PERCOBAAN IV

Judul Tujuan

: Pemisahan Pigmen dari Tanaman : Pada akhir percobaan ini Mahasiswa harus paham mengenai 1. Cara kerja dan teknik-teknik isolasi tumbuhan. 2. Pengenalan isolasi bahan alam yang bermolekul besar. 3. Analisa senyawa tumbuhan berwarna dengan

menggunakan KLT dan kromatografi kolom Hari/tanggal Tempat : Selasa / 5 April 2011 : Laboratorium kimia FKIP UNLAM Banjarmasin

I.

DASAR TEORI

1.1 Daun dan Pigmen Tanaman Daun merupakan salah satu organ tumbuhan yang tumbuh dari batang, umumnya berwarna hijau daun dan terutama berfungsi sebagai penangkap energi cahaya matahari melalui fotosintesis. Bentuk daun sangat beragam namun biasanya berupa helaian, bisa tipis atau tebal. Daun juga bisa bermodifikasi menjadi duri (misalnya kaktus) dan berakibat daun kehilangan fungsinya sebagai organ fotosintetik. Warna hijau pada daun berasal dari kandungan klorofil pada daun. Daun seringkali mengandung beberapa senyawa yang berwarna (pigmen) antara lain klorofil (hijau), karoten (kuning) dan xantofil (kuning). Meskipun klorofil mengandung bagian yang polar, akan tetapi secara keseluruhan strukturnya adalah non polar, seperti hidrokarbon, sehingga klorofil mudah larut dalam pelarut non polar seperti eter atau petroleum eter. Ada dua jenis klorofil yaitu klorofil a dan klorofil b, yang membedakan kedua jenis klorofil ini adalah adanya gugus aldehid pada struktur klorofil b yang menyebabkan klorofil b ini bersifat sedikit lebih polar dibandingkan klorofil a. Adapun struktur dari kedua jenis klorofil ini adalah sebagai berikut.

1

Gambar 1. Struktur klorofil a

Gambar 2. Struktur klorofil b

Karoten C40H56 adalah senyawa alkena dengan rantai panjang dari sistem ikatan rangkap terkonjugasi. Daun hijau mengandung sekitar 90% betakaroten dan 10 % alpha karoten. Meskipun secara keseluruhan molekul karoten adalah non polar, akan tetapi mempunyai sifat dapat mengubah bidang polarisasi. Karoten juga ada dua jenis yaitu a-karoten dan β-karoten, yang membedakan kedua struktur ini adalah posisi ikatan rangkap pada cincin ujung. Adapun strukturnya adalah sebagai berikut.

2

Gambar 3. Struktur α-karoten

Gambar 4. Struktur β-karoten

Xantofil C40H50O2 adalah bentuk karoten yang terhidroksilasi, kandungan xantofil dalam daun hijau selalu dua kali lebih besar dari karoten. Xantofil lebih larut dalam alkohol dan sedikit larut dalam petroleum eter dibandingkan karoten. Xantofil memiliki struktur yang mirip dengan karoten, hanya bedanya xantofil memiliki gugus OH pada struktur sikliknya. Adapun struktur dari xantofil adalah sebagai berikut.

Gambar 5. Struktur xantofil

Selain itu, di dalam daun juga mengandung antosianin yang berwarna merah, biru atau ungu tergantung derajat keasamannya. Untuk mengekstraksi pigmen dari daun, terlebih dahulu dilakukan penggerusan dengan mortar terhadap daun kering sampai halus. Pelarut yang dapat mengekstraksi pigmen secara bertahap dengan urutan kepolaran yaitu petroleum eter, kloroform, etanol, dan metanol. Adapun struktur umum dari antosianin adalah sebagai berikut.

3

sehingga ikatannya kuat dan rapat. Kromatografi kolom bertujuan untuk mengisolasi komponen dari campurannya. Perbedaan kemampuan masing-masing komponen diadsorpsi dan perbedaan distribusi dua fase yang tidak saling bercampur (partisi). yakni fase diam dan fase gerak. Alat yang digunakan yaitu kolom yang di dalamnya berisi fase stasioner (padat atau cair).2 Kromatografi Kolom dan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Kromatografi adalah prinsip pemisahan campuran senyawa atas komponenkomponen berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi komponen pada dua fase. dapat dilakukan dengan kromatografi kolom. adsorben silika gel mampu menghasilkan proses pemisahan yang lebih optimal. Dengan demikian. sangat tergantung pada distribusi pada kedua fase cair dan padat. Untuk pemisahan pigmen dari tumbuhan. Struktur umum antosianin 1. kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis (KLT). Campuran ditambahkan ke kolom dari satu ujung dan campuran akan bergerak dengan bantuan pengembang yang cocok (fase gerak). Pada kromatogarfi kolom digunakan kolom dengan adsorben sillika gel karena kolom yang dibentuk dengan silika gel memiliki tekstur dan struktur yang lebih kompak dan teratur. Pemisahan suatu campuran secara kromatografi dapat dilakukan kromatografi kolom. 4 . Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom.Gambar 6. Silika gel memadat dalam bentuk tetrahedral raksasa. Pemisahan berdasarkan kromatografi adsorpsi. yang ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara fase gerak dan fase diam (stationer).

yaitu : 1) Kromatografi fase normal Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya “normal” bersifat polar. aromatis. adsorben silika gel harus senantiasa basah karena. Oleh karenanya. Kromatografi kolom dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya dapat dibedakan menjadi dua. plastik atau nilon. Selain itu. Ukuran kolom yang lazim digunakan mempunyai diameter dalam 2 cm dan panjang 45 cm. Dalam proses pemisahan dengan kromatografi kolom. karena pada permukaannya terikat gugus hidroksil. 2) Kromatografi fase terbalik Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar. kondisi yang senantiasa basah berperan untuk memudahkan proses elusi (larutan melewati kolom) dalam kolom. keton. aldehid dan alkohol. eter. Untuk menahan fasa diam (adsorben) biasanya digunakan kapas gelas (glass wool) atau gelas berpori (fritted glass). silica gel sifatnya sangat polar. sehingga proses pemisahan zat tidak berjalan optimal. Ujung bagian bawah dilengkapi dengan kran untuk mengatur laju alir eluen. kolom yang terbentuk dari silika gel bisa retak. Sorben yang digunakan dalam kromatografi kolom diantaranya arang. Berikut ini beberapa golongan solutnya misalnya alkana. alumina. senyawa-senyawa yang semakin polar akan semakin lama tertahan di fasa stasioner. Jika fasa gerak yang digunakan sifatnya non-polar. sedangkan fase geraknya bersifat polar. jika dibiarkan kering. kalsium sulfat dan serbuk selulosa. 5 .Silica gel dapat membentuk ikatan hidrogen di permukaannya. maka pada saat campuran dimasukkan. misalnya silica gel. Kolom yang digunakan dalam kromatografi kolom dapat berupa gelas. dan senyawa-senyawa yang semakin tidak (kurang) polar akan terbawa keluar kolom lebih cepat. ester. magnesium silikat. kebalikan dari fase normal. sedangkan fase geraknya bersifat non polar. silika gel. alkena.

6 .

Bagan kolom kromatografi Gambar 8.Berikut ini gambar-gambar bagan dalam kromatografi kolom : Gambar 7. Kolom berisi sampel 7 .

tanah diatome. lembaran aluminium maupun plastik dengan tebal tertentu.063 – 0. selulosa dan lainnya yang mempunyai ukuran butir sangat kecil yaitu 0. Dalam kromatografi lapis tipis (KLT) fase diamnya biasanya adalah serbuk silika gel.125 mm dilapiskan pada kaca. Proses pemisahan pigmen tanaman Dalam pemisahan biasanya kromatografi kolom diikuti pemeriksaan secara kualitatif dengan KLT untuk memonitor apakah pemeriksaan dengan cara kromatografi kolom berhasil atau tidak.Gambar 9. plat diangkat dan dikeringkan. Ketika eluen sudah mencapai batas pada plat yang telah dibuat sebelumnya. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending) atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending). Setelah 8 . alumina. sampel ditotolkan pada plat KLT lalu dimasukkan ke dalam chamber yang sudah jenuh oleh eluen. Pada prakteknya.

Berikut ini gambar-gambar bagan dalam kromatografi lapis tipis (KLT). Metoda identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut. maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa. Gambar 10. Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi yang konstan merupakan besaran yang karakteristik dan reprodusibel. Pigmen dalam sampel menuju batas atas plat KLT 9 . Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi lapis tipis. menggunakan harga Rf. Bagan kromatografi lapis tipis (KLT) Gambar 11.daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi.

fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet. tapi bergelombang 10 . Beragam kultival telah dikembangkan dengan variasi warna hijau. merah. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna. Perbandingan untuk perhitungan Rf Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan lebih murah dibandingkan dengan kromatografi kolom. ungu. peralatan yang digunakan lebih sederhana dan dapat dikatakan hampir semua laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat.  Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending). serta campurannya.  Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak. kuning. jingga. Beberapa keuntungan dari kromatografi planar ini adalah :   Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis.Gambar 12. Bentuk daunnya bermacam-macam. Dalam kromatografi lapis tipis. menurun (descending). Demikian juga peralatan yang digunakan. atau dengan cara elusi 2 dimensi.3 Beberapa Jenis Tumbuhan a) Daun Puring (Codiaeum variegatum) Puring atau kroton adalah tumbuhan hias pekarangan populer berbentuk perdu dengan bentuk dan warna daun yang sangat bervariasi. 1. memanjang. oval.

xantofil dan antosianin. puring adalah kerabat jauh singkong serta kaksuba. Sirih hijau sejak dahulu telah digunakan oleh masyarakat sebagai obat untuk menyembuhkan berbagai jenis penyakit. Secara botani. namun masih juga mengandung warna hijau yaitu berada pada bagian dalam. tannin dan flavonoid. Dalam daun sirih hijau terkandung senyawa fitokimia yakni alkaloid. c) Daun seledri (Apium graveolens) Seledri adalah sayuran dan tumbuhan obat yang biasa digunakan sebagai bumbu masakan. Klorofil adalah senyawa pigmen yang berperan dalam menyeleksi panjang gelombang cahaya yang energinya diambil dalam fotosintesis. hepatitis. Warna daun sirih hijau memang merah kepekatan. batu ginjal dan sebagainya. Penggunaan sirih hijau dapat digunakan dalam bentuk segar. saponin. maupun ekstrak kapsul. Daun sirih hijau berasa pahit dan getir. seperti diabetes. Ciri yang sama adalah batangnya menghasilkan biloks berwarna putih pekat dan lengket.helainya terputus-putus dan sebagainya. namun beraroma lebih wangi dibandingkan dengan sirih hijau. Beberapa negara termasuk Jepang. Secara empiris sirih hijau dapat menyembuhkan berbagai jenis penyakit. b) Daun sirih hijau (Piper crocatum) Daun sirih hijau (Piper crocatum) termasuk dalam family piperaceae. Pigmen lain yang terkandung dalam daun adalah karoten. Cina dan Korea mempergunakan bagian tangkai daun sebagai bahan 11 . yang tumbuh merambat dengan bentuk daun menyerupai hati dan bertangkai yang tumbuh berselang-seling dari batangnya serta penampakan daun yang berwarna merah keperakan dan mengkilap. yang merupakan ciri khas suku Euphobaceae. Warna hijau pada daun berasal dari kandungan klorofil.

Kandungan utamanya adalah butilftalida dan butilidftalida sebagai pembawa aroma utama.1 . dan umbinya semua dimanfaatkan. Kandungan asam lemak utama adalah asam petroselin (40-60%). morfologi daun dan tahapan fisiologis suatu tanaman merupakan faktor yang menentukan kandungan klorofil. Selain itu. tromboksan. Kandungan vitamin C pada daun katuk jauh lebih tinggi daripada jeruk maupun jambu biji. Sifat fisika pada klorofil daun katuk dapat dilihat pada semakin tinggi suhu pengeringan. daun berukuran kecil dengan helaian daun yang tipis. Komponen lainnya apiin. Terdapat juga sejumlah flavonoid seperti graveobiosid A (1-2%)dan B (0. daun kemangi hanya tersusun dari selapis jaringan palisade. glukokortikoid) dan senyawa eikosanoid (diantaranya prostaglandin. Daun katuk dapat mengandung hampir 7 % protein dan serat kasar 19 %. Di Indonesia tumbuhan ini diperkenalkan oleh penjajah Belanda dan digunakan daunnya untuk menyedapkan sup atau sebagai lalapan.7%). isokuersitrin. Umur daun. Penggunaan seledri paling lengkap adalah di Eropa: daun. serta senyawa golongan fenol. kadar klorofil semakin tinggi dan intensitas warna semakin hijau. buah. terstosteron.0.makanan. Daun ini 12 . furanokumarin. prostasiklin. lipoksin dan leukotrien). tangkai daun. Khususnya jaringan palisade yang mengandung klorofil. e) Daun katuk (Sauropus androgynus) Sifat kimia daun katuk dapat dilihat dari kadar kalsium yang tinggi. Hal ini dikarenakan kemangi merupakan tanaman semusim. mesofil. Daun dan tangkai daun mengandung steroid seperti stigmasterol dan sitosterol. Terdapat tujuh senyawa aktif yang dapat merangsang produksi hormon-hormon steroid (seperti progesteron. serta isoimperatorin. estradiol. d) Daun kemangi (Ocimum sanctum) Daun kemangi memiliki kandungan klorofil yang paling rendah.

kaya akan vitamin K. Klorofil b berfungsi sebagai antena fotosintetik yang mengumpulkan cahaya kemudian ditransfer ke pusat reaksi. Hal ini menunjukkan bahwa kemampuan singkong dalam menangkap energi radiasi cahaya lebih efisien. protein yang terlibat dalam proses fotosintesis) sehingga berguna bagi penderita anemia. tidak hanya pada organ daun saja namun juga dijumpai pada bagian batang.8 %). selain itu pro-vitamin A ( β-karoten). Daun bayam mempunyai kandungan klorofil yang tinggi. sehingga laju fotosintesisnya juga lebih tinggi. g) Daun kangkung (Ipomoea aquatica) Kangkung memiliki kandungan klorofil yang relatif rendah yaitu setara dengan daun kemangi. Pusat reaksi tersusun dari klorofil a. Klorofil a dan klorofil b berperan dalam proses fotosintesis. 13 . B dan C. Energi cahaya akan diubah menjadi energi kimia di pusat reaksi yang kemudian dapat digunakan untuk proses reduksi dalam fotosintesis. kalium. Hal ini diduga klorofil pada tanaman kangkung tersebar. Hal ini menyebabkan laju fotosintesis berlangsung lama karena tidak efisien dalam menangkap energi radiasi cahaya. h) Daun bayam (Amaranthus spp) Kandungan besi pada bayam relatif lebih tinggi daripada sayuran lain (besi merupakan penyusun sitokrom. sehingga laju fotosintesisnya juga tinggi. Mineral yang dikandungnya adalah kalsium (hingga 2. besi. f) Daun singkong (Manihot utilisima L) Daun singkong memiliki kandungan klorofil a dan klorofil b yang tinggi. fosfor dan magnesium.

Bunsen + kaki tiga + kain kasa 2.i) Daun pandan (Pandanus amaryllifolius Roxb) Daun pandan mengandung klorofil yang sangat tinggi yang sering digunakan sebagai pewarna alami. Kolom kaca 2.2 Bahan yang digunakan 1. Semakin tinggi kandungan klorofilnya maka semakin cepat laju fotosintesisnya dan lebih efisien dalam menangkap energi radiasi cahaya. Sampel daun : Puring. dan pandan. Rak tabung reaksi 8.1 Alat yang digunakan 1. Corong biasa 4. Seledri. Glass wool 4. Lumpang dan alu 10. Gelas ukur 10 ml 3. katuk. II. Etanol 3. Pipet tetes 9. ALAT DAN BAHAN 2. Sebuk Al2O3 ( alumina ) : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 36 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah 14 . singkong. Cawan porselin 12. Statif dan klem 11. bayam. Tabung reaksi 7. sirih hijau. kemangi. Gelas kimia 250 ml 6. 2. kangkung. Batang pengaduk 5.

3.1 Ekstraksi Sampel 1. 2. Petroleum eter 7. Memasukkan larutan sampel daun setinggi 2 cm setelah permukaan pelarut etanol turun mendekati penyerap (adonan Al2O3). 4. Memasukkan glass wool ke dalam kolom gelas hingga setinggi 1 cm.2 Pembuatan Kromatografi Kolom 1. Metanol III. 15 .5 cm yang bagian bawahnya telah dilengkapi dengan kran.3 Pemisahan Pigmen dari Tumbuhan 1. 2. 5. Mengelusi kembali kolom dengan pelarut hingga mencapai permukaan alumina dalam kolom dan memasukkan glass woll. Kertas saring 6. Melalui corong menuangkan etanol ke dalam kolom hingga setinggi 1 cm. PROSEDUR KERJA 3. serta secara sedikit demi sedikit (jangan ada gelembung udara). Memekatkan larutan dengan menggunakan pembakar bunsen sampai larutan tinggal setengah mL.5. tinggi 20 cm dan diameternya 1. mengaduk sampai merata. 3. Memasukkan adonan tersebut ke dalam kolom hingga setinggi 10 cm sambil mengetuk-ngetuk dengan kran dalam keadaan terbuka. Melumatkan 10-15 lembar sampel daun dengan lumpang dan alu. Kloroform 8. 4. Menambahkan 20 mL etanol. 3. Menyaring larutan sampel dengan kertas saring melalui corong. 3. Membuat adonan dari 25 g alumina (Al2O3) dengan 25 mL etanol. Menyiapkan kolom gelas 50 mL. 6.

Menyaring campuran 3. Menggerus sampel daun + 20 ml etanol 2. 5.2. kloroform. 4. 3. Menampung tetesan yang keluar dari kolom dengan beberapa tabung reaksi yang bersih. Memasukkan glass wool dalam kolom + 1 ml etanol Al2O3 + 25 ml etanol Glass wool dan etanol dalam kolom Memasukkan adonan alumina + Adonan alumina. Daun singkong:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau kekuningan larutan kuning B. 4. 8. HASIL PENGAMATAN No. Perlakuan 1. Segera mengelusikan kolom dengan pelarut secara bertahap sesuai dengan kepolarannya yaitu petroleum eter. etanol dan metanol. IV. Daun Pandan:  Tabung I + petroleum eter  Tabung II + Kloroform  Tabung III + Etanol  larutan hijau muda  larutan hijau tua  larutan hijau kekuningan 16 . 7. campuran glass wool kedalam kolom + 2 ml etanol +larutan sampel Mendiamkan sampai larutan sampel menetes Menambahkan petroleum eter Larutan sampel menyebar dan menetes Sampel yang digunakan: A. Jika permukaan sampel telah mendekati permukaan penyerap. Menghentikan pemberian pelarut bila semua warna telah keluar dari kolom kaca. Hasil Pengamatan Campuran Filtrat: larutan hijau tua Residu: ampas daun Tinggi glass wool 1 cm 6.

Daun Kemangi:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau bening larutan hijau kekuningan larutan hijau kekuningan larutan kuning E. Daun Katuk:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau muda larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau tua 17 . Daun Bayam:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau tua larutan hijau tua D. Daun Sirih:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan kuning bening larutan kuning tua larutan kuning larutan kuning H. Daun Kangkung:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau tua larutan hijau muda larutan hijau kekuningan larutan hijau bening G. Daun Puring:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan kuning jernih larutan hijau muda larutan hijau muda larutan hijau muda F. Tabung IV + metanol  larutan hijau muda C.

metanol. kangkung. Setelah itu menguji masingmasing ekstrak pelarut dari masing-masing sampel daun dengan metode KLT untuk menentukan jenis pigmen yang terkandung dalam daun tersebut. Reaksinya adalah sebagai berikut. dan pandan menggunakan kromatografi kolom dengan beberapa pelarut yaitu petroleum eter.I. Daun Seledri:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau muda larutan hijau tua V.1 Ekstraksi Sampel Daun Pertama-tama menumbuk sampel daun dengan lumpang dan alu. yaitu daun Puring. 5. Etanol efektif untuk mengekstrak pigmen tumbuhan karena sebagian besar pigmen tumbuhan seperti klorofil. Seledri. Namun proses ekstrasi ini harus dilakukan dengan cepat karena enzim klorofilasi yang terkandung dalam daun segar akan mengkatalisis reaksi antara klorofil dengan etanol sehingga jumlah klorofil dalam daun akan berkurang. karoten dan xantofil memiliki sifat diantara polar dan non polar sehingga dapat larut dalam etanol yang merupakan pelarut semipolar. Etanol + klorofil → fitol + etil klorofilida 18 . kloroform. singkong. ANALISIS DATA Pada percobaan ini dilakukan pemisahan pigmen dari beberapa sampel daun. kemangi. Penumbukan ini bertujuan menghaluskan daun sehingga senyawa yang terkandung di dalamnya mudah larut dalam pelarut etanol. dan etanol. lalu mengekstraksinya dengan menggunakan pelarut etanol. bayam. sirih hijau. sebab semakin halus daun maka semakin luas permukaan untuk terjadi kontak dengan pelarut maka semakin banyak zat yang dapat terekstrak. katuk.

Larutan hasil ekstrak dengan etanol ini. selanjutnya diuapkan hingga separuh volume mula-mula. 19 . sedangkan residunya dibuang.Setelah itu dilakukan penyaringan agar diperoleh filtrat yang mengandung pigmen tanaman.

Setelah itu bagain atas kolom juga diberi glass woll agar ekstrak daun yang akan dimasukkan ke dalam kolom dapat tersaring. Adapun pelarut yang digunakan adalah berdasarkan kepolaran yang paling kecil 20 . kran kolom ditutup. Selain itu. kran dibuka agar pelarut etanol dapat keluar sehingga diperoleh fase diam (alumina) yang padat. Bubur alumina dimasukkan ke dalam kolom sambil mengetuk-ngetuk kolomnya agar tidak terbentuk gelembung udara.5. Lalu memasukkan pelarut ke dalam kolom dan membuka krannya. Saat mengisi kolom. Di sini terlihat bahwa pigmen dari sampel daun mulai bergerak turun dan mulai menetes. dimana langkah pertama yang dilakukan adalah membuat adonan Al2O3 dengan pelarut etanol sehingga terbentuk bubur alumina. ekstrak sampel daun di masukkan ke dalam kolom. Selanjutnya memasukkan kembali etanol untuk mengelusi kolom dan setelah selesai. bagian bawah kolom ditutupi dengan glass woll. Penggunaan etanol ini dikarenakan alumina mengandung titik aktif Al-OH sehingga etanol yang juga mengandung gugus OH akan dapat terikat kuat dengan alumina jadi bubur alumina yang merupakan fase diam akan lebih homogen. hal ini bertujuan untuk menahan fase diam (adsorben) alumina agar tidak turun dari kolom karena glass woll merupakan gelas yang masih berpori sehingga dapat menahan alumina. sebelum dimasukkan alumina. karena Al2O3 lazim digunakan untuk senyawa organik stabil. kolom harus bebas dari gelembung gas karena bila ada gelembung udara maka proses pemisahan yang terjadi tidak akan sempurna sehingga akan terjadi penyebaran noda ketika hasil kromatografi kolom di uji KLT. tetapi ekstrak daun masih bisa mengalir. Dalam hal ini alumina Al2O3 yang digunakan sebagai adsorben atau fase diamnya.3 Pemisahan Pigmen Tanaman Setelah kolom kromatografi siap dipakai. 5. Tetesan yang keluar dari kolom ini ditampung dalam tabung reaksi dan mengganti tabung reaksinya ketika warna yang keluar dari kolom berubah.2 Penyiapan Kolom Kromatografi Selanjutnya membuat kolom kromatografi. Larutan berawarna ini adalah pigmen dari daun sampel.

Prinsip pemisahan dalam kolom tersebut adalah sebagai berikut. berarti klorofil tidak teradsorpsi dengan kuat pada alumina. Ini dapat terjadi karena alumina adalah senyawa polar sedangkan klorofil adalah senyawa yang tergolong non polar. ketika petroleum eter kita masukkan ke dalam kolom. Adapun struktur dari senyawa-senyawa yang terkandung dalam daun adalah : Gambar struktur klorofil a 21 . kloroform. etanol dan metanol. Pelarut ini digunakan pada kromatografi kolom secara berurutan. Kita misalkan di dalam suatu ekstrak daun terdapat klorofil. klorofil dalam ekstrak daun akan larut di dalamnya dengan kecepatan yang sama dengan fase geraknya (petroleum eter) dan keluar paling pertama.yaitu petroleum eter. Untuk itulah digunakan pelarut berikutnya yang lebih polar dibandingkan petroleum eter yaitu kloroform agar karoten dapat keluar dari kolom dengan lebih cepat namun dengan catatan klorofil sudah keluar seluruhnya. Begitu pula seterusnya digunakan pelarut etanol dan metanol untuk mengeluarkan pigmen yang lebih polar seperti xantofil. akan keluar dari kolom lebih lambat dibandingkan klorofil karena karoten akan teradsorbsi lebih kuat dari pada klorofil. Karoten yang merupakan senyawa yang lebih polar daripada klorofil.

Gambar struktur klorofil b Gambar struktur α-karoten Gambar struktur β-karoten 22 .

etanol atau metanol. etanol dan metanol menghasilkan larutan berwarna hijau muda. Klorofil mengandung sifat nonpolar sehingga dapat larut dalam petroleum eter yang dan kloroform yang juga bersifat nonpolar. dengan warna yang sedikit berbeda. Pada tabung I dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna kuning bening.Gambar struktur antosianin Dari penjelasan di atas dapat dikatakan bahwa urutan keluarnya pigmen dari kolom sesuai dengan urutan kepolaran dari pigmen yang paling non polar yaitu klorofil. Sedangkan pada tabung lainnya dengan pelarut kloroform. Warna hijau yang dihasilkan menunjukkan bahwa sampel daun seledri mengandung klorofil karena klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau dengan semua pelarut. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Kemangi Dari proses kromatografi kolom dihasilkan tiga fraksi ekstrak sesuai dengan pelarutnya. Kenonpolaran klorofil dapat dilihat dari strukturnya di mana walaupun klorofil mengandung bagian yang polar namun secara keseluruhan strukturnya adalah nonpolar. b. karena uji KLT tidak 23 . Sesuai dengan literatur daun seledri mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan berwarna hijau muda). a. Walaupun demikian belum dapat dipastikan dalam pelarut apa pigmen-pigmen tersebut terkandung. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Puring Dari proses kromatografi kolom dihasilkan empat fraksi. baru kemudian xantofil. apakah dalam petroleum eter. kloroform. karoten.

Dalam hal ini. 24 . Kenonpolaran klorofil dapat dilihat dari strukturnya di mana walaupun klorofil mengandung bagian yang polar namun secara keseluruhan strukturnya adalah nonpolar. Pada tabung I dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna hijau muda.dilakukan maka analisis dilakukan berdasarkan harga Rf menurut literatur dan perbedaan warna yang dihasilkan. xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar. Sesuai dengan literatur daun seledri mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan berwarna hijau muda). Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen karoten karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar tetapi kepolarannya agak rendah jika dibandingkan dengan petroleum eter. Di samping itu. Hasil ini sesuai dengan literatur bahwa pigmen karoten memang senyawa yang berwarna kuning. Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung xantofil (C40H50O2) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol dibandingkan dengan karoten. Warna hijau yang dihasilkan menunjukkan bahwa sampel daun seledri mengandung klorofil karena klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau dengan semua pelarut. Klorofil mengandung sifat nonpolar sehingga dapat larut dalam petroleum eter yang dan kloroform yang juga bersifat nonpolar. Fraksi ini berwanra hijau kekuningan (warna kuning dominan). larutan pada fraksi ini berwarna kuning dan hal ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang berwarna kuning. Pada tabung II dengan pelarut kloroform menghasilkan larutan berwarna hijau tua. Untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter berwarna hijau sehingga dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah klorofil. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Seledri Dari proses kromatografi kolom dihasilkan empat fraksi. c. Tabung III dengan pelarut etanol menghasilkan larutan berwarna hijau muda dan pada tabung IV dengan pelarut metanol menghasilkan larutan yang berwarna hijau.

Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Singkong Dari proses kromatografi kolom diperoleh empat fraksi. Karena pelarut yang digunakan adalah etanol yang bersifat polar. dimana seharusnya untuk pelarut kloroform dapat menghasilkan pigmen karoten dan untuk pelarut metanol menghasilkan pigmen xantofil. Berbanding terbalik dengan harga Rf yang kecil. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Bayam Dari proses kromatografi kolom diperoleh tiga fraksi ekstrak sesuai pelarutnya. tetapi kepolarannya agak rendah sehingga dapat larut dalam etanol. e. Pigmen xantofil dihasilkan dari pelarut petroleum eter dan etanol. Pelarut etanol menghasilkan ekstrak berwarna hijau kekuningan menunjukkan adanya pigmen karoten. dan harga Rf klorofil b terhadap petroleum eter paling kecil. maka bila harga Rf kecil. Dengan pelarut petroleum eter terdapat klorofil dengan warna larutan hijau. larutan tersebut memiliki komponen yang bersifat nonpolar. Klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau dengan sifat nonpolar sehingga mudah larut dalam petroleum eter maupun kloroform. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Katuk 25 . Untuk uji KLT. f. harga Rf yang besar menunjukkan bahwa komponen tersebut lebih larut dalam eluennya. Untuk pelarut petroleum eter menghasilkan ekstrak warna hijau muda menunjukkan adanya pigmen klorofil b (C55H70O6N4Mg). Untuk pelarut metanol menghasilkan ekstrak berwarna kuning menunjukkan adanya pigmen xantofil. komponen yang terkandung bersifat lebih polar. dan sebaliknya apabila harga Rf besar. Namun pada pelarut metanol dan kloroform masih menghasilkan klorofil. artinya komponen tersebut kurang larut dalam pelarut etanol. Berdasarkan hal tersebut maka dapat diketahui bahwa harga Rf xantofil terhadap metanol lebih besar daripada harga Rf karoten terhadap etanol.d. Meskipun karoten bersifat nonpolar. Pelarut kloroform menghasilkan ekstrak warna hijau tua menunjukkan adanya pigmen klorofil a (C55H72O6N4Mg). Harga Rf karoten terhadap etanol lebih besar daripada harga Rf klorofil a terhadap kloroform.

Untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter berwarna hijau sehingga dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah klorofil. xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar. Dalam hal ini. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Pandan Dalam pemisahan pigmen tanaman dari daun pandan. 26 . Hasil ini sesuai dengan literatur bahwa pigmen karoten memang senyawa yang berwarna kuning.Dari proses kromatografi kolom dihasilkan tiga fraksi ekstrak sesuai dengan pelarutnya. larutan pada fraksi ini berwarna kuning dan hal ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang berwarna kuning. Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung xantofil (C40H50O2) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol dibandingkan dengan karoten. Di samping itu. xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar. Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen karoten karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar tetapi kepolarannya agak rendah jika dibandingkan dengan petroleum eter. Di samping itu. Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung xantofil (C40H50O2) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol dibandingkan dengan karoten. karena uji KLT tidak dilakukan maka analisis dilakukan berdasarkan harga Rf menurut literatur dan perbedaan warna yang dihasilkan. Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen karoten karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar dimana pigmennya berwarna hijau. Fraksi ini berwarna hijau kekuningan (warna kuning dominan). Dalam hal ini. dengan warna yang sedikit berbeda. untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter (nonpolar) berwarna hijau sehingga dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah klorofil. larutan pada fraksi ini berwarna hijau kekuningan dan hal ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang berwarna kuning. g.

i. Sedangkan karoten merupakan senyawa yang dapat larut dalam etanol. xantofil dan karoten. Pada tabung III dengan pelarut kloroform menghasilkan larutan berwarna hijau muda. 27 . Warna hijau yang dihasilkan menunjukkan bahwa sampel daun kangkung mengandung klorofil karena klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Kangkung Dari proses kromatografi kolom dihasilkan enam fraksi. Hasil pemisahan pigmen yang diperoleh melalui kromatografi kolom adalah klotofil. Tabung IV sampai VI dengan pelarut etanol dan metanol menghasilkan warna hijau kekuningan. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Sirih Hijau Untuk perhitungan harga Rf tidak dilakukan uji KLT namun berdasarkan literatur yang ada. Sedangkan xantofil yang mudah larut dalam alkohol akan keluar bersama dengan pelarut etanol dan metanol. Sedangkan warna hijau kekuningan menunjukkan adanya karoten karena karoten merupakan senyawa yang berwarna hijau kekuningan. sedangkan karoten keluar bersama dengan pelarut kloroform. klorofil dapat larut dalam pelarut petroleum eter dan kloroform yang bersifat nonpolar. Pada tabung I dan II dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna hijau tua dan hijau lebih tua. Klorofil mengandung bagian yang polar walaupun secara keseluruhan stukturnya adalah senyawa nonpolar. Klorofil dan karoten sama-sama bersifat non polar. Klorofil keluar bersama dengan pelarut petroleum eter. Oleh karena itu. Sesuai dengan literatur di mana daun kangkung mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan berwarna hijau muda). ada 5 tabung reaksi yang kemudian diuji dengan KLT dengan kenampakan noda yang terlihat setelah disinari lampu UV (berwarna jingga) dan diurutkan dari warna yang paling muda sampai tua. namun karena karoten sedikit lebih bersifat polar maka karoten lebih lambat keluar daripada klorofil.h.

28 .

3. Pada percobaan pemisahan pigmen dari tanaman dari semua sampel tanaman dilakukan dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut yaitu etanol untuk melarutkan pigmen sampel daun. Rf = 0. 9.Fraksi 2 (kloroform) yang mengandung karoten.Dari percobaan ini dapat disimpulkan bahwa jenis pigmen dalam tiap sampel daun untuk tiap fraksinya adalah sebagai berikut : No. 8. Sampel Daun Singkong Pandan Bayam Kemangi Puring Kangkung Sirih Katuk Seledri Petroleum eter Klorofil Klorofil Klorofil Klorofil Xantofil Klorofil Xantofil Klorofil Klorofil Kloroform Klorofil Klorofil Klorofil Karoten Klorofil Klorofil Xantofil Klorofil Klorofil Etanol Karoten Karoten Klorofil Karoten Klorofil Karoten Xantofil Klorofil Klorofil Metanol Xantofil Klorofil Klorofil Xantofil Klorofil Klorofil Xantofil Klorofil Klorofil Untuk uji KLT. yang ditentukan oleh kekuatan adsorspi atau koefisien partisi antara fasa gerak dan fasa diam. Rf = 0. 3. 6.Fraksi 4 (metanol) yang mengandung xantofil. 7.756 . menurut literatur harga Rf standar untuk masing-masing komponen adalah sebagai berikut : . 1.Fraksi 3 (etanol) yang mengandung xantofil. Rf = 0. 5.Fraksi 1 (petroleum eter) yang mengandung klorofil. Pemisahan dengan kromatografi kolom dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom.767 . 4.767 VI. kloroform. 2. KESIMPULAN 1. 29 . metanol dan etanol. Rf = 0. 2. Pemisahan menggunakan kromatografi kolom yang fase diam berupa Alumina dan fase gerak yaitu petroleum eter.75 .

(Tidak dipublikasikan). VII.. Daun sirih mengandung pigmen xantofil. Sumar. Robinson. 1996. Tim Dosen Kimia Organik. 2006. Pengantar Praktikum Kimia Organik. Hendayana. Bambang Purwono. Berdasarkan percobaan. DAFTAR PUSTAKA Anwar. Pengantar Kromatografi. Daun bayam.4. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis Modern. dkk. Bandung : ITB. 1991. Gritter. Trevon. Daun puring mengandung pigmen klorofil dan xantofil. Chairil. daun singkong dan kemangi mengandung pigmen klorofil. J. katuk dan seledri mengandung pigmen klorofil. 2010. Panduan Praktikum Kimia Organik II. Bandung : Remaja Rosdakarya. Bandung : ITB. xantofil. FKIP Banjarmasin : UNLAM. 1995. karoten. 30 . Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Yogyakarta : Depdikbud. harno Dwi Pranowo dan Tutik dwi Wahyuningsih. Daun pandan dan kangkung mengandung pigmen klorofil dan karoten.

xantofil dan klorofil. hal ini mungkin dikarenakan: a. Sedangkan fraksi yang muncul selanjutnya adalah fraksi etanol dan disusul fraksi metanol yang membawa pigmen xantofil. 3. Mengapa tidak boleh ada gelembung udara dalam timbunan penyerap di dalam kolom ? 2. 2. Pigmen yang keluar pertama bersama petroleum benzen adalah klorofil. dimana karoten dan kloroform sama-sama nonpolar tetapi sedikit polar dibandingkan dengan klorofil dan petroleum benzen. Teknik yang telah dilakukan berhasil memisahkan pigmen seperti yang diharapkan karena melalui fraksi-fraksi tersebut dimungkinkan ada 3 pigmen yang muncul yaitu karoten. Akibatnya terjadi penyebaran noda ketika larutan hasil kromatografi kolom di KLT. Namun proses pemisahannya kurang sempurna. sehingga pemisahan menjadi kurang baik (tidak sempurna). fraksi ini muncul terakhir karena pigmen ini lebih larut dalam alkohol. Tidak boleh ada gelembung udara dalam timbunan penyerap di dalam kolom karena dapat mengakibatkan distribusi yang tidak merata (ketidakhomogenan penyerap). Tidak dilakukannya homogenasi alumina sebagai fase diam. 31 . Kemudian disusul dengan fraksi kloroform dengan pigmen karoten. b. Hal ini dikarenakan klorofil dan petroleum benzen bersifat nonpolar sehingga petroleum benzen dapat melarutkan pigmen klorofil.1 Pertanyaan dan Jawaban 1.VIII. Apakah teknik yang anda lakukan berhasil memisahkan pigmen seperti yang diinginkan ? Jawaban 1. Identifikasi pigmen apa saja yang keluar dari kolom secara berurutan dan jelaskan mengapa terjadi demikian ? 3. LAMPIRAN 8. Penambahan tiap-tiap pelarut yang secara terus-menerus tanpa menunggu tetesan untuk fraksi pelarut tertentu itu habis.

Fraksi pigmen yang dihasilkan kurang spesifik karena mata memiliki keterbatasan dalam menentukan warna jadi kemungkinan ada fraksi yang tercampur. Pergantian tabung reaksi untuk penampungan tidak dilakukan berdasarkan waktu tertentu atau sampai pelarut tidak menetes lagi. melainkan berdasarkan warna.c. 32 .

Memekatkan dengan alat rotavapor sampai cairan tinggal beberapa mL Pelarut Larutan pekat N/B: * Sampel daun : Puring. katuk. Seledri. bayam.Mengaduk sampai merata Campuran .2 Flow Chart A.Menambahkan beberapa mL etanol Lumatan daun contoh + etanol .Menyaring melalui corong biasa dengan kertas saring Residu Filtrat . Ekstraksi Sampel 10-15 lembar daun contoh* .Melumatkan dalam lumpang . kemangi. kangkung. dan pandan 33 . sirih hijau. singkong.8.

hingga setinggi 1 cm Glass wool + Etanol .Membuat adonan Adonan alumina Campuran 1 + adonan .Menuangkannya melalui corong dan memasukannya ke dalam kolom hingga setinggi 10 cm Campuran I Al2O3 + etanol .B. Pembuatan Kromatografi Kolom Glass wool .Memasukan ke dalam kolom kaca setinggi 20 cm.Memasukkan adonan melalui corong ke dalam kolom sehingga setinggi 15 cm sambil mengetukngetuk dan keran dalam keadaan terbuka Campuran II 34 .

Membuka keran Campuran IV + etanol .Kemudian melanjutkan dengan KLT dengan larutan pengembang yang sesuai (etanol) 35 .C.Memisahkan berdasarkan warnanya .Membuka keran . jika permukaan sampel telah mendekati permukaan penyerap .Segera mengelusikan kolom dengan pelarut secara bertahap sesuai dengan kepolarannya (**yaitu petroleum benzen.Mengelusi kembali. kemudian menutup keran Campuran III + glass wool .Memasukkan setinggi 1 cm Campuran VI + pelarut . etanol dan metanol).Memasukkan .Menghentikan pemberian pelarut bila semua warna telah keluar dari kolom Larutan berwarna NB : . kloroform. sampai permukaan pelarut turun mendekati penyerap (adonan Al2O3) Campuran V + larutan contoh . Pemisahan Pigmen dari Tanaman Campuran II + etanol .Menampung tetesan yang keluar dari kolom dengan beberapa tabung reaksi yang bersih .Mengelusi kembali kolom dan mengatur keran sampai terjadi kira-kira 20 tetes per menit.

Sampel ekstrak daun puring mulai turun pada KK Gambar 20.LAMPIRAN FOTO – FOTO PERCOBAAN Gambar 17. Kolom kromatografi Gambar 18. Sampel ekstrak daun andong pada KK 36 . Sampel ekstrak daun puring pada KK Gambar 19.

37 .