PETUNJUK PRAKTIKUM

PETUNJUK PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI DASAR

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO 2008

KATA PENGANTAR
Buku/Diktat petunjuk praktikum Mikrobiologi ini disusun dengan maksud dan tujuan membantu mahasiswa dalam melaksanakan praktikum Mikrobiologi Dasar. Keahlian dan keterampilan kerja di laboratorium sangat membantu dalam memahami teori yang telah diperoleh di kuliah sehingga dapat tercipta korelasi yang saling membangun antara teori dengan kenyataan. Diktat praktikum ini disusun rinci dan sistematis, dilengkapi dengan gambar sehingga memudahkan praktikan memahami dan mempersiapkan diri sebelum melakukan kegiatan praktikum. Materi yang disajikan dalam diktat ini mencakup teknik dasar yang lazim dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi pada umumnya. Harapan kami, buku ini dapat bermanfaat bagi praktikan mikrobiologi dasar serta bagi mahasiswa yang memerlukannya. Segala kritik dan saran yang bersifat membangun tentang isi buku ini sangat dihargai demi perbaikan kualitas lebih lanjut.

Purwokerto, Februari 2008

Tim Penyusun

TATA TERTIB PRAKTIKUM
Untuk menjaga keamanan 1. Praktikan harus telah mengenakan jas lab saat memasuki laboratorium dan bekerja dengan peralatan di laboratorium untuk menghindari kontaminasi dan terkena khemikalia 2. Dilarang keras makan, merokok dan minum di laboratorium 3. Sebelum dan sesudah bekerja, meja praktikum dibersihkan dengan desinfektan 4. Praktikan berambut panjang harus mengikat rambutnya sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu kerja dan menghindari dari hal-hal yang tidak diinginkan 5. Pengambilan kultur cair atau suspensi dan khemikal harus menggunakan pipet dengan bantuan filler atau menggunakan mikropipet. 6. Dilarang membuang biakan sisa atau habis pakai dan pewarna sisa disembarang tempat. Bahan tersebut harus dibuang di tempat yang telah disediakan oleh asisten. 7. Laporkan segera jika terjadi kecelakaan seperti kebakaran, biakan tumpah ada yang menelan bahan kimia, atau biakan kepada asisten 8. Jika menggunakan jarum inokulum, ujung jarum dibakar sampai memijar sesudah dan sebelum bekerja menggunakan alat ini 9. Sebelum meninggalkan laboratorium disarankan untuk mencuci tangan dengan seksama. Untuk kelancaran praktikum 1. Praktikan diwajibkan memakai jas laboratorium sebelum memasuki laboratorium dan dilepas di luar laboratorium. 2. Praktikan wajib memakai sepatu pada saat praktikum. 3. Praktikan dilarang berbicara yang tidak perlu dan membuat gaduh 4. Memakai pakaian yang sopan pada saat praktikum (baju berkrah untuk laki-laki) 5. Praktikan yang datang terlambat lebih dari 10 menit mengganti di akhir acara. 6. Praktikan yang datang terlambat lebih dari 20 menit maka wajib inhal. 7. Kuis akan dilaksanakan pada awal acara sebelum memulai praktikum untuk mengetahui sejauh mana kompetensi yang dicapai. 8. Inhal kuis akan diadakan satu kali dan nilai yang diambil adalah nilai terbaik. 9. Bagi praktikan yang akan berpindah jadwal praktikum harus seizin koordinator praktikum mikrodas dengan menyerahkan surat pengantar paling lambat dua hari berikutnya. 10. Praktikan yang tidak hadir praktikum (absen), maka disarankan ikut inhal praktikum, di mana harus membayar untuk mengganti biaya praktikum dan tenaga asisten 11. Praktikan akan dinilai keterampilannya selama praktikum oleh asisten 12. Praktikan yang tidak mengikuti asistensi tanpa keterangan tidak mendapatkan nilai pretest, tapi jika ada izin tertulis maka dapat mengikuti pretest susulan. 13. Praktikan yang tidak mengikuti pengamatan harus mengikuti pengamatan susulan. 14. Laporan harus dibawa saat masuk pada praktikum sebagai syarat masuk. 15. Praktikan yang tidak membawa laporan karena tertinggal, tetap diizinkan mengikuti praktikum tetapi harus mengambil laporan yang tertinggal pada hari itu juga dan menyerahkkannya ke asisten. 16. Aturan-aturan / tata tertib yang belum tercantum akan diputuskan kemudian.

.......... 9.. 8............ 6............ 7.......................................... 2................. Daya Oligodinamik dan Antimikroba .............................................................. 5...................................................................................DAFTAR ISI Halaman KATA PENGANTAR .................................................................. TATA TERTIB PRAKTIKUM ............................................................................ Isolasi Mikroorganisme .... Menentukan Jumlah dan Ukuran Mikroorganisme ............................ Morfologi Mikroorganisme ............................................... ........................................................... 4......... Pengaruh Faktor Lingkungan Terhadap Pertumbuhan Mikroorganisme ................... Pengenalan Alat ...................................... Sterilisasi ................................................................................... DAFTAR ISI ....................................... 1............................................................................ Pembuatan Media ......... 3................................................................ Aktivitas Enzimatik Mikroorganisme .

PENGENALAN ALAT Kompetensi : mahasiswa mengenal dan mengetahui fungsi dari tiap-tiap alat Berikut daftar alat-alat mikrobiologi yang perlu dikenal: Alat-alat elektrik  Mikroskop cahaya  Mikroskop stereo  Autoklaf elektrik  Incubator  Hot plate & stirrer  Colony counter  Biological Safety Cabinet (BSC)  Mikropipet Alat-alat gelas dan keramik  Cawan Petri  Pipet ukur  Pipet tetes  Tabung reaksi  Labu Erlenmeyer  Glass beads  Mortar & pestle  Beaker glass  Buncen burner  Gelas ukur  Batang L / Drugalsky  Tabung durham Alat-alat non gelas  Jarum inokulum / ose  Pinset  Rubber bulb  pH meter universal .

1 mm. Vertical feed knob (sekrup pengatur vertikal) Untuk menaikkan atau menurunkan object glass 14. Brightness adjustment knob (pengatur kekuatan lampu) Untuk memperbesar dan memperkecil cahaya lampu 8. Interpupillar distance adjustment knob (pengatur jarak interpupillar) 11. Eyepiece / oculars (lensa okuler) Untuk memperbesar bayangan yang dibentuk lensa objektif 2. Objective lense (lensa objektif) Memperbesar spesimen 7. Bagian-bagian Mikroskop: 1. Observation tube (tabung pengamatan / tabung okuler) 4. Observation tube securing knob (sekrup pengencang tabung okuler) 18. Stage (meja benda) Spesimen diletakkan di sini 5. Coarse focus knob (sekrup fokus kasar) Menaik turunkan meja benda (untuk mencari fokus) secara kasar dan cepat 16. Horizontal feed knob (sekrup pengatur horizontal) Untuk menggeser ke kanan / kiri objek glas 15. Fine focus knob (sekrup fokus halus) Menaik turunkan meja benda secara halus dan lambat 17. Main switch (tombol on-off) 9. Condenser adjustment knob (sekrup pengatur kondenser) Untuk menaik-turunkan kondenser . Revolving nosepiece (pemutar lensa objektif) Untuk memutar objektif sehingga mengubah perbesaran 3. Specimen holder (penjepit spesimen) 12. Diopter adjustmet ring (cincin pengatur diopter) Untuk menyamakan focus antara mata kanan dan kiri 10. Condenser (condenser) Untuk mengumpulkan cahaya supaya tertuju ke lensa objektif 6. Dengan mikroskop kita dapat mengamati sel bakteri yang tidak dapat dilihat dengan mata telanjang. berikut merupakan uraian tentang cara penggunaan bagian-bagiandan spesifikasi mikroskop cahaya merk Olympus CH20 yang dimiliki Laboratorium Mikrobiologi. Mikroskop Cahaya (Brightfield Microscope) Salah satu alat untuk melihat sel mikroorganisme adalah mikroskop cahaya. Pada umumnya mata tidak mampu membedakan benda dengan diameter lebih kecil dari 0. Illuminator (sumber cahaya) 13.

maka meja benda tidak perlu diturunkan dan tidak perlu khawatir bahwa lensa objektif akan menggesek cover glass karena terdapat sisa jarak A yang lebih kecil antara cover glass dengan lensa objektif (lihat tabel diatas). Tambahan a. misal 40x. diturunkan dengan sekrup kasar (15) b. Menempatkan spesimen pada meja benda a. Memfokuskan a. tekan tombol on (8) b. Misal = Okuler (10x) x Objektif (40x) = 400x Penggunaan minyak imersi Semakin kecil nilai daya pisah.Prosedur Operasi 1. hal ini akan mengubah dua bayangan yang akan diterima oleh 2 mata menjadi gambar yang tunggal sehingga sangat membantu dalam mengatasi kelelahan mata b. Pengaturan condenser (5) akan memperjelas bayangan yang tampak dengan mensetting pada posisi tertinggi (cahaya penuh) Perbesaran total Ukuran specimen yang diamati dapat diperoleh dengan mengalikan perbesaran lensa okuler dengan lensa objektif.3 40x 0.Cari bagian dari objek glas yang terdapat preparat ulas (dicari dan diperkirakan memiliki gambar yang jelas) dengan memutar sekrup vertikal dan horizontal (13) dan (14) 3. Letakan objek glas diatas meja benda (4) kemudian jepit dengan (11). Biasanya dapat digunakan minyak imersi untuk meningkatkan indeks bias pada perbesaran 10 x 100 . atur kekuatan lampu dengan memutar bagian (7) 2.53 60x 0. kemudian putar sekrup halus (16) untuk mendapatkan fokusnya c. 4. Jika perlu interpupillar distance adjustment knob (10) dapat digeser. akan semakin kuat kemampuan lensa untuk memisahkan dua titikyang berdekatan pada preparat sehingga struktur benda terlihat lebih jelas. maka putar (2) pada perbesaran selanjutnya yaitu perbesaran objektif 10x. Lakukan hal yang sama jika menggunakan perbesaran yang lebih tinggi Berikut adalah tabel yang menunjukan jarak antara spesimen dengan lensa objektif jika okus telah didapatkan Perbesaran objektif Jarak A (mm) 4x 29 10x 6. dan ingin memutar objektif ke perbesaran 100x.Setelah fokus perbesaran 4 x 10 didapatkan. Putar Revolving nosepiece (2) pada perbesaran objektif 4x lalu putar sekrup kasar (15) sehingga meja benda bergerak ke atas untuk mencari fokus b. Daya pisah dapat diperkuat dengan memperbesarkan indeks bias atau menggunakan cahaya yang memiliki panjang gelombang (λ) pendek. Jika perlu diopter adjustment knob (9) dapat diatur untuk memperoleh bayangan focus yang seimbang antara mata kanan dan kiri c.29 Catatan: Setelah mendapatkkan fokus pada perbesaran tetentu. Jika meja benda belum turun. Menyalakan lampu a.

9 x 10 x 1x 2x 4x total 6. 1.7 x 9x 10 x 20 x 40 x . jepit jika perlu 2.a. Zoom control knob (sekrup pengatur pembesaran) 4. Di Laboratorium Mikrobiologi. Stage plate (pelat tempat specimen diletakkan) 6. Diopter adjustment ring (cincin pengatur diopter) 3.67 x 0. putar Zoom Control Knob (3) ke perbesaran yang lebih tinggi kemudian dicari fokusnya Mikroskop ini memiliki pilihan perbesaran: Okuler Objektif 0. Berikut merupakan uraian tentang mikroskop stereo yang dimiliki Laboratorium Mikrobiologi yaitu Zoom Stereo Microscope. Focusing knob (sekrup pengatur fokus) 5. Jika telah selesai menggunakan mikroskop. Letakkan spesimen / preparat di stage plate (5). Jika ingin mendapatkan bayangan yang lebih besar. mikroskop stereo biasanya digunakan untuk mengamati secara detail bentuk koloni dan jamur. Jika fokus pada perbesaran 10 x 40 telah didapatkan maka putar ke perbesaran objektif 100x b. bersihkan lensa objektif 100x dengan kertas lensa yang dibasahi xylol 1  2 1 2 Mikroskop stereo (Zoom Stereo Microscope) Mikroskop ini berfungsi untuk melihat objek yang membutuhkan perbesaran tidak terlalu besar. Olimpus SZ3060. tetesi minyak imersi 1 – 2 tetes dari sisi lensa c. Stage clip (penjepit spesimen / preparat) Prosedur operasi 1. Oculars eyepiece (lensa okuler) 2. Atur perbesaran pada perbesaran terkecil dengan memutar Zoom Control Knob (3) kemudian dicari fokusnya dengan memutar Focusing Knob (4) 3.

maka tutup harus dikendorkan. Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang keluar dari bibir autoklaf. diatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu 121oC. Klep pengaman jangan dikencangkan terlebih dahulu. Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan keluarkan isi autoklaf dengan hati-hati. Aquades (dH2O) 9. untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat. Katup pengeluaran uap 3. 3. Tombol on-off 6. 6. Kisaran suhu untuk inkubator produksi Heraeus B5042 misalnya adalah 10-70oC. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. 4. Masukkan peralatan dan bahan. batas penambahan air Autoclave adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan. Penghitungan waktu 15’ dimulai sejak tekanan mencapai 2 atm. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu 121oC (250oF). 2. Lempeng sumber panas 8. . maka tunggu tekanan dalam kompartemen turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure gauge menunjuk ke angka nol). Tunggu samapai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf dan terdesak keluar dari klep pengaman. maka dapat ditambah air sampai batas tersebut. kelep pengaman 5. Kemudian klep pengaman ditutup (dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. pengukur tekanan 4. Jika alarm tanda selesai berbunyi. Jika mensterilisasi botol beretutup ulir.. Jika air kurang dari batas yang ditentukan. Gunakan air hasil destilasi. Autoklaf (Autoclave) Diagram autoklaf vertical 1. Nyalakan autoklaf. Cara Penggunaan : 1. 5.  Inkubator (Incubator) Inkubator adalah alat untuk menginkubasi atau memeram mikroba pada suhu yang terkontrol. Lama sterilisasi yang dilakukan biasanya 15 menit untuk 121oC. Alat ini dilengkapi dengan pengatur suhu dan pengatur waktu. Termometer 7. Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi2 (15 Psi = 15 pounds per square inch). Sekrup pengaman 10. Tombol pengatur waktu mundur (timer) 2.

Usap permukaan interior BSC dengan alkohol 70 % atau desinfektan yang cocok dan biarkan menguap 7. jangan terlalu penuh (overload) karena memperbesar resiko kontaminan 8.  Colony counter Alat ini berguna untuk mempermudah perhitungan koloni yang tumbuh setelah diinkubasi di dalam cawankarena adanya kaca pembesar. Cuci tangan dan lengan dengan sabun gemisidal / alkohol 70 % 6. Selain itu alat tersebut dilengkapi dengan skala/ kuadran yang sangat berguna untuk pengamatan pertumbuhan koloni sangat banyak. Jumlah koloni pada cawan Petri dapat ditandai dan dihitung otomatis yang dapat di-reset. Purifier™ Biological Safety Cabinet dari LABCONCO yang dimiliki laboratorium mikrobiologi adalah sebagai berikut: 1. Kerja secara aseptis dan jangan sampai pola aliran udara terganggu oleh aktivitas kerja 11. Hidupkan lampu UV selama 2 jam. selanjutnya matikan segera sebelum mulai bekerja 2. dengan kecepatan sangat lambat sampai 1600 rpm dan dapat dipanaskan sampai 425oC. Jangan menggunakan pembakar Bunsen dengan bahan bakar alkohol tapi gunakan yang berbahan bakar gas. Nyalakan lampu neon dan blower 4. masukkan alat dan bahan yang akan dikerjakan. 10. Pengadukan dengan bantuan batang magnet Hot plate dan magnetic stirrer seri SBS-100 dari SBS® misalnya mampu menghomogenkan sampai 10 L. Pastikan kaca penutup terkunci dan pada posisi terendah 3. Prosedur penggunaan BSC seri 36212.  Biological Safety Cabinet Biological Safety Cabinet (BSC) atau dapat juga disebut Laminar Air Flow (LAF) adalah alat yang berguna untuk bekerja secara aseptis karena BSC mempunyai pola pengaturan dan penyaring aliran udara sehingga menjadi steril dan aplikasisinar UV beberapa jam sebelum digunakan. setelah selesai bekerja. Hot plate stirrer dan Stirre bar Hot plate stirrer dan Stirrer bar (magnetic stirrer) berfungsi untuk menghomogenkan suatu larutan dengan pengadukan. Pelat (plate) yang terdapat dalam alat ini dapat dipanaskan sehingga mampu mempercepat proses homogenisasi. Biarkan selama 5 menit 5. biarkan 2-3 menit supaya kontaminan tidak keluar dari BSC . Atur alat dan bahan yang telah dimasukan ke BSC sedemikian rupa sehingga efektif dalam bekerja dan tercipta areal yang benar-benar steril 9.

Medium dapat dituang ke cawan bagian bawah dan cawan bagian atas sebagai penutup. mukropipet memerlukan tip. . Masukkan Tip bersih ke dalam Nozzle / ujung mikropipet. 7. Jika ingin melepas tip putar Thumb Knob searah jarum jam dan ditekan maka tip akan terdorong keluar dengan sendirinya. 4. 6. 3. biasanya kurang dari 1000 µl. diameter cawan yang biasa berdiameter 15 cm dapat menampung media sebanyak 15-20 ml.12. Pindahkan ujung tip ke tempat penampung yang diinginkan. Tahan pipet dalam posisi vertikal kemudian lepaskan tekanan dari Thumb Knob maka cairan akan masuk ke tip. 8. sedangkan cawan berdiameter 9 cm kira-kira cukup diisi media sebanyak 10 ml. hanya tersedia satu pilihan volume (fixed volume pipette) misalnya mikropipet 5 µl. 2. atau menggunakan alat tambahan yang berfungsi mendorong tip keluar. Tekan Thumb Knob sampai hambatan pertama / first stop. Mikropipet tip Cara Penggunaan : 1. Tekan Thumb Knob sampai hambatan kedua / second stop atau tekan semaksimal mungkin maka semua cairan akan keluar dari ujung tip. Usap permukaan interior BSC dengan alkohol 70 % dan biarkan menguap lalu tangan dibasuh dengan desinfektan 13. Cawan petri tersedia dalam berbagai macam ukuran. Masukkan tip ke dalam cairan sedalam 3-4 mm. Sebelum digunakan Thumb Knob sebaiknya ditekan berkali-kali untuk memastikan lancarnya mikropipet. atau mikropipet yang tidak bisa diatur volumenya. Matikan lampu neon dan blower  Mikropipet (Micropippete) dan Tip Mikropipet adalah alat untuk memindahkan cairan yang bervolume cukup kecil. jangan ditekan lebih ke dalam lagi. 5. dalam penggunaannya.  Cawan Petri (Petri Dish) Cawan petri berfungsi untuk membiakkan (kultivasi) mikroorganisme. misalnya mikropipet yang dapat diatur volume pengambilannya (adjustable volume pipette) antara 1µl sampai 20 µl. Banyak pilihan kapasitas dalam mikropipet.

tutup plastik atau aluminium foil. bahan atau cairan yang. kultivasi mikroba dalam kultur cair. dll. namun volume yang dipindahkan tidak diketahui. Terdapat beberapa pilihan berdasarkan volume cairan yang dapat ditampungnya yaitu 25 ml. Cara penggunaanya adalah cairan disedot dengan pipet ukur dengan bantuan filler sampai dengan volume yang diingini. menampung akuades.Tabung reaksi dapat diisi media padat maupun cair. . Volume yang dipindahkan dikeluarkan menikuti skala yang tersedia (dilihat bahwa skala harus tepat sejajar dengan mensikus cekung cairan) dengan cara menyamakan tekanan filler dengan udara sekitar. diantaranya pipet berukuran 1 ml. Pipet Ukur (Measuring Pippete) Pipet ukur merupakan alat untuk memindahkan larutan dengan volume yang diketahui. yaitu media agar tegak (deep tube agar) dan agar miring (slants agar). Labu Erlenmeyer dapat digunakan untuk meracik dan menghomogenkan bahan-bahan komposisi media. 50 ml. perlu diperhatikan tentang kemiringan media yaitu luas permukaan yang kontak dengan udara tidak terlalu sempit atau tidak terlalu lebar dan hindari jarak media yang terlalu dekat dengan mulut tabung karena memperbesar resiko kontaminasi. media yang ditambahkan berkisar 10-12 ml tiap tabung.  Pipet tetes (Pasteur Pippete) Fungsinya sama dengan pipet ukur.  Tabung reaksi (Reaction Tube / Test Tube) Di dalam mikrobiologi. penambahan reagen ada uji biokimia. tutup metal. Tersedia berbagai macam ukuran kapasitas pipet ukur. Untuk alas an efisiensi. Salah satu penerapannya adalah dalam menambahkan HCl / NaOH saat mengatur pH media. 5 ml dan 10 ml.  Labu Erlenmeyer (Erlenmeyer Flask) Berfungsi untuk menampung larutan. dsb. 250 ml. 300 ml. tabung reaksi digunakan untuk uji-uji biokimiawi dan menumbuhkan mikroba. 1000 ml. dll. Untuk membuat agar miring. Tutup tabung reaksi dapat berupa kapas. 500 ml. Media padat yang dimasukkan ke tabung reaksi dapat diatur menjadi 2 bentuk menurut fungsinya. 100 ml.

gelas ukur memiliki beberapa pilihan berdasarkan skala volumenya. misal daging.  Mortar dan Pestle Mortar dan penumbuk (pastle) digunakan untuk menumbuk atau menghancurkan materi cuplikan. dapat digunakan untuk preparasi media media. sebaiknya volume tersebut ditentukan berdasarkan meniskus cekung larutan. menampung akuades dll. Pada saat mengukur volume larutan.  Batang L (L Rod) Batang L bermanfaat untuk menyebarkan cairan di permukaan agar supaya bakteri yang tersuspensi dalam cairan tersebut tersebar merata. Glass beads digunakan pada teknik spread plate yang fungsinya sama dengan batang L atau Spreader. Perubahan bunsen dapat menggunakan bahan bakar gas atau metanol.. Untuk sterilisasi jarum ose atau yang lain. roti atau tanah sebelum diproses lebih lanjut. Gelas ukur (Graduated Cylinder) Berguna untuk mengukur volume suatu cairan. .  Beaker Glass Beaker glass merupakan alat yang memiliki banyak fungsi.  Pembakar Bunsen (Bunsen Burner) Salah satu alat yang berfungsi untuk menciptakan kondisi yang steril adalah pembakar bunsen.  Glass Beads Glass Beads adalah manik-manik gelas kecil yang digunakan untuk meratakan suspensi biakan dengan menyebarkan beberapa butir di atas permukaan agar dan digoyang merata. Alat ini juga disebut spreader. bagian api yang paling cocok untuk memijarkannya adalah bagian api yang berwarna biru (paling panas). seperti labu erlenmeyer. Api yang menyala dapat membuat aliran udara karena oksigen dikonsumsi dari bawah dan diharapkan kontaminan ikut terbakar dalam pola aliran udara tersebut. Di dalam mikrobiologi.

 Pinset Pinset memiliki banyak fungsi diantaranya adalah untuk mengambil benda dengan menjepit misalnya saat memindahkan cakram antibiotik. S (suction) merupakan katup yang jika ditekan maka cairan dari ujung pipet akan tersedot ke atas. Inoculating loop cocok untuk melakukan streak di permukaan agar. Tabung Durham Tabung durham berbentuk mirip dengan tabung reaksi namun ukurannya lebih kecil dan berfungsi untuk menampung/menjebak gas yang terbentuk akibat metabolisme pada bakteri yang diujikan.  Pipet Filler / Rubber Bulb Filler adalah alat untuk menyedot larutan yang dapat dipasang pada pangkal pipet ukur. Kertas pH indikator dicelupkan sampai tidak ada perubahan warna kemudian strip warna dicocokkan dengan skala warna acuan.  Jarum Inokulum Jarum inokulum berfungsi untuk memindahkan biakan untuk ditanam/ditumbuhkan ke media baru. Penempatannya terbalik dalam tabung reaksi dan harus terendam sempurna dalam media (jangan sampai ada sisa udara). Jarum inokulum biasanya terbuat dari kawat nichrome atau platinum sehingga dapat berpijar jika terkena panas. Jarum inokulum ini akan sangat bermanfaat saat membelah agar untuk preprasi Heinrich’s Slide Culture. Hal ini sangat penting dalam pembuatan media karena pH pada media berpengaruh terhadap petumbuhan mikroba. Katup yang bersimbol A (aspirate) berguna untuk mengeluarkan udara dari gelembung.  pH Indikator Universal berguna untuk mengukur/mengetahui pH suatu larutan. Bentuk ujung jarum dapat berbentuk lingkaran (loop) dan disebut ose atau inoculating loop/transfer loop. dan yang berbentuk lurus disebut inoculating needle/Transfer needle. Karet sebagai bahan filler merupakan karet yang resisten bahan kimia. Kemudian katup E (exhaust) berfungsi untuk mengeluarkan cairan dari pipet ukur. sedangkan inoculating needle cocok digunakan untuk inokulasi secara tusukan pada agar tegak (stab inoculating). Filler memiliki 3 saluran yang masing-masing saluran memiliki katup. .

O. yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. P.1 Bahan dasar b. Nutrisi atau zat makanan Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan media bagi mikroorganisme autotrof obligat. Macam-macam media pertumbuhan c. .  gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar.  Silica gel. N.MEDIA PERTUMBUHAN Kompetensi : Mahasiswa dapat membuat media pertumbuhan Nutrient Agar dan Potato Dextrose Agar Media pertumbuhan : a. protein dan asam organik. 2.3 Berdasarkan tujuan d. lemak. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya. Bahan dasar  air (H2O) sebagai pelarut  agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media.1 Berdasarkan sifat fisik c. Bahan-bahan media pertumbuhan b.3 Bahan tambahan b.4 Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media c.2 Nutrisi atau zat makanan b. Pembuatan Nutrient Agar dan Nutrient Broth e. Jasad heterotrof memerlukan sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat.  Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik atau anorganik esuai dengan sifat mikrobanya. Pembuatan Potato Dextrose Agar Pengertian dan Fungsi Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Bahan-bahan media pertumbuhan 1. Pengertian dan fungsi b. Kekurangannnya adalah lebih banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar. Mg dan unsur pelikan/trace element. unsur mikro seperti Fe. Agar sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45 o C. Fungsinya juga sebagai pemadat media.2 Berdasarkan komposisi c. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekulmolekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. H. Gelatin adalah polimer asam amino yang diproduksi dari kolagen.

terutama pada pH yang asam  Peptone. Jenis karbohidrat yang umumnya digunkan dalam amilum. dll. jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media. casein. susu. tidak begitu cair. agar tidak akan larut. limpa. Macam-Macam Media Pertumbuhan 1. fruktosa.5-1%.  Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0. Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea. Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0. Medium berdasarkan komposisi . 3. Meat extract mengandung basa organik terbuat dari otak. 2.  Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (B complex). tidak padat. granula atau bubuk dan terbuat dari beberapa jenis rumput laut. misalnya pada media Nitrate Broth. liver. pencairan dan pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan kekuatan agar. kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media.  Meat extract.. Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media  Agar. LB (Lactose Broth).  Yeast extract. Jika dicampur dengan air dingin. agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan. misalnya phenol red (indikator asam basa) ditambahkan untuk indikator perubahan pH akibat produksi asam organik hasil metabolisme.3-0. Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Yeast extract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alcohol. contohnya adalah NB (Nutrient Broth). Bahan tambahan Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan tujuan tertentu. manitol.4% sehingga menjadi sedikit kenyal. Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya. galaktosa. Medium berdasarkan sifat fisik  Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media menjadi padat. protein atau senyawa bernitrogen lain. sukrosa.  Vitamin-vitamin.  Karbohidrat. 4. Kegunaannya adalah sebagai pemadat (gelling) yang pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther Hesse untuk membuat media. Antibiotik ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba nontarget/kontaminan. plasenta dan daging sapi. darah. gelatin dan kedelai. glukosa. Sumber nitrogen mencakup asam amino. lactalbumin. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam amino dan gas dari karbohidrat. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen. Untuk melarutkannya harus diasuk dan dipanasi. peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot.

misalnya Blood Tellurite Agar.  Media selektif/penghambat Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan.. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba.. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu.  Media diferensial Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial. Salt broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam. serum. misalnya Nutrient Broth.  Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti. tetapi membutuhkan komponen kompleks.  Media diperkaya (enrichment) Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah. kuning telur.  Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka. ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni. misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk. Medium berdasarkan tujuan  Media untuk isolasi Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba. Arginine Agar. Blood Agar. Pancreatic Extract. misalnya Glucose Agar. Bile Agar. dll. yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon. misalnya Tomato Juice Agar. warna.  Media untuk karakterisasi bakteri Media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu mikroba. . Contohnya adalah Koser’s Citrate medium. Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E. Untuk bahan ekstrak kentang. Serum Agar.3.  Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti. Lactose Broth.  Media untuk peremajaan kultur Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur  Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik. Ampiciline. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak. kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya. Brain Heart Infusion Agar. dekstrosa dan ekstrak kentang. Mac Conkey Agar. misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar. Contohnya adalah Nitrate Broth.

media langsung dituang ke tabung kemudian disterilisasi. Sebaiknya air untuk melarutkan agar lebih banyak  Larutkan agar pada sebagian air tersebut dengan mengaduk secara konstan dan diberi panas. Proses pembuatan ini tidak memerlukan panas.d 1000 ml  Akuades sebanyak 100 ml dibagi menjadi dua satu bagian untuk melarutkan Beef extract dan peptone dan sebagian lagi untuk melarutkan agar.  Tuang media steril ke cawan petri steril secara aseptis. Jika diinginkan media tegak atau miring pada point ke 5. cukup dengan pengadukan. larutan dituangkan ke larutan agar dan diaduk sampai homogen.  Setelah keduanya larut. Dapat menggunakan kompor gas atau hot plate stirrer (jangan sampai overheat.  Sementara itu sebagian akuades digunakan untuk melarutkan peptone dan beef extract. Kemudian pH media diukur dengan mencelupkan kertas pH indikator. Jika pH tidak netral maka dapat ditambahkan HCl/NaOH. peptone dan beef extract akan mudah larut sempurna pada air suhu kamar jika diaduk Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA)  Timbang komponen media dengan menggunakan timbangan analitis untuk volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut:  Potato/kentang 3g  Peptone 5g  Agar 15 g  Akuades s.Pembuatan Nutrient Agar dan Nutrient Broth  Pembuatan Nutrient Agar  Timbang komponen medium dengan menggunakan timbangan analitis untuk volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut:  Beef extract 3g  Peptone 5g  Agar 15 g  Akuades s.d 1000 ml .  Pembuatan Nutrient Broth Komposisi untuk media NB sama dengan NA tetapi tidak memakai agar sebagai pemadat. Proses pembuatannyapun lebih sederhana. karena akan terbentuk busa dan memuai sehingga tumpah). tinggal melarutkan peptone dan beef extract kemudian ditampung dalam labu Erlenmeyer atau tabung reaksi dan siap disterilisasi.  Setelah itu media dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan disterilisasi dengan autoklaf.

Agar dilarutkan dengan Hot Plate Stirrer dalam 50 ml akuades lalu setelah larut dapat ditambahkan dekstrosa dan dihomogenkan lagi. Setelah semua larut. sebaiknya kentang dikupas dan diiris kecil-kecil)  Rebus kentang dalam sebagian akuades tadi selama 1-3 jam sampai lunak.  (sebelum ditimbang. kemudian diambil ekstraknya dengan menyaring dan memerasnya menggunakan kertas saring lalu ditampung di Beaker glass baru. ekstrak kentang dan agar-dekstrosa dicampur dan dihomogenkan. Atur pH media menjadi 5-6 dengan meneteskan HCl/NaOH. Media dituang ke dalam Erlenmeyer atau ke tabung reaksi kemudian siap untuk disterilisasi.   .

tyndalisasi mahasiswa dapat melakukan kerja aseptis Sterilisasi : 1. Pipetting 4. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) b. Pengertian sterilisasi 2. Tyndalisasi 7. Sterilisasi dengan udara panas 8. Menuang media d. Sterilisasi dengan cara penyaringan 6. filtrasi.Uap air panas .Panas kering . Sterilisasi secara fisik  Pemanasan . Mensterilkan meja kerja b. Memindahkan biakan (streak) c. Prosedur/Teknik aseptis a. Prinsip cara kerja autoklaf 5. Macam-macam sterilisasi a.Uap air panas bertekanan  Penyinaran UV c.Dengan api langsung . Prinsip kerja Biological Safety Cabinet . Sterilisasi secara kimia  dengan larutan disinfektan 3.STERILISASI Kompetensi : mahasiswa mengetahui sterilisasi dengan autoklaf.

Sterilisai secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0. c. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas. pinset. b. misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV 3. Uap air panas bertekanan : menggunalkan autoklaf  Penyinaran dengan UV Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi. Sterilisaisi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol. batang L.45 mikrob) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. d. Bahan yang mengandung air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi. misal nya larutan enzim dan antibiotik. .22mikron atau 0. Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer. dll. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran.Pengertian Sterilisasi yaitu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda dari semua bentuk kehidupan.  Pemanasan a. 2. 1. Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. tabung reaksi dll. fisik dan kimiawi. Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-1800C. Macam-macam sterilisasi Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik. contoh alat : jarum inokulum.

Berbagai prosedur umum kerja dalam mikrobiologi yang membutuhkan teknik aseptis Desinfeksi meja kerja .

Jika kerja di Safety Cabinet tidak perlu memakai pembakar bunsen tetapi jika di luar Safety Cabinet maka semakin banyak sumber api maka semakin terjamin kondisi aseptisnya Prinsip cara kerja autoklaf Seperti yang telah dijelaskan sebagian pada bab pengenalan alat.4 Kpa) selama 15 menit. 3. Usahakan bagian alat yang diharapkan dalam kondisi steril didekatkan ke bagian api. Ujung jarum inokulum yang sudah dipijarkan harus ditunggu dingin dahulu atau dapat ditempelkan tutup cawan bagian dalam untuk mempercepat transfer panas yang terjadi.8 0F adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. Sebelum membuka ruangan atau bagian steril di dalam tabung/cawan/erlenmeyer sebaiknya bagian mulut (bagian yang memungkinkan kontaminan masuk) dibakar/dilewatkan api terlebih dahulu. Biasanya untuk mesterilkan media digunakan suhu 1210C dan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103.Saran-saran kerja aseptis : 1. Alasan digunakan suhu 1210C atau 249. 4. 2. Pinset. Untuk cara kerja penggunaan autoklaf telah disampaikan di depan. dll dapat disemprot dengan alkohol terlebih dahulu lalu dibakar. batang L. Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut . autoklaf adalah alat untuk memsterilkan berbagai macam alat & bahan yang menggunakan tekanan 15 psi (2 atm) dan suhu 1210C. 5.

Misalnya autoklaf diletakkan pada ketinggian 2700 kaki dpl. Setelah semua udara dalam autoklaf diganti dengan uap air.(sea level) air mendidih pada suhu 1000C. maka tekanan dinaikkan menjadi 20 psi supaya tercapai suhu 1210C untuk mendidihkan air. menggunakan tekanan 15 psi maka air akan memdididh pada suhu 1210C. seperti SDS Untuk mencegah terjadinya presipitasi.5 jangan disterilkan dengan autoklaf  Jangan mensterilisasi larutan agar dengan pH < 6. pencoklatan (media menjadi coklat) dan hancurnya substrat dapat dilakukan pencegahan sbb :  Glukosa disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa fosfat  Senyawa fosfat disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa garam mineral lain. sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi. vitamin.. Cairan yang disterilisasi dilewatkan ke suatu saringan (ditekan dengan gaya sentrifugasi atau pompa vakum) yang berpori dengan diameter yang cukup kecil untuk menyaring bakteri. sisa ruang dibirkan kosong. Virus tidak akan tersaring dengan metode ini. Ingat kejadian ini hanya berlaku untuk sea level.0 Erlenmeyer hanya boleh diisi media maksimum ¾ dari total volumenya. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai. Jika mensterilkan media 1L yang ditampung pada erlenmeyer 2L maka sterilisasi diatur dengan waktu 30 menit. air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 1210C dan tekanan 15 psi selama 15 menit. Pada saat sumber panas dinyalakan. jika dilaboratorium terletak pada ketinggian tertentu.  Senyawa garam mineral disterilkan terpisah dengan agar  Media yang memiliki pH > 7. Setelah proses sterilisai lalu ditumbuhkan pada media. Beberapa media atau bahan yang tidak disterilkan dengan autoklaf adalah :  Bahan tidak tahan panas seperti serum. lazimnya mikroba ini tersedia secara komersial dalam bentuk spore strip. Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan sempurna dapat digunakan mikroba pengguji yang bersifat termofilik dan memiliki endospora yaitu Bacillus stearothermophillus. Kertas spore strip ini dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan. maka pengaturan tekanan perlu disetting ulang. seperti fenol  Buffer engan kandungan detergen. katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik. . dan enzim  Paelarut organik. Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi. maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur. antibiotik. sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di ketinggian sama. Jika media tetap bening maka menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan baik. Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi) Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk mensterilisasi cairan yagn mudah rusak jika terkena panas atu mudah menguap (volatile). Setelah proses sterilisasi selesai.

lalu isi corong dengan larutan yang akan disterilkan.Volume 15-1000 ml  Disposable filtration unit dengan botol penyimpan . .Disedot dengan pompa vakum .  setelah semua larutan melewati membran filter dan tertampung dierlenmeyer. maka larutan dapat dipindahkan kedalam gelas penampung lain yang sudah steril dan tutup dengan kapas atau aluminium foil yang steril.Sterilisasi dengan penyaringan dapat dilakukan dengan berbagai cara :  Non-disposable filtration apparatus .Volume 1-20 ml  Spin filters .Volume 15-1000 ml  Syringe filters . membran penyaring (kertas saring) dan erlenmeyer penampung.Ditekan dengan gaya setrifugasi .  Pasang atau rakit alat-alat tersebut secara aseptis (sesuai gambar).Disedot dengan pompa vakum .Ditekan seperti jarum suntik .Volume 20-1000 ml  Disposable filter cup unit .Volume kurang dari 1 ml Cara kerja menggunakan Non-disposable filtration apparatus  Sterilkan saringan (dapat menggunakan saringan Bekerfeld.Disedot dengan pompa vakum . Chamberland Zeitz).  Hubungkan katup erlenmeyer dengan pompa vakum kemudian hidupkan pompa.

