PERCOBAAN IV

Judul Tujuan

: Pemisahan Pigmen dari Tanaman : Pada akhir percobaan ini Mahasiswa harus paham mengenai 1. Cara kerja dan teknik-teknik isolasi tumbuhan. 2. Pengenalan isolasi bahan alam yang bermolekul besar. 3. Analisa senyawa tumbuhan berwarna dengan

menggunakan KLT dan kromatografi kolom Hari/tanggal Tempat : Selasa / 5 April 2011 : Laboratorium kimia FKIP UNLAM Banjarmasin

I.

DASAR TEORI

1.1 Daun dan Pigmen Tanaman Daun merupakan salah satu organ tumbuhan yang tumbuh dari batang, umumnya berwarna hijau daun dan terutama berfungsi sebagai penangkap energi cahaya matahari melalui fotosintesis. Bentuk daun sangat beragam namun biasanya berupa helaian, bisa tipis atau tebal. Daun juga bisa bermodifikasi menjadi duri (misalnya kaktus) dan berakibat daun kehilangan fungsinya sebagai organ fotosintetik. Warna hijau pada daun berasal dari kandungan klorofil pada daun. Daun seringkali mengandung beberapa senyawa yang berwarna (pigmen) antara lain klorofil (hijau), karoten (kuning) dan xantofil (kuning). Meskipun klorofil mengandung bagian yang polar, akan tetapi secara keseluruhan strukturnya adalah non polar, seperti hidrokarbon, sehingga klorofil mudah larut dalam pelarut non polar seperti eter atau petroleum eter. Ada dua jenis klorofil yaitu klorofil a dan klorofil b, yang membedakan kedua jenis klorofil ini adalah adanya gugus aldehid pada struktur klorofil b yang menyebabkan klorofil b ini bersifat sedikit lebih polar dibandingkan klorofil a. Adapun struktur dari kedua jenis klorofil ini adalah sebagai berikut.

1

Gambar 1. Struktur klorofil a

Gambar 2. Struktur klorofil b

Karoten C40H56 adalah senyawa alkena dengan rantai panjang dari sistem ikatan rangkap terkonjugasi. Daun hijau mengandung sekitar 90% betakaroten dan 10 % alpha karoten. Meskipun secara keseluruhan molekul karoten adalah non polar, akan tetapi mempunyai sifat dapat mengubah bidang polarisasi. Karoten juga ada dua jenis yaitu a-karoten dan β-karoten, yang membedakan kedua struktur ini adalah posisi ikatan rangkap pada cincin ujung. Adapun strukturnya adalah sebagai berikut.

2

Gambar 3. Struktur α-karoten

Gambar 4. Struktur β-karoten

Xantofil C40H50O2 adalah bentuk karoten yang terhidroksilasi, kandungan xantofil dalam daun hijau selalu dua kali lebih besar dari karoten. Xantofil lebih larut dalam alkohol dan sedikit larut dalam petroleum eter dibandingkan karoten. Xantofil memiliki struktur yang mirip dengan karoten, hanya bedanya xantofil memiliki gugus OH pada struktur sikliknya. Adapun struktur dari xantofil adalah sebagai berikut.

Gambar 5. Struktur xantofil

Selain itu, di dalam daun juga mengandung antosianin yang berwarna merah, biru atau ungu tergantung derajat keasamannya. Untuk mengekstraksi pigmen dari daun, terlebih dahulu dilakukan penggerusan dengan mortar terhadap daun kering sampai halus. Pelarut yang dapat mengekstraksi pigmen secara bertahap dengan urutan kepolaran yaitu petroleum eter, kloroform, etanol, dan metanol. Adapun struktur umum dari antosianin adalah sebagai berikut.

3

sangat tergantung pada distribusi pada kedua fase cair dan padat. yang ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara fase gerak dan fase diam (stationer). Alat yang digunakan yaitu kolom yang di dalamnya berisi fase stasioner (padat atau cair). 4 . adsorben silika gel mampu menghasilkan proses pemisahan yang lebih optimal. Struktur umum antosianin 1. dapat dilakukan dengan kromatografi kolom. Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom. Pemisahan berdasarkan kromatografi adsorpsi. kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis (KLT). yakni fase diam dan fase gerak. Campuran ditambahkan ke kolom dari satu ujung dan campuran akan bergerak dengan bantuan pengembang yang cocok (fase gerak). Untuk pemisahan pigmen dari tumbuhan.2 Kromatografi Kolom dan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Kromatografi adalah prinsip pemisahan campuran senyawa atas komponenkomponen berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi komponen pada dua fase. Kromatografi kolom bertujuan untuk mengisolasi komponen dari campurannya. sehingga ikatannya kuat dan rapat. Perbedaan kemampuan masing-masing komponen diadsorpsi dan perbedaan distribusi dua fase yang tidak saling bercampur (partisi). Silika gel memadat dalam bentuk tetrahedral raksasa.Gambar 6. Dengan demikian. Pada kromatogarfi kolom digunakan kolom dengan adsorben sillika gel karena kolom yang dibentuk dengan silika gel memiliki tekstur dan struktur yang lebih kompak dan teratur. Pemisahan suatu campuran secara kromatografi dapat dilakukan kromatografi kolom.

