ISOLASI DNA BUAH

Oleh: Nama NIM Kelompok Rombongan Asisten : Siti Nur Azizah : B1J011086 :3 : II : Puspa Dwi

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2013

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Dewasa ini perkembangan ilmu pengetahuan dalam ilmu biologi sangat pesat, diantaranya adalah perkembangan teknik biologi molekuler yang memungkinkan diperolehnya suatu marka gen yang mengendalikan karakter target perbaikan dalam program pemuliaan tanaman. Penemuan teknik dalam memperoleh gen atau disebut dengan teknik molekuler yang mengendalikan suatu karakter sebagai penanda atau marker molekuler, sangat membantu efektifitas maupun efisiensi dari pelaksanaan proses seleksi yang akan dilakukan. Teknik molekuler bervariasi dalam cara pelaksanaan untuk mendapatkan data, baik tekniknya maupun tingkatan target data yang diinginkan sesuai kemudahan pelaksanaan, ketersediaan sumber daya manusia, fasilitas, dan dana. DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon. DNA memiliki struktur pilinan untai ganda yang anti pararel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap dari materi genetik (DNA) yang dimilikimsuatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih, karena memiliki nukleus dimana terdapat DNA didalamnya.

Pengetahuan tentang DNA dan cara mengisolasinya akan dibahas dengan menggunakan alat dan bahan yang sederhana.

dibahas

B. Tujuan Praktikum kali ini bertujuan untuk mengisolasi DNA kromosom serta mengetahui prinsip dan proses isolasi DNA kromosom.

II. MATERI DAN METODE

A. Materi Bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah buah strawberry, buah mangga, buah alpukat, buah naga, buah pepaya, deterjen, NaCl (garam dapur), tenderizer, etanol absolut dan akuades. Alat-alat yang digunakan adalah kantung plastik, beaker glass, corong plastik, kain kasa, pipet plastik, tabung falcon, tabung eppendorf, sarung tangan dan kamera digital.

B. Metode 1. 2. 3. Masukkan buah ke dalam kantung plastik. Tambahkan 1 sendok NaCl dan akuades lalu dihancurkan. Masukkan detergen cair lalu disaring saat dimasukkan ke dalam tabung falcon. 4. Tambahkan tenderizer secukupnya dan tambahkan etanol absolut sebanyak 2 ml. 5. Amati kabut putih yang terbentuk.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Tabel 1. Hasil Isolasi DNA Buah Kabut Putih No. Kelompok Tabung Eppendorf 1 1 2 3 4 5 Strawberry Alpokat Pepaya Mangga Buah Naga + + + + Tabung Eppendorf II + + _ + +

Gambar 1. Hasil Isolasi DNA Buah Pepaya

Gambar 2. Hasil Isolasi DNA Buah Mangga

B. Pembahasan Isolasi DNA merupakan suatu teknik dalam biologi molekuler yang digunakan untuk memisahkan DNA dengan campurannya, sehingga didapat DNA murni yang dapat digunakan untuk perkembangan teknik biologi molekuler lainnya sperti vektor kloning (Medina, 2011). Sebagai contoh, DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom, untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis dengan penambahan detergen (Fatih, 2009). Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA, protein dan komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan penambahan potasium. DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang tersisa dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol. RNA, terutama mRNA merupakan materi genetik yang mengkode suatu protein. Jumlah populasi mRNA akan lebih banyak dibanding dengan DNA. mRNA eukariot dapat dipisahkan dari DNA dengan menggunakan oligonukleotida dT. Atau RNA total juga dapat diisolasi dari sel dengan menambahkan enzim DNase yang berfungsi untuk mendegradasi DNA (Zubaidah, 2004). Ekstraksi DNA dari organisme eukariot (manusia, hewan dan tumbuhan) dilakukan melalui proses penghancuran dinding sel (lysis of cell walls), penghilangan protein dan RNA (cell digestion) dan pengendapan DNA (precipitation of DNA) dan pemanenan. Berbagai teknik ekstraksi DNA telah dikembangkan dari prinsip dasar tersebut, sehingga saat ini muncul berbagai teknik ekstraksi dan purifikasi DNA. Prinsip dasar ekstraksi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponen-komponen sel lainnya. Hasil ekstraksi tersebut merupakan tahapan penting untuk langkah berikutnya. Oleh sebab itu dalam pelaksanaannya harus dilakukan dengan baik dan bebas kontaminasi. Bedanya, isolasi DNA kromosom lebih banyak menyerap