BSC juga disebut biosafety hood. Aliran udara diatur untuk menghambat udara luar masuk dan udara di dalam keluar. Cara kerja :  Bahan dimasukkan kedalam erlenmeyer atau botol dan ditutup rapat dengan sumbat atau aluminium foil. aliran udara keluar disaring dengan saringan HEPA Kelas II Sebagaian. untuk mencegah kontaminasi dari luar dan pencemaran bakteri dari ruang BSC. bahan tersebut di sterilkan lagi dengan cara yang sama.  Setelah 24 jam. Bahan yang mengandung air dan tidak tahan tekanan atau suhu tinggi lebih tepat disterilkan dengan metode ini. Sterilisasi dengan udara panas (Dry heat sterilization) Sterilisasi dengan metode ini biasanya digunakan untuk peralatan gelas seperti cawan petri.  Erlenmeyer/botol lalu dimasukkan kedalam alat sterilisasi (alat standar menggunakan Arnold Steam Sterilizen atau dandang). Prinsip kerja Biological Saferty Cabinet Biological Safety Cabinet merupakan kabinet kerja yang sterilkan untuk kerja mikrobiologi. BSC memiliki suatu pengatur aliran udara yang menciptakan aliran udara kotor (dimungkinkan ada kontaminan) untuk disaring dan diresirkulasi melalui filter. Misalnya susu yang disterilkan dengan suhu tinggi akan mengalami koagulasi dan bahan yang berpati disterilkan pada suhu bertekanan pada kondisi pH asam akan terhidrolisis. sedang waktu ini dimaksudkan untuk memberi kesempatan spora atau sel vegetatif yang belum mati untuk tumbuh sehingga mudah dibunuh.Tyndalisasi Konsep kerja metode ini merip dengan mengukus. dan juga dikenal dengan Laminar flow hood atau Class II vertical flow cabinet yang menyediakan alat filtrasi dan aliran udara yang bersirkulasi didalam ruang kerja. Berbagai kelas Biological Safety Cabinet.  Nyalakan sumber panas dan tunggu hingga termometer menunjukkan suhu 1000C kemudian hitung waktu mundur hingga 30 menit (uap panas yang terbentuk akan mematikan mikroba).  Setelah selesai alat sterilisasi dimatikan dan bahan yang steril dikeluarkan. Udara yang keluar disaring melewati penyaring sehingga sel-sel yang berbahaya tidak lepas keluar ke ruangan lain. aliran udara keluar disaring dengan saringan HEPA Kelas III Semua. pipet ukur dan labu erlenmyer. Alat gelas yang disterilisasi dengan udara panas tidak akan timbul kondensasi sehingga tidak ada tetes air (embun) didalam alat gelas.  Bungkus alat-alat gelas dengan kertas payung atau aluminium foil  Atur pengatur suhu oven menjadi 1800C dan alat disterilkan selama 2-3 jam. terdapat perlindungan sempurna (Gloves box) dan udara disaring dengan saringan HEPA . Perlindungan untuk praktikan/pen elitian Kelas I Sebagian.

larutan yang volatil Ada. Udara yang berasal dari luar kabinet akan langsung terserap masuk kesaluran bawah yang bergabung dengan udara dari meja kerja yang dimungkinkan mengandung bakteri yang digunakan untuk kerja. Udara dari meja kerja disedot dari depan meja kerja. . udara masuk disaring terlebih dahulu Ada. udara masuk disaring dan memiliki sirkulasi udara yang lebih sederhana Kerja dengan bahan kimia yang sangat berbahaya atau dengan mikroorganisme yang sangat patogen Cocok untuk Kerja untuk membiakkan sel atau kerja mikrobiologi BSC yang dimiliki Lab mikrobiologi merupakan BSC kelas II yang memiliki konfigurasi udara seperti gambar disamping ini. tidak ada area kerja yang steril karena uadara luar dapat masuk melewati area kerja Kerja dengan bahan kimia yang karsinigen bahan kimia beradiasi rendah.Perlindungan untuk alat dan bahan Tidak ada. Kemudian udara kotor ini disaring oleh penyaring HEPA dan disirkulasikan keluar kabinet atau kembali lagi ke meja kerja sebagai udara bersih.

botol dapat dicelupkan dengan tali. 2. Pengertian b. Sampel air Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. jika ingin mengambil sampel dari air keran maka sebelumya keran dialirkan dulu beberapa saat dan mulut kran dibakar. Prosedur isolasi jamur dari sampel Pengertian Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya. Di dalam laboratorium populasi bakteri inidapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi. Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang. Prosedur isolasi bakteri dari sampel e. Berikut merupakan prosedur pengambilan sampel. . Sampel tanah Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah. Teknik Pengambilan Sampel Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel. tetapi terdiri dari campuran berbagai macam sel. sifat dan kemampuan biokimiawinya.. Jika beerasal dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir botol melawan arus air.ISOLASI MIKROORGANISME Kompetensi: mahasiswa dapat memisahkan mikroba dari campurannya sehingga didapat kultur murni. Isolasi dengan cara pengenceran 1) Teknik preparasi suspensi  Swab  Rinse  Maserasi 2) Teknik pengenceran bertingkat 3) Teknik penanaman  Dari suspensi (spread dan pour plate)  Dengan goresan (streak dan quadrant streak inoculation) d. Teknik Pengambilan sample c. 1. Isolasi Mikroorganisme: a. Misal jika yang diinginkan mikroorganisma rhizosfer maka sampel diambil dari sekitar perakaran dekat permukaan hingga ujung perakaran. maka cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan.

batang kayu dll. Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan permukaan sampel. Rinse merupakan prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9 (w/v). c. Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil. Swab (ulas). Unutk sampel dari tanh tak perlu dimaserasi 2. buah dll. Macam-macam preparsi bergantung kepada bentuk sampel : a.Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution) 1. Teknik Pengenceran Bertingkat Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Contoh sampelnya antar alain bakso. biji. Contohnya sampel daun diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan akuades 45 ml yang terdapat dalam beaker glass. Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v). batu. Maseration (pengancuran). Penentuan besarnya atau banyaknya . misalnya daun bunga dll. Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke dalam larutan atraktan semisal pepton water. Contohnya adalah meja. dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel yang memiliki permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut. b. Teknik Preparasi Suspensi Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air.

2. Cara Kerja : a. Pour Plate (agar tuang) Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi suspensi). penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar. Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan adalah sebagai berikut :  Ambil suspensi cairan senamyak 0. sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan cairan dari sumber yang sama. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh . Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya (pengocokan yang benar dapat dilihat pada gambar disamping) b.  Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar diatas bunsen beberapa saat.tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. a. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir.  Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas.1 ml dengan pipet ukur kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat. artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet ukur steril yang berbeda/baru. 3. Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung 10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogen. Teknik penanaman dari suspensi Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya. Spread Plate (agar tabur ulas) Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni. kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa detik.  Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar supaya tetesan suspensi merata. hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan harus selalu diganti. Teknik Penanaman a.1. a. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama. Perbandingan berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 dan ingat akuades yang digunakan jika memakai teknik rinse dan swab sudah termasuk pengencer 10-1.

lalu putar cawan 180 C lanjutkan goresan sampai habis. b. Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal. Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna  Lakukan hal yang sama pada daerah 3 .2 Goresan T Cara kerja :  Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker  Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag  Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin. Adapun prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut : Siapkan cawan steril. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak) Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru. o  Jangan pijarkan loop. melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.1 Goresan Sinambung Cara kerja :  Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar. Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0. sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate.1 ml untuk spread plate dan 1 ml untuk pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja. kemudian diinkubasi. b. tabung pengenceran yang akan ditanam dan media  padat yang masih cair (>45oC) Teteskan 1 ml secara aseptis. kemudian lanjutkan streak zig-zag pada daerah 2 (streak pada gambar). b.dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen.suspensi sel kedalam cawan kosong  Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untuk  menghomogenkan suspensi bakteri dan media.

Cara Kerja Isolasi Bakteri dari Sampel Tanah :  Tanah seberat 1 g dimasukan ke dalam tabung pengenceran 10-1 secara aseptis dan selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10-8  Tiga pengenceran terakhir diambil 0. namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi empat.1 ml untuk ditanam secara spread plate pada medium NA. setelah selesai.3 Goresan Kuadran (Streak quadrant) Cara kerja : Hampir sama dengan goresan T.Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.B. diinkubasi pada 37oC selama 1x24 jam  Koloni akan tumbuh pada ketiga cawan tersebut kemudian dipilih koloni yang relatif terpisah dari koloni lain dan koloni yang mudah dikenali  Koloni yang terpilih kemudian ditumbuhkan atau dimurnikan ke NA baru dengan teknik streak kuadran  Inkubasi 1x24 jam. . Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisma.

Cara Kerja Isolasi Jamur dari Tanah :  Tanah dalam cawan petri dipanaskan dengan oven pada suhu 80oC selama 30 menit dengan cawan petri untuk membunuh sel vegetatiftetap bertahan  Tanah yang telah dioven diambil 1 g kemudian dimasukan ke dalam tabung pengenceran bertingkat  Tiga pengenceran terakhir diambil untuk ditanama secara spread plate ke media PDA yang ditambah streptomycin atau penicillin. Kemudian diinkubnasi pada suhu ruang 5-7 hari  Koloni jamur yang tumbuh dimurnikan dan ditanam pada medium PDA baru.  Inkubasi pada suhu ruang 5-7 hari. .

dan 500C dan mikroorganisma yang berbeda (E.FAKTOR LINGKUNGAN YANG BERPENGARUH TERHADAP PERTUMBUHAN MIKROORGANISME Kompetensi: mahasiswa mengetahui pengaruh suhu. cawan dibagi menjadi 2 dengan spidol kemudian labeli dengan bakteri E.5%. termofilik (50-1000C).coli dan Bacillus sp. 3%. 370C. Setelah diinokulasi dengan bekteri yang berbeda. Suhu rendah menyebabkan aktiivtas enzim menurun dan jika suhu terlalu tinggi dapat mendenaturasi protein enzim.  Setiap konsentrasi. mesofilik Mesofilik (20-300C). Pengaruh tekanan osmotik terhadap pertumbuhan mikroorganisme Keberadaan mikroorganisma dilingkungan dapat dipengaruhi kepekatan suspensi/cairan di lingkungan.  Inkubasi selama 48 jam dan amati pertumbuhannya . 5% dan 15%.coli dan Bacillus sp. diinkubasi sesuai suhu yang tertera  setelah ditumbuhkan selama 48 jam. pengaruh tekanan osmotik terhadap pertumbuhan mikroorganisme c. 3. pengaruh sinar ultraviolet tehadap pertumbuhan mikroorganisme d.coli dan Bacillus sp. pengaruh suhu berhubungan dengan aktivitas enzim. pengaruh pH terhadap pertumbuhan mikroorganisme Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan mikroorganisme Berdasarkan suhu optimum untuk pertumbuhan maka dapat dikelompokan menjadi 3 yaitu : 1.  Inokulasikan E. bandingkan derajat kekeruhannya. psikrofilik(0-200C). tekanan sinar UV dan pH terhadap pertumbuhuan Mikroorganisme Faktor lingkungan : a. Cara Kerja :  8x2 tabung yang berisi Nutrient Broth untuk suhu inkubasi 50C. pengaruh suhu terhadap pertumbuhan mikroorganisme b. Suhu merupakan faktor lingkungan yang sangat menentukan kehidupan mikroorganisme. 2. dengan streak kontinyu  Gunakan kontrol untuk masing-masing biakan dengan media yang tidak ditambahi NaCl. 250C. Bila kepekatan suspensi di lingkungan tinggi maka isi sel akan ke luar.) diberi label . Sebaliknya kepekatan suspensi di lingkungan rendah maka akan terjadi pergerakan massa cair ke dalam sel Cara Kerja:  buat 4 buah cawan Nutrient Agar yang mengandung NaCl 0.

Cara Kerja:  Inokulasikan Aspergillus sp. Basofilik Cara Kerja :  Buatlah tabung reaksi berisi NB dan atur pH-nya (pH 3.coli lalu diinkubasi pada suhu 370C selama 48 jam  Amati perbedaan kekeruhan pada tiap nilai pH .  Dedahkan ketiga cawan tersebut pada sinar UV dengan panjang 254 nm selama 1 menit. Komponen seluler yang dapat menyerap sinar UV adalah asam nukleat sehingga dapat rusak dan menyebabkan kematian.0). pada umumnya bakteri tumbuh dengan baik pada pH netral (7. Acidofilik. Berdasarkan nilai pH yang dibutuhkan untuk kehidupannya dikenal 3 kelompok mikroorganisme yaitu : 1. Jarak antar UV dan cawan sekitar 12 inchi  Gunakan kontrol untuk masing-masing biakan dengan tidak memaparkan pada sinar UV  Inkubasi selama 48 jam dan amati pertumbuhan koloninya Pengaruh pH terhadap pertumbuhan mikroorgansime pH berpengaruh terhadap sel dengan mempengaruhi metabolisme. E. 7 dan 9) masing-masing 2 tabung untuk tiap nilai pH  Labeli dengan nama bakteri yang akan diinokulasikan  Inokulasi tiap tabung dengan Bacillus sp dan E.coli dan Bacillus sp. pada 3 cawan NA. 2 Mesofilik/Neutrofilik dan 3. dan 15 menit (ingat tutup cawan dibuka dan diusahakan lingkungan sekitar steril)..Pengaruh sinar ultraviolet terhadap pertumbuhan mikroorganisme Sinar UV panjang gelombang 210-300 nm dapat membunuh mikroorganisme jika di paparkan. 5 menit.

2 pada agar miring a.3. pinpoint/punctiform (titik) Small (kecil) Moderate (sedang) Large (besar) .2.2. Mengamati Morfologi Koloni Bakteri Kegiatan ini merupakan tindakan pertama kali jika ingin mempelajari suatu jenis bakteri lebih lanjut.4 pada media cair a.1.2 mengamati morfologi sel yeast (dengan pewarnaan sederhana) c.2.1.2 pengamatan tidak langsung b.MORFOLOGI MIKROBA Kompetensi : mahasiswa dapat mengenali bentuk dan morfologi sel dan koloni mikroorganisme a. Cara Kerja :  Tumbuhkan biakan pada media NA cawan dengan streak kuadran  Tumbuhkan biakan pada media NA miring dengan pola inokulasi yang tegak lurus  Tumbuhkan biakan pada media NA tegak dengan stab inoculation  Tumbuhkan biakan pada media NB A.1. Setelah mendapatkan kultur murni maka biakan yang diinginkan ditumbuhkan ke berbagai bentuk media untuk dikenali ciri koloninya.1 mengamati morfologi koloni kapang (pada agar cawan) c.1.1 pengamatan langsung a.2 dengan pewarnaan negatif a.1 mengamati morfologi koloni yeast (pada agar cawan) b. Yeast b. khususnya untuk tujuan identifikasi.2 mengamati morfologi sel bakteri a.1 mengamati morfologi koloni bakteri a.4 dengan pewarnaan endospora a. Pertumbuhan pada Cawan Petri Ciri-ciri yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut :  Ukuran.2.3 mengamati motilitas bakteri a. Bakteri a.1 pada media cawan a.3 dengan pewarnaan gram a. Kapang c.2 mengamati morfologi sel kapang (dengan metode slide culture) Bakteri A.3.1.3 pada agar tegak a.1 dengan pewarnaan sederhana a.

Pertumbuhan pada Agar Miring Ciri-ciri koloni diperoleh dengan menggoreskan jarum inokulum tegak dan lurus Ciri koloni berdasarkan bentuk: . Opaque (tidak dapat ditembus cahaya).  Pigmentasi : mikroorganisme kromogenik sering memproduksi pigmen intraseluler. Transparant (bening)  Bentuk : Circular Elevasi : Flat Irregular Raised Spindle Convex Filamentous Umbonate Rhizoid   Permukaan : Halus mengkilap Kasar Berkerut Kering seperti bubuk Margins : Entire Lobate Undulate Serrate Felamentous Curled A.2. beberapa jenis lain memproduksi pigmen ekstraseluler yang dapat terlarut dalam media Karakteristik optik : diamati berdasarkan jumlah cahaya yang melewati koloni. Translucent (dapat ditembus cahaya sebagian).

A.3 Pertumbuhan pada Agar Tegak Cara penanaman adalah dengan menusukkan jarum inokulum needle ke dalam media agar tegak. Ciri-ciri koloni berdasar bentuk : Ciri koloni berdasar kebutuhan O2 : .

pewarnaan gram . Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya. Base Fuchsin. maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop.pewarnaan negatif  Pewarnaan diferensial . . Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif) Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi.pewarnaan flagella dll. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya.pewarnaan acid fast dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin. tapi jika suspensi bakteri terlalu encer. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat. sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan.4 Pertumbuhan pada Media Cair Pola pertumbuhan berdasarkan kebutuhan O2 A. bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Malachite Green dll. Mengamati Morfologi Bakteri Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi.pewarnaan endospora . Pewarnaan  Pewarnaan sederhana . Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri.pewarnaan positif . Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif.A. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan.  Pewarnaan khusus . Safranin. Congo Red dll. Methylene Blue. Pada zat warna basa. B. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel.1. sel bakteri sulit terlihat.

B.2 Pewarnaan Negatif Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Crystal Violet) dan tunggu kurang lebih 30 detik.Cara Kerja :  Bersihkan object glass dengan kapas  Jika perlu tulislah kode atau nama bakteri pada sudut object glass  Bila menggunakan biakan cair maka pindahkan setetes biakan dengan pipet tetes atau dapat juga dipindahkan dengan jarum inokulum. maka biakan dipindahkan dengan jarum inokulum. Jika digunakan biakan padat. . lalu dicampurkan  Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan ke samping kiri  Biarkan preparat mengering di udara. satu ulasan saja kemudian diberi akuades dan disebarkan supaya sel merata. Tapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif.  Cuci dengan akuades kemudian keringkan dengan kertas tissue  Periksa dengan mikroskop (perbesaran 100 x 10). sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam. teteskan nigrosin atau tinta cina di ujung kanan salah satu object glass  Biakan diambil lalu diulaskan atau diteteskan dalam tetesan nigrosin tadi. Jangan lupa biakan dikocok terlebih dahulu.  Keringkan ulasan tersebut sambil memfiksasinya dengan api bunsen (lewatkan di atas api 2-3 kali)  Setelah benar-benar kering dan tersebar selanjutnya ditetesi dengan pewarna (dapat digunakan Methylen blue. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya. Safranin. jangan difiksasi atau dipanaskan di atas api. Prosedur:  Ambil dua object glass.

Ancylobacter dll Bacillus Spirochaeta. Spirillum.1 2 3 4 Setelah dilihat di mikroskop. Lactobacilus. Bdellovibrio. blunt end Helical (spirillum) Diplococcus Streptococcus Streptobacillus Staphylococcus Tetrad (Gaffkya) Sarcina (cuboid packets) Neisseria. pediococcus. Veillonella. clostridium Vibrio. Mycobacterium Staphylococcus Deinococci. maka akan tampak bentuk sel bakteri. Moraxela Streptococcus Bacillus. rounded ends Vibrio (curved) Bacilli (Rod). Enterococcus Moraxella. Berikut merupakan berbagai bentuk sel bakteri Bentuk Contoh jenis Coccus (sphere) Coccobacilli Bacilli. campylobacter Neisseria. micrococcus Sarcina . Acinetobacter Escherichia. (rod).

Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.Cuci dengan akuades mengalir 8. Pada gram positif dapat terbentuk CV iodinribonukleat pada dinding sel 5. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri.Keringkan preparat dengan kertas tissue yang ditempelkan di sisi ulasan (jangan sampai merusak ulasan) lalu biarkan mengering di udara. Counterstain hanya berfungsi sebagai pengontras saja 9. Jangan sampai terlalu banyak (overdecolorize) Penetesan etanol absolut menyebabkan terbentuknya pori-pori pada gram negatif yang memiliki banyak lapisn lemak (lipid larut dalam etanol).s iodine) Adanya lugol’s iodine menyebabkan lalu tunggu ± 1 menit adanya ikatan CV dengan iodine yang akan meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri.Cuci dengan akuades mengalir 10.Buat preparat ulas (smear) yang Sel bakteri tertempel pada permukaan telah difiksasi dari bakteri gram kaca (object glas) positif misal Bacillus subtilis dan gram negatif misal Escherichia coli 2.Berikut merupakan prosedur pewarnaan Gram: Cara Kerja : Dampak/Hasil 1.Teteskan mordant (lugol.Teteskan kristal violet sebagai Kristal ungu akan mewarnai seluruh pewarna utama pada kedua preparat .Teteskan counterstain (safranin) dan Safranin akan mewarnai sel gram tunggu selama ± 45 detik negatif menjadi berwarna merah.Cuci dengan akuades mengalir 4. Pewarnaan Gram Adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. permukaan sel bakteri gram positif dan usahakan semua ulasan terwarnai dan negatif tunggu selama ± 1 menit 3. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. . karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. sehingga komplek CV-iodine akan lepas dari permukaan sel gram negatif. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel. sel gram negatif menjadi bening 7. sedangkan gram positif tidak terpengaruh.3. sedangkan pada gram positif CV-iodine tetap menempel di dinding sel.A.Beri larutan pemucat (ethanol 96%/ aseton) setetes demi setetes hingga etanol yang jatuh berwarna jernih.Cuci dengan akuades mengalir 6.

Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam . Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sbb: Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif.

endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (keduaduanya transparan. sehingga pembedaannya tampak jelas. dingin. Berikut merupakan prosedur pewarnaan endospora dengan metode Schaeffer-Fulton. Desulfomaculatum dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya.Tetesi ulasan pada object glass dengan Malachite green di atas kertas merang. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif. penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif. Pewarnaan Endospora Anggota dari genus Clostridium. Untuk mewarnainya dilakukan pemanasan untuk mempermudah penetrasi Malachite green ke dinding endospora. radiasi dan bahan kimia. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel.Cuci kering anginkan . sehingga diperlukan teknik pewarnaan endospora. Pembilasan dengan akuades akan melunturkan Malachite green pada sel vegetatif Safranin akan mewarnai sel vegetatif menjadi merah. Endospora sukar menyerap zat warna. tambahkan lagi Malachite Green. sel vegetatif berwarna). diamkan selama + 45 detik 5. Namun jika dengan pewarnaan sederhana. sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas. bilas object glass dengan akuades mengalir Dampak/Hasil Sel bakteri menempel pada permukaan object glass Malachite green akan mewarnai sel vegetatif bakteri. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV). Walaupun ada beberapa species yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter. Jika bagian pinggir mulai mengering. Letakan di atas air yang mendidih. Dijaga jangan sampai kering. 4. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. warna tersebut sulit dilunturkan.4. Cara Kerja : 1. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif.Buat preparat ulas dari Bacillus subtilis lalu tutup dengan kertas merang 2.Tetesi dengan safranin sebagai counter stain. Air digunakan sebagai agen dekolorasi sel. Setelah perlakuan di atas Malachite green tidak melekat kuat dengan sel vegetatif.Setelah dingin. sekali diberi zat warna. Biarkan 5 menit. B. sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. khususnya pada gram positif. kering. warna ini tidak mempengaruhi warna hijau endospora. 3. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil.

Pemberian Malachite green Pelunturan dengan air mengalir Penambahan safranin Cuci dan keringkan .

2 Pengamatan tidak langsung Cara Kerja :  Tanam biakan pada media NA tegak atau Media Motilitas dengan cara tusuk (Stab inoculation) sedalam + 5 mm.Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya : C.  Inkubasi selama 2x24 jam. Mengamati motilitas C. C. Hati-hati jangan salah membedakan antara sel yang bergerak sendiri karena flagel atau bergerak terkena aliran air.1 Pengamatan Langsung Cara Kerja :  Teteskan biakan bakteri motil seperti Bacillus atau E.  Inkubasi pada suhu 370 C selama 1x 24 jam  Hasil positif (motil) jika bakteri tumbuh pada seluruh permukaan media.  Tutup dengan cover glass  Amati menggunakan mikroskop dengan perbesaran maksimak.coli ke object glass (sebaiknya dari biakan cair). hasil negatif menunjukan bakteri hanya tumbuh pada daerah tusukan saja Bakteri motil akan bermigrasi ke seluruh permukaan agar dan bekas tusukan Yeast / Khamir A. . Jika digunakan biakan padat maka ulas dengan jarum inokulum lalu ditambah akuades satu tetes. ratakan. Bakteri akan tampak transparan dan pola pergerakannya tidak beraturan. Mengamati morfologi koloni yeast  Tanam biakan yeast (dapat berupa Sacharomyces cereviceae atau Candida albicans) pada PDA dengan cara streak quadrant.