Dalam proses pemisahan dengan kromatografi kolom. kolom yang terbentuk dari silika gel bisa retak. Oleh karenanya. senyawa-senyawa yang semakin polar akan semakin lama tertahan di fasa stasioner. silika gel. sehingga proses pemisahan zat tidak berjalan optimal. kondisi yang senantiasa basah berperan untuk memudahkan proses elusi (larutan melewati kolom) dalam kolom. Kromatografi kolom dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya dapat dibedakan menjadi dua. Selain itu. 2) Kromatografi fase terbalik Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar. Jika fasa gerak yang digunakan sifatnya non-polar. ester. sedangkan fase geraknya bersifat polar. Untuk menahan fasa diam (adsorben) biasanya digunakan kapas gelas (glass wool) atau gelas berpori (fritted glass). sedangkan fase geraknya bersifat non polar. aldehid dan alkohol. silica gel sifatnya sangat polar. Kolom yang digunakan dalam kromatografi kolom dapat berupa gelas. Ukuran kolom yang lazim digunakan mempunyai diameter dalam 2 cm dan panjang 45 cm. misalnya silica gel. kebalikan dari fase normal. karena pada permukaannya terikat gugus hidroksil. Sorben yang digunakan dalam kromatografi kolom diantaranya arang. plastik atau nilon. keton.Silica gel dapat membentuk ikatan hidrogen di permukaannya. maka pada saat campuran dimasukkan. aromatis. dan senyawa-senyawa yang semakin tidak (kurang) polar akan terbawa keluar kolom lebih cepat. kalsium sulfat dan serbuk selulosa. eter. yaitu : 1) Kromatografi fase normal Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya “normal” bersifat polar. 5 . magnesium silikat. Berikut ini beberapa golongan solutnya misalnya alkana. adsorben silika gel harus senantiasa basah karena. jika dibiarkan kering. alumina. Ujung bagian bawah dilengkapi dengan kran untuk mengatur laju alir eluen. alkena.

6 .

Berikut ini gambar-gambar bagan dalam kromatografi kolom : Gambar 7. Bagan kolom kromatografi Gambar 8. Kolom berisi sampel 7 .

selulosa dan lainnya yang mempunyai ukuran butir sangat kecil yaitu 0.063 – 0. plat diangkat dan dikeringkan. Proses pemisahan pigmen tanaman Dalam pemisahan biasanya kromatografi kolom diikuti pemeriksaan secara kualitatif dengan KLT untuk memonitor apakah pemeriksaan dengan cara kromatografi kolom berhasil atau tidak. Pada prakteknya. Setelah 8 .125 mm dilapiskan pada kaca.Gambar 9. tanah diatome. Dalam kromatografi lapis tipis (KLT) fase diamnya biasanya adalah serbuk silika gel. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending) atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending). sampel ditotolkan pada plat KLT lalu dimasukkan ke dalam chamber yang sudah jenuh oleh eluen. Ketika eluen sudah mencapai batas pada plat yang telah dibuat sebelumnya. lembaran aluminium maupun plastik dengan tebal tertentu. alumina.

Pigmen dalam sampel menuju batas atas plat KLT 9 . Bagan kromatografi lapis tipis (KLT) Gambar 11. Berikut ini gambar-gambar bagan dalam kromatografi lapis tipis (KLT). Gambar 10. Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi lapis tipis. menggunakan harga Rf.daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi. Metoda identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut. maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa. Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi yang konstan merupakan besaran yang karakteristik dan reprodusibel.

atau dengan cara elusi 2 dimensi. Dalam kromatografi lapis tipis. menurun (descending). jingga. fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.3 Beberapa Jenis Tumbuhan a) Daun Puring (Codiaeum variegatum) Puring atau kroton adalah tumbuhan hias pekarangan populer berbentuk perdu dengan bentuk dan warna daun yang sangat bervariasi. Demikian juga peralatan yang digunakan. Beberapa keuntungan dari kromatografi planar ini adalah :   Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis.  Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak. Bentuk daunnya bermacam-macam.  Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending). Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna. serta campurannya. merah. Perbandingan untuk perhitungan Rf Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan lebih murah dibandingkan dengan kromatografi kolom. peralatan yang digunakan lebih sederhana dan dapat dikatakan hampir semua laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat. kuning. tapi bergelombang 10 .Gambar 12. ungu. memanjang. oval. Beragam kultival telah dikembangkan dengan variasi warna hijau. 1.

saponin. namun masih juga mengandung warna hijau yaitu berada pada bagian dalam. Warna hijau pada daun berasal dari kandungan klorofil. namun beraroma lebih wangi dibandingkan dengan sirih hijau. Sirih hijau sejak dahulu telah digunakan oleh masyarakat sebagai obat untuk menyembuhkan berbagai jenis penyakit. batu ginjal dan sebagainya. hepatitis. Pigmen lain yang terkandung dalam daun adalah karoten. Penggunaan sirih hijau dapat digunakan dalam bentuk segar. Daun sirih hijau berasa pahit dan getir. maupun ekstrak kapsul. yang tumbuh merambat dengan bentuk daun menyerupai hati dan bertangkai yang tumbuh berselang-seling dari batangnya serta penampakan daun yang berwarna merah keperakan dan mengkilap. Beberapa negara termasuk Jepang. Klorofil adalah senyawa pigmen yang berperan dalam menyeleksi panjang gelombang cahaya yang energinya diambil dalam fotosintesis. yang merupakan ciri khas suku Euphobaceae. puring adalah kerabat jauh singkong serta kaksuba. Dalam daun sirih hijau terkandung senyawa fitokimia yakni alkaloid. Secara empiris sirih hijau dapat menyembuhkan berbagai jenis penyakit. xantofil dan antosianin. Cina dan Korea mempergunakan bagian tangkai daun sebagai bahan 11 . Ciri yang sama adalah batangnya menghasilkan biloks berwarna putih pekat dan lengket. Warna daun sirih hijau memang merah kepekatan.helainya terputus-putus dan sebagainya. c) Daun seledri (Apium graveolens) Seledri adalah sayuran dan tumbuhan obat yang biasa digunakan sebagai bumbu masakan. Secara botani. tannin dan flavonoid. b) Daun sirih hijau (Piper crocatum) Daun sirih hijau (Piper crocatum) termasuk dalam family piperaceae. seperti diabetes.