zat warna daripada isolasi DNA biasa. Selain itu, DNA kromosom juga diproduksi didalam sel (Cespedes, 2010). Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetic), dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). EDTA berfungsi sebagai perusak sel dengan cara mengikat ion magnesium (ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuclease yang merusak asam nukleat). SDS merupakan sejenis deterjen yang berfungsi merusak membrane sel. Enzim proteinase K dapat digunakan untuk menghancurkan protein. Kotoran akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Kemudian molekul nuleotida (DNA dan RNA) yang telah dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan menggunakan phenol (Mustahib, 2012). Proses ini sebagian kecil RNA juga dapat dibersihkan. Sedangkan choloform digunakan untuk membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida dari larutan. Enzim RNAase digunakan untuk menghancurkan RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh. Pemurnian atau purifikasi DNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan DNA tersebut dengan NaCl yang berfungsi memekatkan, memisahkan DNA dari larutan, dan mengendapkan DNA sewaktu dicampur dengan ethanol. Proses sentrifugasi dengan kecepatan tinggi akan mengendapkan tepung berwarna putih (DNA) dan menempel di dasar tabung ependorf (Mustahib, 2012). Secara umum, ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi jaringan, pelisisan dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. 1. Isolasi jaringan Tahap pertama yaitu mengisolasi jaringan yang akan digunakan. 2. Pelisisan dinding dan membran sel Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan cara penggerusan (homogenasi), sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari 10.000 rpm atau dengan menggunakan larutan pelisis sel atau buffer, ada didalamnya. Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan untuk melisiskan sel yang tidak mengandung DNA agar sel yang mengandung inti sel dapat

diisolasi atau dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya yang tidak berfungsi (Davis, 1994). 3. Pengekstrasikan dalam larutan Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak. 4. Purifikasi Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstrak dari zat-zat lainnya. Pada larutan tersebut kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65C. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. Penambahan RNAse berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh. 5. Presipitasi Tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas (Calista, 2010). Penambahan NaCl berfungsi sebagai buffer atau penyeimbang pH, detergen berfungsi menggantikan senyawasenyawa kimia. Detergen mengandung sodium dodesil sulfat (SDA) yang dapat menyebabkan hilangnya molekul lipid pada membran sel sehingga struktur membranakan rusak dan melisiskan isi sel (Jamilah, 2005). Penghancuran jaringa jaringan sampel pada awal proses isolasi DNA, terjadi pelepasan senyawa polifenol dan polisakarida. Penambahan etanol,

larutan akan tampak terbalik untuk beberapa saat, dan pada akhirnya ethanol akan berada di bagian atas tabung, sementara filtrat berada dibagian dasar tabung karena ethanol memiliki kerapatan yang lebih kecil dibandingkan air (Jamilah, 2005). Tujuan setiap tahapan isolasi DNA buah yang pertama adalah penghancuran buah secara mekanik dengan cara di remas-remas bertujuan untuk perusakan dinding sel selanjutnya penambahan NaCl 1 sendok bertujuan sebagai buffer, mengubah larutan dari isotonis menjadi hipertonis, penambahan akuades sebagai pengencer atau pelarut, penambahan detergen untuk membantu kerja NaCl untuk melisiskan sel, selain itu juga sebagai pelarut lemak, penyaringan untuk memisahkan serat buah dan DNA, penambahan Tenderizer untuk menghidrolisis atau menghancurkan protein, penambahan alkohol 96% atau etanol absolut atau bisa juga dengan isopropanol untuk pemurnian DNA, memisahkan DNA dari bahan lain, etanol absolut memiliki berat jenis yang ringan, tidak melarutkan DNA yang dapat menyebabakan DNA melayang, selain itu juga etanol absolut dapat mengikat air dan memiliki suhu yang rendah, supaya DNA tidak rusak, menyebabkan DNA stabil dan bias disimpan untuk keperluan yang lain misalnya untuk keperluan elektroforesis. Proses peremasan merupakan perlakuan untuk mensederhanakan tekstur dan merusak dinding sel secara mekanis (Jamilah, 2005). Menurut Jamilah (2005), DNA tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain. Zubaidah (2004) dalam Jamilah (2005) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang

berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit. Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membrane membentuk senyawa lipid proteindeterjen kompleks. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia. (Jamilah, 2005). Menurut Majumder (2011), dalam penelitiannya, tiga jenis DNA tanaman protokol ekstraksi dipelajari dan target adalah mendirikan eter jenuh air (WSE) dengan metode 1,25 M NaCl sebagai yang paling efisien protokol untuk menghapus polisakarida yang sangat terkonsentrasi dari DNA genomik tanaman buah berkayu. Metode ini melibatkan yang CTAB yang dimodifikasi atau prosedur SDS menggunakan langkah pemurnian untuk menghilangkan

polisakarida menggunakan metode WSE. pengendapan dengan volume yang sama isopropanol menyebabkan pelet DNA terbentuk. Setelah dicuci dengan etil alkohol 70%, pelet menjadi mudah dilarutkan dalam buffer TE. Dengan menggunakan tiga metode, DNA diekstraksi dari sampel dari 60 genotipe mangga, termasuk muda, dewasa, tua, daun buram tua tua dan layu. Dibandingkan dengan tiga protokol DNA dipelajari ekstraksi mangga, ditemukan bahwa Metode WSE dengan NaCl memiliki nilai tertinggi dari persentase rata-rata (85.44%) pada DNA content genotipe mangga. rata-rata menghasilkan DNA berkisar antara 5,05 ug / uL to11.28 ug / uL. DNA cocok untuk analisis PCR dan RAPD dan penyimpanan jangka panjang untuk digunakan lebih lanjut. Menurut Wane (2011) penggunaan kemikalia seperti garam dan fenol memiliki tujuan dan fungsi yang berbeda pada isolasi DNA. Pemberian garam (NaCl) bertujuan untuk presipitasi alkohol, dan deterjen Sodium Dodesil Sulfat (SDS) untuk merusak membran sel, mendenaturasi protein, menghambat aktivitas nuklease. Pemberian fenol untuk pendenaturasi protein sedangkan rasio pemberian fenol dan kloroform (1:1) yang berfungsi deproteinasi supaya lebih efektif. Pemberian isoamil alkohol saat memisahkan natan dengan supernatan lebih kepada membantu penisahan fase, menurunkan jumlah material yang ikut

terkontaminan dalam fase cair dan interfase serta membantu menurunkan busa. Fungsi tenderizer (pengempuk daging hewan) dalam isolasi buah atau bagian lain dari tumbuhan juga memiliki fungsi yang sama untuk mengempukkan buah sehingga lebih mudah didapatkan ekstrak buahnya. Kelompok menggunakan buah papaya sebagai sumber DNA untuk

