tidak dilakukan maka analisis dilakukan berdasarkan harga Rf menurut literatur dan perbedaan warna yang dihasilkan. Untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter berwarna hijau sehingga dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah klorofil. Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen karoten karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar tetapi kepolarannya agak rendah jika dibandingkan dengan petroleum eter. Fraksi ini berwarna hijau kekuningan (warna kuning dominan). Hasil ini sesuai dengan literatur bahwa pigmen karoten memang senyawa yang berwarna kuning. Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung xantofil (C40H50O2) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol dibandingkan dengan karoten. Di samping itu, larutan pada fraksi ini berwarna kuning dan hal ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang berwarna kuning. Dalam hal ini, xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar. g. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Pandan Dalam pemisahan pigmen tanaman dari daun pandan, untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter (nonpolar) berwarna hijau sehingga dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah klorofil. Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen karoten karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar dimana pigmennya berwarna hijau. Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung xantofil (C40H50O2) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol dibandingkan dengan karoten. Di samping itu, larutan pada fraksi ini berwarna hijau kekuningan dan hal ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang berwarna kuning. Dalam hal ini, xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar.

26

h. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Sirih Hijau Untuk perhitungan harga Rf tidak dilakukan uji KLT namun berdasarkan literatur yang ada, ada 5 tabung reaksi yang kemudian diuji dengan KLT dengan kenampakan noda yang terlihat setelah disinari lampu UV (berwarna jingga) dan diurutkan dari warna yang paling muda sampai tua. Hasil pemisahan pigmen yang diperoleh melalui kromatografi kolom adalah klotofil, xantofil dan karoten. Klorofil dan karoten sama-sama bersifat non polar, namun karena karoten sedikit lebih bersifat polar maka karoten lebih lambat keluar daripada klorofil. Klorofil keluar bersama dengan pelarut petroleum eter, sedangkan karoten keluar bersama dengan pelarut kloroform. Sedangkan xantofil yang mudah larut dalam alkohol akan keluar bersama dengan pelarut etanol dan metanol. i. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Kangkung Dari proses kromatografi kolom dihasilkan enam fraksi. Pada tabung I dan II dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna hijau tua dan hijau lebih tua. Pada tabung III dengan pelarut kloroform menghasilkan larutan berwarna hijau muda. Tabung IV sampai VI dengan pelarut etanol dan metanol menghasilkan warna hijau kekuningan. Warna hijau yang dihasilkan

menunjukkan bahwa sampel daun kangkung mengandung klorofil karena klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau. Sedangkan warna hijau kekuningan menunjukkan adanya karoten karena karoten merupakan senyawa yang berwarna hijau kekuningan. Klorofil mengandung bagian yang polar walaupun secara keseluruhan stukturnya adalah senyawa nonpolar. Oleh karena itu, klorofil dapat larut dalam pelarut petroleum eter dan kloroform yang bersifat nonpolar. Sesuai dengan literatur di mana daun kangkung mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan berwarna hijau muda). Sedangkan karoten merupakan senyawa yang dapat larut dalam etanol.

27

28

Dari percobaan ini dapat disimpulkan bahwa jenis pigmen dalam tiap sampel daun untuk tiap fraksinya adalah sebagai berikut : No. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Sampel Daun Singkong Pandan Bayam Kemangi Puring Kangkung Sirih Katuk Seledri Petroleum eter Klorofil Klorofil Klorofil Klorofil Xantofil Klorofil Xantofil Klorofil Klorofil Kloroform Klorofil Klorofil Klorofil Karoten Klorofil Klorofil Xantofil Klorofil Klorofil Etanol Karoten Karoten Klorofil Karoten Klorofil Karoten Xantofil Klorofil Klorofil Metanol Xantofil Klorofil Klorofil Xantofil Klorofil Klorofil Xantofil Klorofil Klorofil

Untuk uji KLT, menurut literatur harga Rf standar untuk masing-masing komponen adalah sebagai berikut : - Fraksi 1 (petroleum eter) yang mengandung klorofil; Rf = 0,75 - Fraksi 2 (kloroform) yang mengandung karoten; Rf = 0,756 - Fraksi 3 (etanol) yang mengandung xantofil; Rf = 0,767 - Fraksi 4 (metanol) yang mengandung xantofil; Rf = 0,767

VI. KESIMPULAN 1. Pada percobaan pemisahan pigmen dari tanaman dari semua sampel tanaman dilakukan dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut yaitu etanol untuk melarutkan pigmen sampel daun. 2. Pemisahan menggunakan kromatografi kolom yang fase diam berupa Alumina dan fase gerak yaitu petroleum eter, kloroform, metanol dan etanol. 3. Pemisahan dengan kromatografi kolom dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom, yang ditentukan oleh kekuatan adsorspi atau koefisien partisi antara fasa gerak dan fasa diam.

29

4. Berdasarkan percobaan, daun singkong dan kemangi mengandung pigmen klorofil, karoten, xantofil. Daun pandan dan kangkung mengandung pigmen klorofil dan karoten. Daun bayam, katuk dan seledri mengandung pigmen klorofil. Daun puring mengandung pigmen klorofil dan xantofil. Daun sirih mengandung pigmen xantofil.