Umur daun. Selain itu. mesofil. Kandungan vitamin C pada daun katuk jauh lebih tinggi daripada jeruk maupun jambu biji. Terdapat juga sejumlah flavonoid seperti graveobiosid A (1-2%)dan B (0. d) Daun kemangi (Ocimum sanctum) Daun kemangi memiliki kandungan klorofil yang paling rendah.7%). Terdapat tujuh senyawa aktif yang dapat merangsang produksi hormon-hormon steroid (seperti progesteron. terstosteron. glukokortikoid) dan senyawa eikosanoid (diantaranya prostaglandin. estradiol. tromboksan. Daun dan tangkai daun mengandung steroid seperti stigmasterol dan sitosterol. dan umbinya semua dimanfaatkan. lipoksin dan leukotrien).0. Di Indonesia tumbuhan ini diperkenalkan oleh penjajah Belanda dan digunakan daunnya untuk menyedapkan sup atau sebagai lalapan. Sifat fisika pada klorofil daun katuk dapat dilihat pada semakin tinggi suhu pengeringan. Komponen lainnya apiin. Daun katuk dapat mengandung hampir 7 % protein dan serat kasar 19 %. Khususnya jaringan palisade yang mengandung klorofil. prostasiklin. buah. isokuersitrin. furanokumarin. Kandungan asam lemak utama adalah asam petroselin (40-60%). Hal ini dikarenakan kemangi merupakan tanaman semusim. daun kemangi hanya tersusun dari selapis jaringan palisade. morfologi daun dan tahapan fisiologis suatu tanaman merupakan faktor yang menentukan kandungan klorofil. kadar klorofil semakin tinggi dan intensitas warna semakin hijau. tangkai daun. Kandungan utamanya adalah butilftalida dan butilidftalida sebagai pembawa aroma utama. serta senyawa golongan fenol.1 . Daun ini 12 . e) Daun katuk (Sauropus androgynus) Sifat kimia daun katuk dapat dilihat dari kadar kalsium yang tinggi. Penggunaan seledri paling lengkap adalah di Eropa: daun.makanan. serta isoimperatorin. daun berukuran kecil dengan helaian daun yang tipis.

protein yang terlibat dalam proses fotosintesis) sehingga berguna bagi penderita anemia.kaya akan vitamin K. sehingga laju fotosintesisnya juga tinggi. Hal ini diduga klorofil pada tanaman kangkung tersebar. fosfor dan magnesium. Mineral yang dikandungnya adalah kalsium (hingga 2. Klorofil b berfungsi sebagai antena fotosintetik yang mengumpulkan cahaya kemudian ditransfer ke pusat reaksi. selain itu pro-vitamin A ( β-karoten). f) Daun singkong (Manihot utilisima L) Daun singkong memiliki kandungan klorofil a dan klorofil b yang tinggi. Hal ini menyebabkan laju fotosintesis berlangsung lama karena tidak efisien dalam menangkap energi radiasi cahaya. 13 . Pusat reaksi tersusun dari klorofil a. Hal ini menunjukkan bahwa kemampuan singkong dalam menangkap energi radiasi cahaya lebih efisien. g) Daun kangkung (Ipomoea aquatica) Kangkung memiliki kandungan klorofil yang relatif rendah yaitu setara dengan daun kemangi. Daun bayam mempunyai kandungan klorofil yang tinggi.8 %). kalium. B dan C. tidak hanya pada organ daun saja namun juga dijumpai pada bagian batang. besi. h) Daun bayam (Amaranthus spp) Kandungan besi pada bayam relatif lebih tinggi daripada sayuran lain (besi merupakan penyusun sitokrom. Energi cahaya akan diubah menjadi energi kimia di pusat reaksi yang kemudian dapat digunakan untuk proses reduksi dalam fotosintesis. Klorofil a dan klorofil b berperan dalam proses fotosintesis. sehingga laju fotosintesisnya juga lebih tinggi.

Cawan porselin 12. Glass wool 4. Batang pengaduk 5. Sampel daun : Puring. Gelas ukur 10 ml 3. Pipet tetes 9.i) Daun pandan (Pandanus amaryllifolius Roxb) Daun pandan mengandung klorofil yang sangat tinggi yang sering digunakan sebagai pewarna alami. katuk. Rak tabung reaksi 8. Bunsen + kaki tiga + kain kasa 2. kangkung. Etanol 3. ALAT DAN BAHAN 2. Lumpang dan alu 10. kemangi. Sebuk Al2O3 ( alumina ) : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 36 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah : 9 buah 14 . sirih hijau. Statif dan klem 11. Corong biasa 4. Semakin tinggi kandungan klorofilnya maka semakin cepat laju fotosintesisnya dan lebih efisien dalam menangkap energi radiasi cahaya. dan pandan. 2. II.1 Alat yang digunakan 1. Tabung reaksi 7. singkong. bayam. Gelas kimia 250 ml 6. Seledri.2 Bahan yang digunakan 1. Kolom kaca 2.

Membuat adonan dari 25 g alumina (Al2O3) dengan 25 mL etanol. Kloroform 8. mengaduk sampai merata. 4. Menyaring larutan sampel dengan kertas saring melalui corong. 15 . Menyiapkan kolom gelas 50 mL. Memasukkan adonan tersebut ke dalam kolom hingga setinggi 10 cm sambil mengetuk-ngetuk dengan kran dalam keadaan terbuka. 2.5. 3. Metanol III. Memasukkan larutan sampel daun setinggi 2 cm setelah permukaan pelarut etanol turun mendekati penyerap (adonan Al2O3). serta secara sedikit demi sedikit (jangan ada gelembung udara). 3. 3. Memekatkan larutan dengan menggunakan pembakar bunsen sampai larutan tinggal setengah mL. Petroleum eter 7. Melumatkan 10-15 lembar sampel daun dengan lumpang dan alu.2 Pembuatan Kromatografi Kolom 1. 2. Memasukkan glass wool ke dalam kolom gelas hingga setinggi 1 cm.5 cm yang bagian bawahnya telah dilengkapi dengan kran. 3. Menambahkan 20 mL etanol. Melalui corong menuangkan etanol ke dalam kolom hingga setinggi 1 cm.1 Ekstraksi Sampel 1. 5. tinggi 20 cm dan diameternya 1. 6. PROSEDUR KERJA 3. Kertas saring 6. 4.3 Pemisahan Pigmen dari Tumbuhan 1. Mengelusi kembali kolom dengan pelarut hingga mencapai permukaan alumina dalam kolom dan memasukkan glass woll.

campuran glass wool kedalam kolom + 2 ml etanol +larutan sampel Mendiamkan sampai larutan sampel menetes Menambahkan petroleum eter Larutan sampel menyebar dan menetes Sampel yang digunakan: A. Menghentikan pemberian pelarut bila semua warna telah keluar dari kolom kaca. Menampung tetesan yang keluar dari kolom dengan beberapa tabung reaksi yang bersih. Daun singkong:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau kekuningan larutan kuning B. Hasil Pengamatan Campuran Filtrat: larutan hijau tua Residu: ampas daun Tinggi glass wool 1 cm 6. Memasukkan glass wool dalam kolom + 1 ml etanol Al2O3 + 25 ml etanol Glass wool dan etanol dalam kolom Memasukkan adonan alumina + Adonan alumina. 7.2. etanol dan metanol. Perlakuan 1. kloroform. Menggerus sampel daun + 20 ml etanol 2. 8. IV. Menyaring campuran 3. Segera mengelusikan kolom dengan pelarut secara bertahap sesuai dengan kepolarannya yaitu petroleum eter. 4. Jika permukaan sampel telah mendekati permukaan penyerap. 4. HASIL PENGAMATAN No. 3. 5. Daun Pandan:  Tabung I + petroleum eter  Tabung II + Kloroform  Tabung III + Etanol  larutan hijau muda  larutan hijau tua  larutan hijau kekuningan 16 .

Daun Kangkung:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau tua larutan hijau muda larutan hijau kekuningan larutan hijau bening G. Daun Sirih:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan kuning bening larutan kuning tua larutan kuning larutan kuning H. Tabung IV + metanol  larutan hijau muda C. Daun Katuk:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau muda larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau tua 17 . Daun Kemangi:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau bening larutan hijau kekuningan larutan hijau kekuningan larutan kuning E. Daun Bayam:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau tua larutan hijau tua D. Daun Puring:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan kuning jernih larutan hijau muda larutan hijau muda larutan hijau muda F.

dan etanol. dan pandan menggunakan kromatografi kolom dengan beberapa pelarut yaitu petroleum eter. kangkung.I. metanol. singkong. Reaksinya adalah sebagai berikut. Daun Seledri:     Tabung I + petroleum eter Tabung II + Kloroform Tabung III + Etanol Tabung IV + metanol     larutan hijau muda larutan hijau tua larutan hijau muda larutan hijau tua V. katuk.1 Ekstraksi Sampel Daun Pertama-tama menumbuk sampel daun dengan lumpang dan alu. karoten dan xantofil memiliki sifat diantara polar dan non polar sehingga dapat larut dalam etanol yang merupakan pelarut semipolar. kloroform. Penumbukan ini bertujuan menghaluskan daun sehingga senyawa yang terkandung di dalamnya mudah larut dalam pelarut etanol. Seledri. Etanol + klorofil → fitol + etil klorofilida 18 . kemangi. 5. bayam. Etanol efektif untuk mengekstrak pigmen tumbuhan karena sebagian besar pigmen tumbuhan seperti klorofil. lalu mengekstraksinya dengan menggunakan pelarut etanol. sebab semakin halus daun maka semakin luas permukaan untuk terjadi kontak dengan pelarut maka semakin banyak zat yang dapat terekstrak. ANALISIS DATA Pada percobaan ini dilakukan pemisahan pigmen dari beberapa sampel daun. sirih hijau. Setelah itu menguji masingmasing ekstrak pelarut dari masing-masing sampel daun dengan metode KLT untuk menentukan jenis pigmen yang terkandung dalam daun tersebut. yaitu daun Puring. Namun proses ekstrasi ini harus dilakukan dengan cepat karena enzim klorofilasi yang terkandung dalam daun segar akan mengkatalisis reaksi antara klorofil dengan etanol sehingga jumlah klorofil dalam daun akan berkurang.

Larutan hasil ekstrak dengan etanol ini. selanjutnya diuapkan hingga separuh volume mula-mula. 19 .Setelah itu dilakukan penyaringan agar diperoleh filtrat yang mengandung pigmen tanaman. sedangkan residunya dibuang.

kran kolom ditutup. Larutan berawarna ini adalah pigmen dari daun sampel. Bubur alumina dimasukkan ke dalam kolom sambil mengetuk-ngetuk kolomnya agar tidak terbentuk gelembung udara. Setelah itu bagain atas kolom juga diberi glass woll agar ekstrak daun yang akan dimasukkan ke dalam kolom dapat tersaring. Lalu memasukkan pelarut ke dalam kolom dan membuka krannya. Selanjutnya memasukkan kembali etanol untuk mengelusi kolom dan setelah selesai. tetapi ekstrak daun masih bisa mengalir. 5.3 Pemisahan Pigmen Tanaman Setelah kolom kromatografi siap dipakai. dimana langkah pertama yang dilakukan adalah membuat adonan Al2O3 dengan pelarut etanol sehingga terbentuk bubur alumina. Di sini terlihat bahwa pigmen dari sampel daun mulai bergerak turun dan mulai menetes. Tetesan yang keluar dari kolom ini ditampung dalam tabung reaksi dan mengganti tabung reaksinya ketika warna yang keluar dari kolom berubah. hal ini bertujuan untuk menahan fase diam (adsorben) alumina agar tidak turun dari kolom karena glass woll merupakan gelas yang masih berpori sehingga dapat menahan alumina. bagian bawah kolom ditutupi dengan glass woll. kran dibuka agar pelarut etanol dapat keluar sehingga diperoleh fase diam (alumina) yang padat. ekstrak sampel daun di masukkan ke dalam kolom. Dalam hal ini alumina Al2O3 yang digunakan sebagai adsorben atau fase diamnya. sebelum dimasukkan alumina.5. Penggunaan etanol ini dikarenakan alumina mengandung titik aktif Al-OH sehingga etanol yang juga mengandung gugus OH akan dapat terikat kuat dengan alumina jadi bubur alumina yang merupakan fase diam akan lebih homogen. karena Al2O3 lazim digunakan untuk senyawa organik stabil. Selain itu. Saat mengisi kolom. kolom harus bebas dari gelembung gas karena bila ada gelembung udara maka proses pemisahan yang terjadi tidak akan sempurna sehingga akan terjadi penyebaran noda ketika hasil kromatografi kolom di uji KLT. Adapun pelarut yang digunakan adalah berdasarkan kepolaran yang paling kecil 20 .2 Penyiapan Kolom Kromatografi Selanjutnya membuat kolom kromatografi.

ketika petroleum eter kita masukkan ke dalam kolom. klorofil dalam ekstrak daun akan larut di dalamnya dengan kecepatan yang sama dengan fase geraknya (petroleum eter) dan keluar paling pertama. kloroform.yaitu petroleum eter. Karoten yang merupakan senyawa yang lebih polar daripada klorofil. Prinsip pemisahan dalam kolom tersebut adalah sebagai berikut. Untuk itulah digunakan pelarut berikutnya yang lebih polar dibandingkan petroleum eter yaitu kloroform agar karoten dapat keluar dari kolom dengan lebih cepat namun dengan catatan klorofil sudah keluar seluruhnya. akan keluar dari kolom lebih lambat dibandingkan klorofil karena karoten akan teradsorbsi lebih kuat dari pada klorofil. berarti klorofil tidak teradsorpsi dengan kuat pada alumina. Kita misalkan di dalam suatu ekstrak daun terdapat klorofil. Begitu pula seterusnya digunakan pelarut etanol dan metanol untuk mengeluarkan pigmen yang lebih polar seperti xantofil. Pelarut ini digunakan pada kromatografi kolom secara berurutan. etanol dan metanol. Ini dapat terjadi karena alumina adalah senyawa polar sedangkan klorofil adalah senyawa yang tergolong non polar. Adapun struktur dari senyawa-senyawa yang terkandung dalam daun adalah : Gambar struktur klorofil a 21 .

Gambar struktur klorofil b Gambar struktur α-karoten Gambar struktur β-karoten 22 .

dengan warna yang sedikit berbeda. Pada tabung I dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna kuning bening. b. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Puring Dari proses kromatografi kolom dihasilkan empat fraksi. apakah dalam petroleum eter. Sedangkan pada tabung lainnya dengan pelarut kloroform. a. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Kemangi Dari proses kromatografi kolom dihasilkan tiga fraksi ekstrak sesuai dengan pelarutnya. Walaupun demikian belum dapat dipastikan dalam pelarut apa pigmen-pigmen tersebut terkandung. Warna hijau yang dihasilkan menunjukkan bahwa sampel daun seledri mengandung klorofil karena klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau dengan semua pelarut. karoten. Klorofil mengandung sifat nonpolar sehingga dapat larut dalam petroleum eter yang dan kloroform yang juga bersifat nonpolar. baru kemudian xantofil. kloroform. Sesuai dengan literatur daun seledri mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan berwarna hijau muda). karena uji KLT tidak 23 .Gambar struktur antosianin Dari penjelasan di atas dapat dikatakan bahwa urutan keluarnya pigmen dari kolom sesuai dengan urutan kepolaran dari pigmen yang paling non polar yaitu klorofil. etanol dan metanol menghasilkan larutan berwarna hijau muda. Kenonpolaran klorofil dapat dilihat dari strukturnya di mana walaupun klorofil mengandung bagian yang polar namun secara keseluruhan strukturnya adalah nonpolar. etanol atau metanol.

dilakukan maka analisis dilakukan berdasarkan harga Rf menurut literatur dan perbedaan warna yang dihasilkan. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Seledri Dari proses kromatografi kolom dihasilkan empat fraksi. 24 . Pada tabung II dengan pelarut kloroform menghasilkan larutan berwarna hijau tua. Tabung III dengan pelarut etanol menghasilkan larutan berwarna hijau muda dan pada tabung IV dengan pelarut metanol menghasilkan larutan yang berwarna hijau. larutan pada fraksi ini berwarna kuning dan hal ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang berwarna kuning. xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar. Kenonpolaran klorofil dapat dilihat dari strukturnya di mana walaupun klorofil mengandung bagian yang polar namun secara keseluruhan strukturnya adalah nonpolar. Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen karoten karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar tetapi kepolarannya agak rendah jika dibandingkan dengan petroleum eter. Dalam hal ini. Untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter berwarna hijau sehingga dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah klorofil. Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung xantofil (C40H50O2) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol dibandingkan dengan karoten. Fraksi ini berwanra hijau kekuningan (warna kuning dominan). Pada tabung I dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna hijau muda. Di samping itu. Sesuai dengan literatur daun seledri mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan berwarna hijau muda). Warna hijau yang dihasilkan menunjukkan bahwa sampel daun seledri mengandung klorofil karena klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau dengan semua pelarut. c. Klorofil mengandung sifat nonpolar sehingga dapat larut dalam petroleum eter yang dan kloroform yang juga bersifat nonpolar. Hasil ini sesuai dengan literatur bahwa pigmen karoten memang senyawa yang berwarna kuning.

Untuk uji KLT. maka bila harga Rf kecil. Berdasarkan hal tersebut maka dapat diketahui bahwa harga Rf xantofil terhadap metanol lebih besar daripada harga Rf karoten terhadap etanol. e. tetapi kepolarannya agak rendah sehingga dapat larut dalam etanol. Namun pada pelarut metanol dan kloroform masih menghasilkan klorofil. larutan tersebut memiliki komponen yang bersifat nonpolar. dan harga Rf klorofil b terhadap petroleum eter paling kecil. dimana seharusnya untuk pelarut kloroform dapat menghasilkan pigmen karoten dan untuk pelarut metanol menghasilkan pigmen xantofil. komponen yang terkandung bersifat lebih polar. Untuk pelarut petroleum eter menghasilkan ekstrak warna hijau muda menunjukkan adanya pigmen klorofil b (C55H70O6N4Mg). Karena pelarut yang digunakan adalah etanol yang bersifat polar. harga Rf yang besar menunjukkan bahwa komponen tersebut lebih larut dalam eluennya. Untuk pelarut metanol menghasilkan ekstrak berwarna kuning menunjukkan adanya pigmen xantofil. f. Pelarut etanol menghasilkan ekstrak berwarna hijau kekuningan menunjukkan adanya pigmen karoten. Harga Rf karoten terhadap etanol lebih besar daripada harga Rf klorofil a terhadap kloroform. Klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau dengan sifat nonpolar sehingga mudah larut dalam petroleum eter maupun kloroform. Pigmen xantofil dihasilkan dari pelarut petroleum eter dan etanol. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Katuk 25 . Dengan pelarut petroleum eter terdapat klorofil dengan warna larutan hijau. artinya komponen tersebut kurang larut dalam pelarut etanol. dan sebaliknya apabila harga Rf besar. Berbanding terbalik dengan harga Rf yang kecil. Meskipun karoten bersifat nonpolar.d. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Singkong Dari proses kromatografi kolom diperoleh empat fraksi. Pelarut kloroform menghasilkan ekstrak warna hijau tua menunjukkan adanya pigmen klorofil a (C55H72O6N4Mg). Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Bayam Dari proses kromatografi kolom diperoleh tiga fraksi ekstrak sesuai pelarutnya.