diisolasi. Langkah pertama yaitu potongan buah naga dimasukkan kedalam plastik dan diremas-remas, ditambahkan akuades agar hancur lebih mudah kemudian ditambahkan l dan 15 sendok NaCl dan ditambahkan deterjen, disaring dan ditambah tenderizer, kemudian dari penyaringan tadi ditambahkan alkohol 96% kemudian, diambil 2 ml untuk dimasukkan kedalam tabung eppendorf. Hasilnya tidak terlihat adanya kabut putih yang kemudian dimasukkan kedalam tabung eppendorf. Kelompok 1, 2, 4 dan 5 terlihat adanya kabut setelah diisolasi. Kabut diduga mengandung DNA setelah dielektroforesis. Menurut Cespedes et al (2009) dalam melakukan isolasi dengan bahan buah, buah harus dipisahkan antara daging buah dan bijinya; dagingnya dihancurkan dan diekstraksi dengan menggunakan etanol (dengan penambahan 0,1% HCl). Ekstrak tadi membentuk EtOH yang akan terpisah menjadi aseton dan etil-asetat. Penggunaan etanol biasanya dilakukan pada isolasi buah yang mengandung antioksidan. Antioksidan dalam konsentrasi rendah akan mudah teroksidasi oleh senyawa ROS maupun fenol. Jadi, fungsi fenol ialah dapat memutus urutan reaksi metabolisme dan fenol sendiri merupakan senyawa aktif yang berada di alam (Wahyuni, 2009). Isolasi DNA juga dapat diaplikasikan pada DNA tanaman. Analisis genetik pada tanaman membutuhkan DNA sampel yang benar-benar murni. Isolasi DNA pada tanaman berkayu lebih sulit dilakukan karena tanaman berkayu mengandung polisakarida, tanin, alkaloid, polifenol, dan metabolit lain yang dapat menghambat isolasi DNA. Pada tahapan presipitasi, etanol dapat menggumpal dengan polisakarida, dan hal ini dapat mempersulit pemurnian DNA tumbuhan berkayu itu sendiri (Sahasrabudhe, 2010).

IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan 1. Isolasi DNA kromosom prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Buah yang memiliki kadar air rendah menghasilkan presipitasi DNA yang lebih baik daripada buah yang kadar airnya tinggi. Bawang bombay menunjukkan kualitas DNA terbaik selanjutnya berturut-turut buah alpukat, mangga, strawberry dan buah naga. 2. Ada 5 (lima) tahapan untuk melakukan isolasi DNA, yaitu isolasi jaringan, pelisisan dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi.

B. Saran Praktikum isolasi DNA, hendaknya tidak hanya memakai preparat buahbuahan, alangkah baiknya mengisolasi DNA dari jaringan hewan.

DAFTAR REFERENSI

Calista, C.D. 2010. http://carladc.student.umm.ac.id/download-aspdf/umm_blog_article_57.pdf. Diakses pada tanggal 20 Mei 2013. Cespedes, C.L., M.V. Moralea, J.G. Avila, M.E. Hafidi, J. Alacron, O.P. Lopez. 2010. Phytochemical profile and the antioxidant activity of Chilean wild black berry fruits, Aristotelia chilensis (Mol) Stuntz (Elaeocarpaceae). Food Chemistry 119 (2010) 886895. Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology. 2nd ed. Appleton & Lange, Norwol. Fatih, Mukhlissul. 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. Jurnal Penelitian Sains & Teknologi, Vol. 10, No. 1, 2009: 61 67. Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah. Universitas Negeri Malang, Malang. Mustahib. 2012. Isolasi DNA metode Kitchen Preparation. Available on http:// biologi.blogsome.com/2012/02/11/isolasi-dna-metode-kitchenpreparation/. Diakses tanggal 20 Mei 2013. Medina, M.M. 2011. Molecular Diversity of Escherichia coli in the Human Gut: New Ecological Evidence Supporting the Role of Adherent-Invasive E. coli (AIEC) in Crohns Disease. Inflamm Bowel Dis 2009;15:872 882. Sahasrabudhe, et, al. 2010. Standardization of DNA Extraction and Optimization of RAPD-PCR Conditions in Garcinia indica. International Journal of Botani 6 (3): 293-298. Asian Network for Scientific Information Wahyuni, Dwi A. 2009. Teknik isolasi genom tanaman pepaya dan jeruk dengan menggunakan modifikasi buher CTAB. Wane. 2011. Pengertian DNA dan Isolasi DNA kromosom, Isolasi DNA plasmid, Isolasi RNA Available on http://wanenoor.blogspot.com/2011/06/ pengertian-dna-dan-isolasi-dna-kromosom.html. Diakses tanggal 20 Mei 2013. Zubaidah, Siti. 2004. Identifikasi, Variasi Genetik, Distribusi dan Upaya Eliminasi Bakteri Penyebab CVPD (Citrus Vein Phloem). Program Pasca Sarjana Universitas Brawijaya, Malang.