VII. DAFTAR PUSTAKA Anwar, Chairil, Bambang Purwono, harno Dwi Pranowo dan Tutik dwi Wahyuningsih. 1996. Pengantar Praktikum Kimia Organik. Yogyakarta : Depdikbud. Gritter, J., dkk. 1991. Pengantar Kromatografi. Bandung : ITB. Hendayana, Sumar. 2006. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis Modern. Bandung : Remaja Rosdakarya. Robinson, Trevon. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Bandung : ITB. Tim Dosen Kimia Organik. 2010. Panduan Praktikum Kimia Organik II. FKIP Banjarmasin : UNLAM. (Tidak dipublikasikan).

30

VIII. LAMPIRAN 8.1 Pertanyaan dan Jawaban 1. Mengapa tidak boleh ada gelembung udara dalam timbunan penyerap di dalam kolom ? 2. Identifikasi pigmen apa saja yang keluar dari kolom secara berurutan dan jelaskan mengapa terjadi demikian ? 3. Apakah teknik yang anda lakukan berhasil memisahkan pigmen seperti yang diinginkan ? Jawaban 1. Tidak boleh ada gelembung udara dalam timbunan penyerap di dalam kolom karena dapat mengakibatkan distribusi yang tidak merata (ketidakhomogenan penyerap), sehingga pemisahan menjadi kurang baik (tidak sempurna). Akibatnya terjadi penyebaran noda ketika larutan hasil kromatografi kolom di KLT. 2. Pigmen yang keluar pertama bersama petroleum benzen adalah klorofil. Hal ini dikarenakan klorofil dan petroleum benzen bersifat nonpolar sehingga petroleum benzen dapat melarutkan pigmen klorofil. Kemudian disusul dengan fraksi kloroform dengan pigmen karoten, dimana karoten dan kloroform sama-sama nonpolar tetapi sedikit polar dibandingkan dengan klorofil dan petroleum benzen. Sedangkan fraksi yang muncul selanjutnya adalah fraksi etanol dan disusul fraksi metanol yang membawa pigmen xantofil, fraksi ini muncul terakhir karena pigmen ini lebih larut dalam alkohol. 3. Teknik yang telah dilakukan berhasil memisahkan pigmen seperti yang diharapkan karena melalui fraksi-fraksi tersebut dimungkinkan ada 3 pigmen yang muncul yaitu karoten, xantofil dan klorofil. Namun proses pemisahannya kurang sempurna, hal ini mungkin dikarenakan: a. Tidak dilakukannya homogenasi alumina sebagai fase diam. b. Penambahan tiap-tiap pelarut yang secara terus-menerus tanpa menunggu tetesan untuk fraksi pelarut tertentu itu habis.

31

c. Pergantian tabung reaksi untuk penampungan tidak dilakukan berdasarkan waktu tertentu atau sampai pelarut tidak menetes lagi, melainkan berdasarkan warna. Fraksi pigmen yang dihasilkan kurang spesifik karena mata memiliki keterbatasan dalam menentukan warna jadi kemungkinan ada fraksi yang tercampur.

32

8.2 Flow Chart A. Ekstraksi Sampel 10-15 lembar daun contoh* - Melumatkan dalam lumpang - Menambahkan beberapa mL etanol Lumatan daun contoh + etanol - Mengaduk sampai merata Campuran - Menyaring melalui corong biasa dengan kertas saring

Residu

Filtrat - Memekatkan dengan alat rotavapor sampai cairan tinggal beberapa mL

Pelarut

Larutan pekat

N/B: * Sampel daun : Puring, sirih hijau, Seledri, kemangi, katuk, singkong, kangkung, bayam, dan pandan

33

B. Pembuatan Kromatografi Kolom

Glass wool - Memasukan ke dalam kolom kaca setinggi 20 cm, hingga setinggi 1 cm Glass wool + Etanol - Menuangkannya melalui corong dan memasukannya ke dalam kolom hingga setinggi 10 cm

Campuran I

Al2O3 + etanol - Membuat adonan

Adonan alumina

Campuran 1 + adonan - Memasukkan adonan melalui corong ke dalam kolom sehingga setinggi 15 cm sambil mengetukngetuk dan keran dalam keadaan terbuka

Campuran II

34

C. Pemisahan Pigmen dari Tanaman Campuran II + etanol - Mengelusi kembali, kemudian menutup keran Campuran III + glass wool - Memasukkan - Membuka keran Campuran IV + etanol - Membuka keran - Mengelusi kembali kolom dan mengatur keran sampai terjadi kira-kira 20 tetes per menit, sampai permukaan pelarut turun mendekati penyerap (adonan Al2O3) Campuran V + larutan contoh - Memasukkan setinggi 1 cm Campuran VI + pelarut - Segera mengelusikan kolom dengan pelarut secara bertahap sesuai dengan kepolarannya (**yaitu petroleum benzen, kloroform, etanol dan metanol), jika permukaan sampel telah mendekati permukaan penyerap - Menampung tetesan yang keluar dari kolom dengan beberapa tabung reaksi yang bersih - Memisahkan berdasarkan warnanya - Menghentikan pemberian pelarut bila semua warna telah keluar dari kolom Larutan berwarna NB : - Kemudian melanjutkan dengan KLT dengan larutan pengembang yang sesuai (etanol)

35

LAMPIRAN FOTO FOTO PERCOBAAN

Gambar 17. Kolom kromatografi

Gambar 18. Sampel ekstrak daun puring pada KK

Gambar 19. Sampel ekstrak daun puring mulai turun pada KK

Gambar 20. Sampel ekstrak daun andong pada KK

36

37