Amati di bawah mikroskop.  Inkubasi selam beberapa hari. Mengamati Morfologi Sel Yeast Yeast merupakan fungi mikroskopik uniseluler. . B. Panasi preparat dengan api bunsen selama + 30 detik (sampai timbul uap). Penampakan morfologi koloni pada umumnya seperti benang (filamentous) yang pertumbuhannya membentuk lingkaran. Cuci preparat dengan air mengalir. A. B. Keringkan dengan tissue kemudian biarkan pada udara terbuka.  Warnai dengan cara Shager dan Fulgen yaitu: Tetesi preparat dengan Malachite Green dan biarkan 30-60 detik. bulat telur.  Fiksasi dengan api bunsen.1 Melihat bentuk sel Yeast Cara Kerja :  Tumbuhkan Sacharomyces cereviceae pada glukosa cair selama 24 jam.  Ulaskan suspensi biakan pada object glass lalu teteskan Methilene Blue hingga rata (jangan difiksasi). Pseudohifa adalah hifa yeast yang terbentuk dari rangkaian sel hasil pembelahan aseksual secara budding. Koloni kapang memiliki keragaman warna yang muncul dari sporanya. Perhatikan spora yang berwarna Kapang / Jamur Jamur merupakan mikroba dengan struktur talus berupa benang-benang (hifa) yang terjalin seperti jala (myselium). tetapi tidak melepaskan diri dari induk.  Tutup preparat dengan cover glass. Mengamati morfologi koloni kapang Cara kerja :  Tanam/pindahkan biakan kapang dengan jarum inokulum needle yang diletakan di tenganh-tengah cawan petri. B. bulat memanjang dengan ukuran 1-9x20 µm.  Amati dengan perbesaran 40x10 atau 100x10. Setelah didapatkan koloni tunggal. Morfologi internal sel mudah dilihat dan terdiri dari inti dan organel seperti mitkondria.2 Melihat bentuk spora sel Yeast Cara kerja :  Buat preparat ulas dari biakan yeast pada Goodkowa Agar yang berumur 10 hari. tidak membentuk hifa (beberapa spesies dapat membentuk pseudohifa). Hifa dapat berekat (septat) dengan inti tunggal/ lebih dan hifa tidak bersekat (aseptat). pengamatan ciri-ciri morfologi koloni hampir sama dengan ciri morfologi bakteri. Bentuk selnya bervariasi dapat berbentuk bulat. seperti dari kelompok Actinomycetes atau Bacillus mycoides. grannula lemak dan glikogen. Beberapa spesies yeast memiliki sifat dimorfisme yaitu bentuk sel tunggal dan bentuk hifa atau pseudohifa. Morfologi koloninya dapat dengan mudah dibedakan dengan bakteri walaupun ada beberapa jenis bakteri yang koloninya mirip jamur.

tissue basah yang dimasukkan dalam cawan dan sterilkan dengan autoclave. B. . cara kerja :  Siapkan object glass. Tekan cover galss secara media merata. Amati pertumbuhan koloni (miselium) yang menyebar.  Inkubasi pada suhu kamar selama 3x24 jam. Namun seringkali miselium atau susunan spora menjadi pecah atau terputus sehingga penampakan di mikroskop dapat membingungkan. potong media Saboraud Dextrose Agar steril berbentuk kubus dan letakkan di atas object glass.  Tutup potongan agar dengan cover glass. 2 Metode Riddel.  Teteskan suspensi spora jamur dalam media cair pada media cover glass yang tidak diberi lilin. B.  Inkubasi pada suhu kamar selama 3x24 jam. B. cara kerja :  Persiapan sama seperti di atas  Setelah semua steril. Dengan teknik ini.  Tutup dengan cover glass. cover glass.1 Metode Heinrich’s. Mengamati sel morfologi kapang dengan metode Slide Culture (Microculture) Teknik ini bertujuan untuk mengamati sel kapang dengan menumbuhkan spora pada object glass yang ditetesi media pertumbuhan.  Ambil preparat dan amati di bawah mikroskop. spora dan miselium tumbuh langsung pada slide sehingga dapat mengatasi masalah tersebut.  Setelah selesai sterilisasi berikan lilin (parafin-petrolatum) steril pada sebelah kiri dan kanan tempat yang akan ditutup cover glass (aseptis).  Inokulasikan spora jamur pada bagian atau potongan agar. Berikan sampai setengah luasan cover glass. Pengamatan struktur spora dan miselium dapat juga dilakukan dengan preparat ulas seperti yang telah diuraikan di depan.

3 Prosedur yang lebih sederhana. Ambil preparat dan diamati di bawah mikroskop.  Belah media yang memadat dengan jarum inokulum yang berujung L.  Inkubasi selama 2x24 jam.  Teteskan media PDA pada object glass secara aseptis lalu tunggu memadat (teteskan jangan terlalu banyak).  Amati pertumbuhan miselium dan spora pada object glass dengan perbesaran sedang .  Tutup dengan cover glass tepat di atas media dan tekan hingga merata. cara kerja :  Sterilkan cawan petri yang berisi kapas yang di atasnya terdapat object glass dan cover glass.  Ulaskan spora jamur yang akan diamati pada belahan tersebut.  Siapkan media PDA dan dijaga supaya tetap cair. B.

2 MPN b. menjadi tolak ukur untuk menentukan ukuran skala micrometer okuler. Menentukan ukuran mikroba Menggunakan mikrometer b. 1 skala okuler = Jarak yang diketahui antara 2 garis pada mik. Jarak ini dapat ditentukan dengan mengkalibrasi antara mikrometer okuler dan objektif.2 penghitungan jumlah bakteri secara keseluruhan (penghitungan langsung dengan haemocytometer  Menentukan Ukuran Mikroorganisme Mikroba berukuran sangat kecil dan untuk mengetahuinya digunakan mikrometer. Mikrometer merupakan kaca berskala dan dikenal 2 jenis micrometer yaitu mikrometer okuler dan mikrometer objektif.MENENTUKAN JUMLAH & UKURAN MIKROBA Kompetensi : Mahasiswa dapat melakukan pengukuran sel mikroorganisme Mahasiswa dapat melakukan perhitungan mikroba dengan cara Plate Count. MPN dan dengan haemocytometer Menentukan jumlah dan ukuran mikroba a.1.1. Skala ke nol (garis pertama) kedua mikrometer disimpulkan menjadi 1 garis kemudian dilihat pada skala ke berapa kedua jenis mikrometer tersebut bertemu/berhimpit kembali. Mikrometer okuler dipasang pada lensa okuler mikroskop.1. Kalibrasi dilakukan dengan menghimpitkan skala mikrometer objektif dan okuler pada perbesaran yang diinginkan.1 penghitungan jumlah bakteri hidup (penghitungan tidak langsung) b..D = Okuler Division) Jarak skala pada mikrometer okuler = 0.1.1.1. Dari hasil tersebut dapat diketahui satu satuan panjang pada skala mikrometer okuler itu berdasarkan beberapa jumlah skala kecil mikrometer objektif yang berada di antara garis yang berhimpit tadi. 1 skala micrometer objektif = 0.01 mm / 10 µm. Menentukan jumlah mikroba (enumerasi) b. Jarak antar garis skala pada mikrometer okuler tergantung pada perbesaran lensa objektif yang digunakan yang menentukan lapang pandang mikroskop.1 Plate count (hitungan cawan) b. sedangkan micrometer objektif berbentuk slide yang ditempatkan pada meja preparat mikroskop. Mikrometer objektif memiliki skala yang telah diketahui.3 cara kerja SPC dan TPC b. Objektif (O.1.1.1 SPC b.01 X Skala Objektif Skala Okuler 10 X Skala Ob Skala Ok (mm) = (µm) .2 TPC b.

 Hitung besarnya skala okuler dengan rumus di atas.00154 mm = 1.01 x 2/13 0.Misal : jika skala ke 0 mikrometer okuler berhimpit dengan skala ke 0 mikrometer objektif lalu skala ke 13 mikrometer okuler berhimpit dengan skala ke 2 mikrometer objektif maka beberapa 1 skala okuler.  Tentukan perbesaran yang digunakan.  Hitung panjang dan lebar sel sebenarnya : .02 = 0. kemudian selanjutnya himpitkan skala ke nol mikrometer objektif dan okuler. 1 Skala Okuler = = 0.  Setelah fokus didapat.  Jika diperlukan hitung lebar sel dengan cara yang sama. (misalnya 40 X 10) kemudian cari gambar perbesaran dari skala mikrometer objektif. Tabung lensa okuler dapat diputar dan dicari posisi yang pas.54 µm 13 Cara Kerja : Kalibrasi  Letakkan mikrometer objektif pada meja benda dan pasang mikrometer okuler pada tabung lensa okuler.  Ganti dengan preparat ulas yang telah disiapkan  Cari fokus dari preparat tersebut dengan perbesaran yang sama. : Cara kalibrasi cara mengukur mikroba Penentuan ukuran mikroba  Lepaskan mikrometer objektif dari meja benda.  Cari dengan teliti skala ke berapa antara mikrometer objektif dan okuler yang berhimpit lagi.  Hitung berapa panjang sel dengan menghitung skala mikrometer okuler.

1. .Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni.54 = 7.7 µm 2 X 1. -6 dengan Spread plate : koloni = 50 Fp = 1/10 -6 SP = 0.1 ml = 50 000 000 CFU’s / 0. Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel mikroorganisme karena beberapa mikroorganisme tertentu cenderung membentuk kelompok atau berantai.Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni. . Perhitungan mengacu kepada standar atau peraturan yang telah ditentukan.1 ml = 5x107 CFU’s / ml a. penghitungan jumlah bakteri hidup (tidak langsung) a.Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan) tidah dihitung. Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah sebagai berikut “ .Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni.1. . Plate Count (hitungan cawan) Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai.1 ml koloni = 50 Fp = 1/10 -6 SP = 1 ml Pour plate : = 50 x 106 CFU’s / 0.Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni. .1. jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut.08 µm  Menentukan jumlah mikroorganisme (enumerasi) A.1 ml = 500 000 000 CFU’s / ml = 5x108 CFU’s / ml = 50 x 106 CFU’s / 1 ml = 50 000 000 CFU’s / 0. .Satu koloni dihitung 1 koloni. Berdasarkan hal tersebut digunakan istilah Coloni Forming Units (CFU’s) per ml. Standard Plate Count (SPC) Koloni yang dipilih untuk dihitung menggunakan cara SPC memiliki syarat khusus berdasarkan statistic untuk memperkecil kesalahan dalam perhitungan. Syaratsyaratnya sebagai berikut : .54 = 3. Setelah diinkubasi. koloni yang tumbuh berasal dari suspensi yang diperoleh menggunakan pengenceran bertingkat dari sebuah sampel yang ingin diketahui jumlah bakterinya.x skala okuler X hasil kalibrasi y skala okuler X hasil kalibrasi misal : 5 X 1. Cara menghitung sel relatif / CFU’s per ml CFU’s / ml = jumlah koloni X faktor pengenceran Misal : penanaman dilakukan dari tabung pengenceran 10 metode Spread Plate dan Pour Plate.

5X10 Dilap. pembulatan keatas dilakukan pada angka seperseratus yang sama atau lebih besar dari lima. maka hanya dari pengenceran terendah yang dilaporkan.000)/2=b 285 40 7 Dilap. > 300 = TNTC (Too Numerous To Count) atau TBUD (Terlalu Banyak Untuk Dihitung). maka jumlah yang dilaporkan adalah nilai rata-rata.000/29.3X105 650 >300 6 TNTC TNTC 195 2X10 TNTC >300 Jumlah koloni yang dilaporkan terdiri dari 2 digit yaitu angka satuan dan angka sepersepuluh yang dikalikan dengan kelipatan 10 (eksponensial). terendah 275 35 5 (27.000+30.000)/2=a 27.000)/2 = 290 25 5 meskipun 3X104 305>300 305 28 0 - - - - - .000/14. Bila diperoleh perhitungan < 30 dari semua pengenceran. maka hanya dari pengenceran tertinggi yang dilaporkan. 10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan TNTC TNTC 358 3.3X10 28 dan 5 <30 650 127 10 1. 10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan 15 1 0 1.3X104 rata-rata 25 dan 28 <30 (29. Pengc. Hasil (a+b)/2 = 3.000/13. < 30 = TFTC (Too Few To Count).000<2 28.000/10.500/35.000>2 Apabila setiap pengenceran digunakan 2 cawan petri (duplo).3 X 104. 10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan 4 234 20 5 2.9X104 135 45 5 (13.6X106 Pngc.5X10 40.trtgg(10-3) Bila ada 2 cawan.34 X 104.500>2 4 165 45 8 = 1. missal 2.34 X 104 menjadi 2.500+16.000<2 (28. atau 2.35 X 104 menjadi 2.500<2 140 35 1 1. maka jumlah angka yang digunakan adalah rata-rata dari kedua nilai jumlah masingmasing setelah diperhitungkan.3X105 Pngc.trtgg(10-4) TNTC 325 18 3. Jika hasil bagi dari pengenceran tertinggi dan terendah > 2 maka jumlah yang dilaporkan adalah dari cawan dengan pengenceran terendah.4 X 104.800)/2 15 dan 20 <30 208 20 2 = 1.500/35.500+40.500>2 45. bukan 2. missal 2. 10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan 4 295 40 5 3.3 X 104.500+20.500/40. 10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan 175 15 5 (17. masing-masing dari pengenceran rendah dan tinggi yang berurutan dengan jumlah koloni 30-300 dan hasil bagi dari jumlah koloni pengenceran tertinggi dan terendah ≤ 2.- Pilih cawan yang ditumbuhi koloni dengan jumlah 30-300 koloni.4X104 35.500)/2 45.5X103 Semua <30 Bila diperoleh perhitungan > 300 dari semua pengenceran.

Inkubasi pada suhu 30º C selama 1-2 x 24 jam. Masukkan sampel ke tabung berisi 9 ml akuades untuk pengenceran pertama. koloni dihitung dengan persyaratan yang telah diuraikan di depan. Dari 3 pengenceran terakhir diplating (ditanam) ke media NA (Nutrien Agar) atau PCA (Plate Count Agar) sebanyak dua kali tiap pengenceran (duplo). Jika secara Spread Plate. Penghitungan koloni pada cawan sebaiknya dibuat transek atau dibagi-bagi jika koloni yang tumbuh terlalu banyak.1. maserasi dan rinse) (jika perlu).Bagan alur persyaratan SPC a. Setelah tumbuh. Pola . dapat digunakan batang L atau glass beads. Plating dapat secara Spread Plate atau Pour Plate. selanjutnya diencerkan sampai tingkat pengenceran (misalnya sampai 10-8) tertentu.      Lakukan preparasi suspensi kepada sampel terlebih dahulu (swab. Transek dibuat dengan spidol/marker di bagian bawah cawan petri.3 Prosedur perhitungan jumlah bakteri dengan metode Plate Count.

Untuk sampel 1 ml dan 0. Sampel ditumbuhkan pada seri tabung sebanyak 3 atau 5 buah tabung untuk setiap kelompok. peptone (5 gr). . lactose (10 gr) dan Bromthymol Blue (0. dan jika dipakai 5 tabung maka disebut 5 seri. MPN didasarkan pada metode statistik (teori kemungkinan). tergantung kebutuhan. a. batang pendek. maka bakteri ini dapat memfermentasikan laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi oleh berubahnya warna dan gas dalam tabung durham.2 Most Probable Number (MPN) Pendekatan lain untuk enumerasi bakteri hidup adalah dengan metode MPN. Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri pada air khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri koliform yang merupakan kontaminan utama sumber air minum.transek dapat dibuat bervariasi. Penghitungan akan lebih mudah bila memakai Coloni Counter. Berdasar sifat coliform. Ciri-ciri utamanya yaitu bakteri gram negatif.2 %) per liternya.1 ml dimasukkan pada media LBSS (Lactose Broth Single Stegth) yang berkomposisi sama tapi hanya kadar laktosa setengah dari LBDS yaitu 5 gr. tidak membentuk spora. Untuk sampel sebanyak 10 ml ditumbuhkan pada media LBDS (Lactose Broth Double Stegth) yang memiliki komposisi Beef extract (3 gr). memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi dalam waktu 24 jam inkubasi pada 37º C. Nilai MPN ditentukan dengan kombinasi jumlah tabung positif (asam dan gas) tiap serinya setelah diinkubasi. Pemberian sampel pada tiap seri tabung berbeda-beda. Media pada tabung adalah Lactose Broth yang diberi indikator perubahan pH dan ditambah tabung durham. Apabila dipakai 3 tabung maka disebut seri 3.

 Kocok botol yang berisi air sampel. Misal : didapatkan kombinasi jumlah tabung positif : 321 maka jumlah bakteri coliform adalah 150 sel/100 ml. secara aseptis. secara aseptis. Tulis kombinasi tabung positif tiap seri (misal : 3 2 1).  Inkubasi semua tabung pada suhu 37º C selama 48 jam. Atur kesembilan tabung menjadi 3 seri (seperti di gambar). lalu hitung tabung positif untuk tiap seri.Cara kerja :  Sediakan 3 tabung berisi LBDS (9 ml tiap tabung) dan 6 tabung berisi LBSS (9 ml tiap tabung) lengkap dengan tabung durham.  Pindahkan suspensi air sample sebanyak 10 ml ke masing-masing tabung seri pertama (3 tabung LBDS). secara aseptis. Kombinasi angka tersebut lalu dicocokkan dengan tabel MPN untuk seri 3 sehingga diperoleh jumlah mikroba sebenarnya. harus ada keduanya).  Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing tabung seri ketiga (3 tabung LBSS). .  Lihat tabung gas positif (asam dan gas .  Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing tabung seri kedua (3 tabung LBSS).

Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil.2 mm. Penghitungan jumlah bakteri secara keseluruhan (langsung) Penghitungan secara langsung dapat dilakukan secara mikroskopis yaitu dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Alat yang digunakan adalah Petroff-Hauser Chamber atau Haemocytometer.B. dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0. Jumlah cairan yang terdapat antara coverglass dan alat ini mempunyai volume tertentu sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu bujur sangkar juga tertentu. Satu kotak besar di tengah. Sel nakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui. . Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm².1 mm.

04 mm2 Volume kotak sedang : = 0.2 x 0.2 = 0.000004 cm3 = 4x10-6 ml Sel/ml : = jumlah sel/4x10-6 ml = (jumlah sel/4) x 106 = jumlah sel x (¼) x 106 = jumlah sel x 2.  Hitung sampel.04 mm2 x 0.  Tambahkan ± 50 µl suspensi sel yeast (kira-kira 1 tetes) dengan cara meneteskan pada parit kaca pada alat hitung.004 mm3 Karena 1 ml = 1cm2 Maka : = 0.004 mm3 = 0. Jika dilakukan pengenceran maka jumlah sel/ml dikalikan faktor pengenceran. Jika dalam satu kotak sedang terdapat sel-sel yang banyak dan bertumpuk maka perhitungan akan tidak akurat dan diperlukan pengenceran dengan perbandingan 1:5 atau 1:10. Hasil perhitungan dirata-rata kemudian hasil rataan dimasukkan rumus untuk kotak sedang. .5 x 105 Kotak sedang : Jumlah sel/ml = jumlah sel x 2.  Letakkan cover glass di atas alat hitung.  Lakukan perhitungan secara kasar apakah diperlukan pengenceran atau tidak.Luas kotak sedang : =pxl = 0. Suspensi sel akan menyebar karena daya kapilaritas.1 mm = 0.5 x 105 jadi misalnya diperoleh: 20 sel dalam satu kotak sedang maka jumlah sel keseluruhan : = 20 x (1/4) x 106 = 5 x 106 sel/ml Dengan perhitungan yang sama maka diperoleh rumus untuk kotak kecil : Jumlah sel/ml = jumlah sel x 4 x 106 Cara kerja (digunakan kotak sedang) :  Bersihkan Petroff-Hauser Counting Chamber atau Haemocytometer dengan alkohol 70 % lalu keringkan dengan tissue. paling tidak sebanyak 5 kotak sedang (lebih banyak lebih baik).  Letakkan alat hitung pada meja benda kemudian cari fokusnya pada perbesaran 40x10.  Biarkan sejenak sehingga sel diam di tempat (tidak terkena aliran air dari efek kapilaritas).

lantai dan pisau bedah. Disinfektan yaitu suatu senyawa kimia yang dapat menekan pertumbuhan mikroorganisme pada permukaan benda mati seperti meja. Zat antimikroba dapat bersifat membunuh mikroorganisme (microbicidal) atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme (microbiostatic). Cara kerja pengujian disinfektan  Pengujian zat disinfektan dengan kertas cakram  Pengujian pengaruh daya oligodinamik c.DAYA KERJA ANTIMIKROBA DAN OLIGODINAMIK Kompetensi : mahasiswa mengetahui cara kerja pengujian oligodinamik dan zat antimikroba a. Adapun antiseptik adalah senyawa kimia yang digunakan untuk menekan pertumbuhan mikroorganisme pada jaringan tubuh. pH dan jenis tempat mikroba hidup Beberapa jenis disinfektan diantaranya adalah: Jenis Senyawa fenol : Fenol Cresol Hexaclhorophene Recorcinol Thymol Alkohol : Ethyl Isopropil Senyawa halogen : Senyawa chlorin : Sodium hipochlorite Chloramine Senyawa iodine : Povidone-iodine (betadine) Keterangan Merusak membran sel Mendenaturasi protein Konsentrasi kerja : 2-5% Pelarut lemak Denaturasi dan koagulasi protein Konsentrasi kerja : 50-75% Agen oksidasi Presipitasi protein Klorin bereaksi dengan air membentuk asam hipoklorit yang bersifat bakterisidal . Efisiensi dan efektivitas disinfektan dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu:     Konsentrasi Waktu terpapar Jenis mikroba Kondisi lingkungan: temperatur. Pengertian dan jenis disinfektan b. Pengertian Antibiotik  Cara kerja pengujian antibiotik dengan metode Kirby-Bauer Pengertian dan Jenis Disinfektan Zat antimikroba adalah senyawa yang dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme. misalnya kulit.

 Zona hambat yang terbentuk diukur diameternya. Pada NA cawan sengan streak kontinyu. .  Inkubasi selama 48 jam pada 37 0C. LysoI 5%. betadin. Agen aktif permukaan : Sabun Detergen emulsifier Senyawa kationik : Senyawa amonium kuartener benzalconiumclhoride Senyawa anionik : Sodium Tertradecyl Sulphate Asam (H+) Basa (OH-) Pewarna : Crystal Violet Bereaksi dengan gugus SH (sufihidril) pada enzim yang menyebabkan denaturasi. sisa tetes larutan yang berlebihan pada kertas cakram diulaskan pada dinding wadah karena dikhawatirkan larutan akan meluas di permukaan agar jika larutan terlalu banyak. Tekan dengan pinset supaya kertas cakram benar-benar menempel pada agar.Logam berat : Senyawa Hg Senyawa Zn Senyawa Cu dll. Menciptakan tegangan permukaan yang rendah Merusak membran sel Memindahkan sel secara mekanis Tegangan permukaan yang rendah Daya kerja sama dengan senyawa aktif permukaan Merusak dinding sel dan membran sel Koagulasi protein Memiliki avinitas terhadap asam nukleat Pengujian zat disinfektan dengan kertas cakram Cara kerja :  Inokulasikan E. bandingkan daya kerja berbagai disinfektan.  Kertas cakram steril dicelupkan ke dalam larutan disinfektan (alkohol 70%.  Kertas cakram diletakkan dipermukaan agar dengan pinset. coli dan Bacillus sp. Setelah diangkat. dan hipoklorit 5%).

misal antibiotik macrolide. Daya hambat atau mematikan dari logam dengan konsentrasi yang rendah disebut daya oligodinamik. Logam mengalami ionisasi dan ion-ion tersebut bereaksi dengan bagian sulfihidril pada protein sel sehingga menyebabkan denaturasi. Antibiotik dikelompokkan berdasarkan gugus aktifnya.coli dan Bacillus sp. Antibiotik memiliki spektrum aktivitas antibiosis yang beragam. Cara Kerja :  Inokulasikan E. pada cawan NA dengan streak kontinyu  Letakan koin tembaga dan seng ke dalam cawan dengan pinset  Inkubasi 370C selama 48 jam  Hitung zona hambat yang terbentuk dengan mengukur diameter daerah yang jernih atau tidak ada pertumbuhan Pengertian dan Jenis Antibiotik Antibiotik adalah bahan yang dihasilkan oleh mikroorganisme atau sintetis yang dalam jumlah kecil mampu menekan menghambat atau membunuh mikroorganisme lainnya. Adapun penamaannya biasanya berdasarkan gugus kimiawinya ataupun mikroorganisma produsernya. Cu.Pengujian pengaruh daya oligodinamik Logam-logam berat seperti Hg. misalnya:  ragam antibakteria:  Penicillin dan cephalosporin         Erythromycine Sulfa drugs Trimethoprim dan sulfamethoxazole Polymyxin B Quinolone Tetracycline  Antifungi : Nystatin Azoles . Ag dan Pb bersifat racun terhadap sel meskipun hanya dalam kadar rendah. antimikroba peptida.

. Sensitivitas suatu bakteri terhadap antibiotik ditentukan oleh diameter zona hambat yang terbentuk.Konsentrasi mikroba uji . Faktor yang mempengaruhi metode Kirby-Bauer : .Konsentrasi antibiotik yang terdapat dalam cakram .  Menghambat replikasi DNA.pH medium.Mekanisme kerja antibiotik antara lain :  Menghambat dsintesis dinding sel  Merusak permeabilitas membran sel. Cara kerja pengujian antibiotik dengan metode Kirby-Bauer :  Celupkan cotton bud (cotton swab) dalam biakan bakteri kemudian tekan kapas ke sisi tabung agar air tiris  Ulaskan pada seluruh permukaan cawan Mueller-Hinton Agar secara merata  Biarkan cawan selama 5 menit  Kertas cakram dicelupkan dalam larutan antibiotik dengan konsentrasi tertentu.  Menghambat sintesis RNA (proses transkripsi)  Menghambat sintesis protein (proses translasi).Jenis antibiotik. Semakin besar diameternya maka semakin terhambat pertumbuhannya. . sehingga diperlukan standar acuan untuk menentukan apakah bakteri itu resisten atau peka terhadap suatu antibiotik. Prosedur difusi-kertas cakram-agar yang distandardisasikan (metode KirbyBauer) merupakan cara untuk menentukan sensitivitas antibiotik untuk bakteri.

 Angkat. Maka interpretasinya adalah bakteri tersebut peka terhadap antibiotik Eryhtromycin. Resistent : tahan Intermediate : medium Susceptible : peka . biarkan sejenak agar tiris.  Kertas cakram ditekan menggunakan pinset supaya menempel sempurna di permukaan agar.  Ukur diameter zona hambat (mm) kemudian bandingkan dengan tabel. sensitivitas antibiotik. Tabel Penentuan Sensitivitas Antibiotik (diameter zona hambat dalam mm) Cara menginterpretasikan : Ukur diameter zona hambat (zona jernih) Misal didapatkan zona hambat suatu bakteri berdiameter 26 mm untuk Eryhtromycin. selanjutnya letakkan kertas cakram pada permukaan agar.  Inkubasi pada suhu 37 0C selama 24-48 jam.

Hidrolisis akhir maltosa menghasilkan glukosa terlarut yang dapat ditransport masuk ke dalam sel.AKTIVITAS ENZIMATIS MIKROORGANISME Kompetensi : mahasiswa mengetahui beberapa teknik uji aktivitas enzimatik. Cara Kerja :  Inokulasi Nutrient Agar yang mengandung pati (2 g/l) dengan E. NA yang tersuspensi pati digunakan sebagai media. Amilum akan bereaksi dengan iodine membentuk komplex warna biru hitam yang terlihat pada media.  Inkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC  Setelah selesai inkubasi. Degradasi amilum membutuhkan enzim amilase yang akan memecah/menghidrolisis menjadi polisakarida yang lebih pendek (dextrin). Aktivitas enzimatis mikroorganisme : a. dan selanjutnya menjadi maltosa. Prosedur di bawah ini menunjukkan aktivitas amilase. . terdiri atas polimer glukosa yang bercabang-cabang yang diikat dengan ikatan glikosidik. Uji aktivitas eksoenzim :  Uji amilolitik  Uji lipolitik  Uji proteolitik b. secara streak. Indikator yang dipakai pada uji amilolitik adalah iodine. Warna biru hitam terjadi jika iodine masuk ke dalam bagian kosong pada amilum yang berbentuk spiral. Amilum akan bereaksi dengan iodine membentuk warna biru hitam yang terlihat pada media. Uji aktivitas endoenzim :  Uji oksidase  Uji katalase  Uji Triple Sugar Iron Agar Uji Amilolitik Amilum adalah senyawa yang memiliki berat molekul tinggi.  Hidrolisis zat pati terlihat sebagai zona jernih di sekeliling koloni. Indikator yang dipakai adalah iodine. tetesi cawan dengan lugol’s iodine secukupnya sehingga seluruh permukaan media terkena.coli dan Bacillus sp. sedangkan hasil negatif ditunjukkan warna sekitar koloni tetap biru hitam.

 Reaksi positif ditandai oleh bercak-bercak kuning disekeliling koloni. Uji proteolitik Uji proteolitik ditujukan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme menghasilkan enzim protease. Cara Kerja :  Inokulasikan Bacillus sp. sedangkan reaksi negatif ditandai oleh bercak-bercak yang tetap berwarna merah. Pada prinsipnya metode-metode di atas menggunakan indikator yang mampu mendeteksi keberadaan asam lemak yang terbentuk akibat hidrolisis lemak. mikroba menghasilkan enzim lipase dan esterase yang memecah ikatan ester menghasilkan gliserol dan asam lemak. Rodhamine Agar dan Spirit Blue Agar.Uji Lipolitik Lipid misalnya trigliserida merupakan sumber energi bagi sejumlah mikroorganisma. Untuk mendapatkan energi dari lipid. coli pada media Tributyrin Agar dengan indikator neutral red  Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Terdapat berbagai macam prosedur untuk mengetahui aktivitas lipase diantaranya adalah dengan menggunakan media Trybutirin Agar. Pada praktikum ini protein yang digunakan dalam . dan E.

sebagai akseptor elektron terakhir selama penguraian karbohidrat untuk menghsilkan energi. Dan E. Proses ini dinamakan peptonisasi atau proteolisis Cara Kerja :  Inokulasikan Bacillus sp.  Aktivitas proteolitik ditunjukkan oleh terbentuknya zone jernih di sekeliling koloni. Mikroorganisme ini menggunakan oksigen. coli pada Skim Milk Agar (SMA)  Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Enzim ini merupakan bagian dari kompleks enzim yang berperan dalam proses fosforilasi oksidatif. Positif tertunda (warna biru muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi) menandakan bahwa bakteri uji memiliki sedikit enzim. Tidak adanya perubahan warna mengindikasikan bahwa uji yang dilakukan negatif. Reagen yang digunakan adalah tetramethyl-D-phenylenediamine dihydrocloride. Hidrolisis kasein secara bertahap akan menghasilkan monomernya berupa asam amino. Reagen akan mendonorkan elektron terhadap enzim ini sehingga akan teroksidasi membentuk senyawa yang berwarna biru kehitaman. Uji Oksidase Enzim oksidase memegang peranan penting dalam transport elektron selama respirasi aerobik. dan mikroaerofilik.bentuk kasein susu. . Sitokrom oksidase mengkatalisis oksidasi dan reduksi sitokrom oleh molekul oksigen. Kemampuan bakteri memproduksi sitokrom oksidase dapat diketahui dari reaksi yang ditimbulkan setelah pemberian reagen oksidase pada koloni bakteri. Enzim oksidase dihasilkan oleh bakteri aerob. fakultatif anaerob.

Diatas object glass diberi kertas merang yang sehingga tetesan tersebar pada kertas. sedangkan bila tidak terjadi perubahan maka hasil uji negatif.    Cara Kerja : Koloni bakteri diambil satu tetes (sebaiknya dari biakan cair) secara aseptis dan diinokulasikan pada Object glass. Senyawa ini dihasilkan oleh mikroorganisme aerobik. Cara Kerja : Koloni bakteri diambil satu ose secara aseptis dan diinokulasikan pada Object glass. lalu lihat perubahan yang terjadi Jika warna berubah menjadi biru marun maka hasil uji positif. Dengan menggunakan pipet tetes. 3% H2O2 diteteskan pada Object glass secukupnya. fakultatif aerob maupun mikroaerofilik yang menggunakan jalur respirasi aerobik. Uji Katalase Selama respirasi aerobik (proses fosforilasi oksidatif).    Superoksida dismutase adalah enzim yang bertanggung jawab untuk penguraian khususnya superoksida pada organisme aerob yang bersifat katalase negatif. Hasil uji positif tertunda jika warna biru muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi. mikroorganisme menghasilkan hidrogen peroksida. Senyawa ini dalam jumlah besar akan menyebabkan kematian pada mikroorganisme. berarti bakteri tersebut mampu memproduksi enzim katalase. Jika dihasilkan gelembung gas. Amati adanya gelembung untuk hasil positif dan tidak ada gelembung untuk hasil negatif (hati-hati membedakan . bahkan ada yang menghasilkan superoksida yang sangat beracun. Produksi katalase bisa diidentifikasi dengan menanmbahkan reagen H2O2 pada suspensi bakteri. Tetesi dengan reagen. Jika tidak dihasilkan gelembung gas berarti uji katalase dinyatakan negatif.

yang bersifat gram negatif dan memfermentasikan glukosa membentuk asam sehingga dapat dibedakan dengan bakteri gram negatif intestinal lain. Media mengandung glukosa yang sangat sedikit (lebih sedikit dibanding laktosa dan sukrosa) sehingga jumlah asam pada permukaan (slant) hilang secara . Warna media mula-mula adalah merah-orange. media TSIA mengandung laktosa dan sukrosa dengan konsentrasi 1%. sedangkan warna merah pekat tampak di semua media maka interpretasinya adalah degradasi peptone secara aerob maupun anaerob. = slant merah (alkali) sedangkan butt kuning (asam) dengan atau tanpa produksi gas  hanya terjadi fermentasi glukosa. sedangkan pepton yang ada digunakan untuk sumber energi dalam keadaan aerob atau anaerob sehingga meningkatkan pH karena produksi amonia meningkat sebagai hasil samping metabolisme protein. Sel lebih memilih untuk mendegradasi glukosa terlebih dahulu karena glukosa adalah monosakarida yang dapat langsung massuk ke dalam jalur metabolisme (glikolisis). Perubahan warna menjadi kuning menandakan asam. Konsentrasi ini akan berpengaruh terhadap penggunaan karbohidrat dan keadaan asam yang terbentuk. Jika kemerahan lebih pekat pada slant maka terjadi degradasi aerobik peptone. Untuk mengamati fermentasi karbohidrat. Selain itu ditambahkan FeSO4 untuk mendeteksi adanya gas H2S.1%. Perbedaan ini didasarkan pada pola fermentasi karbohidrat dan produksi H2S pada tabung reaksi.antara gelembung yang muncul dari sel dengan kumpulan sel yang mengambang akibat ditambahi reagen). sedangkan fermentasi laktosa dan sukrosa tidak terjadi. Cara kerja : Inokulasikan biakan pada media TSIA dengan cara inokulasi tusuk kemudian dilanjutkan dengan diulaskan lurus tegak pada agar miring (lihat gambar). Uji Triple Sugar Iron Agar TSIA adalah uji yang dirancang untuk membedakan beberapa jenis bakteri yang termasuk kelompok Enterobacteriaceae.    = slant dan butt merah (alkali) atau tidak terjadi perubahan warna  tidak terjadi fermentasi karbohidrat. Inkubasi pada 37oC selama 24-48 jam. Indikator pH (Phenol Red) ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan pH akibat fermentasi karbohidrat. sedangkan warna menjadi lebih merah menendakan media menjadi basa. Interpretasikan hasil dengan melihat keterangan dibawah ini. dan mengandung glukosa dengan konsentrasi yang lebih rendah yaitu 0.

H2S ini merupakan hasil dari metabolisme protein media pecah atau terangkat  timbul gas sebagai hasil samping fermentasi .cepat menjadi basa. = slant dan butt kuning (asam) dengan atau tidak adanya gas  telah terjadi fermentasi glukosa. = butt berwarna kehitaman  adanya H2S yang bereaksi dengan senyawa besi FeSO4 pada media menghasilkan FeS yang berwarna kehitam-hitaman. karena pada mulanya bagian slant telah menjadi kuning tapi dalam waktu lebih dari 24 jam sel akan kehabisan glukosa dan memilih untuk memanfaatkan protein sehingga media menjadi merah. laktosa dan atau sukrosa karena laktosa dan sukrosa memiliki konsentrasi yang lebih tinggi sehingga dapat dimanfaatkan untuk substrat fermentasi lanjutan (jika glukosa habis) menghasilkan asam yang ditandai warna kuning setelah 24 jam.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful