PERCOBAAN IV

Judul Tujuan

: Pemisahan Pigmen dari Tanaman : Pada akhir percobaan ini Mahasiswa harus paham mengenai 1. Cara kerja dan teknik-teknik isolasi tumbuhan. 2. Pengenalan isolasi bahan alam yang bermolekul besar. 3. Analisa senyawa tumbuhan berwarna dengan

menggunakan KLT dan kromatografi kolom Hari/tanggal Tempat : Selasa / 5 April 2011 : Laboratorium kimia FKIP UNLAM Banjarmasin

I.

DASAR TEORI

1.1 Daun dan Pigmen Tanaman Daun merupakan salah satu organ tumbuhan yang tumbuh dari batang, umumnya berwarna hijau daun dan terutama berfungsi sebagai penangkap energi cahaya matahari melalui fotosintesis. Bentuk daun sangat beragam namun biasanya berupa helaian, bisa tipis atau tebal. Daun juga bisa bermodifikasi menjadi duri (misalnya kaktus) dan berakibat daun kehilangan fungsinya sebagai organ fotosintetik. Warna hijau pada daun berasal dari kandungan klorofil pada daun. Daun seringkali mengandung beberapa senyawa yang berwarna (pigmen) antara lain klorofil (hijau), karoten (kuning) dan xantofil (kuning). Meskipun klorofil mengandung bagian yang polar, akan tetapi secara keseluruhan strukturnya adalah non polar, seperti hidrokarbon, sehingga klorofil mudah larut dalam pelarut non polar seperti eter atau petroleum eter. Ada dua jenis klorofil yaitu klorofil a dan klorofil b, yang membedakan kedua jenis klorofil ini adalah adanya gugus aldehid pada struktur klorofil b yang menyebabkan klorofil b ini bersifat sedikit lebih polar dibandingkan klorofil a. Adapun struktur dari kedua jenis klorofil ini adalah sebagai berikut.

1

Gambar 1. Struktur klorofil a

Gambar 2. Struktur klorofil b

Karoten C40H56 adalah senyawa alkena dengan rantai panjang dari sistem ikatan rangkap terkonjugasi. Daun hijau mengandung sekitar 90% betakaroten dan 10 % alpha karoten. Meskipun secara keseluruhan molekul karoten adalah non polar, akan tetapi mempunyai sifat dapat mengubah bidang polarisasi. Karoten juga ada dua jenis yaitu a-karoten dan β-karoten, yang membedakan kedua struktur ini adalah posisi ikatan rangkap pada cincin ujung. Adapun strukturnya adalah sebagai berikut.

2

Gambar 3. Struktur α-karoten

Gambar 4. Struktur β-karoten

Xantofil C40H50O2 adalah bentuk karoten yang terhidroksilasi, kandungan xantofil dalam daun hijau selalu dua kali lebih besar dari karoten. Xantofil lebih larut dalam alkohol dan sedikit larut dalam petroleum eter dibandingkan karoten. Xantofil memiliki struktur yang mirip dengan karoten, hanya bedanya xantofil memiliki gugus OH pada struktur sikliknya. Adapun struktur dari xantofil adalah sebagai berikut.

Gambar 5. Struktur xantofil

Selain itu, di dalam daun juga mengandung antosianin yang berwarna merah, biru atau ungu tergantung derajat keasamannya. Untuk mengekstraksi pigmen dari daun, terlebih dahulu dilakukan penggerusan dengan mortar terhadap daun kering sampai halus. Pelarut yang dapat mengekstraksi pigmen secara bertahap dengan urutan kepolaran yaitu petroleum eter, kloroform, etanol, dan metanol. Adapun struktur umum dari antosianin adalah sebagai berikut.

3

4 . Campuran ditambahkan ke kolom dari satu ujung dan campuran akan bergerak dengan bantuan pengembang yang cocok (fase gerak). Perbedaan kemampuan masing-masing komponen diadsorpsi dan perbedaan distribusi dua fase yang tidak saling bercampur (partisi). sangat tergantung pada distribusi pada kedua fase cair dan padat. Kromatografi kolom bertujuan untuk mengisolasi komponen dari campurannya. Alat yang digunakan yaitu kolom yang di dalamnya berisi fase stasioner (padat atau cair). Pemisahan suatu campuran secara kromatografi dapat dilakukan kromatografi kolom. yang ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara fase gerak dan fase diam (stationer). Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom.Gambar 6. sehingga ikatannya kuat dan rapat. Dengan demikian. Silika gel memadat dalam bentuk tetrahedral raksasa. Untuk pemisahan pigmen dari tumbuhan. dapat dilakukan dengan kromatografi kolom. kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis (KLT). adsorben silika gel mampu menghasilkan proses pemisahan yang lebih optimal. yakni fase diam dan fase gerak. Struktur umum antosianin 1. Pada kromatogarfi kolom digunakan kolom dengan adsorben sillika gel karena kolom yang dibentuk dengan silika gel memiliki tekstur dan struktur yang lebih kompak dan teratur. Pemisahan berdasarkan kromatografi adsorpsi.2 Kromatografi Kolom dan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Kromatografi adalah prinsip pemisahan campuran senyawa atas komponenkomponen berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi komponen pada dua fase.

jika dibiarkan kering. kondisi yang senantiasa basah berperan untuk memudahkan proses elusi (larutan melewati kolom) dalam kolom. silica gel sifatnya sangat polar. karena pada permukaannya terikat gugus hidroksil. sedangkan fase geraknya bersifat polar. adsorben silika gel harus senantiasa basah karena. Sorben yang digunakan dalam kromatografi kolom diantaranya arang. Kromatografi kolom dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya dapat dibedakan menjadi dua. Untuk menahan fasa diam (adsorben) biasanya digunakan kapas gelas (glass wool) atau gelas berpori (fritted glass). Oleh karenanya. Dalam proses pemisahan dengan kromatografi kolom. kolom yang terbentuk dari silika gel bisa retak. kebalikan dari fase normal.Silica gel dapat membentuk ikatan hidrogen di permukaannya. Ukuran kolom yang lazim digunakan mempunyai diameter dalam 2 cm dan panjang 45 cm. Jika fasa gerak yang digunakan sifatnya non-polar. aromatis. silika gel. kalsium sulfat dan serbuk selulosa. ester. 2) Kromatografi fase terbalik Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar. Ujung bagian bawah dilengkapi dengan kran untuk mengatur laju alir eluen. eter. yaitu : 1) Kromatografi fase normal Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya “normal” bersifat polar. aldehid dan alkohol. keton. alumina. senyawa-senyawa yang semakin polar akan semakin lama tertahan di fasa stasioner. Selain itu. Berikut ini beberapa golongan solutnya misalnya alkana. magnesium silikat. sedangkan fase geraknya bersifat non polar. alkena. plastik atau nilon. Kolom yang digunakan dalam kromatografi kolom dapat berupa gelas. sehingga proses pemisahan zat tidak berjalan optimal. dan senyawa-senyawa yang semakin tidak (kurang) polar akan terbawa keluar kolom lebih cepat. 5 . maka pada saat campuran dimasukkan. misalnya silica gel.

6 .

Berikut ini gambar-gambar bagan dalam kromatografi kolom : Gambar 7. Kolom berisi sampel 7 . Bagan kolom kromatografi Gambar 8.

Setelah 8 . alumina. Pada prakteknya. Dalam kromatografi lapis tipis (KLT) fase diamnya biasanya adalah serbuk silika gel.125 mm dilapiskan pada kaca. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending) atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending). selulosa dan lainnya yang mempunyai ukuran butir sangat kecil yaitu 0.Gambar 9. lembaran aluminium maupun plastik dengan tebal tertentu. Ketika eluen sudah mencapai batas pada plat yang telah dibuat sebelumnya.063 – 0. plat diangkat dan dikeringkan. tanah diatome. Proses pemisahan pigmen tanaman Dalam pemisahan biasanya kromatografi kolom diikuti pemeriksaan secara kualitatif dengan KLT untuk memonitor apakah pemeriksaan dengan cara kromatografi kolom berhasil atau tidak. sampel ditotolkan pada plat KLT lalu dimasukkan ke dalam chamber yang sudah jenuh oleh eluen.

Gambar 10.daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi. Metoda identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut. maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa. Berikut ini gambar-gambar bagan dalam kromatografi lapis tipis (KLT). Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi yang konstan merupakan besaran yang karakteristik dan reprodusibel. Pigmen dalam sampel menuju batas atas plat KLT 9 . menggunakan harga Rf. Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi lapis tipis. Bagan kromatografi lapis tipis (KLT) Gambar 11.

oval. Beberapa keuntungan dari kromatografi planar ini adalah :   Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis. menurun (descending).3 Beberapa Jenis Tumbuhan a) Daun Puring (Codiaeum variegatum) Puring atau kroton adalah tumbuhan hias pekarangan populer berbentuk perdu dengan bentuk dan warna daun yang sangat bervariasi. Bentuk daunnya bermacam-macam. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna. serta campurannya. 1. Perbandingan untuk perhitungan Rf Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan lebih murah dibandingkan dengan kromatografi kolom.Gambar 12. tapi bergelombang 10 . Beragam kultival telah dikembangkan dengan variasi warna hijau. peralatan yang digunakan lebih sederhana dan dapat dikatakan hampir semua laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat. memanjang. Demikian juga peralatan yang digunakan. Dalam kromatografi lapis tipis. kuning. jingga. merah.  Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending). ungu. atau dengan cara elusi 2 dimensi.  Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak. fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.

Beberapa negara termasuk Jepang. tannin dan flavonoid. xantofil dan antosianin. Warna daun sirih hijau memang merah kepekatan. Sirih hijau sejak dahulu telah digunakan oleh masyarakat sebagai obat untuk menyembuhkan berbagai jenis penyakit. hepatitis. Secara empiris sirih hijau dapat menyembuhkan berbagai jenis penyakit. Ciri yang sama adalah batangnya menghasilkan biloks berwarna putih pekat dan lengket. maupun ekstrak kapsul. Klorofil adalah senyawa pigmen yang berperan dalam menyeleksi panjang gelombang cahaya yang energinya diambil dalam fotosintesis. namun masih juga mengandung warna hijau yaitu berada pada bagian dalam. batu ginjal dan sebagainya. yang tumbuh merambat dengan bentuk daun menyerupai hati dan bertangkai yang tumbuh berselang-seling dari batangnya serta penampakan daun yang berwarna merah keperakan dan mengkilap. saponin. Secara botani. Penggunaan sirih hijau dapat digunakan dalam bentuk segar.helainya terputus-putus dan sebagainya. namun beraroma lebih wangi dibandingkan dengan sirih hijau. puring adalah kerabat jauh singkong serta kaksuba. seperti diabetes. yang merupakan ciri khas suku Euphobaceae. Warna hijau pada daun berasal dari kandungan klorofil. Dalam daun sirih hijau terkandung senyawa fitokimia yakni alkaloid. Pigmen lain yang terkandung dalam daun adalah karoten. b) Daun sirih hijau (Piper crocatum) Daun sirih hijau (Piper crocatum) termasuk dalam family piperaceae. Cina dan Korea mempergunakan bagian tangkai daun sebagai bahan 11 . Daun sirih hijau berasa pahit dan getir. c) Daun seledri (Apium graveolens) Seledri adalah sayuran dan tumbuhan obat yang biasa digunakan sebagai bumbu masakan.

d) Daun kemangi (Ocimum sanctum) Daun kemangi memiliki kandungan klorofil yang paling rendah. Penggunaan seledri paling lengkap adalah di Eropa: daun.7%). tromboksan. Umur daun. e) Daun katuk (Sauropus androgynus) Sifat kimia daun katuk dapat dilihat dari kadar kalsium yang tinggi. isokuersitrin.1 . Daun katuk dapat mengandung hampir 7 % protein dan serat kasar 19 %. Daun ini 12 . furanokumarin. tangkai daun. buah. Khususnya jaringan palisade yang mengandung klorofil. prostasiklin. Terdapat tujuh senyawa aktif yang dapat merangsang produksi hormon-hormon steroid (seperti progesteron. serta isoimperatorin. daun kemangi hanya tersusun dari selapis jaringan palisade. Kandungan utamanya adalah butilftalida dan butilidftalida sebagai pembawa aroma utama. Terdapat juga sejumlah flavonoid seperti graveobiosid A (1-2%)dan B (0. dan umbinya semua dimanfaatkan. estradiol.makanan. lipoksin dan leukotrien).0. Sifat fisika pada klorofil daun katuk dapat dilihat pada semakin tinggi suhu pengeringan. Selain itu. glukokortikoid) dan senyawa eikosanoid (diantaranya prostaglandin. morfologi daun dan tahapan fisiologis suatu tanaman merupakan faktor yang menentukan kandungan klorofil. Daun dan tangkai daun mengandung steroid seperti stigmasterol dan sitosterol. Di Indonesia tumbuhan ini diperkenalkan oleh penjajah Belanda dan digunakan daunnya untuk menyedapkan sup atau sebagai lalapan. mesofil. Hal ini dikarenakan kemangi merupakan tanaman semusim. Kandungan asam lemak utama adalah asam petroselin (40-60%). serta senyawa golongan fenol. Komponen lainnya apiin. kadar klorofil semakin tinggi dan intensitas warna semakin hijau. Kandungan vitamin C pada daun katuk jauh lebih tinggi daripada jeruk maupun jambu biji. daun berukuran kecil dengan helaian daun yang tipis. terstosteron.

selain itu pro-vitamin A ( β-karoten). Daun bayam mempunyai kandungan klorofil yang tinggi. B dan C. sehingga laju fotosintesisnya juga lebih tinggi. protein yang terlibat dalam proses fotosintesis) sehingga berguna bagi penderita anemia. Energi cahaya akan diubah menjadi energi kimia di pusat reaksi yang kemudian dapat digunakan untuk proses reduksi dalam fotosintesis. Klorofil a dan klorofil b berperan dalam proses fotosintesis. kalium. f) Daun singkong (Manihot utilisima L) Daun singkong memiliki kandungan klorofil a dan klorofil b yang tinggi. Hal ini menyebabkan laju fotosintesis berlangsung lama karena tidak efisien dalam menangkap energi radiasi cahaya.kaya akan vitamin K. Pusat reaksi tersusun dari klorofil a. h) Daun bayam (Amaranthus spp) Kandungan besi pada bayam relatif lebih tinggi daripada sayuran lain (besi merupakan penyusun sitokrom. fosfor dan magnesium. Hal ini menunjukkan bahwa kemampuan singkong dalam menangkap energi radiasi cahaya lebih efisien. besi. g) Daun kangkung (Ipomoea aquatica) Kangkung memiliki kandungan klorofil yang relatif rendah yaitu setara dengan daun kemangi. Klorofil b berfungsi sebagai antena fotosintetik yang mengumpulkan cahaya kemudian ditransfer ke pusat reaksi. Hal ini diduga klorofil pada tanaman kangkung tersebar.8 %). 13 . tidak hanya pada organ daun saja namun juga dijumpai pada bagian batang. sehingga laju fotosintesisnya juga tinggi. Mineral yang dikandungnya adalah kalsium (hingga 2.

Etanol 3. Pipet tetes 9.1 Alat yang digunakan 1. Statif dan klem 11. Batang pengaduk 5. bayam. kemangi. Gelas kimia 250 ml 6. Tabung reaksi 7. Seledri. Lumpang dan alu 10. sirih hijau. Sampel daun : Puring. Rak tabung reaksi 8. Gelas ukur 10 ml 3. Sebuk Al2O3 ( alumina ) : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 36 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah 14 . Cawan porselin 12. Corong biasa 4. singkong. Kolom kaca 2. Semakin tinggi kandungan klorofilnya maka semakin cepat laju fotosintesisnya dan lebih efisien dalam menangkap energi radiasi cahaya.2 Bahan yang digunakan 1. katuk. II. ALAT DAN BAHAN 2.i) Daun pandan (Pandanus amaryllifolius Roxb) Daun pandan mengandung klorofil yang sangat tinggi yang sering digunakan sebagai pewarna alami. dan pandan. Bunsen + kaki tiga + kain kasa 2. 2. Glass wool 4. kangkung.

PROSEDUR KERJA 3.5. 6. Mengelusi kembali kolom dengan pelarut hingga mencapai permukaan alumina dalam kolom dan memasukkan glass woll. Memekatkan larutan dengan menggunakan pembakar bunsen sampai larutan tinggal setengah mL. Menyaring larutan sampel dengan kertas saring melalui corong. 4. 2.3 Pemisahan Pigmen dari Tumbuhan 1. Melumatkan 10-15 lembar sampel daun dengan lumpang dan alu. Kertas saring 6. 3. Membuat adonan dari 25 g alumina (Al2O3) dengan 25 mL etanol. serta secara sedikit demi sedikit (jangan ada gelembung udara). 3. mengaduk sampai merata. Menambahkan 20 mL etanol. Kloroform 8. tinggi 20 cm dan diameternya 1.2 Pembuatan Kromatografi Kolom 1. 5. Metanol III. 2. 4. Memasukkan adonan tersebut ke dalam kolom hingga setinggi 10 cm sambil mengetuk-ngetuk dengan kran dalam keadaan terbuka. Petroleum eter 7.5 cm yang bagian bawahnya telah dilengkapi dengan kran. 15 . Memasukkan larutan sampel daun setinggi 2 cm setelah permukaan pelarut etanol turun mendekati penyerap (adonan Al2O3). Melalui corong menuangkan etanol ke dalam kolom hingga setinggi 1 cm. Menyiapkan kolom gelas 50 mL. Memasukkan glass wool ke dalam kolom gelas hingga setinggi 1 cm. 3. 3.1 Ekstraksi Sampel 1.

Perlakuan 1. Menggerus sampel daun + 20 ml etanol 2. 3. HASIL PENGAMATAN No. Menyaring campuran 3. Memasukkan glass wool dalam kolom + 1 ml etanol Al2O3 + 25 ml etanol Glass wool dan etanol dalam kolom Memasukkan adonan alumina + Adonan alumina. kloroform. Segera mengelusikan kolom dengan pelarut secara bertahap sesuai dengan kepolarannya yaitu petroleum eter. campuran glass wool kedalam kolom + 2 ml etanol +larutan sampel Mendiamkan sampai larutan sampel menetes Menambahkan petroleum eter Larutan sampel menyebar dan menetes Sampel yang digunakan: A. IV. 4. etanol dan metanol. 7. 5. Jika permukaan sampel telah mendekati permukaan penyerap.2. Menghentikan pemberian pelarut bila semua warna telah keluar dari kolom kaca. Daun Pandan:  Tabung I + petroleum eter  Tabung II + Kloroform  Tabung III + Etanol  larutan hijau muda  larutan hijau tua  larutan hijau kekuningan 16 . Hasil Pengamatan Campuran Filtrat: larutan hijau tua Residu: ampas daun Tinggi glass wool 1 cm 6. Daun singkong:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau kekuningan larutan kuning B. Menampung tetesan yang keluar dari kolom dengan beberapa tabung reaksi yang bersih. 4. 8.

 Tabung IV + metanol  larutan hijau muda C. Daun Katuk:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau muda larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau tua 17 . Daun Bayam:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau tua larutan hijau tua D. Daun Puring:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan kuning jernih larutan hijau muda larutan hijau muda larutan hijau muda F. Daun Kangkung:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau tua larutan hijau muda larutan hijau kekuningan larutan hijau bening G. Daun Kemangi:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau bening larutan hijau kekuningan larutan hijau kekuningan larutan kuning E. Daun Sirih:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan kuning bening larutan kuning tua larutan kuning larutan kuning H.

kangkung. lalu mengekstraksinya dengan menggunakan pelarut etanol. Seledri. karoten dan xantofil memiliki sifat diantara polar dan non polar sehingga dapat larut dalam etanol yang merupakan pelarut semipolar. Namun proses ekstrasi ini harus dilakukan dengan cepat karena enzim klorofilasi yang terkandung dalam daun segar akan mengkatalisis reaksi antara klorofil dengan etanol sehingga jumlah klorofil dalam daun akan berkurang. Penumbukan ini bertujuan menghaluskan daun sehingga senyawa yang terkandung di dalamnya mudah larut dalam pelarut etanol.I. kemangi. Etanol efektif untuk mengekstrak pigmen tumbuhan karena sebagian besar pigmen tumbuhan seperti klorofil. yaitu daun Puring. Reaksinya adalah sebagai berikut. bayam. Etanol + klorofil → fitol + etil klorofilida 18 . Daun Seledri:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau muda larutan hijau tua V. singkong. katuk. metanol. dan pandan menggunakan kromatografi kolom dengan beberapa pelarut yaitu petroleum eter. dan etanol.1 Ekstraksi Sampel Daun Pertama-tama menumbuk sampel daun dengan lumpang dan alu. Setelah itu menguji masingmasing ekstrak pelarut dari masing-masing sampel daun dengan metode KLT untuk menentukan jenis pigmen yang terkandung dalam daun tersebut. ANALISIS DATA Pada percobaan ini dilakukan pemisahan pigmen dari beberapa sampel daun. kloroform. sirih hijau. 5. sebab semakin halus daun maka semakin luas permukaan untuk terjadi kontak dengan pelarut maka semakin banyak zat yang dapat terekstrak.

19 . sedangkan residunya dibuang. Larutan hasil ekstrak dengan etanol ini.Setelah itu dilakukan penyaringan agar diperoleh filtrat yang mengandung pigmen tanaman. selanjutnya diuapkan hingga separuh volume mula-mula.

Saat mengisi kolom. Bubur alumina dimasukkan ke dalam kolom sambil mengetuk-ngetuk kolomnya agar tidak terbentuk gelembung udara. Penggunaan etanol ini dikarenakan alumina mengandung titik aktif Al-OH sehingga etanol yang juga mengandung gugus OH akan dapat terikat kuat dengan alumina jadi bubur alumina yang merupakan fase diam akan lebih homogen. Selanjutnya memasukkan kembali etanol untuk mengelusi kolom dan setelah selesai. 5.2 Penyiapan Kolom Kromatografi Selanjutnya membuat kolom kromatografi. karena Al2O3 lazim digunakan untuk senyawa organik stabil. bagian bawah kolom ditutupi dengan glass woll. sebelum dimasukkan alumina. kran kolom ditutup. kran dibuka agar pelarut etanol dapat keluar sehingga diperoleh fase diam (alumina) yang padat.5. Setelah itu bagain atas kolom juga diberi glass woll agar ekstrak daun yang akan dimasukkan ke dalam kolom dapat tersaring. Larutan berawarna ini adalah pigmen dari daun sampel.3 Pemisahan Pigmen Tanaman Setelah kolom kromatografi siap dipakai. Di sini terlihat bahwa pigmen dari sampel daun mulai bergerak turun dan mulai menetes. hal ini bertujuan untuk menahan fase diam (adsorben) alumina agar tidak turun dari kolom karena glass woll merupakan gelas yang masih berpori sehingga dapat menahan alumina. Dalam hal ini alumina Al2O3 yang digunakan sebagai adsorben atau fase diamnya. Tetesan yang keluar dari kolom ini ditampung dalam tabung reaksi dan mengganti tabung reaksinya ketika warna yang keluar dari kolom berubah. dimana langkah pertama yang dilakukan adalah membuat adonan Al2O3 dengan pelarut etanol sehingga terbentuk bubur alumina. kolom harus bebas dari gelembung gas karena bila ada gelembung udara maka proses pemisahan yang terjadi tidak akan sempurna sehingga akan terjadi penyebaran noda ketika hasil kromatografi kolom di uji KLT. ekstrak sampel daun di masukkan ke dalam kolom. Lalu memasukkan pelarut ke dalam kolom dan membuka krannya. Selain itu. Adapun pelarut yang digunakan adalah berdasarkan kepolaran yang paling kecil 20 . tetapi ekstrak daun masih bisa mengalir.

Prinsip pemisahan dalam kolom tersebut adalah sebagai berikut. Adapun struktur dari senyawa-senyawa yang terkandung dalam daun adalah : Gambar struktur klorofil a 21 . Karoten yang merupakan senyawa yang lebih polar daripada klorofil. Untuk itulah digunakan pelarut berikutnya yang lebih polar dibandingkan petroleum eter yaitu kloroform agar karoten dapat keluar dari kolom dengan lebih cepat namun dengan catatan klorofil sudah keluar seluruhnya. etanol dan metanol.yaitu petroleum eter. Pelarut ini digunakan pada kromatografi kolom secara berurutan. akan keluar dari kolom lebih lambat dibandingkan klorofil karena karoten akan teradsorbsi lebih kuat dari pada klorofil. klorofil dalam ekstrak daun akan larut di dalamnya dengan kecepatan yang sama dengan fase geraknya (petroleum eter) dan keluar paling pertama. Kita misalkan di dalam suatu ekstrak daun terdapat klorofil. Ini dapat terjadi karena alumina adalah senyawa polar sedangkan klorofil adalah senyawa yang tergolong non polar. ketika petroleum eter kita masukkan ke dalam kolom. Begitu pula seterusnya digunakan pelarut etanol dan metanol untuk mengeluarkan pigmen yang lebih polar seperti xantofil. kloroform. berarti klorofil tidak teradsorpsi dengan kuat pada alumina.

Gambar struktur klorofil b Gambar struktur α-karoten Gambar struktur β-karoten 22 .

Kenonpolaran klorofil dapat dilihat dari strukturnya di mana walaupun klorofil mengandung bagian yang polar namun secara keseluruhan strukturnya adalah nonpolar. Warna hijau yang dihasilkan menunjukkan bahwa sampel daun seledri mengandung klorofil karena klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau dengan semua pelarut. etanol dan metanol menghasilkan larutan berwarna hijau muda. karoten. Klorofil mengandung sifat nonpolar sehingga dapat larut dalam petroleum eter yang dan kloroform yang juga bersifat nonpolar. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Kemangi Dari proses kromatografi kolom dihasilkan tiga fraksi ekstrak sesuai dengan pelarutnya. Sesuai dengan literatur daun seledri mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan berwarna hijau muda). Pada tabung I dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna kuning bening. baru kemudian xantofil. dengan warna yang sedikit berbeda. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Puring Dari proses kromatografi kolom dihasilkan empat fraksi. karena uji KLT tidak 23 .Gambar struktur antosianin Dari penjelasan di atas dapat dikatakan bahwa urutan keluarnya pigmen dari kolom sesuai dengan urutan kepolaran dari pigmen yang paling non polar yaitu klorofil. Sedangkan pada tabung lainnya dengan pelarut kloroform. Walaupun demikian belum dapat dipastikan dalam pelarut apa pigmen-pigmen tersebut terkandung. a. apakah dalam petroleum eter. etanol atau metanol. b. kloroform.

larutan pada fraksi ini berwarna kuning dan hal ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang berwarna kuning. 24 . Dalam hal ini. Klorofil mengandung sifat nonpolar sehingga dapat larut dalam petroleum eter yang dan kloroform yang juga bersifat nonpolar. Kenonpolaran klorofil dapat dilihat dari strukturnya di mana walaupun klorofil mengandung bagian yang polar namun secara keseluruhan strukturnya adalah nonpolar. Warna hijau yang dihasilkan menunjukkan bahwa sampel daun seledri mengandung klorofil karena klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau dengan semua pelarut. Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen karoten karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar tetapi kepolarannya agak rendah jika dibandingkan dengan petroleum eter. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Seledri Dari proses kromatografi kolom dihasilkan empat fraksi. Sesuai dengan literatur daun seledri mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan berwarna hijau muda). Pada tabung II dengan pelarut kloroform menghasilkan larutan berwarna hijau tua.dilakukan maka analisis dilakukan berdasarkan harga Rf menurut literatur dan perbedaan warna yang dihasilkan. Fraksi ini berwanra hijau kekuningan (warna kuning dominan). Untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter berwarna hijau sehingga dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah klorofil. Pada tabung I dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna hijau muda. Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung xantofil (C40H50O2) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol dibandingkan dengan karoten. c. xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar. Hasil ini sesuai dengan literatur bahwa pigmen karoten memang senyawa yang berwarna kuning. Di samping itu. Tabung III dengan pelarut etanol menghasilkan larutan berwarna hijau muda dan pada tabung IV dengan pelarut metanol menghasilkan larutan yang berwarna hijau.

komponen yang terkandung bersifat lebih polar. f. Namun pada pelarut metanol dan kloroform masih menghasilkan klorofil. dan sebaliknya apabila harga Rf besar. dimana seharusnya untuk pelarut kloroform dapat menghasilkan pigmen karoten dan untuk pelarut metanol menghasilkan pigmen xantofil. dan harga Rf klorofil b terhadap petroleum eter paling kecil. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Katuk 25 . Meskipun karoten bersifat nonpolar. Untuk pelarut metanol menghasilkan ekstrak berwarna kuning menunjukkan adanya pigmen xantofil. Untuk uji KLT. Karena pelarut yang digunakan adalah etanol yang bersifat polar. Berbanding terbalik dengan harga Rf yang kecil. artinya komponen tersebut kurang larut dalam pelarut etanol. Klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau dengan sifat nonpolar sehingga mudah larut dalam petroleum eter maupun kloroform. Pelarut etanol menghasilkan ekstrak berwarna hijau kekuningan menunjukkan adanya pigmen karoten. Harga Rf karoten terhadap etanol lebih besar daripada harga Rf klorofil a terhadap kloroform. e. Dengan pelarut petroleum eter terdapat klorofil dengan warna larutan hijau. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Singkong Dari proses kromatografi kolom diperoleh empat fraksi. harga Rf yang besar menunjukkan bahwa komponen tersebut lebih larut dalam eluennya. larutan tersebut memiliki komponen yang bersifat nonpolar. Untuk pelarut petroleum eter menghasilkan ekstrak warna hijau muda menunjukkan adanya pigmen klorofil b (C55H70O6N4Mg).d. Pelarut kloroform menghasilkan ekstrak warna hijau tua menunjukkan adanya pigmen klorofil a (C55H72O6N4Mg). tetapi kepolarannya agak rendah sehingga dapat larut dalam etanol. Pigmen xantofil dihasilkan dari pelarut petroleum eter dan etanol. Berdasarkan hal tersebut maka dapat diketahui bahwa harga Rf xantofil terhadap metanol lebih besar daripada harga Rf karoten terhadap etanol. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Bayam Dari proses kromatografi kolom diperoleh tiga fraksi ekstrak sesuai pelarutnya. maka bila harga Rf kecil.

dengan warna yang sedikit berbeda. karena uji KLT tidak dilakukan maka analisis dilakukan berdasarkan harga Rf menurut literatur dan perbedaan warna yang dihasilkan. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Pandan Dalam pemisahan pigmen tanaman dari daun pandan. Di samping itu. larutan pada fraksi ini berwarna hijau kekuningan dan hal ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang berwarna kuning. Dalam hal ini. untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter (nonpolar) berwarna hijau sehingga dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah klorofil. g. Dalam hal ini.Dari proses kromatografi kolom dihasilkan tiga fraksi ekstrak sesuai dengan pelarutnya. xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar. 26 . larutan pada fraksi ini berwarna kuning dan hal ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang berwarna kuning. Untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter berwarna hijau sehingga dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah klorofil. xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar. Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung xantofil (C40H50O2) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol dibandingkan dengan karoten. Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen karoten karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar dimana pigmennya berwarna hijau. Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung xantofil (C40H50O2) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol dibandingkan dengan karoten. Fraksi ini berwarna hijau kekuningan (warna kuning dominan). Hasil ini sesuai dengan literatur bahwa pigmen karoten memang senyawa yang berwarna kuning. Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen karoten karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar tetapi kepolarannya agak rendah jika dibandingkan dengan petroleum eter. Di samping itu.

27 . Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Sirih Hijau Untuk perhitungan harga Rf tidak dilakukan uji KLT namun berdasarkan literatur yang ada. sedangkan karoten keluar bersama dengan pelarut kloroform. Hasil pemisahan pigmen yang diperoleh melalui kromatografi kolom adalah klotofil. Klorofil mengandung bagian yang polar walaupun secara keseluruhan stukturnya adalah senyawa nonpolar. xantofil dan karoten. Klorofil dan karoten sama-sama bersifat non polar. Tabung IV sampai VI dengan pelarut etanol dan metanol menghasilkan warna hijau kekuningan. Sedangkan warna hijau kekuningan menunjukkan adanya karoten karena karoten merupakan senyawa yang berwarna hijau kekuningan. Sesuai dengan literatur di mana daun kangkung mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan berwarna hijau muda). Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Kangkung Dari proses kromatografi kolom dihasilkan enam fraksi. namun karena karoten sedikit lebih bersifat polar maka karoten lebih lambat keluar daripada klorofil. Pada tabung I dan II dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna hijau tua dan hijau lebih tua. ada 5 tabung reaksi yang kemudian diuji dengan KLT dengan kenampakan noda yang terlihat setelah disinari lampu UV (berwarna jingga) dan diurutkan dari warna yang paling muda sampai tua. klorofil dapat larut dalam pelarut petroleum eter dan kloroform yang bersifat nonpolar. Oleh karena itu. Klorofil keluar bersama dengan pelarut petroleum eter. i.h. Sedangkan karoten merupakan senyawa yang dapat larut dalam etanol. Sedangkan xantofil yang mudah larut dalam alkohol akan keluar bersama dengan pelarut etanol dan metanol. Pada tabung III dengan pelarut kloroform menghasilkan larutan berwarna hijau muda. Warna hijau yang dihasilkan menunjukkan bahwa sampel daun kangkung mengandung klorofil karena klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau.

28 .

767 . 6.767 VI.Fraksi 3 (etanol) yang mengandung xantofil.Dari percobaan ini dapat disimpulkan bahwa jenis pigmen dalam tiap sampel daun untuk tiap fraksinya adalah sebagai berikut : No. Rf = 0. Sampel Daun Singkong Pandan Bayam Kemangi Puring Kangkung Sirih Katuk Seledri Petroleum eter Klorofil Klorofil Klorofil Klorofil Xantofil Klorofil Xantofil Klorofil Klorofil Kloroform Klorofil Klorofil Klorofil Karoten Klorofil Klorofil Xantofil Klorofil Klorofil Etanol Karoten Karoten Klorofil Karoten Klorofil Karoten Xantofil Klorofil Klorofil Metanol Xantofil Klorofil Klorofil Xantofil Klorofil Klorofil Xantofil Klorofil Klorofil Untuk uji KLT. 3. Rf = 0. Rf = 0. Pemisahan dengan kromatografi kolom dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom.756 .Fraksi 1 (petroleum eter) yang mengandung klorofil. 2. KESIMPULAN 1. Pemisahan menggunakan kromatografi kolom yang fase diam berupa Alumina dan fase gerak yaitu petroleum eter. 4. 7. 1. 29 . 8. Rf = 0.75 . yang ditentukan oleh kekuatan adsorspi atau koefisien partisi antara fasa gerak dan fasa diam.Fraksi 4 (metanol) yang mengandung xantofil. 3. 5. kloroform. 9. menurut literatur harga Rf standar untuk masing-masing komponen adalah sebagai berikut : .Fraksi 2 (kloroform) yang mengandung karoten. Pada percobaan pemisahan pigmen dari tanaman dari semua sampel tanaman dilakukan dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut yaitu etanol untuk melarutkan pigmen sampel daun. 2. metanol dan etanol.

Bandung : Remaja Rosdakarya. J. daun singkong dan kemangi mengandung pigmen klorofil. Hendayana. 2010. Bandung : ITB. Sumar. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Pengantar Kromatografi. katuk dan seledri mengandung pigmen klorofil. Robinson. 2006. DAFTAR PUSTAKA Anwar. Chairil. 1996. 1995.4. Panduan Praktikum Kimia Organik II. Trevon. Daun pandan dan kangkung mengandung pigmen klorofil dan karoten. VII. Berdasarkan percobaan. Yogyakarta : Depdikbud. Tim Dosen Kimia Organik. (Tidak dipublikasikan). harno Dwi Pranowo dan Tutik dwi Wahyuningsih.. karoten. FKIP Banjarmasin : UNLAM. xantofil. dkk. Daun bayam. Pengantar Praktikum Kimia Organik. 30 . Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis Modern. Bandung : ITB. Daun puring mengandung pigmen klorofil dan xantofil. 1991. Daun sirih mengandung pigmen xantofil. Gritter. Bambang Purwono.

dimana karoten dan kloroform sama-sama nonpolar tetapi sedikit polar dibandingkan dengan klorofil dan petroleum benzen. Tidak boleh ada gelembung udara dalam timbunan penyerap di dalam kolom karena dapat mengakibatkan distribusi yang tidak merata (ketidakhomogenan penyerap). Sedangkan fraksi yang muncul selanjutnya adalah fraksi etanol dan disusul fraksi metanol yang membawa pigmen xantofil. xantofil dan klorofil. Pigmen yang keluar pertama bersama petroleum benzen adalah klorofil.VIII. Akibatnya terjadi penyebaran noda ketika larutan hasil kromatografi kolom di KLT. Penambahan tiap-tiap pelarut yang secara terus-menerus tanpa menunggu tetesan untuk fraksi pelarut tertentu itu habis. 31 . fraksi ini muncul terakhir karena pigmen ini lebih larut dalam alkohol. Tidak dilakukannya homogenasi alumina sebagai fase diam. LAMPIRAN 8. sehingga pemisahan menjadi kurang baik (tidak sempurna). 2.1 Pertanyaan dan Jawaban 1. Apakah teknik yang anda lakukan berhasil memisahkan pigmen seperti yang diinginkan ? Jawaban 1. Hal ini dikarenakan klorofil dan petroleum benzen bersifat nonpolar sehingga petroleum benzen dapat melarutkan pigmen klorofil. Kemudian disusul dengan fraksi kloroform dengan pigmen karoten. hal ini mungkin dikarenakan: a. 3. Namun proses pemisahannya kurang sempurna. b. Teknik yang telah dilakukan berhasil memisahkan pigmen seperti yang diharapkan karena melalui fraksi-fraksi tersebut dimungkinkan ada 3 pigmen yang muncul yaitu karoten. Mengapa tidak boleh ada gelembung udara dalam timbunan penyerap di dalam kolom ? 2. Identifikasi pigmen apa saja yang keluar dari kolom secara berurutan dan jelaskan mengapa terjadi demikian ? 3.

32 . melainkan berdasarkan warna. Fraksi pigmen yang dihasilkan kurang spesifik karena mata memiliki keterbatasan dalam menentukan warna jadi kemungkinan ada fraksi yang tercampur. Pergantian tabung reaksi untuk penampungan tidak dilakukan berdasarkan waktu tertentu atau sampai pelarut tidak menetes lagi.c.

Mengaduk sampai merata Campuran .Menambahkan beberapa mL etanol Lumatan daun contoh + etanol . singkong. bayam.2 Flow Chart A.8.Melumatkan dalam lumpang . katuk. Seledri. kangkung. kemangi.Memekatkan dengan alat rotavapor sampai cairan tinggal beberapa mL Pelarut Larutan pekat N/B: * Sampel daun : Puring. dan pandan 33 .Menyaring melalui corong biasa dengan kertas saring Residu Filtrat . Ekstraksi Sampel 10-15 lembar daun contoh* . sirih hijau.

Menuangkannya melalui corong dan memasukannya ke dalam kolom hingga setinggi 10 cm Campuran I Al2O3 + etanol . Pembuatan Kromatografi Kolom Glass wool .B.Membuat adonan Adonan alumina Campuran 1 + adonan . hingga setinggi 1 cm Glass wool + Etanol .Memasukkan adonan melalui corong ke dalam kolom sehingga setinggi 15 cm sambil mengetukngetuk dan keran dalam keadaan terbuka Campuran II 34 .Memasukan ke dalam kolom kaca setinggi 20 cm.

kemudian menutup keran Campuran III + glass wool .Memasukkan . etanol dan metanol).Membuka keran .Memisahkan berdasarkan warnanya .Segera mengelusikan kolom dengan pelarut secara bertahap sesuai dengan kepolarannya (**yaitu petroleum benzen. sampai permukaan pelarut turun mendekati penyerap (adonan Al2O3) Campuran V + larutan contoh . Pemisahan Pigmen dari Tanaman Campuran II + etanol .Memasukkan setinggi 1 cm Campuran VI + pelarut . kloroform.Menghentikan pemberian pelarut bila semua warna telah keluar dari kolom Larutan berwarna NB : .Menampung tetesan yang keluar dari kolom dengan beberapa tabung reaksi yang bersih .Membuka keran Campuran IV + etanol .Mengelusi kembali.Kemudian melanjutkan dengan KLT dengan larutan pengembang yang sesuai (etanol) 35 .Mengelusi kembali kolom dan mengatur keran sampai terjadi kira-kira 20 tetes per menit.C. jika permukaan sampel telah mendekati permukaan penyerap .

LAMPIRAN FOTO – FOTO PERCOBAAN Gambar 17. Kolom kromatografi Gambar 18. Sampel ekstrak daun andong pada KK 36 . Sampel ekstrak daun puring mulai turun pada KK Gambar 20. Sampel ekstrak daun puring pada KK Gambar 19.

37 .

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful