Prinsip Dasar Uji Widal

:
Uji aglutinasi Antigen adalah suspensi kuman Salmonella (tidak larut) yang direaksikan dengan antibodi spesifik terhadap kuman tersebut yang ada di dalam serum penderita.

1

Cara mempersiapkan Antigen
Identifikasi kuman:

Identifikasi morfologi kuman: media SS (Salmonella Shigella agar): halus, opaque, transparan dan tidak berwarna.
Pengecatan Gram: batang Gram negatif.

2

Uji Biokimia pada media: TSI (Triple Sugar Iron), LIM (Lysine Indole Moltility) dan SC (Simmons Citrate), inkubasi suhu 37C; 18-24 jam. Uji serologis: antisera O dan H (S. typhi), antisera H (S. paratyphi A dan B)
3

TSI Spesies Slant Butt Gas H2S S. typhi S. Paratyphi A S. Paratyphi B SC L I M Alk Alk Alk Acid Acid Acid + + + + - + + - + + + 4 .

Antigen H (Bailey/Scott) Pilih strain kuman Salmonella yang motil. inkubasi pada suhu ruangan 24-48 jam. letakkan pada lemari es 48 jam. Motilitas: dikultur pada agar 0. 5 .3-0.4%.3%. Tambahkan formalin (40% formaldehyde) konsentrasi menjadi 0. Inokulasi pada infusion broth atau trypticase soy broth. dan halus.

Biarkan stabil dalam lemari es 2 minggu sebelum digunakan.8–7) yang berisi 0.3% formalin hingga kepadatan sel setara dengan standar 3 Mc Farland.Encerkan suspensi stok dengan larutan bufer fosfat (pH 6. 6 .

Kerok dengan ose. masukkan pada TSB atau TPB. inkubasi 37C. 7 .3%. letakkan dalam lemari es 3-4 hari. aduk. 24 jam. inkubasi 37C. Simpan dalam lemari es. sentrifus dan cuci dengan salin hingga jernih. Encerkan dengan bufer fosfat hingga 3 Mc Farland. 24 jam.Antigen H (Mikrobiologi PK) Pilih strain kuman Salmonella yang motil. Inokulasi pada agar Mueller Hinton. Tambahkan formalin (40% formaldehyde) hingga konsentrasi menjadi 0. dan halus.

Antigen O (Bailey/Scott) Tanamkan koloni kuman yang halus dari agar pada botol Roux yang mengandung 2% kaldu atau pada trypticase soy agar. Inkubasikan suhu 36C. 18-24 jam. 8 . Panen kuman dan letakkan pada botol sentifus dengan sejumlah salin.

8-7 yang berisi 0. buang supernatan. letakkan pada suhu kamar. cuci 2 kali dengan salin 0.85%. Encerkan dengan salin hingga kepadatan sel setara dengan standar 3 Mc Farland. Kocok 30 menit.3% formalin. dalam gelap selama 48 jam. Sentrifus.Tambahkan 95% alkohol dengan rasio 4:1 (Alkohol:suspensi kuman). Resuspensi dengan bufer fosfat pH 6. 9 .

Kocok 30 menit. Panen kuman dan letakkan pada botol sentifus dengan sejumlah salin.Antigen O (Mikrobiologi PK) Tanamkan koloni kuman yang halus pada Mueller Hinton agar. letakkan dalam lemari es 3-4 hari. Tambahkan 95% alkohol dengan rasio 4:1 (Alkohol:suspensi kuman). 10 . 18-24 jam. Inkubasikan suhu 37C.

85%. buang supernatan. Resuspensi dengan bufer fosfat pH 6. 11 .3% formalin. cuci 2 kali dengan salin 0.8-7 yang berisi 0.Sentrifus. Encerkan dengan salin hingga kepadatan sel setara dengan standar 3 Mc Farland. Simpan dalam lemari es.

Tes Tabung 12 . Tes slide 2.Cara Uji Widal Ada dua cara: 1.

campur dengan gelas pengaduk. Uji titrasi: Serum penderita diencerkan serial 13 . suhu kamar. aglutinasi dilihat dengan bantuan lampu neon atau cahaya matahari dekat jendela kaca. gerakkan gelas objek dengan gerakan memutar perlahan 5 menit.Tes Slide Uji penyaring: Pada gelas objek: 2 tts serum penderita + 2 tts suspensi antigen.

Contoh pengenceran serial (dari kit reagensia lokal) Perbandingan Titer 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 Serum (l) Pengencer serum (l) 10 7 5 4 3 30 34 35 36 38 Antigen (l) 40 40 40 40 40 14 .

4. Rak kecil berlubang 24 dan tabung venoject 3 ml. Pipet serologi 1 ml dengan skala 0. 3. 15 . Inkubator.01 ml. 2. Mikropipet 50μL.Tes Tabung Bahan : Serum penderita Alat : 1.

Reagen : Antigen Widal O = antigen Salmonella typhi (somatik) H = antigen Salmonella typhi (flagelar) A = antigen Salmonella paratyphi A (flagelar) B = antigen Salmonella paratyphi B (flagelar) 16 .

Cara kerja Lakukan pengenceran serum (lihat diagram berikut) Tambahkan antigen 0.25 ml pada tiap tabung Campur dengan cara menggoyang rak 34x Inkubasi pada suhu 37C selama 24 jam Lihat adanya aglutinasi pada dasar tabung dengan bantuan cermin (Widal reader) 17 .

mudah pecah aglutinin O : agregat granuler dan halus 18 .Cara membaca aglutinasi • Pola sedimen di dasar tabung. • Negatif: sedimen bulat. lihat diatas cermin cekung. goyangkan tabung: aglutinin H : agregat flokuler. • Positif: sedimen melebar ke tepi dengan pola ireguler. • Setelah dilihat. tepi halus.

25 ml H  0.25 ml (2x pengenceran) 19 . +100μl serum  1 ml  1 ml  1 ml  1 ml  1 ml  1 ml B  -100μl PZ  2ml PZ  1ml PZ  1ml PZ  1ml PZ  1ml PZ  1ml PZ Buang A  0.25 ml O  0.25 ml 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 Diagram cara pengenceran sebelum diencerkan dengan penambahan antigen 0.

Kontrol Kontrol Positif • Uji Widal dilakukan terhadap serum yang mengandung aglutinin dengan titer >1:160 • Dalam 1 rak. A dan B) 20 . H.25 ml PZ dan 0. dikerjakan bersama beberapa rak yang berisi serum penderita • Kontrol Negatif • 4 tabung berisi 0.25 ml antigen (O.

21 .Interpretasi Kriteria diagnostik untuk demam tifoid: bila titer dari aglutinin O saja atau dan H  2 kali batas atas titer normalnya. Aglutinin O: 1:80 Aglutinin H: 1:40 Aglutinin A: 1:40 Aglutinin B: 1:80 atau bila dalam jangka waktu 5-7 hari terjadi kenaikan titer aglutinin sebesar 4 kali.

H lebih tinggi dari batas normal di laboratorium kami. 22 . Titer >1:160  hasil titer O. paratifoid tidak dapat disingkirkan.Laboratorium Mikrobiologi Patologi Klinik Cut off: anak-anak (1-13 th) : 1:80 dewasa : 1:160 Contoh cara penulisan: Titer 1:160  kemungkinan demam tifoid.

Hasil Negatif Tidak ada infeksi S. typhi Dalam status carrier Antigen bakteri belum adekuat merangsang pembentukan antibodi Kesulitan teknis atau kesalahan dalam melakukan uji Widal Pengobatan dengan antibiotika sebelumnya Variasi dalam persiapan antigen 23 .

Hasil Positif Menderita demam tifoid Imunisasi dengan antigen Salmonella Reaksi silang dengan Salmonella nontifoid Variasi dan standarisasi yang kurang. seperti dengue 24 . dalam persiapan antigen Infeksi dengan malaria atau enterobacter lain Penyakit lain.

Kelemahan Uji Widal Antigen: strain bukan dari daerah yang bersangkutan. Kadar aglutinin terlalu tinggi: fenomena prozone  negatif semu Cara pembacaan: subjektif Aglutinat tidak berwarna: menyulitkan pembacaan 25 . kekeruhan suspensi yang kurang standarisasi.

26 .

ferri sitrat 1g. ditambah air suling sampai 1 liter. natrium sitrat 10g. • Buatan OXOID: Lab-Lemco 5g.3. garam empedu 8. brilliant green 0. Pepton 5g. Laktose 5g. natrium tiosulfat 8.5g. neutral red 0.025g.Salmonella-Shigella (SS) agar • Media agar selektif untuk subkultur kuman Salmonella dan Shigella. agar 12g. pH media 7. 27 .000333g.5g.

28 . glukosa dan sukrosa dengan pembentukan asam dan gas.Media Triple Sugar Iron (TSI) • Untuk identifikasi kuman patogen enterik Gram negatif berdasarkan kemampuan kuman: – meragi laktosa. – memproduksi hidrogen sulfida.

29 .Media Lysine Indole Motility (LIM) • Media untuk reaksi biokimia. untuk melihat: – Dekarboksilasi lysine – Motilitas kuman – Melakukan tes Indol dengan reagen Kovac Reagen Kovac diteteskan pada media LIM setelah inkubasi 24 jam.

Media Simmons Citrate (SC) • Menentukan karakteristik Enterobacteriaceae dengan cara mendeteksi pemakaian sitrat. 30 .

4 300g 17.5g 1. infusion from • Peptone • Starch • Agar pH = 7.Mueller Hinton agar • Beef.5g 17g Untuk Tes Kepekaan Antibiotika 31 .

10 detik.Pewarnaan Gram (Bailey/Scott) • Hapusan kuman difiksasi di atas api • Banjiri gelas objek dengan cat kristal violet. keringkan diantara dua kertas bersih. • Cuci dengan air mengalir. • Cuci dengan air. 32 . • Hilangkan warna dengan larutan alkohol-aseton 10-20 detik. • Buang cat. • Banjiri dengan larutan iodine 10 detik. • Counterstain dengan safranin 10 detik. bersihkan dengan larutan iodine.

7 9.7 0.5 0.2 0.4 9.5 9.1 9 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 .8 0.4 0.6 0.1 0.Standar Nefelometer Mc Farland No tab Barium Klorida (ml) Asam sulfur (ml) Densitas (x108 /ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0.8 9.2 9.3 9.9 1 9.6 9.9 9.3 0.