Dalam hal ini. xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Pandan Dalam pemisahan pigmen tanaman dari daun pandan. xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar sehingga dapat larut dalam etanol yang juga bersifat polar. Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen karoten karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar dimana pigmennya berwarna hijau. Untuk fraksi yang larut bersama kloroform diduga mengandung pigmen karoten karena karoten dan kloroform sama-sama bersifat non polar tetapi kepolarannya agak rendah jika dibandingkan dengan petroleum eter. Dalam hal ini. Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung xantofil (C40H50O2) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol dibandingkan dengan karoten. g. dengan warna yang sedikit berbeda. untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter (nonpolar) berwarna hijau sehingga dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah klorofil. larutan pada fraksi ini berwarna kuning dan hal ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang berwarna kuning. Hasil ini sesuai dengan literatur bahwa pigmen karoten memang senyawa yang berwarna kuning. Untuk fraksi yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung xantofil (C40H50O2) karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol dibandingkan dengan karoten. Di samping itu. Di samping itu. Untuk fraksi yang larut di dalam petroleum eter berwarna hijau sehingga dapat diperkirakan kandungan pigmen tersebut adalah klorofil. larutan pada fraksi ini berwarna hijau kekuningan dan hal ini sesuai dengan literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang berwarna kuning.Dari proses kromatografi kolom dihasilkan tiga fraksi ekstrak sesuai dengan pelarutnya. karena uji KLT tidak dilakukan maka analisis dilakukan berdasarkan harga Rf menurut literatur dan perbedaan warna yang dihasilkan. 26 . Fraksi ini berwarna hijau kekuningan (warna kuning dominan).

Oleh karena itu. i. sedangkan karoten keluar bersama dengan pelarut kloroform. 27 . Klorofil keluar bersama dengan pelarut petroleum eter. Pada tabung I dan II dengan pelarut petroleum eter didapatkan larutan berwarna hijau tua dan hijau lebih tua. Sedangkan warna hijau kekuningan menunjukkan adanya karoten karena karoten merupakan senyawa yang berwarna hijau kekuningan. klorofil dapat larut dalam pelarut petroleum eter dan kloroform yang bersifat nonpolar. ada 5 tabung reaksi yang kemudian diuji dengan KLT dengan kenampakan noda yang terlihat setelah disinari lampu UV (berwarna jingga) dan diurutkan dari warna yang paling muda sampai tua. Sesuai dengan literatur di mana daun kangkung mengandung klorofil a (larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan berwarna hijau muda). Klorofil dan karoten sama-sama bersifat non polar. Tabung IV sampai VI dengan pelarut etanol dan metanol menghasilkan warna hijau kekuningan.h. Pada tabung III dengan pelarut kloroform menghasilkan larutan berwarna hijau muda. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Sirih Hijau Untuk perhitungan harga Rf tidak dilakukan uji KLT namun berdasarkan literatur yang ada. Hasil pemisahan pigmen yang diperoleh melalui kromatografi kolom adalah klotofil. Warna hijau yang dihasilkan menunjukkan bahwa sampel daun kangkung mengandung klorofil karena klorofil merupakan senyawa yang berwarna hijau. Sedangkan karoten merupakan senyawa yang dapat larut dalam etanol. Klorofil mengandung bagian yang polar walaupun secara keseluruhan stukturnya adalah senyawa nonpolar. Pemisahan Pigmen Tanaman dari Daun Kangkung Dari proses kromatografi kolom dihasilkan enam fraksi. namun karena karoten sedikit lebih bersifat polar maka karoten lebih lambat keluar daripada klorofil. Sedangkan xantofil yang mudah larut dalam alkohol akan keluar bersama dengan pelarut etanol dan metanol. xantofil dan karoten.

28 .

Rf = 0.767 . 2. metanol dan etanol. Pemisahan dengan kromatografi kolom dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom.Fraksi 3 (etanol) yang mengandung xantofil. 1.Dari percobaan ini dapat disimpulkan bahwa jenis pigmen dalam tiap sampel daun untuk tiap fraksinya adalah sebagai berikut : No. 2.Fraksi 4 (metanol) yang mengandung xantofil. 5. 29 . Pada percobaan pemisahan pigmen dari tanaman dari semua sampel tanaman dilakukan dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut yaitu etanol untuk melarutkan pigmen sampel daun. 3. menurut literatur harga Rf standar untuk masing-masing komponen adalah sebagai berikut : . 9. 3. Rf = 0. Rf = 0. 6. yang ditentukan oleh kekuatan adsorspi atau koefisien partisi antara fasa gerak dan fasa diam.756 .Fraksi 1 (petroleum eter) yang mengandung klorofil.75 . KESIMPULAN 1.Fraksi 2 (kloroform) yang mengandung karoten. Pemisahan menggunakan kromatografi kolom yang fase diam berupa Alumina dan fase gerak yaitu petroleum eter. 8. Sampel Daun Singkong Pandan Bayam Kemangi Puring Kangkung Sirih Katuk Seledri Petroleum eter Klorofil Klorofil Klorofil Klorofil Xantofil Klorofil Xantofil Klorofil Klorofil Kloroform Klorofil Klorofil Klorofil Karoten Klorofil Klorofil Xantofil Klorofil Klorofil Etanol Karoten Karoten Klorofil Karoten Klorofil Karoten Xantofil Klorofil Klorofil Metanol Xantofil Klorofil Klorofil Xantofil Klorofil Klorofil Xantofil Klorofil Klorofil Untuk uji KLT.767 VI. 4. Rf = 0. 7. kloroform.

2010. 1996. katuk dan seledri mengandung pigmen klorofil. Tim Dosen Kimia Organik. Daun puring mengandung pigmen klorofil dan xantofil. Bandung : ITB. DAFTAR PUSTAKA Anwar.4. Gritter. dkk. 1995. Yogyakarta : Depdikbud. Daun pandan dan kangkung mengandung pigmen klorofil dan karoten. J. 1991. Berdasarkan percobaan. harno Dwi Pranowo dan Tutik dwi Wahyuningsih. 30 . Trevon. 2006. Daun sirih mengandung pigmen xantofil. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis Modern. xantofil. Sumar. Pengantar Praktikum Kimia Organik. Daun bayam. daun singkong dan kemangi mengandung pigmen klorofil. karoten. Pengantar Kromatografi. Panduan Praktikum Kimia Organik II. Robinson. VII. FKIP Banjarmasin : UNLAM. Bandung : ITB. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. (Tidak dipublikasikan). Bambang Purwono. Chairil.. Hendayana. Bandung : Remaja Rosdakarya.

VIII. fraksi ini muncul terakhir karena pigmen ini lebih larut dalam alkohol. Identifikasi pigmen apa saja yang keluar dari kolom secara berurutan dan jelaskan mengapa terjadi demikian ? 3. 31 . b. 2. hal ini mungkin dikarenakan: a. Hal ini dikarenakan klorofil dan petroleum benzen bersifat nonpolar sehingga petroleum benzen dapat melarutkan pigmen klorofil. Mengapa tidak boleh ada gelembung udara dalam timbunan penyerap di dalam kolom ? 2. sehingga pemisahan menjadi kurang baik (tidak sempurna). Sedangkan fraksi yang muncul selanjutnya adalah fraksi etanol dan disusul fraksi metanol yang membawa pigmen xantofil.1 Pertanyaan dan Jawaban 1. LAMPIRAN 8. dimana karoten dan kloroform sama-sama nonpolar tetapi sedikit polar dibandingkan dengan klorofil dan petroleum benzen. Apakah teknik yang anda lakukan berhasil memisahkan pigmen seperti yang diinginkan ? Jawaban 1. Pigmen yang keluar pertama bersama petroleum benzen adalah klorofil. Namun proses pemisahannya kurang sempurna. Penambahan tiap-tiap pelarut yang secara terus-menerus tanpa menunggu tetesan untuk fraksi pelarut tertentu itu habis. 3. Teknik yang telah dilakukan berhasil memisahkan pigmen seperti yang diharapkan karena melalui fraksi-fraksi tersebut dimungkinkan ada 3 pigmen yang muncul yaitu karoten. Tidak boleh ada gelembung udara dalam timbunan penyerap di dalam kolom karena dapat mengakibatkan distribusi yang tidak merata (ketidakhomogenan penyerap). Akibatnya terjadi penyebaran noda ketika larutan hasil kromatografi kolom di KLT. Tidak dilakukannya homogenasi alumina sebagai fase diam. Kemudian disusul dengan fraksi kloroform dengan pigmen karoten. xantofil dan klorofil.

c. Pergantian tabung reaksi untuk penampungan tidak dilakukan berdasarkan waktu tertentu atau sampai pelarut tidak menetes lagi. melainkan berdasarkan warna. 32 . Fraksi pigmen yang dihasilkan kurang spesifik karena mata memiliki keterbatasan dalam menentukan warna jadi kemungkinan ada fraksi yang tercampur.

2 Flow Chart A. dan pandan 33 . sirih hijau. bayam.Melumatkan dalam lumpang . kangkung. katuk.Mengaduk sampai merata Campuran . singkong. Seledri. kemangi. Ekstraksi Sampel 10-15 lembar daun contoh* .Menyaring melalui corong biasa dengan kertas saring Residu Filtrat .Memekatkan dengan alat rotavapor sampai cairan tinggal beberapa mL Pelarut Larutan pekat N/B: * Sampel daun : Puring.8.Menambahkan beberapa mL etanol Lumatan daun contoh + etanol .

B. Pembuatan Kromatografi Kolom Glass wool . hingga setinggi 1 cm Glass wool + Etanol .Memasukan ke dalam kolom kaca setinggi 20 cm.Memasukkan adonan melalui corong ke dalam kolom sehingga setinggi 15 cm sambil mengetukngetuk dan keran dalam keadaan terbuka Campuran II 34 .Membuat adonan Adonan alumina Campuran 1 + adonan .Menuangkannya melalui corong dan memasukannya ke dalam kolom hingga setinggi 10 cm Campuran I Al2O3 + etanol .

Memasukkan .Kemudian melanjutkan dengan KLT dengan larutan pengembang yang sesuai (etanol) 35 .Mengelusi kembali kolom dan mengatur keran sampai terjadi kira-kira 20 tetes per menit. Pemisahan Pigmen dari Tanaman Campuran II + etanol .Membuka keran . kemudian menutup keran Campuran III + glass wool .Mengelusi kembali.C.Membuka keran Campuran IV + etanol .Memasukkan setinggi 1 cm Campuran VI + pelarut .Menampung tetesan yang keluar dari kolom dengan beberapa tabung reaksi yang bersih . jika permukaan sampel telah mendekati permukaan penyerap . sampai permukaan pelarut turun mendekati penyerap (adonan Al2O3) Campuran V + larutan contoh .Segera mengelusikan kolom dengan pelarut secara bertahap sesuai dengan kepolarannya (**yaitu petroleum benzen. kloroform. etanol dan metanol).Menghentikan pemberian pelarut bila semua warna telah keluar dari kolom Larutan berwarna NB : .Memisahkan berdasarkan warnanya .

Sampel ekstrak daun puring pada KK Gambar 19. Kolom kromatografi Gambar 18. Sampel ekstrak daun puring mulai turun pada KK Gambar 20.LAMPIRAN FOTO – FOTO PERCOBAAN Gambar 17. Sampel ekstrak daun andong pada KK 36 .

37 .

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful