PERCOBAAN IV

Judul Tujuan

: Pemisahan Pigmen dari Tanaman : Pada akhir percobaan ini Mahasiswa harus paham mengenai 1. Cara kerja dan teknik-teknik isolasi tumbuhan. 2. Pengenalan isolasi bahan alam yang bermolekul besar. 3. Analisa senyawa tumbuhan berwarna dengan

menggunakan KLT dan kromatografi kolom Hari/tanggal Tempat : Selasa / 5 April 2011 : Laboratorium kimia FKIP UNLAM Banjarmasin

I.

DASAR TEORI

1.1 Daun dan Pigmen Tanaman Daun merupakan salah satu organ tumbuhan yang tumbuh dari batang, umumnya berwarna hijau daun dan terutama berfungsi sebagai penangkap energi cahaya matahari melalui fotosintesis. Bentuk daun sangat beragam namun biasanya berupa helaian, bisa tipis atau tebal. Daun juga bisa bermodifikasi menjadi duri (misalnya kaktus) dan berakibat daun kehilangan fungsinya sebagai organ fotosintetik. Warna hijau pada daun berasal dari kandungan klorofil pada daun. Daun seringkali mengandung beberapa senyawa yang berwarna (pigmen) antara lain klorofil (hijau), karoten (kuning) dan xantofil (kuning). Meskipun klorofil mengandung bagian yang polar, akan tetapi secara keseluruhan strukturnya adalah non polar, seperti hidrokarbon, sehingga klorofil mudah larut dalam pelarut non polar seperti eter atau petroleum eter. Ada dua jenis klorofil yaitu klorofil a dan klorofil b, yang membedakan kedua jenis klorofil ini adalah adanya gugus aldehid pada struktur klorofil b yang menyebabkan klorofil b ini bersifat sedikit lebih polar dibandingkan klorofil a. Adapun struktur dari kedua jenis klorofil ini adalah sebagai berikut.

1

Gambar 1. Struktur klorofil a

Gambar 2. Struktur klorofil b

Karoten C40H56 adalah senyawa alkena dengan rantai panjang dari sistem ikatan rangkap terkonjugasi. Daun hijau mengandung sekitar 90% betakaroten dan 10 % alpha karoten. Meskipun secara keseluruhan molekul karoten adalah non polar, akan tetapi mempunyai sifat dapat mengubah bidang polarisasi. Karoten juga ada dua jenis yaitu a-karoten dan β-karoten, yang membedakan kedua struktur ini adalah posisi ikatan rangkap pada cincin ujung. Adapun strukturnya adalah sebagai berikut.

2

Gambar 3. Struktur α-karoten

Gambar 4. Struktur β-karoten

Xantofil C40H50O2 adalah bentuk karoten yang terhidroksilasi, kandungan xantofil dalam daun hijau selalu dua kali lebih besar dari karoten. Xantofil lebih larut dalam alkohol dan sedikit larut dalam petroleum eter dibandingkan karoten. Xantofil memiliki struktur yang mirip dengan karoten, hanya bedanya xantofil memiliki gugus OH pada struktur sikliknya. Adapun struktur dari xantofil adalah sebagai berikut.

Gambar 5. Struktur xantofil

Selain itu, di dalam daun juga mengandung antosianin yang berwarna merah, biru atau ungu tergantung derajat keasamannya. Untuk mengekstraksi pigmen dari daun, terlebih dahulu dilakukan penggerusan dengan mortar terhadap daun kering sampai halus. Pelarut yang dapat mengekstraksi pigmen secara bertahap dengan urutan kepolaran yaitu petroleum eter, kloroform, etanol, dan metanol. Adapun struktur umum dari antosianin adalah sebagai berikut.

3

yang ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara fase gerak dan fase diam (stationer). Dengan demikian. Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom. kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis (KLT). Pemisahan berdasarkan kromatografi adsorpsi. Kromatografi kolom bertujuan untuk mengisolasi komponen dari campurannya. sangat tergantung pada distribusi pada kedua fase cair dan padat. sehingga ikatannya kuat dan rapat.2 Kromatografi Kolom dan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Kromatografi adalah prinsip pemisahan campuran senyawa atas komponenkomponen berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi komponen pada dua fase. Campuran ditambahkan ke kolom dari satu ujung dan campuran akan bergerak dengan bantuan pengembang yang cocok (fase gerak). Pemisahan suatu campuran secara kromatografi dapat dilakukan kromatografi kolom. Struktur umum antosianin 1. yakni fase diam dan fase gerak. Perbedaan kemampuan masing-masing komponen diadsorpsi dan perbedaan distribusi dua fase yang tidak saling bercampur (partisi). Alat yang digunakan yaitu kolom yang di dalamnya berisi fase stasioner (padat atau cair).Gambar 6. Silika gel memadat dalam bentuk tetrahedral raksasa. adsorben silika gel mampu menghasilkan proses pemisahan yang lebih optimal. dapat dilakukan dengan kromatografi kolom. Pada kromatogarfi kolom digunakan kolom dengan adsorben sillika gel karena kolom yang dibentuk dengan silika gel memiliki tekstur dan struktur yang lebih kompak dan teratur. 4 . Untuk pemisahan pigmen dari tumbuhan.

silica gel sifatnya sangat polar. karena pada permukaannya terikat gugus hidroksil. sedangkan fase geraknya bersifat non polar. Kolom yang digunakan dalam kromatografi kolom dapat berupa gelas. Dalam proses pemisahan dengan kromatografi kolom. yaitu : 1) Kromatografi fase normal Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya “normal” bersifat polar. eter.Silica gel dapat membentuk ikatan hidrogen di permukaannya. sehingga proses pemisahan zat tidak berjalan optimal. aldehid dan alkohol. kalsium sulfat dan serbuk selulosa. Sorben yang digunakan dalam kromatografi kolom diantaranya arang. jika dibiarkan kering. 5 . Oleh karenanya. ester. magnesium silikat. misalnya silica gel. silika gel. Untuk menahan fasa diam (adsorben) biasanya digunakan kapas gelas (glass wool) atau gelas berpori (fritted glass). adsorben silika gel harus senantiasa basah karena. kolom yang terbentuk dari silika gel bisa retak. Selain itu. keton. alkena. kebalikan dari fase normal. sedangkan fase geraknya bersifat polar. maka pada saat campuran dimasukkan. Berikut ini beberapa golongan solutnya misalnya alkana. alumina. Jika fasa gerak yang digunakan sifatnya non-polar. Ujung bagian bawah dilengkapi dengan kran untuk mengatur laju alir eluen. aromatis. 2) Kromatografi fase terbalik Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar. dan senyawa-senyawa yang semakin tidak (kurang) polar akan terbawa keluar kolom lebih cepat. senyawa-senyawa yang semakin polar akan semakin lama tertahan di fasa stasioner. plastik atau nilon. kondisi yang senantiasa basah berperan untuk memudahkan proses elusi (larutan melewati kolom) dalam kolom. Ukuran kolom yang lazim digunakan mempunyai diameter dalam 2 cm dan panjang 45 cm. Kromatografi kolom dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya dapat dibedakan menjadi dua.

6 .

Kolom berisi sampel 7 . Bagan kolom kromatografi Gambar 8.Berikut ini gambar-gambar bagan dalam kromatografi kolom : Gambar 7.

Setelah 8 . Proses pemisahan pigmen tanaman Dalam pemisahan biasanya kromatografi kolom diikuti pemeriksaan secara kualitatif dengan KLT untuk memonitor apakah pemeriksaan dengan cara kromatografi kolom berhasil atau tidak. plat diangkat dan dikeringkan. tanah diatome. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending) atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending). lembaran aluminium maupun plastik dengan tebal tertentu. Pada prakteknya. Ketika eluen sudah mencapai batas pada plat yang telah dibuat sebelumnya.125 mm dilapiskan pada kaca. Dalam kromatografi lapis tipis (KLT) fase diamnya biasanya adalah serbuk silika gel. selulosa dan lainnya yang mempunyai ukuran butir sangat kecil yaitu 0. alumina.Gambar 9.063 – 0. sampel ditotolkan pada plat KLT lalu dimasukkan ke dalam chamber yang sudah jenuh oleh eluen.

Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi lapis tipis. Bagan kromatografi lapis tipis (KLT) Gambar 11. Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi yang konstan merupakan besaran yang karakteristik dan reprodusibel. Berikut ini gambar-gambar bagan dalam kromatografi lapis tipis (KLT). Metoda identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut.daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi. Gambar 10. menggunakan harga Rf. Pigmen dalam sampel menuju batas atas plat KLT 9 . maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa.

serta campurannya. atau dengan cara elusi 2 dimensi. tapi bergelombang 10 .Gambar 12. ungu. Bentuk daunnya bermacam-macam. merah. 1. Perbandingan untuk perhitungan Rf Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan lebih murah dibandingkan dengan kromatografi kolom. kuning. Beberapa keuntungan dari kromatografi planar ini adalah :   Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis. fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.  Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending). Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna. jingga. oval.3 Beberapa Jenis Tumbuhan a) Daun Puring (Codiaeum variegatum) Puring atau kroton adalah tumbuhan hias pekarangan populer berbentuk perdu dengan bentuk dan warna daun yang sangat bervariasi. Dalam kromatografi lapis tipis. menurun (descending). Beragam kultival telah dikembangkan dengan variasi warna hijau. peralatan yang digunakan lebih sederhana dan dapat dikatakan hampir semua laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat.  Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak. memanjang. Demikian juga peralatan yang digunakan.

puring adalah kerabat jauh singkong serta kaksuba. namun beraroma lebih wangi dibandingkan dengan sirih hijau. saponin. c) Daun seledri (Apium graveolens) Seledri adalah sayuran dan tumbuhan obat yang biasa digunakan sebagai bumbu masakan. maupun ekstrak kapsul. Secara botani. Sirih hijau sejak dahulu telah digunakan oleh masyarakat sebagai obat untuk menyembuhkan berbagai jenis penyakit. yang merupakan ciri khas suku Euphobaceae. namun masih juga mengandung warna hijau yaitu berada pada bagian dalam. Ciri yang sama adalah batangnya menghasilkan biloks berwarna putih pekat dan lengket. Cina dan Korea mempergunakan bagian tangkai daun sebagai bahan 11 . hepatitis. Pigmen lain yang terkandung dalam daun adalah karoten.helainya terputus-putus dan sebagainya. b) Daun sirih hijau (Piper crocatum) Daun sirih hijau (Piper crocatum) termasuk dalam family piperaceae. Penggunaan sirih hijau dapat digunakan dalam bentuk segar. Daun sirih hijau berasa pahit dan getir. Secara empiris sirih hijau dapat menyembuhkan berbagai jenis penyakit. Warna daun sirih hijau memang merah kepekatan. Dalam daun sirih hijau terkandung senyawa fitokimia yakni alkaloid. Klorofil adalah senyawa pigmen yang berperan dalam menyeleksi panjang gelombang cahaya yang energinya diambil dalam fotosintesis. batu ginjal dan sebagainya. xantofil dan antosianin. yang tumbuh merambat dengan bentuk daun menyerupai hati dan bertangkai yang tumbuh berselang-seling dari batangnya serta penampakan daun yang berwarna merah keperakan dan mengkilap. Warna hijau pada daun berasal dari kandungan klorofil. seperti diabetes. Beberapa negara termasuk Jepang. tannin dan flavonoid.

Hal ini dikarenakan kemangi merupakan tanaman semusim. mesofil. glukokortikoid) dan senyawa eikosanoid (diantaranya prostaglandin.7%). furanokumarin. Sifat fisika pada klorofil daun katuk dapat dilihat pada semakin tinggi suhu pengeringan. Penggunaan seledri paling lengkap adalah di Eropa: daun. e) Daun katuk (Sauropus androgynus) Sifat kimia daun katuk dapat dilihat dari kadar kalsium yang tinggi. Khususnya jaringan palisade yang mengandung klorofil. daun kemangi hanya tersusun dari selapis jaringan palisade. serta senyawa golongan fenol. terstosteron. Selain itu. kadar klorofil semakin tinggi dan intensitas warna semakin hijau. Daun ini 12 . daun berukuran kecil dengan helaian daun yang tipis. prostasiklin.makanan. estradiol. Umur daun. Kandungan asam lemak utama adalah asam petroselin (40-60%). Kandungan vitamin C pada daun katuk jauh lebih tinggi daripada jeruk maupun jambu biji. tangkai daun.0. lipoksin dan leukotrien). Daun dan tangkai daun mengandung steroid seperti stigmasterol dan sitosterol. dan umbinya semua dimanfaatkan. Kandungan utamanya adalah butilftalida dan butilidftalida sebagai pembawa aroma utama. morfologi daun dan tahapan fisiologis suatu tanaman merupakan faktor yang menentukan kandungan klorofil.1 . buah. Di Indonesia tumbuhan ini diperkenalkan oleh penjajah Belanda dan digunakan daunnya untuk menyedapkan sup atau sebagai lalapan. d) Daun kemangi (Ocimum sanctum) Daun kemangi memiliki kandungan klorofil yang paling rendah. isokuersitrin. Daun katuk dapat mengandung hampir 7 % protein dan serat kasar 19 %. Terdapat tujuh senyawa aktif yang dapat merangsang produksi hormon-hormon steroid (seperti progesteron. Komponen lainnya apiin. tromboksan. serta isoimperatorin. Terdapat juga sejumlah flavonoid seperti graveobiosid A (1-2%)dan B (0.

Mineral yang dikandungnya adalah kalsium (hingga 2. 13 . besi. Klorofil b berfungsi sebagai antena fotosintetik yang mengumpulkan cahaya kemudian ditransfer ke pusat reaksi. h) Daun bayam (Amaranthus spp) Kandungan besi pada bayam relatif lebih tinggi daripada sayuran lain (besi merupakan penyusun sitokrom. tidak hanya pada organ daun saja namun juga dijumpai pada bagian batang. Hal ini diduga klorofil pada tanaman kangkung tersebar. Hal ini menyebabkan laju fotosintesis berlangsung lama karena tidak efisien dalam menangkap energi radiasi cahaya. sehingga laju fotosintesisnya juga lebih tinggi. Hal ini menunjukkan bahwa kemampuan singkong dalam menangkap energi radiasi cahaya lebih efisien.8 %). f) Daun singkong (Manihot utilisima L) Daun singkong memiliki kandungan klorofil a dan klorofil b yang tinggi. sehingga laju fotosintesisnya juga tinggi. B dan C. g) Daun kangkung (Ipomoea aquatica) Kangkung memiliki kandungan klorofil yang relatif rendah yaitu setara dengan daun kemangi.kaya akan vitamin K. Daun bayam mempunyai kandungan klorofil yang tinggi. Energi cahaya akan diubah menjadi energi kimia di pusat reaksi yang kemudian dapat digunakan untuk proses reduksi dalam fotosintesis. protein yang terlibat dalam proses fotosintesis) sehingga berguna bagi penderita anemia. fosfor dan magnesium. selain itu pro-vitamin A ( β-karoten). kalium. Pusat reaksi tersusun dari klorofil a. Klorofil a dan klorofil b berperan dalam proses fotosintesis.

sirih hijau. Pipet tetes 9. kemangi. 2. kangkung. Gelas ukur 10 ml 3. Etanol 3.1 Alat yang digunakan 1. II. Seledri. Kolom kaca 2. katuk. bayam. Sebuk Al2O3 ( alumina ) : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 36 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah 14 . dan pandan. Gelas kimia 250 ml 6. Rak tabung reaksi 8.2 Bahan yang digunakan 1. Lumpang dan alu 10. ALAT DAN BAHAN 2.i) Daun pandan (Pandanus amaryllifolius Roxb) Daun pandan mengandung klorofil yang sangat tinggi yang sering digunakan sebagai pewarna alami. Bunsen + kaki tiga + kain kasa 2. Tabung reaksi 7. Cawan porselin 12. Sampel daun : Puring. Semakin tinggi kandungan klorofilnya maka semakin cepat laju fotosintesisnya dan lebih efisien dalam menangkap energi radiasi cahaya. Statif dan klem 11. Corong biasa 4. singkong. Glass wool 4. Batang pengaduk 5.

Kertas saring 6. Metanol III. 6. Menambahkan 20 mL etanol. 4. Memasukkan adonan tersebut ke dalam kolom hingga setinggi 10 cm sambil mengetuk-ngetuk dengan kran dalam keadaan terbuka. Mengelusi kembali kolom dengan pelarut hingga mencapai permukaan alumina dalam kolom dan memasukkan glass woll. 2.1 Ekstraksi Sampel 1.2 Pembuatan Kromatografi Kolom 1. Menyaring larutan sampel dengan kertas saring melalui corong.5 cm yang bagian bawahnya telah dilengkapi dengan kran. Memasukkan larutan sampel daun setinggi 2 cm setelah permukaan pelarut etanol turun mendekati penyerap (adonan Al2O3). mengaduk sampai merata. 15 . Kloroform 8. Melalui corong menuangkan etanol ke dalam kolom hingga setinggi 1 cm.3 Pemisahan Pigmen dari Tumbuhan 1. Memekatkan larutan dengan menggunakan pembakar bunsen sampai larutan tinggal setengah mL. 3. Memasukkan glass wool ke dalam kolom gelas hingga setinggi 1 cm. tinggi 20 cm dan diameternya 1. 2. 5. serta secara sedikit demi sedikit (jangan ada gelembung udara). 4. 3. Melumatkan 10-15 lembar sampel daun dengan lumpang dan alu. PROSEDUR KERJA 3. 3.5. 3. Petroleum eter 7. Membuat adonan dari 25 g alumina (Al2O3) dengan 25 mL etanol. Menyiapkan kolom gelas 50 mL.

Menghentikan pemberian pelarut bila semua warna telah keluar dari kolom kaca. Jika permukaan sampel telah mendekati permukaan penyerap. Perlakuan 1. kloroform. Segera mengelusikan kolom dengan pelarut secara bertahap sesuai dengan kepolarannya yaitu petroleum eter. Menggerus sampel daun + 20 ml etanol 2. 3. 4. Menampung tetesan yang keluar dari kolom dengan beberapa tabung reaksi yang bersih. Hasil Pengamatan Campuran Filtrat: larutan hijau tua Residu: ampas daun Tinggi glass wool 1 cm 6. 7. HASIL PENGAMATAN No. etanol dan metanol. 5. 4.2. Memasukkan glass wool dalam kolom + 1 ml etanol Al2O3 + 25 ml etanol Glass wool dan etanol dalam kolom Memasukkan adonan alumina + Adonan alumina. campuran glass wool kedalam kolom + 2 ml etanol +larutan sampel Mendiamkan sampai larutan sampel menetes Menambahkan petroleum eter Larutan sampel menyebar dan menetes Sampel yang digunakan: A. IV. 8. Daun singkong:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau kekuningan larutan kuning B. Daun Pandan:  Tabung I + petroleum eter  Tabung II + Kloroform  Tabung III + Etanol  larutan hijau muda  larutan hijau tua  larutan hijau kekuningan 16 . Menyaring campuran 3.

Daun Bayam:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau tua larutan hijau tua D. Daun Kemangi:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau bening larutan hijau kekuningan larutan hijau kekuningan larutan kuning E. Daun Sirih:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan kuning bening larutan kuning tua larutan kuning larutan kuning H. Daun Kangkung:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau tua larutan hijau muda larutan hijau kekuningan larutan hijau bening G. Daun Puring:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan kuning jernih larutan hijau muda larutan hijau muda larutan hijau muda F. Tabung IV + metanol  larutan hijau muda C. Daun Katuk:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau muda larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau tua 17 .

sirih hijau. lalu mengekstraksinya dengan menggunakan pelarut etanol. yaitu daun Puring. ANALISIS DATA Pada percobaan ini dilakukan pemisahan pigmen dari beberapa sampel daun. 5. singkong. Etanol efektif untuk mengekstrak pigmen tumbuhan karena sebagian besar pigmen tumbuhan seperti klorofil. Etanol + klorofil → fitol + etil klorofilida 18 . dan pandan menggunakan kromatografi kolom dengan beberapa pelarut yaitu petroleum eter. Setelah itu menguji masingmasing ekstrak pelarut dari masing-masing sampel daun dengan metode KLT untuk menentukan jenis pigmen yang terkandung dalam daun tersebut. karoten dan xantofil memiliki sifat diantara polar dan non polar sehingga dapat larut dalam etanol yang merupakan pelarut semipolar. Reaksinya adalah sebagai berikut. Seledri. kloroform. bayam.I. kangkung. Daun Seledri:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau muda larutan hijau tua V. Namun proses ekstrasi ini harus dilakukan dengan cepat karena enzim klorofilasi yang terkandung dalam daun segar akan mengkatalisis reaksi antara klorofil dengan etanol sehingga jumlah klorofil dalam daun akan berkurang. katuk. dan etanol.1 Ekstraksi Sampel Daun Pertama-tama menumbuk sampel daun dengan lumpang dan alu. Penumbukan ini bertujuan menghaluskan daun sehingga senyawa yang terkandung di dalamnya mudah larut dalam pelarut etanol. metanol. kemangi. sebab semakin halus daun maka semakin luas permukaan untuk terjadi kontak dengan pelarut maka semakin banyak zat yang dapat terekstrak.

selanjutnya diuapkan hingga separuh volume mula-mula. 19 . Larutan hasil ekstrak dengan etanol ini. sedangkan residunya dibuang.Setelah itu dilakukan penyaringan agar diperoleh filtrat yang mengandung pigmen tanaman.

tetapi ekstrak daun masih bisa mengalir. Selanjutnya memasukkan kembali etanol untuk mengelusi kolom dan setelah selesai. Tetesan yang keluar dari kolom ini ditampung dalam tabung reaksi dan mengganti tabung reaksinya ketika warna yang keluar dari kolom berubah. Selain itu. Penggunaan etanol ini dikarenakan alumina mengandung titik aktif Al-OH sehingga etanol yang juga mengandung gugus OH akan dapat terikat kuat dengan alumina jadi bubur alumina yang merupakan fase diam akan lebih homogen. kolom harus bebas dari gelembung gas karena bila ada gelembung udara maka proses pemisahan yang terjadi tidak akan sempurna sehingga akan terjadi penyebaran noda ketika hasil kromatografi kolom di uji KLT. Dalam hal ini alumina Al2O3 yang digunakan sebagai adsorben atau fase diamnya.3 Pemisahan Pigmen Tanaman Setelah kolom kromatografi siap dipakai. ekstrak sampel daun di masukkan ke dalam kolom. karena Al2O3 lazim digunakan untuk senyawa organik stabil. Setelah itu bagain atas kolom juga diberi glass woll agar ekstrak daun yang akan dimasukkan ke dalam kolom dapat tersaring. Saat mengisi kolom. Di sini terlihat bahwa pigmen dari sampel daun mulai bergerak turun dan mulai menetes. sebelum dimasukkan alumina. dimana langkah pertama yang dilakukan adalah membuat adonan Al2O3 dengan pelarut etanol sehingga terbentuk bubur alumina. 5. Larutan berawarna ini adalah pigmen dari daun sampel. kran kolom ditutup. kran dibuka agar pelarut etanol dapat keluar sehingga diperoleh fase diam (alumina) yang padat. Adapun pelarut yang digunakan adalah berdasarkan kepolaran yang paling kecil 20 . Bubur alumina dimasukkan ke dalam kolom sambil mengetuk-ngetuk kolomnya agar tidak terbentuk gelembung udara.5. bagian bawah kolom ditutupi dengan glass woll.2 Penyiapan Kolom Kromatografi Selanjutnya membuat kolom kromatografi. Lalu memasukkan pelarut ke dalam kolom dan membuka krannya. hal ini bertujuan untuk menahan fase diam (adsorben) alumina agar tidak turun dari kolom karena glass woll merupakan gelas yang masih berpori sehingga dapat menahan alumina.

kloroform. Kita misalkan di dalam suatu ekstrak daun terdapat klorofil. Pelarut ini digunakan pada kromatografi kolom secara berurutan. Untuk itulah digunakan pelarut berikutnya yang lebih polar dibandingkan petroleum eter yaitu kloroform agar karoten dapat keluar dari kolom dengan lebih cepat namun dengan catatan klorofil sudah keluar seluruhnya.yaitu petroleum eter. etanol dan metanol. klorofil dalam ekstrak daun akan larut di dalamnya dengan kecepatan yang sama dengan fase geraknya (petroleum eter) dan keluar paling pertama. ketika petroleum eter kita masukkan ke dalam kolom. berarti klorofil tidak teradsorpsi dengan kuat pada alumina. Begitu pula seterusnya digunakan pelarut etanol dan metanol untuk mengeluarkan pigmen yang lebih polar seperti xantofil. Prinsip pemisahan dalam kolom tersebut adalah sebagai berikut. Adapun struktur dari senyawa-senyawa yang terkandung dalam daun adalah : Gambar struktur klorofil a 21 . akan keluar dari kolom lebih lambat dibandingkan klorofil karena karoten akan teradsorbsi lebih kuat dari pada klorofil. Ini dapat terjadi karena alumina adalah senyawa polar sedangkan klorofil adalah senyawa yang tergolong non polar. Karoten yang merupakan senyawa yang lebih polar daripada klorofil.

Gambar struktur klorofil b Gambar struktur α-karoten Gambar struktur β-karoten 22 .

karoten. Kenonpolaran klorofil dapat dilihat dari strukturnya di mana walaupun klorofil mengandung bagian yang polar namun secara keseluruhan strukturnya adalah nonpolar. etanol atau metanol. etanol dan metanol menghasilkan larutan berwarna hijau muda. karena uji KLT tidak 23 . a. Pada tabung I dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna kuning bening. Klorofil mengandung sifat nonpolar sehingga dapat larut dalam petroleum eter yang dan kloroform yang juga bersifat nonpolar. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Kemangi Dari proses kromatografi kolom dihasilkan tiga fraksi ekstrak sesuai dengan pelarutnya. b. Warna hijau yang dihasilkan menunjukkan bahwa sampel daun seledri mengandung klorofil karena klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau dengan semua pelarut. Sedangkan pada tabung lainnya dengan pelarut kloroform. dengan warna yang sedikit berbeda.Gambar struktur antosianin Dari penjelasan di atas dapat dikatakan bahwa urutan keluarnya pigmen dari kolom sesuai dengan urutan kepolaran dari pigmen yang paling non polar yaitu klorofil. Walaupun demikian belum dapat dipastikan dalam pelarut apa pigmen-pigmen tersebut terkandung. Sesuai dengan literatur daun seledri mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan berwarna hijau muda). baru kemudian xantofil. kloroform. apakah dalam petroleum eter. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Puring Dari proses kromatografi kolom dihasilkan empat fraksi.

Sesuai dengan literatur daun seledri mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan berwarna hijau muda). Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Seledri Dari proses kromatografi kolom dihasilkan empat fraksi. 24 . Klorofil mengandung sifat nonpolar sehingga dapat larut dalam petroleum eter yang dan kloroform yang juga bersifat nonpolar. Dalam hal ini. Untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter berwarna hijau sehingga dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah klorofil. Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung xantofil (C40H50O2) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol dibandingkan dengan karoten. Warna hijau yang dihasilkan menunjukkan bahwa sampel daun seledri mengandung klorofil karena klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau dengan semua pelarut. c. Pada tabung II dengan pelarut kloroform menghasilkan larutan berwarna hijau tua. Fraksi ini berwanra hijau kekuningan (warna kuning dominan). larutan pada fraksi ini berwarna kuning dan hal ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang berwarna kuning. Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen karoten karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar tetapi kepolarannya agak rendah jika dibandingkan dengan petroleum eter. xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar. Hasil ini sesuai dengan literatur bahwa pigmen karoten memang senyawa yang berwarna kuning. Kenonpolaran klorofil dapat dilihat dari strukturnya di mana walaupun klorofil mengandung bagian yang polar namun secara keseluruhan strukturnya adalah nonpolar. Di samping itu.dilakukan maka analisis dilakukan berdasarkan harga Rf menurut literatur dan perbedaan warna yang dihasilkan. Tabung III dengan pelarut etanol menghasilkan larutan berwarna hijau muda dan pada tabung IV dengan pelarut metanol menghasilkan larutan yang berwarna hijau. Pada tabung I dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna hijau muda.

e. tetapi kepolarannya agak rendah sehingga dapat larut dalam etanol. Pigmen xantofil dihasilkan dari pelarut petroleum eter dan etanol. Berdasarkan hal tersebut maka dapat diketahui bahwa harga Rf xantofil terhadap metanol lebih besar daripada harga Rf karoten terhadap etanol. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Bayam Dari proses kromatografi kolom diperoleh tiga fraksi ekstrak sesuai pelarutnya. Karena pelarut yang digunakan adalah etanol yang bersifat polar. f. Harga Rf karoten terhadap etanol lebih besar daripada harga Rf klorofil a terhadap kloroform. Untuk pelarut petroleum eter menghasilkan ekstrak warna hijau muda menunjukkan adanya pigmen klorofil b (C55H70O6N4Mg). Pelarut etanol menghasilkan ekstrak berwarna hijau kekuningan menunjukkan adanya pigmen karoten. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Katuk 25 . Meskipun karoten bersifat nonpolar. harga Rf yang besar menunjukkan bahwa komponen tersebut lebih larut dalam eluennya. Untuk uji KLT. komponen yang terkandung bersifat lebih polar. Klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau dengan sifat nonpolar sehingga mudah larut dalam petroleum eter maupun kloroform. maka bila harga Rf kecil. Pelarut kloroform menghasilkan ekstrak warna hijau tua menunjukkan adanya pigmen klorofil a (C55H72O6N4Mg). dimana seharusnya untuk pelarut kloroform dapat menghasilkan pigmen karoten dan untuk pelarut metanol menghasilkan pigmen xantofil. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Singkong Dari proses kromatografi kolom diperoleh empat fraksi. Untuk pelarut metanol menghasilkan ekstrak berwarna kuning menunjukkan adanya pigmen xantofil.d. artinya komponen tersebut kurang larut dalam pelarut etanol. Namun pada pelarut metanol dan kloroform masih menghasilkan klorofil. dan harga Rf klorofil b terhadap petroleum eter paling kecil. Berbanding terbalik dengan harga Rf yang kecil. Dengan pelarut petroleum eter terdapat klorofil dengan warna larutan hijau. larutan tersebut memiliki komponen yang bersifat nonpolar. dan sebaliknya apabila harga Rf besar.

Untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter berwarna hijau sehingga dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah klorofil. Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung xantofil (C40H50O2) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol dibandingkan dengan karoten. Dalam hal ini. Di samping itu. Dalam hal ini. Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen karoten karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar tetapi kepolarannya agak rendah jika dibandingkan dengan petroleum eter. Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen karoten karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar dimana pigmennya berwarna hijau. larutan pada fraksi ini berwarna kuning dan hal ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang berwarna kuning. Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung xantofil (C40H50O2) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol dibandingkan dengan karoten. Fraksi ini berwarna hijau kekuningan (warna kuning dominan).Dari proses kromatografi kolom dihasilkan tiga fraksi ekstrak sesuai dengan pelarutnya. xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar. xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar. untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter (nonpolar) berwarna hijau sehingga dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah klorofil. 26 . Di samping itu. larutan pada fraksi ini berwarna hijau kekuningan dan hal ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang berwarna kuning. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Pandan Dalam pemisahan pigmen tanaman dari daun pandan. dengan warna yang sedikit berbeda. Hasil ini sesuai dengan literatur bahwa pigmen karoten memang senyawa yang berwarna kuning. karena uji KLT tidak dilakukan maka analisis dilakukan berdasarkan harga Rf menurut literatur dan perbedaan warna yang dihasilkan. g.

Tabung IV sampai VI dengan pelarut etanol dan metanol menghasilkan warna hijau kekuningan. Hasil pemisahan pigmen yang diperoleh melalui kromatografi kolom adalah klotofil. Warna hijau yang dihasilkan menunjukkan bahwa sampel daun kangkung mengandung klorofil karena klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau. Sedangkan xantofil yang mudah larut dalam alkohol akan keluar bersama dengan pelarut etanol dan metanol. Sedangkan warna hijau kekuningan menunjukkan adanya karoten karena karoten merupakan senyawa yang berwarna hijau kekuningan. Klorofil mengandung bagian yang polar walaupun secara keseluruhan stukturnya adalah senyawa nonpolar. Sesuai dengan literatur di mana daun kangkung mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan berwarna hijau muda). namun karena karoten sedikit lebih bersifat polar maka karoten lebih lambat keluar daripada klorofil. Pada tabung III dengan pelarut kloroform menghasilkan larutan berwarna hijau muda. Klorofil keluar bersama dengan pelarut petroleum eter. Oleh karena itu. 27 . Klorofil dan karoten sama-sama bersifat non polar. xantofil dan karoten. Sedangkan karoten merupakan senyawa yang dapat larut dalam etanol. klorofil dapat larut dalam pelarut petroleum eter dan kloroform yang bersifat nonpolar. ada 5 tabung reaksi yang kemudian diuji dengan KLT dengan kenampakan noda yang terlihat setelah disinari lampu UV (berwarna jingga) dan diurutkan dari warna yang paling muda sampai tua. Pada tabung I dan II dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna hijau tua dan hijau lebih tua. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Sirih Hijau Untuk perhitungan harga Rf tidak dilakukan uji KLT namun berdasarkan literatur yang ada. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Kangkung Dari proses kromatografi kolom dihasilkan enam fraksi.h. sedangkan karoten keluar bersama dengan pelarut kloroform. i.

28 .

Fraksi 2 (kloroform) yang mengandung karoten. Rf = 0. 2.75 . kloroform. Rf = 0. 9. 3. KESIMPULAN 1. menurut literatur harga Rf standar untuk masing-masing komponen adalah sebagai berikut : . 5. Pemisahan dengan kromatografi kolom dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom. 2. yang ditentukan oleh kekuatan adsorspi atau koefisien partisi antara fasa gerak dan fasa diam. 7. metanol dan etanol. 6.767 VI.767 . Rf = 0.Dari percobaan ini dapat disimpulkan bahwa jenis pigmen dalam tiap sampel daun untuk tiap fraksinya adalah sebagai berikut : No.Fraksi 4 (metanol) yang mengandung xantofil.Fraksi 1 (petroleum eter) yang mengandung klorofil. 8. 1. Pada percobaan pemisahan pigmen dari tanaman dari semua sampel tanaman dilakukan dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut yaitu etanol untuk melarutkan pigmen sampel daun. 29 . 4. Sampel Daun Singkong Pandan Bayam Kemangi Puring Kangkung Sirih Katuk Seledri Petroleum eter Klorofil Klorofil Klorofil Klorofil Xantofil Klorofil Xantofil Klorofil Klorofil Kloroform Klorofil Klorofil Klorofil Karoten Klorofil Klorofil Xantofil Klorofil Klorofil Etanol Karoten Karoten Klorofil Karoten Klorofil Karoten Xantofil Klorofil Klorofil Metanol Xantofil Klorofil Klorofil Xantofil Klorofil Klorofil Xantofil Klorofil Klorofil Untuk uji KLT. Pemisahan menggunakan kromatografi kolom yang fase diam berupa Alumina dan fase gerak yaitu petroleum eter.Fraksi 3 (etanol) yang mengandung xantofil. 3. Rf = 0.756 .

Daun pandan dan kangkung mengandung pigmen klorofil dan karoten. Chairil. Bandung : ITB. VII.4. (Tidak dipublikasikan). dkk. Bandung : Remaja Rosdakarya. Pengantar Kromatografi. FKIP Banjarmasin : UNLAM. Bambang Purwono. Robinson. 1996. Panduan Praktikum Kimia Organik II. Hendayana. daun singkong dan kemangi mengandung pigmen klorofil. katuk dan seledri mengandung pigmen klorofil. Trevon. Yogyakarta : Depdikbud. Gritter. Daun puring mengandung pigmen klorofil dan xantofil. 1991. Bandung : ITB. Berdasarkan percobaan. Sumar.. 2006. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Tim Dosen Kimia Organik. Daun sirih mengandung pigmen xantofil. karoten. 2010. 1995. Daun bayam. J. DAFTAR PUSTAKA Anwar. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis Modern. xantofil. 30 . Pengantar Praktikum Kimia Organik. harno Dwi Pranowo dan Tutik dwi Wahyuningsih.

Apakah teknik yang anda lakukan berhasil memisahkan pigmen seperti yang diinginkan ? Jawaban 1. Namun proses pemisahannya kurang sempurna. Tidak boleh ada gelembung udara dalam timbunan penyerap di dalam kolom karena dapat mengakibatkan distribusi yang tidak merata (ketidakhomogenan penyerap). xantofil dan klorofil. LAMPIRAN 8. Sedangkan fraksi yang muncul selanjutnya adalah fraksi etanol dan disusul fraksi metanol yang membawa pigmen xantofil. Akibatnya terjadi penyebaran noda ketika larutan hasil kromatografi kolom di KLT. Hal ini dikarenakan klorofil dan petroleum benzen bersifat nonpolar sehingga petroleum benzen dapat melarutkan pigmen klorofil.VIII. hal ini mungkin dikarenakan: a.1 Pertanyaan dan Jawaban 1. 31 . Teknik yang telah dilakukan berhasil memisahkan pigmen seperti yang diharapkan karena melalui fraksi-fraksi tersebut dimungkinkan ada 3 pigmen yang muncul yaitu karoten. b. Pigmen yang keluar pertama bersama petroleum benzen adalah klorofil. Identifikasi pigmen apa saja yang keluar dari kolom secara berurutan dan jelaskan mengapa terjadi demikian ? 3. fraksi ini muncul terakhir karena pigmen ini lebih larut dalam alkohol. sehingga pemisahan menjadi kurang baik (tidak sempurna). Penambahan tiap-tiap pelarut yang secara terus-menerus tanpa menunggu tetesan untuk fraksi pelarut tertentu itu habis. Tidak dilakukannya homogenasi alumina sebagai fase diam. dimana karoten dan kloroform sama-sama nonpolar tetapi sedikit polar dibandingkan dengan klorofil dan petroleum benzen. 3. Kemudian disusul dengan fraksi kloroform dengan pigmen karoten. Mengapa tidak boleh ada gelembung udara dalam timbunan penyerap di dalam kolom ? 2. 2.

melainkan berdasarkan warna.c. Pergantian tabung reaksi untuk penampungan tidak dilakukan berdasarkan waktu tertentu atau sampai pelarut tidak menetes lagi. 32 . Fraksi pigmen yang dihasilkan kurang spesifik karena mata memiliki keterbatasan dalam menentukan warna jadi kemungkinan ada fraksi yang tercampur.

2 Flow Chart A. bayam.Menambahkan beberapa mL etanol Lumatan daun contoh + etanol . katuk.Menyaring melalui corong biasa dengan kertas saring Residu Filtrat . kangkung.8.Melumatkan dalam lumpang . sirih hijau. dan pandan 33 . singkong.Memekatkan dengan alat rotavapor sampai cairan tinggal beberapa mL Pelarut Larutan pekat N/B: * Sampel daun : Puring. Ekstraksi Sampel 10-15 lembar daun contoh* . Seledri. kemangi.Mengaduk sampai merata Campuran .

Pembuatan Kromatografi Kolom Glass wool .Membuat adonan Adonan alumina Campuran 1 + adonan .Memasukkan adonan melalui corong ke dalam kolom sehingga setinggi 15 cm sambil mengetukngetuk dan keran dalam keadaan terbuka Campuran II 34 .Memasukan ke dalam kolom kaca setinggi 20 cm.Menuangkannya melalui corong dan memasukannya ke dalam kolom hingga setinggi 10 cm Campuran I Al2O3 + etanol .B. hingga setinggi 1 cm Glass wool + Etanol .

Mengelusi kembali kolom dan mengatur keran sampai terjadi kira-kira 20 tetes per menit.Kemudian melanjutkan dengan KLT dengan larutan pengembang yang sesuai (etanol) 35 .Membuka keran Campuran IV + etanol . jika permukaan sampel telah mendekati permukaan penyerap .C. Pemisahan Pigmen dari Tanaman Campuran II + etanol .Memasukkan setinggi 1 cm Campuran VI + pelarut .Memasukkan . sampai permukaan pelarut turun mendekati penyerap (adonan Al2O3) Campuran V + larutan contoh .Memisahkan berdasarkan warnanya . kemudian menutup keran Campuran III + glass wool .Menampung tetesan yang keluar dari kolom dengan beberapa tabung reaksi yang bersih .Mengelusi kembali.Menghentikan pemberian pelarut bila semua warna telah keluar dari kolom Larutan berwarna NB : . kloroform.Membuka keran . etanol dan metanol).Segera mengelusikan kolom dengan pelarut secara bertahap sesuai dengan kepolarannya (**yaitu petroleum benzen.

LAMPIRAN FOTO – FOTO PERCOBAAN Gambar 17. Kolom kromatografi Gambar 18. Sampel ekstrak daun puring mulai turun pada KK Gambar 20. Sampel ekstrak daun andong pada KK 36 . Sampel ekstrak daun puring pada KK Gambar 19.

37 .