PERCOBAAN IV

Judul Tujuan

: Pemisahan Pigmen dari Tanaman : Pada akhir percobaan ini Mahasiswa harus paham mengenai 1. Cara kerja dan teknik-teknik isolasi tumbuhan. 2. Pengenalan isolasi bahan alam yang bermolekul besar. 3. Analisa senyawa tumbuhan berwarna dengan

menggunakan KLT dan kromatografi kolom Hari/tanggal Tempat : Selasa / 5 April 2011 : Laboratorium kimia FKIP UNLAM Banjarmasin

I.

DASAR TEORI

1.1 Daun dan Pigmen Tanaman Daun merupakan salah satu organ tumbuhan yang tumbuh dari batang, umumnya berwarna hijau daun dan terutama berfungsi sebagai penangkap energi cahaya matahari melalui fotosintesis. Bentuk daun sangat beragam namun biasanya berupa helaian, bisa tipis atau tebal. Daun juga bisa bermodifikasi menjadi duri (misalnya kaktus) dan berakibat daun kehilangan fungsinya sebagai organ fotosintetik. Warna hijau pada daun berasal dari kandungan klorofil pada daun. Daun seringkali mengandung beberapa senyawa yang berwarna (pigmen) antara lain klorofil (hijau), karoten (kuning) dan xantofil (kuning). Meskipun klorofil mengandung bagian yang polar, akan tetapi secara keseluruhan strukturnya adalah non polar, seperti hidrokarbon, sehingga klorofil mudah larut dalam pelarut non polar seperti eter atau petroleum eter. Ada dua jenis klorofil yaitu klorofil a dan klorofil b, yang membedakan kedua jenis klorofil ini adalah adanya gugus aldehid pada struktur klorofil b yang menyebabkan klorofil b ini bersifat sedikit lebih polar dibandingkan klorofil a. Adapun struktur dari kedua jenis klorofil ini adalah sebagai berikut.

1

Gambar 1. Struktur klorofil a

Gambar 2. Struktur klorofil b

Karoten C40H56 adalah senyawa alkena dengan rantai panjang dari sistem ikatan rangkap terkonjugasi. Daun hijau mengandung sekitar 90% betakaroten dan 10 % alpha karoten. Meskipun secara keseluruhan molekul karoten adalah non polar, akan tetapi mempunyai sifat dapat mengubah bidang polarisasi. Karoten juga ada dua jenis yaitu a-karoten dan β-karoten, yang membedakan kedua struktur ini adalah posisi ikatan rangkap pada cincin ujung. Adapun strukturnya adalah sebagai berikut.

2

Gambar 3. Struktur α-karoten

Gambar 4. Struktur β-karoten

Xantofil C40H50O2 adalah bentuk karoten yang terhidroksilasi, kandungan xantofil dalam daun hijau selalu dua kali lebih besar dari karoten. Xantofil lebih larut dalam alkohol dan sedikit larut dalam petroleum eter dibandingkan karoten. Xantofil memiliki struktur yang mirip dengan karoten, hanya bedanya xantofil memiliki gugus OH pada struktur sikliknya. Adapun struktur dari xantofil adalah sebagai berikut.

Gambar 5. Struktur xantofil

Selain itu, di dalam daun juga mengandung antosianin yang berwarna merah, biru atau ungu tergantung derajat keasamannya. Untuk mengekstraksi pigmen dari daun, terlebih dahulu dilakukan penggerusan dengan mortar terhadap daun kering sampai halus. Pelarut yang dapat mengekstraksi pigmen secara bertahap dengan urutan kepolaran yaitu petroleum eter, kloroform, etanol, dan metanol. Adapun struktur umum dari antosianin adalah sebagai berikut.

3

Kromatografi kolom bertujuan untuk mengisolasi komponen dari campurannya. Pemisahan suatu campuran secara kromatografi dapat dilakukan kromatografi kolom.Gambar 6. adsorben silika gel mampu menghasilkan proses pemisahan yang lebih optimal. yakni fase diam dan fase gerak. Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom. Perbedaan kemampuan masing-masing komponen diadsorpsi dan perbedaan distribusi dua fase yang tidak saling bercampur (partisi).2 Kromatografi Kolom dan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Kromatografi adalah prinsip pemisahan campuran senyawa atas komponenkomponen berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi komponen pada dua fase. yang ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara fase gerak dan fase diam (stationer). sehingga ikatannya kuat dan rapat. Dengan demikian. Campuran ditambahkan ke kolom dari satu ujung dan campuran akan bergerak dengan bantuan pengembang yang cocok (fase gerak). Pemisahan berdasarkan kromatografi adsorpsi. 4 . sangat tergantung pada distribusi pada kedua fase cair dan padat. dapat dilakukan dengan kromatografi kolom. Alat yang digunakan yaitu kolom yang di dalamnya berisi fase stasioner (padat atau cair). kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis (KLT). Struktur umum antosianin 1. Untuk pemisahan pigmen dari tumbuhan. Silika gel memadat dalam bentuk tetrahedral raksasa. Pada kromatogarfi kolom digunakan kolom dengan adsorben sillika gel karena kolom yang dibentuk dengan silika gel memiliki tekstur dan struktur yang lebih kompak dan teratur.

keton. dan senyawa-senyawa yang semakin tidak (kurang) polar akan terbawa keluar kolom lebih cepat. 5 . Sorben yang digunakan dalam kromatografi kolom diantaranya arang. Oleh karenanya. Untuk menahan fasa diam (adsorben) biasanya digunakan kapas gelas (glass wool) atau gelas berpori (fritted glass). Ukuran kolom yang lazim digunakan mempunyai diameter dalam 2 cm dan panjang 45 cm. Kromatografi kolom dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya dapat dibedakan menjadi dua. karena pada permukaannya terikat gugus hidroksil. Jika fasa gerak yang digunakan sifatnya non-polar. sedangkan fase geraknya bersifat polar. senyawa-senyawa yang semakin polar akan semakin lama tertahan di fasa stasioner. kolom yang terbentuk dari silika gel bisa retak. silika gel. aldehid dan alkohol. kalsium sulfat dan serbuk selulosa. aromatis. kondisi yang senantiasa basah berperan untuk memudahkan proses elusi (larutan melewati kolom) dalam kolom. alkena. 2) Kromatografi fase terbalik Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar. Selain itu. maka pada saat campuran dimasukkan. kebalikan dari fase normal. plastik atau nilon. alumina. Kolom yang digunakan dalam kromatografi kolom dapat berupa gelas. silica gel sifatnya sangat polar. Ujung bagian bawah dilengkapi dengan kran untuk mengatur laju alir eluen. Berikut ini beberapa golongan solutnya misalnya alkana. sehingga proses pemisahan zat tidak berjalan optimal. ester. adsorben silika gel harus senantiasa basah karena. misalnya silica gel. yaitu : 1) Kromatografi fase normal Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya “normal” bersifat polar. magnesium silikat. jika dibiarkan kering. Dalam proses pemisahan dengan kromatografi kolom.Silica gel dapat membentuk ikatan hidrogen di permukaannya. eter. sedangkan fase geraknya bersifat non polar.

6 .

Bagan kolom kromatografi Gambar 8. Kolom berisi sampel 7 .Berikut ini gambar-gambar bagan dalam kromatografi kolom : Gambar 7.

plat diangkat dan dikeringkan.063 – 0. Ketika eluen sudah mencapai batas pada plat yang telah dibuat sebelumnya. alumina. selulosa dan lainnya yang mempunyai ukuran butir sangat kecil yaitu 0. lembaran aluminium maupun plastik dengan tebal tertentu. Pada prakteknya. sampel ditotolkan pada plat KLT lalu dimasukkan ke dalam chamber yang sudah jenuh oleh eluen. Dalam kromatografi lapis tipis (KLT) fase diamnya biasanya adalah serbuk silika gel. Proses pemisahan pigmen tanaman Dalam pemisahan biasanya kromatografi kolom diikuti pemeriksaan secara kualitatif dengan KLT untuk memonitor apakah pemeriksaan dengan cara kromatografi kolom berhasil atau tidak. Setelah 8 .Gambar 9.125 mm dilapiskan pada kaca. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending) atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending). tanah diatome.

Metoda identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut. menggunakan harga Rf. Bagan kromatografi lapis tipis (KLT) Gambar 11. Berikut ini gambar-gambar bagan dalam kromatografi lapis tipis (KLT). maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa. Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi lapis tipis. Gambar 10.daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi. Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi yang konstan merupakan besaran yang karakteristik dan reprodusibel. Pigmen dalam sampel menuju batas atas plat KLT 9 .

Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna. Bentuk daunnya bermacam-macam. oval. Dalam kromatografi lapis tipis. jingga. serta campurannya.  Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak. fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet. peralatan yang digunakan lebih sederhana dan dapat dikatakan hampir semua laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat. Demikian juga peralatan yang digunakan. menurun (descending). 1. ungu. atau dengan cara elusi 2 dimensi. Perbandingan untuk perhitungan Rf Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan lebih murah dibandingkan dengan kromatografi kolom.3 Beberapa Jenis Tumbuhan a) Daun Puring (Codiaeum variegatum) Puring atau kroton adalah tumbuhan hias pekarangan populer berbentuk perdu dengan bentuk dan warna daun yang sangat bervariasi.  Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending). tapi bergelombang 10 . Beberapa keuntungan dari kromatografi planar ini adalah :   Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis.Gambar 12. merah. kuning. memanjang. Beragam kultival telah dikembangkan dengan variasi warna hijau.

Sirih hijau sejak dahulu telah digunakan oleh masyarakat sebagai obat untuk menyembuhkan berbagai jenis penyakit. c) Daun seledri (Apium graveolens) Seledri adalah sayuran dan tumbuhan obat yang biasa digunakan sebagai bumbu masakan. puring adalah kerabat jauh singkong serta kaksuba. Warna daun sirih hijau memang merah kepekatan. Ciri yang sama adalah batangnya menghasilkan biloks berwarna putih pekat dan lengket. namun beraroma lebih wangi dibandingkan dengan sirih hijau. Secara botani.helainya terputus-putus dan sebagainya. Secara empiris sirih hijau dapat menyembuhkan berbagai jenis penyakit. Klorofil adalah senyawa pigmen yang berperan dalam menyeleksi panjang gelombang cahaya yang energinya diambil dalam fotosintesis. Pigmen lain yang terkandung dalam daun adalah karoten. Warna hijau pada daun berasal dari kandungan klorofil. saponin. yang merupakan ciri khas suku Euphobaceae. seperti diabetes. b) Daun sirih hijau (Piper crocatum) Daun sirih hijau (Piper crocatum) termasuk dalam family piperaceae. Beberapa negara termasuk Jepang. Penggunaan sirih hijau dapat digunakan dalam bentuk segar. Dalam daun sirih hijau terkandung senyawa fitokimia yakni alkaloid. xantofil dan antosianin. tannin dan flavonoid. namun masih juga mengandung warna hijau yaitu berada pada bagian dalam. maupun ekstrak kapsul. batu ginjal dan sebagainya. hepatitis. yang tumbuh merambat dengan bentuk daun menyerupai hati dan bertangkai yang tumbuh berselang-seling dari batangnya serta penampakan daun yang berwarna merah keperakan dan mengkilap. Daun sirih hijau berasa pahit dan getir. Cina dan Korea mempergunakan bagian tangkai daun sebagai bahan 11 .

Daun ini 12 . daun kemangi hanya tersusun dari selapis jaringan palisade. Terdapat juga sejumlah flavonoid seperti graveobiosid A (1-2%)dan B (0. daun berukuran kecil dengan helaian daun yang tipis.makanan. tangkai daun.1 . terstosteron. d) Daun kemangi (Ocimum sanctum) Daun kemangi memiliki kandungan klorofil yang paling rendah. lipoksin dan leukotrien). prostasiklin. e) Daun katuk (Sauropus androgynus) Sifat kimia daun katuk dapat dilihat dari kadar kalsium yang tinggi. dan umbinya semua dimanfaatkan. isokuersitrin. morfologi daun dan tahapan fisiologis suatu tanaman merupakan faktor yang menentukan kandungan klorofil. serta isoimperatorin. Sifat fisika pada klorofil daun katuk dapat dilihat pada semakin tinggi suhu pengeringan. Selain itu. Komponen lainnya apiin. serta senyawa golongan fenol. Khususnya jaringan palisade yang mengandung klorofil. kadar klorofil semakin tinggi dan intensitas warna semakin hijau. buah. Kandungan vitamin C pada daun katuk jauh lebih tinggi daripada jeruk maupun jambu biji. Terdapat tujuh senyawa aktif yang dapat merangsang produksi hormon-hormon steroid (seperti progesteron. Di Indonesia tumbuhan ini diperkenalkan oleh penjajah Belanda dan digunakan daunnya untuk menyedapkan sup atau sebagai lalapan. mesofil. glukokortikoid) dan senyawa eikosanoid (diantaranya prostaglandin. estradiol. Kandungan asam lemak utama adalah asam petroselin (40-60%). Daun dan tangkai daun mengandung steroid seperti stigmasterol dan sitosterol.0. Umur daun. Penggunaan seledri paling lengkap adalah di Eropa: daun.7%). Kandungan utamanya adalah butilftalida dan butilidftalida sebagai pembawa aroma utama. Daun katuk dapat mengandung hampir 7 % protein dan serat kasar 19 %. tromboksan. Hal ini dikarenakan kemangi merupakan tanaman semusim. furanokumarin.

f) Daun singkong (Manihot utilisima L) Daun singkong memiliki kandungan klorofil a dan klorofil b yang tinggi. protein yang terlibat dalam proses fotosintesis) sehingga berguna bagi penderita anemia. Hal ini menyebabkan laju fotosintesis berlangsung lama karena tidak efisien dalam menangkap energi radiasi cahaya. sehingga laju fotosintesisnya juga tinggi. tidak hanya pada organ daun saja namun juga dijumpai pada bagian batang. Klorofil b berfungsi sebagai antena fotosintetik yang mengumpulkan cahaya kemudian ditransfer ke pusat reaksi. Klorofil a dan klorofil b berperan dalam proses fotosintesis.8 %). B dan C. besi. Hal ini menunjukkan bahwa kemampuan singkong dalam menangkap energi radiasi cahaya lebih efisien. selain itu pro-vitamin A ( β-karoten). g) Daun kangkung (Ipomoea aquatica) Kangkung memiliki kandungan klorofil yang relatif rendah yaitu setara dengan daun kemangi. Daun bayam mempunyai kandungan klorofil yang tinggi. fosfor dan magnesium. Energi cahaya akan diubah menjadi energi kimia di pusat reaksi yang kemudian dapat digunakan untuk proses reduksi dalam fotosintesis. h) Daun bayam (Amaranthus spp) Kandungan besi pada bayam relatif lebih tinggi daripada sayuran lain (besi merupakan penyusun sitokrom. Hal ini diduga klorofil pada tanaman kangkung tersebar.kaya akan vitamin K. sehingga laju fotosintesisnya juga lebih tinggi. 13 . Pusat reaksi tersusun dari klorofil a. kalium. Mineral yang dikandungnya adalah kalsium (hingga 2.

II.1 Alat yang digunakan 1. Rak tabung reaksi 8. sirih hijau. dan pandan. singkong. Corong biasa 4. Tabung reaksi 7. Gelas ukur 10 ml 3. Statif dan klem 11. Glass wool 4. Sebuk Al2O3 ( alumina ) : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 36 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah 14 . Kolom kaca 2. katuk. kemangi. Sampel daun : Puring.2 Bahan yang digunakan 1. Bunsen + kaki tiga + kain kasa 2. Lumpang dan alu 10. kangkung. ALAT DAN BAHAN 2. bayam. Seledri. Etanol 3. Semakin tinggi kandungan klorofilnya maka semakin cepat laju fotosintesisnya dan lebih efisien dalam menangkap energi radiasi cahaya. Gelas kimia 250 ml 6. Pipet tetes 9. Batang pengaduk 5.i) Daun pandan (Pandanus amaryllifolius Roxb) Daun pandan mengandung klorofil yang sangat tinggi yang sering digunakan sebagai pewarna alami. Cawan porselin 12. 2.

2. tinggi 20 cm dan diameternya 1. 2. Menyiapkan kolom gelas 50 mL. Memasukkan adonan tersebut ke dalam kolom hingga setinggi 10 cm sambil mengetuk-ngetuk dengan kran dalam keadaan terbuka. Metanol III. 4. 5. Menyaring larutan sampel dengan kertas saring melalui corong. Melalui corong menuangkan etanol ke dalam kolom hingga setinggi 1 cm. Kloroform 8. Kertas saring 6. Memekatkan larutan dengan menggunakan pembakar bunsen sampai larutan tinggal setengah mL.2 Pembuatan Kromatografi Kolom 1.3 Pemisahan Pigmen dari Tumbuhan 1. Menambahkan 20 mL etanol.5 cm yang bagian bawahnya telah dilengkapi dengan kran. Membuat adonan dari 25 g alumina (Al2O3) dengan 25 mL etanol. PROSEDUR KERJA 3. Memasukkan larutan sampel daun setinggi 2 cm setelah permukaan pelarut etanol turun mendekati penyerap (adonan Al2O3). serta secara sedikit demi sedikit (jangan ada gelembung udara).1 Ekstraksi Sampel 1. 3. 3. 15 . Mengelusi kembali kolom dengan pelarut hingga mencapai permukaan alumina dalam kolom dan memasukkan glass woll. 3. 3. Melumatkan 10-15 lembar sampel daun dengan lumpang dan alu.5. 4. Memasukkan glass wool ke dalam kolom gelas hingga setinggi 1 cm. Petroleum eter 7. 6. mengaduk sampai merata.

3. Hasil Pengamatan Campuran Filtrat: larutan hijau tua Residu: ampas daun Tinggi glass wool 1 cm 6. Menyaring campuran 3. campuran glass wool kedalam kolom + 2 ml etanol +larutan sampel Mendiamkan sampai larutan sampel menetes Menambahkan petroleum eter Larutan sampel menyebar dan menetes Sampel yang digunakan: A. 7. Memasukkan glass wool dalam kolom + 1 ml etanol Al2O3 + 25 ml etanol Glass wool dan etanol dalam kolom Memasukkan adonan alumina + Adonan alumina. Menampung tetesan yang keluar dari kolom dengan beberapa tabung reaksi yang bersih. 4. etanol dan metanol. HASIL PENGAMATAN No. 5. 8. Menggerus sampel daun + 20 ml etanol 2. IV. Perlakuan 1. Daun singkong:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau kekuningan larutan kuning B. Daun Pandan:  Tabung I + petroleum eter  Tabung II + Kloroform  Tabung III + Etanol  larutan hijau muda  larutan hijau tua  larutan hijau kekuningan 16 . Menghentikan pemberian pelarut bila semua warna telah keluar dari kolom kaca. kloroform.2. Segera mengelusikan kolom dengan pelarut secara bertahap sesuai dengan kepolarannya yaitu petroleum eter. 4. Jika permukaan sampel telah mendekati permukaan penyerap.

Daun Sirih:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan kuning bening larutan kuning tua larutan kuning larutan kuning H. Tabung IV + metanol  larutan hijau muda C. Daun Kangkung:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau tua larutan hijau muda larutan hijau kekuningan larutan hijau bening G. Daun Katuk:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau muda larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau tua 17 . Daun Bayam:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau tua larutan hijau tua D. Daun Puring:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan kuning jernih larutan hijau muda larutan hijau muda larutan hijau muda F. Daun Kemangi:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau bening larutan hijau kekuningan larutan hijau kekuningan larutan kuning E.

singkong. dan pandan menggunakan kromatografi kolom dengan beberapa pelarut yaitu petroleum eter. dan etanol. Etanol efektif untuk mengekstrak pigmen tumbuhan karena sebagian besar pigmen tumbuhan seperti klorofil. lalu mengekstraksinya dengan menggunakan pelarut etanol. bayam. Daun Seledri:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau muda larutan hijau tua V. Setelah itu menguji masingmasing ekstrak pelarut dari masing-masing sampel daun dengan metode KLT untuk menentukan jenis pigmen yang terkandung dalam daun tersebut. karoten dan xantofil memiliki sifat diantara polar dan non polar sehingga dapat larut dalam etanol yang merupakan pelarut semipolar. kemangi. yaitu daun Puring. metanol. kloroform. ANALISIS DATA Pada percobaan ini dilakukan pemisahan pigmen dari beberapa sampel daun. katuk. Etanol + klorofil → fitol + etil klorofilida 18 . Penumbukan ini bertujuan menghaluskan daun sehingga senyawa yang terkandung di dalamnya mudah larut dalam pelarut etanol. Seledri.I. sebab semakin halus daun maka semakin luas permukaan untuk terjadi kontak dengan pelarut maka semakin banyak zat yang dapat terekstrak.1 Ekstraksi Sampel Daun Pertama-tama menumbuk sampel daun dengan lumpang dan alu. Namun proses ekstrasi ini harus dilakukan dengan cepat karena enzim klorofilasi yang terkandung dalam daun segar akan mengkatalisis reaksi antara klorofil dengan etanol sehingga jumlah klorofil dalam daun akan berkurang. kangkung. sirih hijau. Reaksinya adalah sebagai berikut. 5.

Setelah itu dilakukan penyaringan agar diperoleh filtrat yang mengandung pigmen tanaman. 19 . Larutan hasil ekstrak dengan etanol ini. selanjutnya diuapkan hingga separuh volume mula-mula. sedangkan residunya dibuang.

kran kolom ditutup. Dalam hal ini alumina Al2O3 yang digunakan sebagai adsorben atau fase diamnya. Selanjutnya memasukkan kembali etanol untuk mengelusi kolom dan setelah selesai. dimana langkah pertama yang dilakukan adalah membuat adonan Al2O3 dengan pelarut etanol sehingga terbentuk bubur alumina. Lalu memasukkan pelarut ke dalam kolom dan membuka krannya. Setelah itu bagain atas kolom juga diberi glass woll agar ekstrak daun yang akan dimasukkan ke dalam kolom dapat tersaring.2 Penyiapan Kolom Kromatografi Selanjutnya membuat kolom kromatografi.3 Pemisahan Pigmen Tanaman Setelah kolom kromatografi siap dipakai. Penggunaan etanol ini dikarenakan alumina mengandung titik aktif Al-OH sehingga etanol yang juga mengandung gugus OH akan dapat terikat kuat dengan alumina jadi bubur alumina yang merupakan fase diam akan lebih homogen. kran dibuka agar pelarut etanol dapat keluar sehingga diperoleh fase diam (alumina) yang padat. tetapi ekstrak daun masih bisa mengalir. Tetesan yang keluar dari kolom ini ditampung dalam tabung reaksi dan mengganti tabung reaksinya ketika warna yang keluar dari kolom berubah. Adapun pelarut yang digunakan adalah berdasarkan kepolaran yang paling kecil 20 . Larutan berawarna ini adalah pigmen dari daun sampel. kolom harus bebas dari gelembung gas karena bila ada gelembung udara maka proses pemisahan yang terjadi tidak akan sempurna sehingga akan terjadi penyebaran noda ketika hasil kromatografi kolom di uji KLT. ekstrak sampel daun di masukkan ke dalam kolom. karena Al2O3 lazim digunakan untuk senyawa organik stabil. 5. Saat mengisi kolom. sebelum dimasukkan alumina.5. bagian bawah kolom ditutupi dengan glass woll. hal ini bertujuan untuk menahan fase diam (adsorben) alumina agar tidak turun dari kolom karena glass woll merupakan gelas yang masih berpori sehingga dapat menahan alumina. Selain itu. Di sini terlihat bahwa pigmen dari sampel daun mulai bergerak turun dan mulai menetes. Bubur alumina dimasukkan ke dalam kolom sambil mengetuk-ngetuk kolomnya agar tidak terbentuk gelembung udara.

Untuk itulah digunakan pelarut berikutnya yang lebih polar dibandingkan petroleum eter yaitu kloroform agar karoten dapat keluar dari kolom dengan lebih cepat namun dengan catatan klorofil sudah keluar seluruhnya. Adapun struktur dari senyawa-senyawa yang terkandung dalam daun adalah : Gambar struktur klorofil a 21 . Prinsip pemisahan dalam kolom tersebut adalah sebagai berikut. berarti klorofil tidak teradsorpsi dengan kuat pada alumina. etanol dan metanol. Pelarut ini digunakan pada kromatografi kolom secara berurutan. akan keluar dari kolom lebih lambat dibandingkan klorofil karena karoten akan teradsorbsi lebih kuat dari pada klorofil. Ini dapat terjadi karena alumina adalah senyawa polar sedangkan klorofil adalah senyawa yang tergolong non polar. kloroform. Begitu pula seterusnya digunakan pelarut etanol dan metanol untuk mengeluarkan pigmen yang lebih polar seperti xantofil. Kita misalkan di dalam suatu ekstrak daun terdapat klorofil. Karoten yang merupakan senyawa yang lebih polar daripada klorofil.yaitu petroleum eter. klorofil dalam ekstrak daun akan larut di dalamnya dengan kecepatan yang sama dengan fase geraknya (petroleum eter) dan keluar paling pertama. ketika petroleum eter kita masukkan ke dalam kolom.

Gambar struktur klorofil b Gambar struktur α-karoten Gambar struktur β-karoten 22 .

etanol dan metanol menghasilkan larutan berwarna hijau muda. Pada tabung I dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna kuning bening. apakah dalam petroleum eter. b. Sesuai dengan literatur daun seledri mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan berwarna hijau muda). baru kemudian xantofil. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Kemangi Dari proses kromatografi kolom dihasilkan tiga fraksi ekstrak sesuai dengan pelarutnya. kloroform. Walaupun demikian belum dapat dipastikan dalam pelarut apa pigmen-pigmen tersebut terkandung. karoten. Warna hijau yang dihasilkan menunjukkan bahwa sampel daun seledri mengandung klorofil karena klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau dengan semua pelarut. karena uji KLT tidak 23 . dengan warna yang sedikit berbeda.Gambar struktur antosianin Dari penjelasan di atas dapat dikatakan bahwa urutan keluarnya pigmen dari kolom sesuai dengan urutan kepolaran dari pigmen yang paling non polar yaitu klorofil. Sedangkan pada tabung lainnya dengan pelarut kloroform. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Puring Dari proses kromatografi kolom dihasilkan empat fraksi. a. etanol atau metanol. Klorofil mengandung sifat nonpolar sehingga dapat larut dalam petroleum eter yang dan kloroform yang juga bersifat nonpolar. Kenonpolaran klorofil dapat dilihat dari strukturnya di mana walaupun klorofil mengandung bagian yang polar namun secara keseluruhan strukturnya adalah nonpolar.

larutan pada fraksi ini berwarna kuning dan hal ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang berwarna kuning.dilakukan maka analisis dilakukan berdasarkan harga Rf menurut literatur dan perbedaan warna yang dihasilkan. 24 . Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung xantofil (C40H50O2) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol dibandingkan dengan karoten. Sesuai dengan literatur daun seledri mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan berwarna hijau muda). Pada tabung I dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna hijau muda. Untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter berwarna hijau sehingga dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah klorofil. Pada tabung II dengan pelarut kloroform menghasilkan larutan berwarna hijau tua. Fraksi ini berwanra hijau kekuningan (warna kuning dominan). Di samping itu. xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar. Tabung III dengan pelarut etanol menghasilkan larutan berwarna hijau muda dan pada tabung IV dengan pelarut metanol menghasilkan larutan yang berwarna hijau. Hasil ini sesuai dengan literatur bahwa pigmen karoten memang senyawa yang berwarna kuning. Warna hijau yang dihasilkan menunjukkan bahwa sampel daun seledri mengandung klorofil karena klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau dengan semua pelarut. c. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Seledri Dari proses kromatografi kolom dihasilkan empat fraksi. Dalam hal ini. Klorofil mengandung sifat nonpolar sehingga dapat larut dalam petroleum eter yang dan kloroform yang juga bersifat nonpolar. Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen karoten karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar tetapi kepolarannya agak rendah jika dibandingkan dengan petroleum eter. Kenonpolaran klorofil dapat dilihat dari strukturnya di mana walaupun klorofil mengandung bagian yang polar namun secara keseluruhan strukturnya adalah nonpolar.

Berbanding terbalik dengan harga Rf yang kecil. dan harga Rf klorofil b terhadap petroleum eter paling kecil. maka bila harga Rf kecil. komponen yang terkandung bersifat lebih polar. Untuk pelarut petroleum eter menghasilkan ekstrak warna hijau muda menunjukkan adanya pigmen klorofil b (C55H70O6N4Mg). larutan tersebut memiliki komponen yang bersifat nonpolar. Pelarut etanol menghasilkan ekstrak berwarna hijau kekuningan menunjukkan adanya pigmen karoten. Dengan pelarut petroleum eter terdapat klorofil dengan warna larutan hijau. Meskipun karoten bersifat nonpolar. Pelarut kloroform menghasilkan ekstrak warna hijau tua menunjukkan adanya pigmen klorofil a (C55H72O6N4Mg). Pigmen xantofil dihasilkan dari pelarut petroleum eter dan etanol. e. dimana seharusnya untuk pelarut kloroform dapat menghasilkan pigmen karoten dan untuk pelarut metanol menghasilkan pigmen xantofil. harga Rf yang besar menunjukkan bahwa komponen tersebut lebih larut dalam eluennya. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Bayam Dari proses kromatografi kolom diperoleh tiga fraksi ekstrak sesuai pelarutnya. Berdasarkan hal tersebut maka dapat diketahui bahwa harga Rf xantofil terhadap metanol lebih besar daripada harga Rf karoten terhadap etanol. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Singkong Dari proses kromatografi kolom diperoleh empat fraksi.d. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Katuk 25 . Untuk pelarut metanol menghasilkan ekstrak berwarna kuning menunjukkan adanya pigmen xantofil. Karena pelarut yang digunakan adalah etanol yang bersifat polar. Namun pada pelarut metanol dan kloroform masih menghasilkan klorofil. artinya komponen tersebut kurang larut dalam pelarut etanol. Harga Rf karoten terhadap etanol lebih besar daripada harga Rf klorofil a terhadap kloroform. Klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau dengan sifat nonpolar sehingga mudah larut dalam petroleum eter maupun kloroform. tetapi kepolarannya agak rendah sehingga dapat larut dalam etanol. dan sebaliknya apabila harga Rf besar. Untuk uji KLT. f.

Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung xantofil (C40H50O2) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol dibandingkan dengan karoten. karena uji KLT tidak dilakukan maka analisis dilakukan berdasarkan harga Rf menurut literatur dan perbedaan warna yang dihasilkan. Di samping itu. xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar. 26 . g. Untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter berwarna hijau sehingga dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah klorofil. Di samping itu.Dari proses kromatografi kolom dihasilkan tiga fraksi ekstrak sesuai dengan pelarutnya. Hasil ini sesuai dengan literatur bahwa pigmen karoten memang senyawa yang berwarna kuning. Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen karoten karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar dimana pigmennya berwarna hijau. Fraksi ini berwarna hijau kekuningan (warna kuning dominan). Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung xantofil (C40H50O2) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol dibandingkan dengan karoten. dengan warna yang sedikit berbeda. larutan pada fraksi ini berwarna kuning dan hal ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang berwarna kuning. Dalam hal ini. Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen karoten karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar tetapi kepolarannya agak rendah jika dibandingkan dengan petroleum eter. xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar. untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter (nonpolar) berwarna hijau sehingga dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah klorofil. Dalam hal ini. larutan pada fraksi ini berwarna hijau kekuningan dan hal ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang berwarna kuning. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Pandan Dalam pemisahan pigmen tanaman dari daun pandan.

Oleh karena itu. i. Sedangkan karoten merupakan senyawa yang dapat larut dalam etanol. Pada tabung III dengan pelarut kloroform menghasilkan larutan berwarna hijau muda. Hasil pemisahan pigmen yang diperoleh melalui kromatografi kolom adalah klotofil. sedangkan karoten keluar bersama dengan pelarut kloroform. ada 5 tabung reaksi yang kemudian diuji dengan KLT dengan kenampakan noda yang terlihat setelah disinari lampu UV (berwarna jingga) dan diurutkan dari warna yang paling muda sampai tua. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Sirih Hijau Untuk perhitungan harga Rf tidak dilakukan uji KLT namun berdasarkan literatur yang ada. Klorofil mengandung bagian yang polar walaupun secara keseluruhan stukturnya adalah senyawa nonpolar. namun karena karoten sedikit lebih bersifat polar maka karoten lebih lambat keluar daripada klorofil. Sedangkan xantofil yang mudah larut dalam alkohol akan keluar bersama dengan pelarut etanol dan metanol.h. Tabung IV sampai VI dengan pelarut etanol dan metanol menghasilkan warna hijau kekuningan. Sesuai dengan literatur di mana daun kangkung mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan berwarna hijau muda). klorofil dapat larut dalam pelarut petroleum eter dan kloroform yang bersifat nonpolar. Klorofil keluar bersama dengan pelarut petroleum eter. Pada tabung I dan II dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna hijau tua dan hijau lebih tua. xantofil dan karoten. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Kangkung Dari proses kromatografi kolom dihasilkan enam fraksi. Klorofil dan karoten sama-sama bersifat non polar. Warna hijau yang dihasilkan menunjukkan bahwa sampel daun kangkung mengandung klorofil karena klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau. 27 . Sedangkan warna hijau kekuningan menunjukkan adanya karoten karena karoten merupakan senyawa yang berwarna hijau kekuningan.

28 .

KESIMPULAN 1. menurut literatur harga Rf standar untuk masing-masing komponen adalah sebagai berikut : .Dari percobaan ini dapat disimpulkan bahwa jenis pigmen dalam tiap sampel daun untuk tiap fraksinya adalah sebagai berikut : No. 2.756 . 7. Rf = 0.Fraksi 4 (metanol) yang mengandung xantofil. Pemisahan menggunakan kromatografi kolom yang fase diam berupa Alumina dan fase gerak yaitu petroleum eter. 1. 6. yang ditentukan oleh kekuatan adsorspi atau koefisien partisi antara fasa gerak dan fasa diam. 29 .Fraksi 1 (petroleum eter) yang mengandung klorofil. Pemisahan dengan kromatografi kolom dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom. Rf = 0.767 . 2. metanol dan etanol. Pada percobaan pemisahan pigmen dari tanaman dari semua sampel tanaman dilakukan dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut yaitu etanol untuk melarutkan pigmen sampel daun. 3. 9.Fraksi 3 (etanol) yang mengandung xantofil. 8. 4. 5.75 .Fraksi 2 (kloroform) yang mengandung karoten. 3. Rf = 0. Sampel Daun Singkong Pandan Bayam Kemangi Puring Kangkung Sirih Katuk Seledri Petroleum eter Klorofil Klorofil Klorofil Klorofil Xantofil Klorofil Xantofil Klorofil Klorofil Kloroform Klorofil Klorofil Klorofil Karoten Klorofil Klorofil Xantofil Klorofil Klorofil Etanol Karoten Karoten Klorofil Karoten Klorofil Karoten Xantofil Klorofil Klorofil Metanol Xantofil Klorofil Klorofil Xantofil Klorofil Klorofil Xantofil Klorofil Klorofil Untuk uji KLT. Rf = 0.767 VI. kloroform.

Daun bayam. 2010. Robinson. katuk dan seledri mengandung pigmen klorofil. Bambang Purwono. Bandung : ITB. Daun sirih mengandung pigmen xantofil. Daun pandan dan kangkung mengandung pigmen klorofil dan karoten. dkk. Berdasarkan percobaan. 1995. 2006.4. Daun puring mengandung pigmen klorofil dan xantofil. (Tidak dipublikasikan). Chairil. 1991. Sumar. Bandung : ITB. Gritter. 1996. J. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis Modern. Yogyakarta : Depdikbud. xantofil. FKIP Banjarmasin : UNLAM. Panduan Praktikum Kimia Organik II. Hendayana. Bandung : Remaja Rosdakarya. karoten. VII. DAFTAR PUSTAKA Anwar. Pengantar Kromatografi. 30 . Trevon. harno Dwi Pranowo dan Tutik dwi Wahyuningsih. Pengantar Praktikum Kimia Organik. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi.. daun singkong dan kemangi mengandung pigmen klorofil. Tim Dosen Kimia Organik.

dimana karoten dan kloroform sama-sama nonpolar tetapi sedikit polar dibandingkan dengan klorofil dan petroleum benzen. Tidak boleh ada gelembung udara dalam timbunan penyerap di dalam kolom karena dapat mengakibatkan distribusi yang tidak merata (ketidakhomogenan penyerap). Namun proses pemisahannya kurang sempurna. Hal ini dikarenakan klorofil dan petroleum benzen bersifat nonpolar sehingga petroleum benzen dapat melarutkan pigmen klorofil. b. hal ini mungkin dikarenakan: a. Sedangkan fraksi yang muncul selanjutnya adalah fraksi etanol dan disusul fraksi metanol yang membawa pigmen xantofil.VIII.1 Pertanyaan dan Jawaban 1. Identifikasi pigmen apa saja yang keluar dari kolom secara berurutan dan jelaskan mengapa terjadi demikian ? 3. Kemudian disusul dengan fraksi kloroform dengan pigmen karoten. Tidak dilakukannya homogenasi alumina sebagai fase diam. sehingga pemisahan menjadi kurang baik (tidak sempurna). Penambahan tiap-tiap pelarut yang secara terus-menerus tanpa menunggu tetesan untuk fraksi pelarut tertentu itu habis. Mengapa tidak boleh ada gelembung udara dalam timbunan penyerap di dalam kolom ? 2. Pigmen yang keluar pertama bersama petroleum benzen adalah klorofil. Apakah teknik yang anda lakukan berhasil memisahkan pigmen seperti yang diinginkan ? Jawaban 1. 3. LAMPIRAN 8. fraksi ini muncul terakhir karena pigmen ini lebih larut dalam alkohol. xantofil dan klorofil. 31 . Akibatnya terjadi penyebaran noda ketika larutan hasil kromatografi kolom di KLT. Teknik yang telah dilakukan berhasil memisahkan pigmen seperti yang diharapkan karena melalui fraksi-fraksi tersebut dimungkinkan ada 3 pigmen yang muncul yaitu karoten. 2.

melainkan berdasarkan warna. Fraksi pigmen yang dihasilkan kurang spesifik karena mata memiliki keterbatasan dalam menentukan warna jadi kemungkinan ada fraksi yang tercampur. Pergantian tabung reaksi untuk penampungan tidak dilakukan berdasarkan waktu tertentu atau sampai pelarut tidak menetes lagi. 32 .c.

kemangi. Seledri. sirih hijau.Mengaduk sampai merata Campuran .Menyaring melalui corong biasa dengan kertas saring Residu Filtrat . katuk. Ekstraksi Sampel 10-15 lembar daun contoh* .Memekatkan dengan alat rotavapor sampai cairan tinggal beberapa mL Pelarut Larutan pekat N/B: * Sampel daun : Puring.2 Flow Chart A. kangkung.Menambahkan beberapa mL etanol Lumatan daun contoh + etanol .8. dan pandan 33 . bayam. singkong.Melumatkan dalam lumpang .

Pembuatan Kromatografi Kolom Glass wool .Memasukan ke dalam kolom kaca setinggi 20 cm.B.Memasukkan adonan melalui corong ke dalam kolom sehingga setinggi 15 cm sambil mengetukngetuk dan keran dalam keadaan terbuka Campuran II 34 . hingga setinggi 1 cm Glass wool + Etanol .Membuat adonan Adonan alumina Campuran 1 + adonan .Menuangkannya melalui corong dan memasukannya ke dalam kolom hingga setinggi 10 cm Campuran I Al2O3 + etanol .

jika permukaan sampel telah mendekati permukaan penyerap . sampai permukaan pelarut turun mendekati penyerap (adonan Al2O3) Campuran V + larutan contoh .Kemudian melanjutkan dengan KLT dengan larutan pengembang yang sesuai (etanol) 35 .Mengelusi kembali kolom dan mengatur keran sampai terjadi kira-kira 20 tetes per menit. kemudian menutup keran Campuran III + glass wool .C.Menghentikan pemberian pelarut bila semua warna telah keluar dari kolom Larutan berwarna NB : . Pemisahan Pigmen dari Tanaman Campuran II + etanol .Menampung tetesan yang keluar dari kolom dengan beberapa tabung reaksi yang bersih .Memasukkan .Segera mengelusikan kolom dengan pelarut secara bertahap sesuai dengan kepolarannya (**yaitu petroleum benzen.Membuka keran Campuran IV + etanol . kloroform. etanol dan metanol).Memisahkan berdasarkan warnanya .Membuka keran .Mengelusi kembali.Memasukkan setinggi 1 cm Campuran VI + pelarut .

Sampel ekstrak daun puring mulai turun pada KK Gambar 20. Sampel ekstrak daun andong pada KK 36 .LAMPIRAN FOTO – FOTO PERCOBAAN Gambar 17. Kolom kromatografi Gambar 18. Sampel ekstrak daun puring pada KK Gambar 19.

37 .

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful