PETUNJUK PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI DASAR

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO 2008

KATA PENGANTAR
Buku/Diktat petunjuk praktikum Mikrobiologi ini disusun dengan maksud dan tujuan membantu mahasiswa dalam melaksanakan praktikum Mikrobiologi Dasar. Keahlian dan keterampilan kerja di laboratorium sangat membantu dalam memahami teori yang telah diperoleh di kuliah sehingga dapat tercipta korelasi yang saling membangun antara teori dengan kenyataan. Diktat praktikum ini disusun rinci dan sistematis, dilengkapi dengan gambar sehingga memudahkan praktikan memahami dan mempersiapkan diri sebelum melakukan kegiatan praktikum. Materi yang disajikan dalam diktat ini mencakup teknik dasar yang lazim dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi pada umumnya. Harapan kami, buku ini dapat bermanfaat bagi praktikan mikrobiologi dasar serta bagi mahasiswa yang memerlukannya. Segala kritik dan saran yang bersifat membangun tentang isi buku ini sangat dihargai demi perbaikan kualitas lebih lanjut.

Purwokerto, Februari 2008

Tim Penyusun

TATA TERTIB PRAKTIKUM
Untuk menjaga keamanan 1. Praktikan harus telah mengenakan jas lab saat memasuki laboratorium dan bekerja dengan peralatan di laboratorium untuk menghindari kontaminasi dan terkena khemikalia 2. Dilarang keras makan, merokok dan minum di laboratorium 3. Sebelum dan sesudah bekerja, meja praktikum dibersihkan dengan desinfektan 4. Praktikan berambut panjang harus mengikat rambutnya sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu kerja dan menghindari dari hal-hal yang tidak diinginkan 5. Pengambilan kultur cair atau suspensi dan khemikal harus menggunakan pipet dengan bantuan filler atau menggunakan mikropipet. 6. Dilarang membuang biakan sisa atau habis pakai dan pewarna sisa disembarang tempat. Bahan tersebut harus dibuang di tempat yang telah disediakan oleh asisten. 7. Laporkan segera jika terjadi kecelakaan seperti kebakaran, biakan tumpah ada yang menelan bahan kimia, atau biakan kepada asisten 8. Jika menggunakan jarum inokulum, ujung jarum dibakar sampai memijar sesudah dan sebelum bekerja menggunakan alat ini 9. Sebelum meninggalkan laboratorium disarankan untuk mencuci tangan dengan seksama. Untuk kelancaran praktikum 1. Praktikan diwajibkan memakai jas laboratorium sebelum memasuki laboratorium dan dilepas di luar laboratorium. 2. Praktikan wajib memakai sepatu pada saat praktikum. 3. Praktikan dilarang berbicara yang tidak perlu dan membuat gaduh 4. Memakai pakaian yang sopan pada saat praktikum (baju berkrah untuk laki-laki) 5. Praktikan yang datang terlambat lebih dari 10 menit mengganti di akhir acara. 6. Praktikan yang datang terlambat lebih dari 20 menit maka wajib inhal. 7. Kuis akan dilaksanakan pada awal acara sebelum memulai praktikum untuk mengetahui sejauh mana kompetensi yang dicapai. 8. Inhal kuis akan diadakan satu kali dan nilai yang diambil adalah nilai terbaik. 9. Bagi praktikan yang akan berpindah jadwal praktikum harus seizin koordinator praktikum mikrodas dengan menyerahkan surat pengantar paling lambat dua hari berikutnya. 10. Praktikan yang tidak hadir praktikum (absen), maka disarankan ikut inhal praktikum, di mana harus membayar untuk mengganti biaya praktikum dan tenaga asisten 11. Praktikan akan dinilai keterampilannya selama praktikum oleh asisten 12. Praktikan yang tidak mengikuti asistensi tanpa keterangan tidak mendapatkan nilai pretest, tapi jika ada izin tertulis maka dapat mengikuti pretest susulan. 13. Praktikan yang tidak mengikuti pengamatan harus mengikuti pengamatan susulan. 14. Laporan harus dibawa saat masuk pada praktikum sebagai syarat masuk. 15. Praktikan yang tidak membawa laporan karena tertinggal, tetap diizinkan mengikuti praktikum tetapi harus mengambil laporan yang tertinggal pada hari itu juga dan menyerahkkannya ke asisten. 16. Aturan-aturan / tata tertib yang belum tercantum akan diputuskan kemudian.

................ Pembuatan Media ................................................................ 5.......................... Menentukan Jumlah dan Ukuran Mikroorganisme ......................................................... 3............................................. Pengaruh Faktor Lingkungan Terhadap Pertumbuhan Mikroorganisme ............ Isolasi Mikroorganisme ............................ 7... Pengenalan Alat ................................... 8.............. Morfologi Mikroorganisme . ......... 6............................................................. 4........... Aktivitas Enzimatik Mikroorganisme ......... TATA TERTIB PRAKTIKUM ...................... Daya Oligodinamik dan Antimikroba ..................................................................... DAFTAR ISI .............................................. 2................... 1................................................................................. 9........ Sterilisasi ........................................................DAFTAR ISI Halaman KATA PENGANTAR ......................................................................................................................................................................

PENGENALAN ALAT Kompetensi : mahasiswa mengenal dan mengetahui fungsi dari tiap-tiap alat Berikut daftar alat-alat mikrobiologi yang perlu dikenal: Alat-alat elektrik  Mikroskop cahaya  Mikroskop stereo  Autoklaf elektrik  Incubator  Hot plate & stirrer  Colony counter  Biological Safety Cabinet (BSC)  Mikropipet Alat-alat gelas dan keramik  Cawan Petri  Pipet ukur  Pipet tetes  Tabung reaksi  Labu Erlenmeyer  Glass beads  Mortar & pestle  Beaker glass  Buncen burner  Gelas ukur  Batang L / Drugalsky  Tabung durham Alat-alat non gelas  Jarum inokulum / ose  Pinset  Rubber bulb  pH meter universal .

Pada umumnya mata tidak mampu membedakan benda dengan diameter lebih kecil dari 0. Condenser (condenser) Untuk mengumpulkan cahaya supaya tertuju ke lensa objektif 6. Stage (meja benda) Spesimen diletakkan di sini 5. Interpupillar distance adjustment knob (pengatur jarak interpupillar) 11. Eyepiece / oculars (lensa okuler) Untuk memperbesar bayangan yang dibentuk lensa objektif 2. Specimen holder (penjepit spesimen) 12. Illuminator (sumber cahaya) 13. Observation tube (tabung pengamatan / tabung okuler) 4. Observation tube securing knob (sekrup pengencang tabung okuler) 18. Dengan mikroskop kita dapat mengamati sel bakteri yang tidak dapat dilihat dengan mata telanjang. Coarse focus knob (sekrup fokus kasar) Menaik turunkan meja benda (untuk mencari fokus) secara kasar dan cepat 16. Objective lense (lensa objektif) Memperbesar spesimen 7. Mikroskop Cahaya (Brightfield Microscope) Salah satu alat untuk melihat sel mikroorganisme adalah mikroskop cahaya. Condenser adjustment knob (sekrup pengatur kondenser) Untuk menaik-turunkan kondenser . Bagian-bagian Mikroskop: 1. Horizontal feed knob (sekrup pengatur horizontal) Untuk menggeser ke kanan / kiri objek glas 15. Brightness adjustment knob (pengatur kekuatan lampu) Untuk memperbesar dan memperkecil cahaya lampu 8. Vertical feed knob (sekrup pengatur vertikal) Untuk menaikkan atau menurunkan object glass 14. berikut merupakan uraian tentang cara penggunaan bagian-bagiandan spesifikasi mikroskop cahaya merk Olympus CH20 yang dimiliki Laboratorium Mikrobiologi. Revolving nosepiece (pemutar lensa objektif) Untuk memutar objektif sehingga mengubah perbesaran 3. Fine focus knob (sekrup fokus halus) Menaik turunkan meja benda secara halus dan lambat 17.1 mm. Main switch (tombol on-off) 9. Diopter adjustmet ring (cincin pengatur diopter) Untuk menyamakan focus antara mata kanan dan kiri 10.

Letakan objek glas diatas meja benda (4) kemudian jepit dengan (11). hal ini akan mengubah dua bayangan yang akan diterima oleh 2 mata menjadi gambar yang tunggal sehingga sangat membantu dalam mengatasi kelelahan mata b.Cari bagian dari objek glas yang terdapat preparat ulas (dicari dan diperkirakan memiliki gambar yang jelas) dengan memutar sekrup vertikal dan horizontal (13) dan (14) 3. maka meja benda tidak perlu diturunkan dan tidak perlu khawatir bahwa lensa objektif akan menggesek cover glass karena terdapat sisa jarak A yang lebih kecil antara cover glass dengan lensa objektif (lihat tabel diatas).Prosedur Operasi 1. dan ingin memutar objektif ke perbesaran 100x. 4. akan semakin kuat kemampuan lensa untuk memisahkan dua titikyang berdekatan pada preparat sehingga struktur benda terlihat lebih jelas. diturunkan dengan sekrup kasar (15) b. Misal = Okuler (10x) x Objektif (40x) = 400x Penggunaan minyak imersi Semakin kecil nilai daya pisah. Jika perlu diopter adjustment knob (9) dapat diatur untuk memperoleh bayangan focus yang seimbang antara mata kanan dan kiri c. Lakukan hal yang sama jika menggunakan perbesaran yang lebih tinggi Berikut adalah tabel yang menunjukan jarak antara spesimen dengan lensa objektif jika okus telah didapatkan Perbesaran objektif Jarak A (mm) 4x 29 10x 6. Jika meja benda belum turun. maka putar (2) pada perbesaran selanjutnya yaitu perbesaran objektif 10x.53 60x 0.29 Catatan: Setelah mendapatkkan fokus pada perbesaran tetentu.Setelah fokus perbesaran 4 x 10 didapatkan. Daya pisah dapat diperkuat dengan memperbesarkan indeks bias atau menggunakan cahaya yang memiliki panjang gelombang (λ) pendek. Menyalakan lampu a. Biasanya dapat digunakan minyak imersi untuk meningkatkan indeks bias pada perbesaran 10 x 100 .3 40x 0. Tambahan a. tekan tombol on (8) b. Putar Revolving nosepiece (2) pada perbesaran objektif 4x lalu putar sekrup kasar (15) sehingga meja benda bergerak ke atas untuk mencari fokus b. misal 40x. Memfokuskan a. kemudian putar sekrup halus (16) untuk mendapatkan fokusnya c. atur kekuatan lampu dengan memutar bagian (7) 2. Menempatkan spesimen pada meja benda a. Jika perlu interpupillar distance adjustment knob (10) dapat digeser. Pengaturan condenser (5) akan memperjelas bayangan yang tampak dengan mensetting pada posisi tertinggi (cahaya penuh) Perbesaran total Ukuran specimen yang diamati dapat diperoleh dengan mengalikan perbesaran lensa okuler dengan lensa objektif.

jepit jika perlu 2. Berikut merupakan uraian tentang mikroskop stereo yang dimiliki Laboratorium Mikrobiologi yaitu Zoom Stereo Microscope. Stage clip (penjepit spesimen / preparat) Prosedur operasi 1. tetesi minyak imersi 1 – 2 tetes dari sisi lensa c.a. Focusing knob (sekrup pengatur fokus) 5. Stage plate (pelat tempat specimen diletakkan) 6. Atur perbesaran pada perbesaran terkecil dengan memutar Zoom Control Knob (3) kemudian dicari fokusnya dengan memutar Focusing Knob (4) 3. Jika ingin mendapatkan bayangan yang lebih besar. Jika telah selesai menggunakan mikroskop. Letakkan spesimen / preparat di stage plate (5).67 x 0.7 x 9x 10 x 20 x 40 x . putar Zoom Control Knob (3) ke perbesaran yang lebih tinggi kemudian dicari fokusnya Mikroskop ini memiliki pilihan perbesaran: Okuler Objektif 0. Diopter adjustment ring (cincin pengatur diopter) 3. Oculars eyepiece (lensa okuler) 2. Olimpus SZ3060. Jika fokus pada perbesaran 10 x 40 telah didapatkan maka putar ke perbesaran objektif 100x b. 1. Zoom control knob (sekrup pengatur pembesaran) 4. Di Laboratorium Mikrobiologi. bersihkan lensa objektif 100x dengan kertas lensa yang dibasahi xylol 1  2 1 2 Mikroskop stereo (Zoom Stereo Microscope) Mikroskop ini berfungsi untuk melihat objek yang membutuhkan perbesaran tidak terlalu besar.9 x 10 x 1x 2x 4x total 6. mikroskop stereo biasanya digunakan untuk mengamati secara detail bentuk koloni dan jamur.

pengukur tekanan 4. Kisaran suhu untuk inkubator produksi Heraeus B5042 misalnya adalah 10-70oC. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi2 (15 Psi = 15 pounds per square inch). Masukkan peralatan dan bahan. Katup pengeluaran uap 3. Jika mensterilisasi botol beretutup ulir. Sekrup pengaman 10. Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang keluar dari bibir autoklaf. maka tutup harus dikendorkan.  Inkubator (Incubator) Inkubator adalah alat untuk menginkubasi atau memeram mikroba pada suhu yang terkontrol. maka tunggu tekanan dalam kompartemen turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure gauge menunjuk ke angka nol). Autoklaf (Autoclave) Diagram autoklaf vertical 1. Alat ini dilengkapi dengan pengatur suhu dan pengatur waktu. batas penambahan air Autoclave adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan. kelep pengaman 5. 2. 5. Jika air kurang dari batas yang ditentukan. 3. untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat. Gunakan air hasil destilasi. Lempeng sumber panas 8. Lama sterilisasi yang dilakukan biasanya 15 menit untuk 121oC. Cara Penggunaan : 1. Termometer 7. diatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu 121oC. 6. Penghitungan waktu 15’ dimulai sejak tekanan mencapai 2 atm. . Jika alarm tanda selesai berbunyi. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu 121oC (250oF). Tombol pengatur waktu mundur (timer) 2. Nyalakan autoklaf. Aquades (dH2O) 9.. Kemudian klep pengaman ditutup (dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. Tunggu samapai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf dan terdesak keluar dari klep pengaman. 4. Klep pengaman jangan dikencangkan terlebih dahulu. maka dapat ditambah air sampai batas tersebut. Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan keluarkan isi autoklaf dengan hati-hati. Tombol on-off 6.

Pelat (plate) yang terdapat dalam alat ini dapat dipanaskan sehingga mampu mempercepat proses homogenisasi. selanjutnya matikan segera sebelum mulai bekerja 2. Prosedur penggunaan BSC seri 36212. Jangan menggunakan pembakar Bunsen dengan bahan bakar alkohol tapi gunakan yang berbahan bakar gas. Kerja secara aseptis dan jangan sampai pola aliran udara terganggu oleh aktivitas kerja 11. Pengadukan dengan bantuan batang magnet Hot plate dan magnetic stirrer seri SBS-100 dari SBS® misalnya mampu menghomogenkan sampai 10 L. Hot plate stirrer dan Stirre bar Hot plate stirrer dan Stirrer bar (magnetic stirrer) berfungsi untuk menghomogenkan suatu larutan dengan pengadukan.  Colony counter Alat ini berguna untuk mempermudah perhitungan koloni yang tumbuh setelah diinkubasi di dalam cawankarena adanya kaca pembesar. Biarkan selama 5 menit 5. masukkan alat dan bahan yang akan dikerjakan. setelah selesai bekerja. dengan kecepatan sangat lambat sampai 1600 rpm dan dapat dipanaskan sampai 425oC. Nyalakan lampu neon dan blower 4. Selain itu alat tersebut dilengkapi dengan skala/ kuadran yang sangat berguna untuk pengamatan pertumbuhan koloni sangat banyak.  Biological Safety Cabinet Biological Safety Cabinet (BSC) atau dapat juga disebut Laminar Air Flow (LAF) adalah alat yang berguna untuk bekerja secara aseptis karena BSC mempunyai pola pengaturan dan penyaring aliran udara sehingga menjadi steril dan aplikasisinar UV beberapa jam sebelum digunakan. Usap permukaan interior BSC dengan alkohol 70 % atau desinfektan yang cocok dan biarkan menguap 7. Hidupkan lampu UV selama 2 jam. Jumlah koloni pada cawan Petri dapat ditandai dan dihitung otomatis yang dapat di-reset. Cuci tangan dan lengan dengan sabun gemisidal / alkohol 70 % 6. 10. biarkan 2-3 menit supaya kontaminan tidak keluar dari BSC . jangan terlalu penuh (overload) karena memperbesar resiko kontaminan 8. Atur alat dan bahan yang telah dimasukan ke BSC sedemikian rupa sehingga efektif dalam bekerja dan tercipta areal yang benar-benar steril 9. Pastikan kaca penutup terkunci dan pada posisi terendah 3. Purifier™ Biological Safety Cabinet dari LABCONCO yang dimiliki laboratorium mikrobiologi adalah sebagai berikut: 1.

Jika ingin melepas tip putar Thumb Knob searah jarum jam dan ditekan maka tip akan terdorong keluar dengan sendirinya. Tahan pipet dalam posisi vertikal kemudian lepaskan tekanan dari Thumb Knob maka cairan akan masuk ke tip. atau menggunakan alat tambahan yang berfungsi mendorong tip keluar. Usap permukaan interior BSC dengan alkohol 70 % dan biarkan menguap lalu tangan dibasuh dengan desinfektan 13. 8. Tekan Thumb Knob sampai hambatan pertama / first stop. mukropipet memerlukan tip. Masukkan tip ke dalam cairan sedalam 3-4 mm. Cawan petri tersedia dalam berbagai macam ukuran. Banyak pilihan kapasitas dalam mikropipet. 6. 5. Sebelum digunakan Thumb Knob sebaiknya ditekan berkali-kali untuk memastikan lancarnya mikropipet. 7. misalnya mikropipet yang dapat diatur volume pengambilannya (adjustable volume pipette) antara 1µl sampai 20 µl. jangan ditekan lebih ke dalam lagi. 4. diameter cawan yang biasa berdiameter 15 cm dapat menampung media sebanyak 15-20 ml. . sedangkan cawan berdiameter 9 cm kira-kira cukup diisi media sebanyak 10 ml. 2.  Cawan Petri (Petri Dish) Cawan petri berfungsi untuk membiakkan (kultivasi) mikroorganisme. Masukkan Tip bersih ke dalam Nozzle / ujung mikropipet. dalam penggunaannya. atau mikropipet yang tidak bisa diatur volumenya. Medium dapat dituang ke cawan bagian bawah dan cawan bagian atas sebagai penutup. Tekan Thumb Knob sampai hambatan kedua / second stop atau tekan semaksimal mungkin maka semua cairan akan keluar dari ujung tip. 3. biasanya kurang dari 1000 µl. hanya tersedia satu pilihan volume (fixed volume pipette) misalnya mikropipet 5 µl. Mikropipet tip Cara Penggunaan : 1. Pindahkan ujung tip ke tempat penampung yang diinginkan. Matikan lampu neon dan blower  Mikropipet (Micropippete) dan Tip Mikropipet adalah alat untuk memindahkan cairan yang bervolume cukup kecil.12.

100 ml. Cara penggunaanya adalah cairan disedot dengan pipet ukur dengan bantuan filler sampai dengan volume yang diingini. 50 ml. Pipet Ukur (Measuring Pippete) Pipet ukur merupakan alat untuk memindahkan larutan dengan volume yang diketahui. perlu diperhatikan tentang kemiringan media yaitu luas permukaan yang kontak dengan udara tidak terlalu sempit atau tidak terlalu lebar dan hindari jarak media yang terlalu dekat dengan mulut tabung karena memperbesar resiko kontaminasi. Volume yang dipindahkan dikeluarkan menikuti skala yang tersedia (dilihat bahwa skala harus tepat sejajar dengan mensikus cekung cairan) dengan cara menyamakan tekanan filler dengan udara sekitar. bahan atau cairan yang. Untuk membuat agar miring. Untuk alas an efisiensi. yaitu media agar tegak (deep tube agar) dan agar miring (slants agar). media yang ditambahkan berkisar 10-12 ml tiap tabung. 1000 ml. menampung akuades. diantaranya pipet berukuran 1 ml. penambahan reagen ada uji biokimia. Tersedia berbagai macam ukuran kapasitas pipet ukur. Media padat yang dimasukkan ke tabung reaksi dapat diatur menjadi 2 bentuk menurut fungsinya. . 300 ml.Tabung reaksi dapat diisi media padat maupun cair.  Pipet tetes (Pasteur Pippete) Fungsinya sama dengan pipet ukur. dsb. namun volume yang dipindahkan tidak diketahui. Labu Erlenmeyer dapat digunakan untuk meracik dan menghomogenkan bahan-bahan komposisi media. tutup metal. Terdapat beberapa pilihan berdasarkan volume cairan yang dapat ditampungnya yaitu 25 ml. 5 ml dan 10 ml. tutup plastik atau aluminium foil. 250 ml. tabung reaksi digunakan untuk uji-uji biokimiawi dan menumbuhkan mikroba. 500 ml. dll. dll. Tutup tabung reaksi dapat berupa kapas. kultivasi mikroba dalam kultur cair.  Labu Erlenmeyer (Erlenmeyer Flask) Berfungsi untuk menampung larutan. Salah satu penerapannya adalah dalam menambahkan HCl / NaOH saat mengatur pH media.  Tabung reaksi (Reaction Tube / Test Tube) Di dalam mikrobiologi.

menampung akuades dll.. .  Pembakar Bunsen (Bunsen Burner) Salah satu alat yang berfungsi untuk menciptakan kondisi yang steril adalah pembakar bunsen.  Batang L (L Rod) Batang L bermanfaat untuk menyebarkan cairan di permukaan agar supaya bakteri yang tersuspensi dalam cairan tersebut tersebar merata. Perubahan bunsen dapat menggunakan bahan bakar gas atau metanol. Alat ini juga disebut spreader. Api yang menyala dapat membuat aliran udara karena oksigen dikonsumsi dari bawah dan diharapkan kontaminan ikut terbakar dalam pola aliran udara tersebut. Di dalam mikrobiologi.  Beaker Glass Beaker glass merupakan alat yang memiliki banyak fungsi. Gelas ukur (Graduated Cylinder) Berguna untuk mengukur volume suatu cairan. sebaiknya volume tersebut ditentukan berdasarkan meniskus cekung larutan. Pada saat mengukur volume larutan. roti atau tanah sebelum diproses lebih lanjut. dapat digunakan untuk preparasi media media. misal daging. Glass beads digunakan pada teknik spread plate yang fungsinya sama dengan batang L atau Spreader.  Glass Beads Glass Beads adalah manik-manik gelas kecil yang digunakan untuk meratakan suspensi biakan dengan menyebarkan beberapa butir di atas permukaan agar dan digoyang merata. gelas ukur memiliki beberapa pilihan berdasarkan skala volumenya. seperti labu erlenmeyer. Untuk sterilisasi jarum ose atau yang lain.  Mortar dan Pestle Mortar dan penumbuk (pastle) digunakan untuk menumbuk atau menghancurkan materi cuplikan. bagian api yang paling cocok untuk memijarkannya adalah bagian api yang berwarna biru (paling panas).

Jarum inokulum biasanya terbuat dari kawat nichrome atau platinum sehingga dapat berpijar jika terkena panas. Karet sebagai bahan filler merupakan karet yang resisten bahan kimia. Katup yang bersimbol A (aspirate) berguna untuk mengeluarkan udara dari gelembung. sedangkan inoculating needle cocok digunakan untuk inokulasi secara tusukan pada agar tegak (stab inoculating). Kertas pH indikator dicelupkan sampai tidak ada perubahan warna kemudian strip warna dicocokkan dengan skala warna acuan. Bentuk ujung jarum dapat berbentuk lingkaran (loop) dan disebut ose atau inoculating loop/transfer loop. Filler memiliki 3 saluran yang masing-masing saluran memiliki katup. . Penempatannya terbalik dalam tabung reaksi dan harus terendam sempurna dalam media (jangan sampai ada sisa udara).  Jarum Inokulum Jarum inokulum berfungsi untuk memindahkan biakan untuk ditanam/ditumbuhkan ke media baru. Kemudian katup E (exhaust) berfungsi untuk mengeluarkan cairan dari pipet ukur.  Pinset Pinset memiliki banyak fungsi diantaranya adalah untuk mengambil benda dengan menjepit misalnya saat memindahkan cakram antibiotik. Jarum inokulum ini akan sangat bermanfaat saat membelah agar untuk preprasi Heinrich’s Slide Culture.  pH Indikator Universal berguna untuk mengukur/mengetahui pH suatu larutan. S (suction) merupakan katup yang jika ditekan maka cairan dari ujung pipet akan tersedot ke atas. Tabung Durham Tabung durham berbentuk mirip dengan tabung reaksi namun ukurannya lebih kecil dan berfungsi untuk menampung/menjebak gas yang terbentuk akibat metabolisme pada bakteri yang diujikan.  Pipet Filler / Rubber Bulb Filler adalah alat untuk menyedot larutan yang dapat dipasang pada pangkal pipet ukur. dan yang berbentuk lurus disebut inoculating needle/Transfer needle. Hal ini sangat penting dalam pembuatan media karena pH pada media berpengaruh terhadap petumbuhan mikroba. Inoculating loop cocok untuk melakukan streak di permukaan agar.

 gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar. Bahan dasar  air (H2O) sebagai pelarut  agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. unsur mikro seperti Fe. Nutrisi atau zat makanan Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C.1 Berdasarkan sifat fisik c. Mg dan unsur pelikan/trace element. yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. 2. Agar sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45 o C. lemak. Pembuatan Nutrient Agar dan Nutrient Broth e.MEDIA PERTUMBUHAN Kompetensi : Mahasiswa dapat membuat media pertumbuhan Nutrient Agar dan Potato Dextrose Agar Media pertumbuhan : a. Kekurangannnya adalah lebih banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar. H. O. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekulmolekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel.4 Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media c. Pengertian dan fungsi b.  Silica gel. protein dan asam organik. Bahan-bahan media pertumbuhan b. P. . Fungsinya juga sebagai pemadat media.1 Bahan dasar b. Bahan-bahan media pertumbuhan 1. Pembuatan Potato Dextrose Agar Pengertian dan Fungsi Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Jasad heterotrof memerlukan sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat. Macam-macam media pertumbuhan c. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan media bagi mikroorganisme autotrof obligat.3 Berdasarkan tujuan d.  Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik atau anorganik esuai dengan sifat mikrobanya. N. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya.3 Bahan tambahan b.2 Nutrisi atau zat makanan b.2 Berdasarkan komposisi c. Gelatin adalah polimer asam amino yang diproduksi dari kolagen.

 Yeast extract. Untuk melarutkannya harus diasuk dan dipanasi. Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya. Kegunaannya adalah sebagai pemadat (gelling) yang pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther Hesse untuk membuat media. darah. contohnya adalah NB (Nutrient Broth). manitol. agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan. Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. misalnya phenol red (indikator asam basa) ditambahkan untuk indikator perubahan pH akibat produksi asam organik hasil metabolisme. kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media. Macam-Macam Media Pertumbuhan 1. 3. Antibiotik ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba nontarget/kontaminan. Jika dicampur dengan air dingin. galaktosa. plasenta dan daging sapi. jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur.  Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar. protein atau senyawa bernitrogen lain.5-1%. 2. Bahan tambahan Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan tujuan tertentu. terutama pada pH yang asam  Peptone. pencairan dan pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan kekuatan agar.  Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0. limpa. Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media  Agar. susu. tidak begitu cair. Meat extract mengandung basa organik terbuat dari otak. fruktosa. casein. dll. agar tidak akan larut. Yeast extract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alcohol. misalnya pada media Nitrate Broth.. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen. LB (Lactose Broth). Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media. Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea. granula atau bubuk dan terbuat dari beberapa jenis rumput laut. Jenis karbohidrat yang umumnya digunkan dalam amilum.  Karbohidrat. Medium berdasarkan komposisi .  Vitamin-vitamin. tidak padat. Sumber nitrogen mencakup asam amino. liver. Medium berdasarkan sifat fisik  Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media menjadi padat. lactalbumin.3-0. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (B complex). Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0.  Meat extract. peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot. sukrosa. glukosa. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam amino dan gas dari karbohidrat. gelatin dan kedelai. 4.4% sehingga menjadi sedikit kenyal.

Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak.. Ampiciline. misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk. Bile Agar.  Media untuk karakterisasi bakteri Media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu mikroba.  Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya. . Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Lactose Broth. Pancreatic Extract. Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka.  Media untuk peremajaan kultur Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur  Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik. Untuk bahan ekstrak kentang.  Media diperkaya (enrichment) Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah. Arginine Agar. Serum Agar. misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar. dll.  Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti.  Media selektif/penghambat Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. misalnya Nutrient Broth. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Blood Agar. tetapi membutuhkan komponen kompleks. Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba. yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon.  Media diferensial Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial.. Medium berdasarkan tujuan  Media untuk isolasi Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba. Brain Heart Infusion Agar. misalnya Tomato Juice Agar. misalnya Glucose Agar. dekstrosa dan ekstrak kentang. warna.  Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti.3. ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni. Contohnya adalah Koser’s Citrate medium. kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya. Salt broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam. kuning telur. Contohnya adalah Nitrate Broth. misalnya Blood Tellurite Agar. Mac Conkey Agar. serum.

Proses pembuatan ini tidak memerlukan panas. Jika diinginkan media tegak atau miring pada point ke 5. Proses pembuatannyapun lebih sederhana.  Setelah keduanya larut. larutan dituangkan ke larutan agar dan diaduk sampai homogen. karena akan terbentuk busa dan memuai sehingga tumpah). tinggal melarutkan peptone dan beef extract kemudian ditampung dalam labu Erlenmeyer atau tabung reaksi dan siap disterilisasi. Kemudian pH media diukur dengan mencelupkan kertas pH indikator.d 1000 ml . peptone dan beef extract akan mudah larut sempurna pada air suhu kamar jika diaduk Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA)  Timbang komponen media dengan menggunakan timbangan analitis untuk volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut:  Potato/kentang 3g  Peptone 5g  Agar 15 g  Akuades s.  Sementara itu sebagian akuades digunakan untuk melarutkan peptone dan beef extract. Sebaiknya air untuk melarutkan agar lebih banyak  Larutkan agar pada sebagian air tersebut dengan mengaduk secara konstan dan diberi panas.d 1000 ml  Akuades sebanyak 100 ml dibagi menjadi dua satu bagian untuk melarutkan Beef extract dan peptone dan sebagian lagi untuk melarutkan agar. media langsung dituang ke tabung kemudian disterilisasi.  Tuang media steril ke cawan petri steril secara aseptis.  Pembuatan Nutrient Broth Komposisi untuk media NB sama dengan NA tetapi tidak memakai agar sebagai pemadat. cukup dengan pengadukan.Pembuatan Nutrient Agar dan Nutrient Broth  Pembuatan Nutrient Agar  Timbang komponen medium dengan menggunakan timbangan analitis untuk volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut:  Beef extract 3g  Peptone 5g  Agar 15 g  Akuades s.  Setelah itu media dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan disterilisasi dengan autoklaf. Jika pH tidak netral maka dapat ditambahkan HCl/NaOH. Dapat menggunakan kompor gas atau hot plate stirrer (jangan sampai overheat.

sebaiknya kentang dikupas dan diiris kecil-kecil)  Rebus kentang dalam sebagian akuades tadi selama 1-3 jam sampai lunak. Setelah semua larut.  (sebelum ditimbang. ekstrak kentang dan agar-dekstrosa dicampur dan dihomogenkan. kemudian diambil ekstraknya dengan menyaring dan memerasnya menggunakan kertas saring lalu ditampung di Beaker glass baru. Agar dilarutkan dengan Hot Plate Stirrer dalam 50 ml akuades lalu setelah larut dapat ditambahkan dekstrosa dan dihomogenkan lagi. Media dituang ke dalam Erlenmeyer atau ke tabung reaksi kemudian siap untuk disterilisasi. Atur pH media menjadi 5-6 dengan meneteskan HCl/NaOH.   .

tyndalisasi mahasiswa dapat melakukan kerja aseptis Sterilisasi : 1. Prinsip cara kerja autoklaf 5.STERILISASI Kompetensi : mahasiswa mengetahui sterilisasi dengan autoklaf. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) b. filtrasi.Dengan api langsung . Pengertian sterilisasi 2. Mensterilkan meja kerja b. Pipetting 4. Macam-macam sterilisasi a. Prosedur/Teknik aseptis a. Sterilisasi dengan udara panas 8. Sterilisasi secara kimia  dengan larutan disinfektan 3. Tyndalisasi 7.Uap air panas . Menuang media d.Uap air panas bertekanan  Penyinaran UV c. Sterilisasi secara fisik  Pemanasan .Panas kering . Sterilisasi dengan cara penyaringan 6. Prinsip kerja Biological Safety Cabinet . Memindahkan biakan (streak) c.

dll. . misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV 3. Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung. misal nya larutan enzim dan antibiotik. Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. tabung reaksi dll. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas.  Pemanasan a.22mikron atau 0. Sterilisai secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0. batang L. Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-1800C. fisik dan kimiawi. Macam-macam sterilisasi Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik. contoh alat : jarum inokulum.Pengertian Sterilisasi yaitu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda dari semua bentuk kehidupan.45 mikrob) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. 2. 1. Bahan yang mengandung air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi. Uap air panas bertekanan : menggunalkan autoklaf  Penyinaran dengan UV Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi. c. b. d. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran. Sterilisaisi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer. pinset.

Berbagai prosedur umum kerja dalam mikrobiologi yang membutuhkan teknik aseptis Desinfeksi meja kerja .

batang L. 3. 2. Usahakan bagian alat yang diharapkan dalam kondisi steril didekatkan ke bagian api. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut . Biasanya untuk mesterilkan media digunakan suhu 1210C dan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103. 5. Ujung jarum inokulum yang sudah dipijarkan harus ditunggu dingin dahulu atau dapat ditempelkan tutup cawan bagian dalam untuk mempercepat transfer panas yang terjadi. autoklaf adalah alat untuk memsterilkan berbagai macam alat & bahan yang menggunakan tekanan 15 psi (2 atm) dan suhu 1210C. Pinset.Saran-saran kerja aseptis : 1. Jika kerja di Safety Cabinet tidak perlu memakai pembakar bunsen tetapi jika di luar Safety Cabinet maka semakin banyak sumber api maka semakin terjamin kondisi aseptisnya Prinsip cara kerja autoklaf Seperti yang telah dijelaskan sebagian pada bab pengenalan alat. dll dapat disemprot dengan alkohol terlebih dahulu lalu dibakar. 4. Alasan digunakan suhu 1210C atau 249. Untuk cara kerja penggunaan autoklaf telah disampaikan di depan. Sebelum membuka ruangan atau bagian steril di dalam tabung/cawan/erlenmeyer sebaiknya bagian mulut (bagian yang memungkinkan kontaminan masuk) dibakar/dilewatkan api terlebih dahulu. Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas.8 0F adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika digunakan tekanan 15 psi.4 Kpa) selama 15 menit.

Setelah proses sterilisasi selesai. pencoklatan (media menjadi coklat) dan hancurnya substrat dapat dilakukan pencegahan sbb :  Glukosa disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa fosfat  Senyawa fosfat disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa garam mineral lain. seperti SDS Untuk mencegah terjadinya presipitasi. Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 1210C dan tekanan 15 psi selama 15 menit. Setelah proses sterilisai lalu ditumbuhkan pada media. Cairan yang disterilisasi dilewatkan ke suatu saringan (ditekan dengan gaya sentrifugasi atau pompa vakum) yang berpori dengan diameter yang cukup kecil untuk menyaring bakteri. . lazimnya mikroba ini tersedia secara komersial dalam bentuk spore strip. Beberapa media atau bahan yang tidak disterilkan dengan autoklaf adalah :  Bahan tidak tahan panas seperti serum. vitamin. Ingat kejadian ini hanya berlaku untuk sea level. Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi) Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk mensterilisasi cairan yagn mudah rusak jika terkena panas atu mudah menguap (volatile). maka pengaturan tekanan perlu disetting ulang. Jika mensterilkan media 1L yang ditampung pada erlenmeyer 2L maka sterilisasi diatur dengan waktu 30 menit. Misalnya autoklaf diletakkan pada ketinggian 2700 kaki dpl. maka tekanan dinaikkan menjadi 20 psi supaya tercapai suhu 1210C untuk mendidihkan air.. Setelah semua udara dalam autoklaf diganti dengan uap air.  Senyawa garam mineral disterilkan terpisah dengan agar  Media yang memiliki pH > 7.0 Erlenmeyer hanya boleh diisi media maksimum ¾ dari total volumenya. sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi. Pada saat sumber panas dinyalakan.(sea level) air mendidih pada suhu 1000C. jika dilaboratorium terletak pada ketinggian tertentu.5 jangan disterilkan dengan autoklaf  Jangan mensterilisasi larutan agar dengan pH < 6. Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi. antibiotik. katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik. seperti fenol  Buffer engan kandungan detergen. Jika media tetap bening maka menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan baik. maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur. dan enzim  Paelarut organik. Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan sempurna dapat digunakan mikroba pengguji yang bersifat termofilik dan memiliki endospora yaitu Bacillus stearothermophillus. sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di ketinggian sama. air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. menggunakan tekanan 15 psi maka air akan memdididh pada suhu 1210C. Virus tidak akan tersaring dengan metode ini. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai. sisa ruang dibirkan kosong. Kertas spore strip ini dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan.

Ditekan dengan gaya setrifugasi . .Volume 20-1000 ml  Disposable filter cup unit .  setelah semua larutan melewati membran filter dan tertampung dierlenmeyer. membran penyaring (kertas saring) dan erlenmeyer penampung.  Hubungkan katup erlenmeyer dengan pompa vakum kemudian hidupkan pompa.Disedot dengan pompa vakum .  Pasang atau rakit alat-alat tersebut secara aseptis (sesuai gambar).Volume 1-20 ml  Spin filters .Sterilisasi dengan penyaringan dapat dilakukan dengan berbagai cara :  Non-disposable filtration apparatus .Volume 15-1000 ml  Syringe filters . maka larutan dapat dipindahkan kedalam gelas penampung lain yang sudah steril dan tutup dengan kapas atau aluminium foil yang steril.Ditekan seperti jarum suntik . lalu isi corong dengan larutan yang akan disterilkan. Chamberland Zeitz).Disedot dengan pompa vakum .Volume 15-1000 ml  Disposable filtration unit dengan botol penyimpan .Disedot dengan pompa vakum .Volume kurang dari 1 ml Cara kerja menggunakan Non-disposable filtration apparatus  Sterilkan saringan (dapat menggunakan saringan Bekerfeld.

Berbagai kelas Biological Safety Cabinet. Sterilisasi dengan udara panas (Dry heat sterilization) Sterilisasi dengan metode ini biasanya digunakan untuk peralatan gelas seperti cawan petri. Alat gelas yang disterilisasi dengan udara panas tidak akan timbul kondensasi sehingga tidak ada tetes air (embun) didalam alat gelas. aliran udara keluar disaring dengan saringan HEPA Kelas II Sebagaian.  Setelah 24 jam. Bahan yang mengandung air dan tidak tahan tekanan atau suhu tinggi lebih tepat disterilkan dengan metode ini.  Bungkus alat-alat gelas dengan kertas payung atau aluminium foil  Atur pengatur suhu oven menjadi 1800C dan alat disterilkan selama 2-3 jam. terdapat perlindungan sempurna (Gloves box) dan udara disaring dengan saringan HEPA . bahan tersebut di sterilkan lagi dengan cara yang sama. Perlindungan untuk praktikan/pen elitian Kelas I Sebagian. aliran udara keluar disaring dengan saringan HEPA Kelas III Semua.Tyndalisasi Konsep kerja metode ini merip dengan mengukus. BSC memiliki suatu pengatur aliran udara yang menciptakan aliran udara kotor (dimungkinkan ada kontaminan) untuk disaring dan diresirkulasi melalui filter. sedang waktu ini dimaksudkan untuk memberi kesempatan spora atau sel vegetatif yang belum mati untuk tumbuh sehingga mudah dibunuh.  Nyalakan sumber panas dan tunggu hingga termometer menunjukkan suhu 1000C kemudian hitung waktu mundur hingga 30 menit (uap panas yang terbentuk akan mematikan mikroba).  Setelah selesai alat sterilisasi dimatikan dan bahan yang steril dikeluarkan. Aliran udara diatur untuk menghambat udara luar masuk dan udara di dalam keluar. untuk mencegah kontaminasi dari luar dan pencemaran bakteri dari ruang BSC. Misalnya susu yang disterilkan dengan suhu tinggi akan mengalami koagulasi dan bahan yang berpati disterilkan pada suhu bertekanan pada kondisi pH asam akan terhidrolisis. Udara yang keluar disaring melewati penyaring sehingga sel-sel yang berbahaya tidak lepas keluar ke ruangan lain. pipet ukur dan labu erlenmyer. dan juga dikenal dengan Laminar flow hood atau Class II vertical flow cabinet yang menyediakan alat filtrasi dan aliran udara yang bersirkulasi didalam ruang kerja. Prinsip kerja Biological Saferty Cabinet Biological Safety Cabinet merupakan kabinet kerja yang sterilkan untuk kerja mikrobiologi.  Erlenmeyer/botol lalu dimasukkan kedalam alat sterilisasi (alat standar menggunakan Arnold Steam Sterilizen atau dandang). Cara kerja :  Bahan dimasukkan kedalam erlenmeyer atau botol dan ditutup rapat dengan sumbat atau aluminium foil. BSC juga disebut biosafety hood.

udara masuk disaring terlebih dahulu Ada. larutan yang volatil Ada. Kemudian udara kotor ini disaring oleh penyaring HEPA dan disirkulasikan keluar kabinet atau kembali lagi ke meja kerja sebagai udara bersih.Perlindungan untuk alat dan bahan Tidak ada. Udara yang berasal dari luar kabinet akan langsung terserap masuk kesaluran bawah yang bergabung dengan udara dari meja kerja yang dimungkinkan mengandung bakteri yang digunakan untuk kerja. . tidak ada area kerja yang steril karena uadara luar dapat masuk melewati area kerja Kerja dengan bahan kimia yang karsinigen bahan kimia beradiasi rendah. udara masuk disaring dan memiliki sirkulasi udara yang lebih sederhana Kerja dengan bahan kimia yang sangat berbahaya atau dengan mikroorganisme yang sangat patogen Cocok untuk Kerja untuk membiakkan sel atau kerja mikrobiologi BSC yang dimiliki Lab mikrobiologi merupakan BSC kelas II yang memiliki konfigurasi udara seperti gambar disamping ini. Udara dari meja kerja disedot dari depan meja kerja.

. Jika beerasal dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir botol melawan arus air. Isolasi Mikroorganisme: a. Isolasi dengan cara pengenceran 1) Teknik preparasi suspensi  Swab  Rinse  Maserasi 2) Teknik pengenceran bertingkat 3) Teknik penanaman  Dari suspensi (spread dan pour plate)  Dengan goresan (streak dan quadrant streak inoculation) d. Di dalam laboratorium populasi bakteri inidapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi. Pengertian b. sifat dan kemampuan biokimiawinya. Sampel tanah Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah. Prosedur isolasi bakteri dari sampel e. maka cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan. tetapi terdiri dari campuran berbagai macam sel. Teknik Pengambilan Sampel Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel. 2. . jika ingin mengambil sampel dari air keran maka sebelumya keran dialirkan dulu beberapa saat dan mulut kran dibakar. botol dapat dicelupkan dengan tali. Prosedur isolasi jamur dari sampel Pengertian Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya. Berikut merupakan prosedur pengambilan sampel. 1. Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang. Teknik Pengambilan sample c. Misal jika yang diinginkan mikroorganisma rhizosfer maka sampel diambil dari sekitar perakaran dekat permukaan hingga ujung perakaran.ISOLASI MIKROORGANISME Kompetensi: mahasiswa dapat memisahkan mikroba dari campurannya sehingga didapat kultur murni. Sampel air Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri.

buah dll. c. Swab (ulas). Contohnya sampel daun diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan akuades 45 ml yang terdapat dalam beaker glass. Maseration (pengancuran). Penentuan besarnya atau banyaknya . Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke dalam larutan atraktan semisal pepton water. sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air. Unutk sampel dari tanh tak perlu dimaserasi 2. Teknik Preparasi Suspensi Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Contohnya adalah meja. Perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v). Teknik Pengenceran Bertingkat Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. misalnya daun bunga dll. batang kayu dll. batu. Macam-macam preparsi bergantung kepada bentuk sampel : a. Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel yang memiliki permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut. Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil. Rinse merupakan prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9 (w/v). Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan permukaan sampel.Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution) 1. Contoh sampelnya antar alain bakso. biji. b.

Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung 10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama. Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan adalah sebagai berikut :  Ambil suspensi cairan senamyak 0.tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya. Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi suspensi). sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh .2.  Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar diatas bunsen beberapa saat.  Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas. artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet ukur steril yang berbeda/baru. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir. a. Perbandingan berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 dan ingat akuades yang digunakan jika memakai teknik rinse dan swab sudah termasuk pengencer 10-1.1 ml dengan pipet ukur kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat. 3.1. Cara Kerja : a. hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan harus selalu diganti. Pour Plate (agar tuang) Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan cairan dari sumber yang sama. Teknik Penanaman a. penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar. Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya (pengocokan yang benar dapat dilihat pada gambar disamping) b. kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa detik.  Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar supaya tetesan suspensi merata. Spread Plate (agar tabur ulas) Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni. a. Teknik penanaman dari suspensi Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat.

Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak) Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru.1 Goresan Sinambung Cara kerja :  Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar. kemudian lanjutkan streak zig-zag pada daerah 2 (streak pada gambar). lalu putar cawan 180 C lanjutkan goresan sampai habis. melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.1 ml untuk spread plate dan 1 ml untuk pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja. Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna  Lakukan hal yang sama pada daerah 3 . sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate. o  Jangan pijarkan loop. tabung pengenceran yang akan ditanam dan media  padat yang masih cair (>45oC) Teteskan 1 ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan kosong  Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untuk  menghomogenkan suspensi bakteri dan media. kemudian diinkubasi. Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0. b.2 Goresan T Cara kerja :  Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker  Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag  Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin. b. Adapun prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut : Siapkan cawan steril. b.dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen.

Cara Kerja Isolasi Bakteri dari Sampel Tanah :  Tanah seberat 1 g dimasukan ke dalam tabung pengenceran 10-1 secara aseptis dan selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10-8  Tiga pengenceran terakhir diambil 0. namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi empat.B.1 ml untuk ditanam secara spread plate pada medium NA. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisma. setelah selesai.3 Goresan Kuadran (Streak quadrant) Cara kerja : Hampir sama dengan goresan T.Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal. diinkubasi pada 37oC selama 1x24 jam  Koloni akan tumbuh pada ketiga cawan tersebut kemudian dipilih koloni yang relatif terpisah dari koloni lain dan koloni yang mudah dikenali  Koloni yang terpilih kemudian ditumbuhkan atau dimurnikan ke NA baru dengan teknik streak kuadran  Inkubasi 1x24 jam. .

Kemudian diinkubnasi pada suhu ruang 5-7 hari  Koloni jamur yang tumbuh dimurnikan dan ditanam pada medium PDA baru.Cara Kerja Isolasi Jamur dari Tanah :  Tanah dalam cawan petri dipanaskan dengan oven pada suhu 80oC selama 30 menit dengan cawan petri untuk membunuh sel vegetatiftetap bertahan  Tanah yang telah dioven diambil 1 g kemudian dimasukan ke dalam tabung pengenceran bertingkat  Tiga pengenceran terakhir diambil untuk ditanama secara spread plate ke media PDA yang ditambah streptomycin atau penicillin.  Inkubasi pada suhu ruang 5-7 hari. .

tekanan sinar UV dan pH terhadap pertumbuhuan Mikroorganisme Faktor lingkungan : a. dengan streak kontinyu  Gunakan kontrol untuk masing-masing biakan dengan media yang tidak ditambahi NaCl. 370C. pengaruh suhu berhubungan dengan aktivitas enzim. pengaruh suhu terhadap pertumbuhan mikroorganisme b. dan 500C dan mikroorganisma yang berbeda (E.  Inokulasikan E. Sebaliknya kepekatan suspensi di lingkungan rendah maka akan terjadi pergerakan massa cair ke dalam sel Cara Kerja:  buat 4 buah cawan Nutrient Agar yang mengandung NaCl 0. 5% dan 15%. termofilik (50-1000C). 250C. psikrofilik(0-200C). diinkubasi sesuai suhu yang tertera  setelah ditumbuhkan selama 48 jam.5%.coli dan Bacillus sp.coli dan Bacillus sp. Suhu rendah menyebabkan aktiivtas enzim menurun dan jika suhu terlalu tinggi dapat mendenaturasi protein enzim. mesofilik Mesofilik (20-300C). Pengaruh tekanan osmotik terhadap pertumbuhan mikroorganisme Keberadaan mikroorganisma dilingkungan dapat dipengaruhi kepekatan suspensi/cairan di lingkungan. bandingkan derajat kekeruhannya. Setelah diinokulasi dengan bekteri yang berbeda. pengaruh pH terhadap pertumbuhan mikroorganisme Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan mikroorganisme Berdasarkan suhu optimum untuk pertumbuhan maka dapat dikelompokan menjadi 3 yaitu : 1. Bila kepekatan suspensi di lingkungan tinggi maka isi sel akan ke luar. 3%.coli dan Bacillus sp.  Setiap konsentrasi. cawan dibagi menjadi 2 dengan spidol kemudian labeli dengan bakteri E.FAKTOR LINGKUNGAN YANG BERPENGARUH TERHADAP PERTUMBUHAN MIKROORGANISME Kompetensi: mahasiswa mengetahui pengaruh suhu.) diberi label . 3. pengaruh sinar ultraviolet tehadap pertumbuhan mikroorganisme d. 2. Cara Kerja :  8x2 tabung yang berisi Nutrient Broth untuk suhu inkubasi 50C.  Inkubasi selama 48 jam dan amati pertumbuhannya . Suhu merupakan faktor lingkungan yang sangat menentukan kehidupan mikroorganisme. pengaruh tekanan osmotik terhadap pertumbuhan mikroorganisme c.

pada 3 cawan NA. Komponen seluler yang dapat menyerap sinar UV adalah asam nukleat sehingga dapat rusak dan menyebabkan kematian. pada umumnya bakteri tumbuh dengan baik pada pH netral (7. 7 dan 9) masing-masing 2 tabung untuk tiap nilai pH  Labeli dengan nama bakteri yang akan diinokulasikan  Inokulasi tiap tabung dengan Bacillus sp dan E.coli lalu diinkubasi pada suhu 370C selama 48 jam  Amati perbedaan kekeruhan pada tiap nilai pH . Cara Kerja:  Inokulasikan Aspergillus sp. Basofilik Cara Kerja :  Buatlah tabung reaksi berisi NB dan atur pH-nya (pH 3. dan 15 menit (ingat tutup cawan dibuka dan diusahakan lingkungan sekitar steril). Jarak antar UV dan cawan sekitar 12 inchi  Gunakan kontrol untuk masing-masing biakan dengan tidak memaparkan pada sinar UV  Inkubasi selama 48 jam dan amati pertumbuhan koloninya Pengaruh pH terhadap pertumbuhan mikroorgansime pH berpengaruh terhadap sel dengan mempengaruhi metabolisme.coli dan Bacillus sp..0). Berdasarkan nilai pH yang dibutuhkan untuk kehidupannya dikenal 3 kelompok mikroorganisme yaitu : 1. 2 Mesofilik/Neutrofilik dan 3. 5 menit. E. Acidofilik.Pengaruh sinar ultraviolet terhadap pertumbuhan mikroorganisme Sinar UV panjang gelombang 210-300 nm dapat membunuh mikroorganisme jika di paparkan.  Dedahkan ketiga cawan tersebut pada sinar UV dengan panjang 254 nm selama 1 menit.

3 pada agar tegak a.2 mengamati morfologi sel yeast (dengan pewarnaan sederhana) c.2 dengan pewarnaan negatif a. Cara Kerja :  Tumbuhkan biakan pada media NA cawan dengan streak kuadran  Tumbuhkan biakan pada media NA miring dengan pola inokulasi yang tegak lurus  Tumbuhkan biakan pada media NA tegak dengan stab inoculation  Tumbuhkan biakan pada media NB A.1 pengamatan langsung a.1.2 mengamati morfologi sel kapang (dengan metode slide culture) Bakteri A.2.2.3.1 pada media cawan a. Mengamati Morfologi Koloni Bakteri Kegiatan ini merupakan tindakan pertama kali jika ingin mempelajari suatu jenis bakteri lebih lanjut.1. Bakteri a. pinpoint/punctiform (titik) Small (kecil) Moderate (sedang) Large (besar) .1.3 dengan pewarnaan gram a. Yeast b. khususnya untuk tujuan identifikasi.1. Kapang c.1 dengan pewarnaan sederhana a.2 mengamati morfologi sel bakteri a.2.3 mengamati motilitas bakteri a.2 pada agar miring a.1 mengamati morfologi koloni kapang (pada agar cawan) c.1 mengamati morfologi koloni bakteri a. Pertumbuhan pada Cawan Petri Ciri-ciri yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut :  Ukuran.4 pada media cair a. Setelah mendapatkan kultur murni maka biakan yang diinginkan ditumbuhkan ke berbagai bentuk media untuk dikenali ciri koloninya.3.1.2 pengamatan tidak langsung b.1 mengamati morfologi koloni yeast (pada agar cawan) b.MORFOLOGI MIKROBA Kompetensi : mahasiswa dapat mengenali bentuk dan morfologi sel dan koloni mikroorganisme a.4 dengan pewarnaan endospora a.2.

Translucent (dapat ditembus cahaya sebagian). Opaque (tidak dapat ditembus cahaya). Pertumbuhan pada Agar Miring Ciri-ciri koloni diperoleh dengan menggoreskan jarum inokulum tegak dan lurus Ciri koloni berdasarkan bentuk: .2.  Pigmentasi : mikroorganisme kromogenik sering memproduksi pigmen intraseluler. Transparant (bening)  Bentuk : Circular Elevasi : Flat Irregular Raised Spindle Convex Filamentous Umbonate Rhizoid   Permukaan : Halus mengkilap Kasar Berkerut Kering seperti bubuk Margins : Entire Lobate Undulate Serrate Felamentous Curled A. beberapa jenis lain memproduksi pigmen ekstraseluler yang dapat terlarut dalam media Karakteristik optik : diamati berdasarkan jumlah cahaya yang melewati koloni.

Ciri-ciri koloni berdasar bentuk : Ciri koloni berdasar kebutuhan O2 : .A.3 Pertumbuhan pada Agar Tegak Cara penanaman adalah dengan menusukkan jarum inokulum needle ke dalam media agar tegak.

Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin.pewarnaan positif .1. sel bakteri sulit terlihat. tapi jika suspensi bakteri terlalu encer. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Malachite Green dll. Safranin. bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif.pewarnaan acid fast dll.pewarnaan flagella dll.pewarnaan negatif  Pewarnaan diferensial . Pada zat warna basa. sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan.A. Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif) Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Pewarnaan  Pewarnaan sederhana . Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya. Congo Red dll.pewarnaan gram . maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Methylene Blue.pewarnaan endospora . Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya.4 Pertumbuhan pada Media Cair Pola pertumbuhan berdasarkan kebutuhan O2 A. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan. .  Pewarnaan khusus . Base Fuchsin. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Mengamati Morfologi Bakteri Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. B.

Jika digunakan biakan padat. sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam.Cara Kerja :  Bersihkan object glass dengan kapas  Jika perlu tulislah kode atau nama bakteri pada sudut object glass  Bila menggunakan biakan cair maka pindahkan setetes biakan dengan pipet tetes atau dapat juga dipindahkan dengan jarum inokulum. teteskan nigrosin atau tinta cina di ujung kanan salah satu object glass  Biakan diambil lalu diulaskan atau diteteskan dalam tetesan nigrosin tadi. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya. jangan difiksasi atau dipanaskan di atas api. Jangan lupa biakan dikocok terlebih dahulu. . Tapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Safranin. B.  Keringkan ulasan tersebut sambil memfiksasinya dengan api bunsen (lewatkan di atas api 2-3 kali)  Setelah benar-benar kering dan tersebar selanjutnya ditetesi dengan pewarna (dapat digunakan Methylen blue. maka biakan dipindahkan dengan jarum inokulum. Prosedur:  Ambil dua object glass. Crystal Violet) dan tunggu kurang lebih 30 detik. lalu dicampurkan  Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan ke samping kiri  Biarkan preparat mengering di udara. satu ulasan saja kemudian diberi akuades dan disebarkan supaya sel merata.  Cuci dengan akuades kemudian keringkan dengan kertas tissue  Periksa dengan mikroskop (perbesaran 100 x 10).2 Pewarnaan Negatif Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa.

(rod). maka akan tampak bentuk sel bakteri. Moraxela Streptococcus Bacillus. Enterococcus Moraxella. Acinetobacter Escherichia. micrococcus Sarcina . rounded ends Vibrio (curved) Bacilli (Rod). Berikut merupakan berbagai bentuk sel bakteri Bentuk Contoh jenis Coccus (sphere) Coccobacilli Bacilli. blunt end Helical (spirillum) Diplococcus Streptococcus Streptobacillus Staphylococcus Tetrad (Gaffkya) Sarcina (cuboid packets) Neisseria. clostridium Vibrio. Bdellovibrio. campylobacter Neisseria. Mycobacterium Staphylococcus Deinococci. Ancylobacter dll Bacillus Spirochaeta. Spirillum. Lactobacilus.1 2 3 4 Setelah dilihat di mikroskop. pediococcus. Veillonella.

Beri larutan pemucat (ethanol 96%/ aseton) setetes demi setetes hingga etanol yang jatuh berwarna jernih.Cuci dengan akuades mengalir 4. . sedangkan gram positif tidak terpengaruh. Counterstain hanya berfungsi sebagai pengontras saja 9.3.s iodine) Adanya lugol’s iodine menyebabkan lalu tunggu ± 1 menit adanya ikatan CV dengan iodine yang akan meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri. sedangkan pada gram positif CV-iodine tetap menempel di dinding sel. sel gram negatif menjadi bening 7.Teteskan counterstain (safranin) dan Safranin akan mewarnai sel gram tunggu selama ± 45 detik negatif menjadi berwarna merah.Cuci dengan akuades mengalir 10. sehingga komplek CV-iodine akan lepas dari permukaan sel gram negatif. karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi.A. Jangan sampai terlalu banyak (overdecolorize) Penetesan etanol absolut menyebabkan terbentuknya pori-pori pada gram negatif yang memiliki banyak lapisn lemak (lipid larut dalam etanol).Teteskan mordant (lugol. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.Keringkan preparat dengan kertas tissue yang ditempelkan di sisi ulasan (jangan sampai merusak ulasan) lalu biarkan mengering di udara. permukaan sel bakteri gram positif dan usahakan semua ulasan terwarnai dan negatif tunggu selama ± 1 menit 3.Cuci dengan akuades mengalir 6.Teteskan kristal violet sebagai Kristal ungu akan mewarnai seluruh pewarna utama pada kedua preparat .Buat preparat ulas (smear) yang Sel bakteri tertempel pada permukaan telah difiksasi dari bakteri gram kaca (object glas) positif misal Bacillus subtilis dan gram negatif misal Escherichia coli 2.Berikut merupakan prosedur pewarnaan Gram: Cara Kerja : Dampak/Hasil 1. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel.Cuci dengan akuades mengalir 8. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Pada gram positif dapat terbentuk CV iodinribonukleat pada dinding sel 5. Pewarnaan Gram Adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif.

Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sbb: Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam .

Jika bagian pinggir mulai mengering. Namun jika dengan pewarnaan sederhana. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif. khususnya pada gram positif. radiasi dan bahan kimia. tambahkan lagi Malachite Green. sekali diberi zat warna. bilas object glass dengan akuades mengalir Dampak/Hasil Sel bakteri menempel pada permukaan object glass Malachite green akan mewarnai sel vegetatif bakteri. Desulfomaculatum dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya.Cuci kering anginkan . sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas. Letakan di atas air yang mendidih. sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Air digunakan sebagai agen dekolorasi sel. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV). Setelah perlakuan di atas Malachite green tidak melekat kuat dengan sel vegetatif. Berikut merupakan prosedur pewarnaan endospora dengan metode Schaeffer-Fulton. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. sel vegetatif berwarna). Cara Kerja : 1. Walaupun ada beberapa species yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.Tetesi ulasan pada object glass dengan Malachite green di atas kertas merang. dingin. Dijaga jangan sampai kering. 4.Tetesi dengan safranin sebagai counter stain. 3. sehingga diperlukan teknik pewarnaan endospora. endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (keduaduanya transparan. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Biarkan 5 menit. Endospora sukar menyerap zat warna. Pembilasan dengan akuades akan melunturkan Malachite green pada sel vegetatif Safranin akan mewarnai sel vegetatif menjadi merah. sehingga pembedaannya tampak jelas. warna tersebut sulit dilunturkan. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif. penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel. B.Buat preparat ulas dari Bacillus subtilis lalu tutup dengan kertas merang 2.Setelah dingin. kering. diamkan selama + 45 detik 5. Untuk mewarnainya dilakukan pemanasan untuk mempermudah penetrasi Malachite green ke dinding endospora.4. warna ini tidak mempengaruhi warna hijau endospora. Pewarnaan Endospora Anggota dari genus Clostridium.

Pemberian Malachite green Pelunturan dengan air mengalir Penambahan safranin Cuci dan keringkan .

C.coli ke object glass (sebaiknya dari biakan cair).  Inkubasi pada suhu 370 C selama 1x 24 jam  Hasil positif (motil) jika bakteri tumbuh pada seluruh permukaan media. Hati-hati jangan salah membedakan antara sel yang bergerak sendiri karena flagel atau bergerak terkena aliran air.Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya : C.  Tutup dengan cover glass  Amati menggunakan mikroskop dengan perbesaran maksimak.  Inkubasi selama 2x24 jam. Mengamati morfologi koloni yeast  Tanam biakan yeast (dapat berupa Sacharomyces cereviceae atau Candida albicans) pada PDA dengan cara streak quadrant. Jika digunakan biakan padat maka ulas dengan jarum inokulum lalu ditambah akuades satu tetes. . Bakteri akan tampak transparan dan pola pergerakannya tidak beraturan.1 Pengamatan Langsung Cara Kerja :  Teteskan biakan bakteri motil seperti Bacillus atau E. hasil negatif menunjukan bakteri hanya tumbuh pada daerah tusukan saja Bakteri motil akan bermigrasi ke seluruh permukaan agar dan bekas tusukan Yeast / Khamir A. Mengamati motilitas C. ratakan.2 Pengamatan tidak langsung Cara Kerja :  Tanam biakan pada media NA tegak atau Media Motilitas dengan cara tusuk (Stab inoculation) sedalam + 5 mm.

grannula lemak dan glikogen. bulat telur. Perhatikan spora yang berwarna Kapang / Jamur Jamur merupakan mikroba dengan struktur talus berupa benang-benang (hifa) yang terjalin seperti jala (myselium). Amati di bawah mikroskop. Setelah didapatkan koloni tunggal. B. bulat memanjang dengan ukuran 1-9x20 µm. A.  Tutup preparat dengan cover glass. Hifa dapat berekat (septat) dengan inti tunggal/ lebih dan hifa tidak bersekat (aseptat).  Amati dengan perbesaran 40x10 atau 100x10. pengamatan ciri-ciri morfologi koloni hampir sama dengan ciri morfologi bakteri. Mengamati Morfologi Sel Yeast Yeast merupakan fungi mikroskopik uniseluler. Pseudohifa adalah hifa yeast yang terbentuk dari rangkaian sel hasil pembelahan aseksual secara budding. Beberapa spesies yeast memiliki sifat dimorfisme yaitu bentuk sel tunggal dan bentuk hifa atau pseudohifa.2 Melihat bentuk spora sel Yeast Cara kerja :  Buat preparat ulas dari biakan yeast pada Goodkowa Agar yang berumur 10 hari.  Inkubasi selam beberapa hari. B. Penampakan morfologi koloni pada umumnya seperti benang (filamentous) yang pertumbuhannya membentuk lingkaran. Morfologi koloninya dapat dengan mudah dibedakan dengan bakteri walaupun ada beberapa jenis bakteri yang koloninya mirip jamur. tetapi tidak melepaskan diri dari induk.  Fiksasi dengan api bunsen. Keringkan dengan tissue kemudian biarkan pada udara terbuka.  Ulaskan suspensi biakan pada object glass lalu teteskan Methilene Blue hingga rata (jangan difiksasi). Bentuk selnya bervariasi dapat berbentuk bulat. Cuci preparat dengan air mengalir. B. Panasi preparat dengan api bunsen selama + 30 detik (sampai timbul uap). Morfologi internal sel mudah dilihat dan terdiri dari inti dan organel seperti mitkondria.  Warnai dengan cara Shager dan Fulgen yaitu: Tetesi preparat dengan Malachite Green dan biarkan 30-60 detik. seperti dari kelompok Actinomycetes atau Bacillus mycoides. Mengamati morfologi koloni kapang Cara kerja :  Tanam/pindahkan biakan kapang dengan jarum inokulum needle yang diletakan di tenganh-tengah cawan petri. Koloni kapang memiliki keragaman warna yang muncul dari sporanya. tidak membentuk hifa (beberapa spesies dapat membentuk pseudohifa). .1 Melihat bentuk sel Yeast Cara Kerja :  Tumbuhkan Sacharomyces cereviceae pada glukosa cair selama 24 jam.

Namun seringkali miselium atau susunan spora menjadi pecah atau terputus sehingga penampakan di mikroskop dapat membingungkan. potong media Saboraud Dextrose Agar steril berbentuk kubus dan letakkan di atas object glass.1 Metode Heinrich’s. Amati pertumbuhan koloni (miselium) yang menyebar. cara kerja :  Siapkan object glass. B. . B. cover glass.  Tutup dengan cover glass. 2 Metode Riddel. Berikan sampai setengah luasan cover glass.  Setelah selesai sterilisasi berikan lilin (parafin-petrolatum) steril pada sebelah kiri dan kanan tempat yang akan ditutup cover glass (aseptis). Dengan teknik ini.  Inkubasi pada suhu kamar selama 3x24 jam. Pengamatan struktur spora dan miselium dapat juga dilakukan dengan preparat ulas seperti yang telah diuraikan di depan.  Teteskan suspensi spora jamur dalam media cair pada media cover glass yang tidak diberi lilin. tissue basah yang dimasukkan dalam cawan dan sterilkan dengan autoclave.  Inkubasi pada suhu kamar selama 3x24 jam. cara kerja :  Persiapan sama seperti di atas  Setelah semua steril.  Tutup potongan agar dengan cover glass. Mengamati sel morfologi kapang dengan metode Slide Culture (Microculture) Teknik ini bertujuan untuk mengamati sel kapang dengan menumbuhkan spora pada object glass yang ditetesi media pertumbuhan. Tekan cover galss secara media merata.  Inokulasikan spora jamur pada bagian atau potongan agar. B.  Ambil preparat dan amati di bawah mikroskop. spora dan miselium tumbuh langsung pada slide sehingga dapat mengatasi masalah tersebut.

 Tutup dengan cover glass tepat di atas media dan tekan hingga merata.3 Prosedur yang lebih sederhana.  Amati pertumbuhan miselium dan spora pada object glass dengan perbesaran sedang . Ambil preparat dan diamati di bawah mikroskop.  Ulaskan spora jamur yang akan diamati pada belahan tersebut. B.  Belah media yang memadat dengan jarum inokulum yang berujung L.  Siapkan media PDA dan dijaga supaya tetap cair.  Teteskan media PDA pada object glass secara aseptis lalu tunggu memadat (teteskan jangan terlalu banyak).  Inkubasi selama 2x24 jam. cara kerja :  Sterilkan cawan petri yang berisi kapas yang di atasnya terdapat object glass dan cover glass.

Jarak antar garis skala pada mikrometer okuler tergantung pada perbesaran lensa objektif yang digunakan yang menentukan lapang pandang mikroskop. MPN dan dengan haemocytometer Menentukan jumlah dan ukuran mikroba a.1.MENENTUKAN JUMLAH & UKURAN MIKROBA Kompetensi : Mahasiswa dapat melakukan pengukuran sel mikroorganisme Mahasiswa dapat melakukan perhitungan mikroba dengan cara Plate Count. Menentukan ukuran mikroba Menggunakan mikrometer b.1 Plate count (hitungan cawan) b.1.01 mm / 10 µm. 1 skala okuler = Jarak yang diketahui antara 2 garis pada mik. Menentukan jumlah mikroba (enumerasi) b.1. 1 skala micrometer objektif = 0.2 MPN b.D = Okuler Division) Jarak skala pada mikrometer okuler = 0. menjadi tolak ukur untuk menentukan ukuran skala micrometer okuler..2 penghitungan jumlah bakteri secara keseluruhan (penghitungan langsung dengan haemocytometer  Menentukan Ukuran Mikroorganisme Mikroba berukuran sangat kecil dan untuk mengetahuinya digunakan mikrometer.3 cara kerja SPC dan TPC b. Skala ke nol (garis pertama) kedua mikrometer disimpulkan menjadi 1 garis kemudian dilihat pada skala ke berapa kedua jenis mikrometer tersebut bertemu/berhimpit kembali.1. Kalibrasi dilakukan dengan menghimpitkan skala mikrometer objektif dan okuler pada perbesaran yang diinginkan. Objektif (O.2 TPC b.1.01 X Skala Objektif Skala Okuler 10 X Skala Ob Skala Ok (mm) = (µm) .1. Dari hasil tersebut dapat diketahui satu satuan panjang pada skala mikrometer okuler itu berdasarkan beberapa jumlah skala kecil mikrometer objektif yang berada di antara garis yang berhimpit tadi.1 SPC b. Mikrometer merupakan kaca berskala dan dikenal 2 jenis micrometer yaitu mikrometer okuler dan mikrometer objektif.1.1. Mikrometer okuler dipasang pada lensa okuler mikroskop. sedangkan micrometer objektif berbentuk slide yang ditempatkan pada meja preparat mikroskop. Jarak ini dapat ditentukan dengan mengkalibrasi antara mikrometer okuler dan objektif. Mikrometer objektif memiliki skala yang telah diketahui.1 penghitungan jumlah bakteri hidup (penghitungan tidak langsung) b.

(misalnya 40 X 10) kemudian cari gambar perbesaran dari skala mikrometer objektif. kemudian selanjutnya himpitkan skala ke nol mikrometer objektif dan okuler.54 µm 13 Cara Kerja : Kalibrasi  Letakkan mikrometer objektif pada meja benda dan pasang mikrometer okuler pada tabung lensa okuler. 1 Skala Okuler = = 0.  Hitung besarnya skala okuler dengan rumus di atas.Misal : jika skala ke 0 mikrometer okuler berhimpit dengan skala ke 0 mikrometer objektif lalu skala ke 13 mikrometer okuler berhimpit dengan skala ke 2 mikrometer objektif maka beberapa 1 skala okuler. Tabung lensa okuler dapat diputar dan dicari posisi yang pas.  Jika diperlukan hitung lebar sel dengan cara yang sama.  Hitung panjang dan lebar sel sebenarnya : .  Cari dengan teliti skala ke berapa antara mikrometer objektif dan okuler yang berhimpit lagi.  Setelah fokus didapat.01 x 2/13 0.  Tentukan perbesaran yang digunakan.00154 mm = 1. : Cara kalibrasi cara mengukur mikroba Penentuan ukuran mikroba  Lepaskan mikrometer objektif dari meja benda.  Hitung berapa panjang sel dengan menghitung skala mikrometer okuler.  Ganti dengan preparat ulas yang telah disiapkan  Cari fokus dari preparat tersebut dengan perbesaran yang sama.02 = 0.

1 ml = 500 000 000 CFU’s / ml = 5x108 CFU’s / ml = 50 x 106 CFU’s / 1 ml = 50 000 000 CFU’s / 0.1.Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni.Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan) tidah dihitung. Plate Count (hitungan cawan) Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Standard Plate Count (SPC) Koloni yang dipilih untuk dihitung menggunakan cara SPC memiliki syarat khusus berdasarkan statistic untuk memperkecil kesalahan dalam perhitungan. . Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah sebagai berikut “ .54 = 3. Berdasarkan hal tersebut digunakan istilah Coloni Forming Units (CFU’s) per ml.Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni. Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel mikroorganisme karena beberapa mikroorganisme tertentu cenderung membentuk kelompok atau berantai.Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni. .x skala okuler X hasil kalibrasi y skala okuler X hasil kalibrasi misal : 5 X 1.1 ml koloni = 50 Fp = 1/10 -6 SP = 1 ml Pour plate : = 50 x 106 CFU’s / 0. Cara menghitung sel relatif / CFU’s per ml CFU’s / ml = jumlah koloni X faktor pengenceran Misal : penanaman dilakukan dari tabung pengenceran 10 metode Spread Plate dan Pour Plate. jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut.1.1 ml = 5x107 CFU’s / ml a. Syaratsyaratnya sebagai berikut : . .7 µm 2 X 1.54 = 7.Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni. Setelah diinkubasi.1 ml = 50 000 000 CFU’s / 0. .1. . koloni yang tumbuh berasal dari suspensi yang diperoleh menggunakan pengenceran bertingkat dari sebuah sampel yang ingin diketahui jumlah bakterinya.Satu koloni dihitung 1 koloni.08 µm  Menentukan jumlah mikroorganisme (enumerasi) A. penghitungan jumlah bakteri hidup (tidak langsung) a. -6 dengan Spread plate : koloni = 50 Fp = 1/10 -6 SP = 0. Perhitungan mengacu kepada standar atau peraturan yang telah ditentukan.

500+20. maka hanya dari pengenceran terendah yang dilaporkan.500/35. missal 2. Hasil (a+b)/2 = 3. < 30 = TFTC (Too Few To Count).000>2 Apabila setiap pengenceran digunakan 2 cawan petri (duplo).5X103 Semua <30 Bila diperoleh perhitungan > 300 dari semua pengenceran.000/13. > 300 = TNTC (Too Numerous To Count) atau TBUD (Terlalu Banyak Untuk Dihitung). maka jumlah angka yang digunakan adalah rata-rata dari kedua nilai jumlah masingmasing setelah diperhitungkan.500<2 140 35 1 1.4 X 104.000/10.3X105 650 >300 6 TNTC TNTC 195 2X10 TNTC >300 Jumlah koloni yang dilaporkan terdiri dari 2 digit yaitu angka satuan dan angka sepersepuluh yang dikalikan dengan kelipatan 10 (eksponensial). 10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan TNTC TNTC 358 3. maka jumlah yang dilaporkan adalah nilai rata-rata.6X106 Pngc.trtgg(10-3) Bila ada 2 cawan.trtgg(10-4) TNTC 325 18 3. Pengc. 10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan 4 234 20 5 2.4X104 35. 10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan 4 295 40 5 3.- Pilih cawan yang ditumbuhi koloni dengan jumlah 30-300 koloni. missal 2.500+40. pembulatan keatas dilakukan pada angka seperseratus yang sama atau lebih besar dari lima.000/14.3X105 Pngc.500>2 45.000<2 28.9X104 135 45 5 (13.000)/2 = 290 25 5 meskipun 3X104 305>300 305 28 0 - - - - - . Bila diperoleh perhitungan < 30 dari semua pengenceran.000<2 (28. bukan 2. maka hanya dari pengenceran tertinggi yang dilaporkan.35 X 104 menjadi 2.3X10 28 dan 5 <30 650 127 10 1.500>2 4 165 45 8 = 1.500)/2 45.000)/2=b 285 40 7 Dilap. 10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan 15 1 0 1.000)/2=a 27.500/35.500/40.34 X 104.5X10 40.5X10 Dilap.3 X 104.000+30. Jika hasil bagi dari pengenceran tertinggi dan terendah > 2 maka jumlah yang dilaporkan adalah dari cawan dengan pengenceran terendah.000/29.800)/2 15 dan 20 <30 208 20 2 = 1.3X104 rata-rata 25 dan 28 <30 (29. terendah 275 35 5 (27.500+16.3 X 104. 10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan 175 15 5 (17.34 X 104 menjadi 2. masing-masing dari pengenceran rendah dan tinggi yang berurutan dengan jumlah koloni 30-300 dan hasil bagi dari jumlah koloni pengenceran tertinggi dan terendah ≤ 2. atau 2.

Dari 3 pengenceran terakhir diplating (ditanam) ke media NA (Nutrien Agar) atau PCA (Plate Count Agar) sebanyak dua kali tiap pengenceran (duplo). Setelah tumbuh.      Lakukan preparasi suspensi kepada sampel terlebih dahulu (swab. dapat digunakan batang L atau glass beads. Inkubasi pada suhu 30º C selama 1-2 x 24 jam. Penghitungan koloni pada cawan sebaiknya dibuat transek atau dibagi-bagi jika koloni yang tumbuh terlalu banyak. Pola . Transek dibuat dengan spidol/marker di bagian bawah cawan petri. Jika secara Spread Plate.1. Plating dapat secara Spread Plate atau Pour Plate. selanjutnya diencerkan sampai tingkat pengenceran (misalnya sampai 10-8) tertentu. koloni dihitung dengan persyaratan yang telah diuraikan di depan. maserasi dan rinse) (jika perlu). Masukkan sampel ke tabung berisi 9 ml akuades untuk pengenceran pertama.Bagan alur persyaratan SPC a.3 Prosedur perhitungan jumlah bakteri dengan metode Plate Count.

. lactose (10 gr) dan Bromthymol Blue (0. a. batang pendek. tidak membentuk spora. Berdasar sifat coliform. tergantung kebutuhan. Media pada tabung adalah Lactose Broth yang diberi indikator perubahan pH dan ditambah tabung durham. memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi dalam waktu 24 jam inkubasi pada 37º C. Apabila dipakai 3 tabung maka disebut seri 3. MPN didasarkan pada metode statistik (teori kemungkinan). Pemberian sampel pada tiap seri tabung berbeda-beda. peptone (5 gr). Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri pada air khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri koliform yang merupakan kontaminan utama sumber air minum.transek dapat dibuat bervariasi. Penghitungan akan lebih mudah bila memakai Coloni Counter. Untuk sampel sebanyak 10 ml ditumbuhkan pada media LBDS (Lactose Broth Double Stegth) yang memiliki komposisi Beef extract (3 gr).2 %) per liternya. dan jika dipakai 5 tabung maka disebut 5 seri. Untuk sampel 1 ml dan 0. maka bakteri ini dapat memfermentasikan laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi oleh berubahnya warna dan gas dalam tabung durham. Ciri-ciri utamanya yaitu bakteri gram negatif. Nilai MPN ditentukan dengan kombinasi jumlah tabung positif (asam dan gas) tiap serinya setelah diinkubasi. Sampel ditumbuhkan pada seri tabung sebanyak 3 atau 5 buah tabung untuk setiap kelompok.1 ml dimasukkan pada media LBSS (Lactose Broth Single Stegth) yang berkomposisi sama tapi hanya kadar laktosa setengah dari LBDS yaitu 5 gr.2 Most Probable Number (MPN) Pendekatan lain untuk enumerasi bakteri hidup adalah dengan metode MPN.

lalu hitung tabung positif untuk tiap seri. . secara aseptis.  Kocok botol yang berisi air sampel. secara aseptis. Tulis kombinasi tabung positif tiap seri (misal : 3 2 1). Misal : didapatkan kombinasi jumlah tabung positif : 321 maka jumlah bakteri coliform adalah 150 sel/100 ml.  Inkubasi semua tabung pada suhu 37º C selama 48 jam. Kombinasi angka tersebut lalu dicocokkan dengan tabel MPN untuk seri 3 sehingga diperoleh jumlah mikroba sebenarnya.  Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing tabung seri ketiga (3 tabung LBSS).  Pindahkan suspensi air sample sebanyak 10 ml ke masing-masing tabung seri pertama (3 tabung LBDS). harus ada keduanya).  Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing tabung seri kedua (3 tabung LBSS). secara aseptis.Cara kerja :  Sediakan 3 tabung berisi LBDS (9 ml tiap tabung) dan 6 tabung berisi LBSS (9 ml tiap tabung) lengkap dengan tabung durham. Atur kesembilan tabung menjadi 3 seri (seperti di gambar).  Lihat tabung gas positif (asam dan gas .

Satu kotak besar di tengah. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil.B. Alat yang digunakan adalah Petroff-Hauser Chamber atau Haemocytometer. . Sel nakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui. Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm².2 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Jumlah cairan yang terdapat antara coverglass dan alat ini mempunyai volume tertentu sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu bujur sangkar juga tertentu.1 mm. dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0. Penghitungan jumlah bakteri secara keseluruhan (langsung) Penghitungan secara langsung dapat dilakukan secara mikroskopis yaitu dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil.

 Tambahkan ± 50 µl suspensi sel yeast (kira-kira 1 tetes) dengan cara meneteskan pada parit kaca pada alat hitung.04 mm2 x 0.000004 cm3 = 4x10-6 ml Sel/ml : = jumlah sel/4x10-6 ml = (jumlah sel/4) x 106 = jumlah sel x (¼) x 106 = jumlah sel x 2.Luas kotak sedang : =pxl = 0.5 x 105 Kotak sedang : Jumlah sel/ml = jumlah sel x 2.5 x 105 jadi misalnya diperoleh: 20 sel dalam satu kotak sedang maka jumlah sel keseluruhan : = 20 x (1/4) x 106 = 5 x 106 sel/ml Dengan perhitungan yang sama maka diperoleh rumus untuk kotak kecil : Jumlah sel/ml = jumlah sel x 4 x 106 Cara kerja (digunakan kotak sedang) :  Bersihkan Petroff-Hauser Counting Chamber atau Haemocytometer dengan alkohol 70 % lalu keringkan dengan tissue. Jika dalam satu kotak sedang terdapat sel-sel yang banyak dan bertumpuk maka perhitungan akan tidak akurat dan diperlukan pengenceran dengan perbandingan 1:5 atau 1:10.  Hitung sampel.004 mm3 Karena 1 ml = 1cm2 Maka : = 0. Suspensi sel akan menyebar karena daya kapilaritas.  Lakukan perhitungan secara kasar apakah diperlukan pengenceran atau tidak.1 mm = 0.  Letakkan alat hitung pada meja benda kemudian cari fokusnya pada perbesaran 40x10.  Letakkan cover glass di atas alat hitung. .2 = 0. paling tidak sebanyak 5 kotak sedang (lebih banyak lebih baik). Jika dilakukan pengenceran maka jumlah sel/ml dikalikan faktor pengenceran.  Biarkan sejenak sehingga sel diam di tempat (tidak terkena aliran air dari efek kapilaritas).04 mm2 Volume kotak sedang : = 0. Hasil perhitungan dirata-rata kemudian hasil rataan dimasukkan rumus untuk kotak sedang.004 mm3 = 0.2 x 0.

lantai dan pisau bedah. Efisiensi dan efektivitas disinfektan dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu:     Konsentrasi Waktu terpapar Jenis mikroba Kondisi lingkungan: temperatur. Adapun antiseptik adalah senyawa kimia yang digunakan untuk menekan pertumbuhan mikroorganisme pada jaringan tubuh. misalnya kulit.DAYA KERJA ANTIMIKROBA DAN OLIGODINAMIK Kompetensi : mahasiswa mengetahui cara kerja pengujian oligodinamik dan zat antimikroba a. Cara kerja pengujian disinfektan  Pengujian zat disinfektan dengan kertas cakram  Pengujian pengaruh daya oligodinamik c. Pengertian Antibiotik  Cara kerja pengujian antibiotik dengan metode Kirby-Bauer Pengertian dan Jenis Disinfektan Zat antimikroba adalah senyawa yang dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme. pH dan jenis tempat mikroba hidup Beberapa jenis disinfektan diantaranya adalah: Jenis Senyawa fenol : Fenol Cresol Hexaclhorophene Recorcinol Thymol Alkohol : Ethyl Isopropil Senyawa halogen : Senyawa chlorin : Sodium hipochlorite Chloramine Senyawa iodine : Povidone-iodine (betadine) Keterangan Merusak membran sel Mendenaturasi protein Konsentrasi kerja : 2-5% Pelarut lemak Denaturasi dan koagulasi protein Konsentrasi kerja : 50-75% Agen oksidasi Presipitasi protein Klorin bereaksi dengan air membentuk asam hipoklorit yang bersifat bakterisidal . Pengertian dan jenis disinfektan b. Disinfektan yaitu suatu senyawa kimia yang dapat menekan pertumbuhan mikroorganisme pada permukaan benda mati seperti meja. Zat antimikroba dapat bersifat membunuh mikroorganisme (microbicidal) atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme (microbiostatic).

coli dan Bacillus sp. sisa tetes larutan yang berlebihan pada kertas cakram diulaskan pada dinding wadah karena dikhawatirkan larutan akan meluas di permukaan agar jika larutan terlalu banyak. Menciptakan tegangan permukaan yang rendah Merusak membran sel Memindahkan sel secara mekanis Tegangan permukaan yang rendah Daya kerja sama dengan senyawa aktif permukaan Merusak dinding sel dan membran sel Koagulasi protein Memiliki avinitas terhadap asam nukleat Pengujian zat disinfektan dengan kertas cakram Cara kerja :  Inokulasikan E. Tekan dengan pinset supaya kertas cakram benar-benar menempel pada agar. Setelah diangkat. Pada NA cawan sengan streak kontinyu.  Zona hambat yang terbentuk diukur diameternya.  Kertas cakram steril dicelupkan ke dalam larutan disinfektan (alkohol 70%.  Inkubasi selama 48 jam pada 37 0C. betadin.Logam berat : Senyawa Hg Senyawa Zn Senyawa Cu dll. LysoI 5%. bandingkan daya kerja berbagai disinfektan.  Kertas cakram diletakkan dipermukaan agar dengan pinset. dan hipoklorit 5%). . Agen aktif permukaan : Sabun Detergen emulsifier Senyawa kationik : Senyawa amonium kuartener benzalconiumclhoride Senyawa anionik : Sodium Tertradecyl Sulphate Asam (H+) Basa (OH-) Pewarna : Crystal Violet Bereaksi dengan gugus SH (sufihidril) pada enzim yang menyebabkan denaturasi.

Ag dan Pb bersifat racun terhadap sel meskipun hanya dalam kadar rendah. antimikroba peptida. Daya hambat atau mematikan dari logam dengan konsentrasi yang rendah disebut daya oligodinamik. Adapun penamaannya biasanya berdasarkan gugus kimiawinya ataupun mikroorganisma produsernya. misalnya:  ragam antibakteria:  Penicillin dan cephalosporin         Erythromycine Sulfa drugs Trimethoprim dan sulfamethoxazole Polymyxin B Quinolone Tetracycline  Antifungi : Nystatin Azoles .Pengujian pengaruh daya oligodinamik Logam-logam berat seperti Hg. Antibiotik dikelompokkan berdasarkan gugus aktifnya.coli dan Bacillus sp. Logam mengalami ionisasi dan ion-ion tersebut bereaksi dengan bagian sulfihidril pada protein sel sehingga menyebabkan denaturasi. pada cawan NA dengan streak kontinyu  Letakan koin tembaga dan seng ke dalam cawan dengan pinset  Inkubasi 370C selama 48 jam  Hitung zona hambat yang terbentuk dengan mengukur diameter daerah yang jernih atau tidak ada pertumbuhan Pengertian dan Jenis Antibiotik Antibiotik adalah bahan yang dihasilkan oleh mikroorganisme atau sintetis yang dalam jumlah kecil mampu menekan menghambat atau membunuh mikroorganisme lainnya. Cara Kerja :  Inokulasikan E. Cu. Antibiotik memiliki spektrum aktivitas antibiosis yang beragam. misal antibiotik macrolide.

Sensitivitas suatu bakteri terhadap antibiotik ditentukan oleh diameter zona hambat yang terbentuk. Faktor yang mempengaruhi metode Kirby-Bauer : .Jenis antibiotik.  Menghambat replikasi DNA.Konsentrasi mikroba uji . Prosedur difusi-kertas cakram-agar yang distandardisasikan (metode KirbyBauer) merupakan cara untuk menentukan sensitivitas antibiotik untuk bakteri. sehingga diperlukan standar acuan untuk menentukan apakah bakteri itu resisten atau peka terhadap suatu antibiotik.  Menghambat sintesis RNA (proses transkripsi)  Menghambat sintesis protein (proses translasi). Semakin besar diameternya maka semakin terhambat pertumbuhannya.Mekanisme kerja antibiotik antara lain :  Menghambat dsintesis dinding sel  Merusak permeabilitas membran sel. Cara kerja pengujian antibiotik dengan metode Kirby-Bauer :  Celupkan cotton bud (cotton swab) dalam biakan bakteri kemudian tekan kapas ke sisi tabung agar air tiris  Ulaskan pada seluruh permukaan cawan Mueller-Hinton Agar secara merata  Biarkan cawan selama 5 menit  Kertas cakram dicelupkan dalam larutan antibiotik dengan konsentrasi tertentu.pH medium. .Konsentrasi antibiotik yang terdapat dalam cakram . .

 Ukur diameter zona hambat (mm) kemudian bandingkan dengan tabel. Tabel Penentuan Sensitivitas Antibiotik (diameter zona hambat dalam mm) Cara menginterpretasikan : Ukur diameter zona hambat (zona jernih) Misal didapatkan zona hambat suatu bakteri berdiameter 26 mm untuk Eryhtromycin. Angkat. Resistent : tahan Intermediate : medium Susceptible : peka . sensitivitas antibiotik.  Inkubasi pada suhu 37 0C selama 24-48 jam.  Kertas cakram ditekan menggunakan pinset supaya menempel sempurna di permukaan agar. Maka interpretasinya adalah bakteri tersebut peka terhadap antibiotik Eryhtromycin. selanjutnya letakkan kertas cakram pada permukaan agar. biarkan sejenak agar tiris.

Aktivitas enzimatis mikroorganisme : a. dan selanjutnya menjadi maltosa. Warna biru hitam terjadi jika iodine masuk ke dalam bagian kosong pada amilum yang berbentuk spiral. Uji aktivitas endoenzim :  Uji oksidase  Uji katalase  Uji Triple Sugar Iron Agar Uji Amilolitik Amilum adalah senyawa yang memiliki berat molekul tinggi. terdiri atas polimer glukosa yang bercabang-cabang yang diikat dengan ikatan glikosidik.  Hidrolisis zat pati terlihat sebagai zona jernih di sekeliling koloni. Uji aktivitas eksoenzim :  Uji amilolitik  Uji lipolitik  Uji proteolitik b.  Inkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC  Setelah selesai inkubasi. sedangkan hasil negatif ditunjukkan warna sekitar koloni tetap biru hitam. Indikator yang dipakai pada uji amilolitik adalah iodine. Amilum akan bereaksi dengan iodine membentuk komplex warna biru hitam yang terlihat pada media. tetesi cawan dengan lugol’s iodine secukupnya sehingga seluruh permukaan media terkena. .AKTIVITAS ENZIMATIS MIKROORGANISME Kompetensi : mahasiswa mengetahui beberapa teknik uji aktivitas enzimatik.coli dan Bacillus sp. Cara Kerja :  Inokulasi Nutrient Agar yang mengandung pati (2 g/l) dengan E. Indikator yang dipakai adalah iodine. Prosedur di bawah ini menunjukkan aktivitas amilase. Hidrolisis akhir maltosa menghasilkan glukosa terlarut yang dapat ditransport masuk ke dalam sel. NA yang tersuspensi pati digunakan sebagai media. secara streak. Degradasi amilum membutuhkan enzim amilase yang akan memecah/menghidrolisis menjadi polisakarida yang lebih pendek (dextrin). Amilum akan bereaksi dengan iodine membentuk warna biru hitam yang terlihat pada media.

Untuk mendapatkan energi dari lipid. sedangkan reaksi negatif ditandai oleh bercak-bercak yang tetap berwarna merah. Pada praktikum ini protein yang digunakan dalam .  Reaksi positif ditandai oleh bercak-bercak kuning disekeliling koloni. Cara Kerja :  Inokulasikan Bacillus sp. mikroba menghasilkan enzim lipase dan esterase yang memecah ikatan ester menghasilkan gliserol dan asam lemak. Pada prinsipnya metode-metode di atas menggunakan indikator yang mampu mendeteksi keberadaan asam lemak yang terbentuk akibat hidrolisis lemak. Terdapat berbagai macam prosedur untuk mengetahui aktivitas lipase diantaranya adalah dengan menggunakan media Trybutirin Agar.Uji Lipolitik Lipid misalnya trigliserida merupakan sumber energi bagi sejumlah mikroorganisma. coli pada media Tributyrin Agar dengan indikator neutral red  Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Uji proteolitik Uji proteolitik ditujukan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme menghasilkan enzim protease. Rodhamine Agar dan Spirit Blue Agar. dan E.

Hidrolisis kasein secara bertahap akan menghasilkan monomernya berupa asam amino. Proses ini dinamakan peptonisasi atau proteolisis Cara Kerja :  Inokulasikan Bacillus sp.bentuk kasein susu. Uji Oksidase Enzim oksidase memegang peranan penting dalam transport elektron selama respirasi aerobik. coli pada Skim Milk Agar (SMA)  Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. . Tidak adanya perubahan warna mengindikasikan bahwa uji yang dilakukan negatif. Kemampuan bakteri memproduksi sitokrom oksidase dapat diketahui dari reaksi yang ditimbulkan setelah pemberian reagen oksidase pada koloni bakteri. Reagen yang digunakan adalah tetramethyl-D-phenylenediamine dihydrocloride. dan mikroaerofilik. Positif tertunda (warna biru muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi) menandakan bahwa bakteri uji memiliki sedikit enzim. Sitokrom oksidase mengkatalisis oksidasi dan reduksi sitokrom oleh molekul oksigen. Reagen akan mendonorkan elektron terhadap enzim ini sehingga akan teroksidasi membentuk senyawa yang berwarna biru kehitaman. Enzim oksidase dihasilkan oleh bakteri aerob. fakultatif anaerob. sebagai akseptor elektron terakhir selama penguraian karbohidrat untuk menghsilkan energi. Dan E. Enzim ini merupakan bagian dari kompleks enzim yang berperan dalam proses fosforilasi oksidatif. Mikroorganisme ini menggunakan oksigen.  Aktivitas proteolitik ditunjukkan oleh terbentuknya zone jernih di sekeliling koloni.

    Cara Kerja : Koloni bakteri diambil satu tetes (sebaiknya dari biakan cair) secara aseptis dan diinokulasikan pada Object glass.    Superoksida dismutase adalah enzim yang bertanggung jawab untuk penguraian khususnya superoksida pada organisme aerob yang bersifat katalase negatif. Produksi katalase bisa diidentifikasi dengan menanmbahkan reagen H2O2 pada suspensi bakteri. Dengan menggunakan pipet tetes. Senyawa ini dihasilkan oleh mikroorganisme aerobik. fakultatif aerob maupun mikroaerofilik yang menggunakan jalur respirasi aerobik. Senyawa ini dalam jumlah besar akan menyebabkan kematian pada mikroorganisme. Jika tidak dihasilkan gelembung gas berarti uji katalase dinyatakan negatif. mikroorganisme menghasilkan hidrogen peroksida. bahkan ada yang menghasilkan superoksida yang sangat beracun. Cara Kerja : Koloni bakteri diambil satu ose secara aseptis dan diinokulasikan pada Object glass. berarti bakteri tersebut mampu memproduksi enzim katalase. 3% H2O2 diteteskan pada Object glass secukupnya. Hasil uji positif tertunda jika warna biru muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi. Tetesi dengan reagen. Jika dihasilkan gelembung gas. Amati adanya gelembung untuk hasil positif dan tidak ada gelembung untuk hasil negatif (hati-hati membedakan . Diatas object glass diberi kertas merang yang sehingga tetesan tersebar pada kertas. sedangkan bila tidak terjadi perubahan maka hasil uji negatif. lalu lihat perubahan yang terjadi Jika warna berubah menjadi biru marun maka hasil uji positif. Uji Katalase Selama respirasi aerobik (proses fosforilasi oksidatif).

media TSIA mengandung laktosa dan sukrosa dengan konsentrasi 1%. sedangkan warna menjadi lebih merah menendakan media menjadi basa. Jika kemerahan lebih pekat pada slant maka terjadi degradasi aerobik peptone. sedangkan warna merah pekat tampak di semua media maka interpretasinya adalah degradasi peptone secara aerob maupun anaerob. Media mengandung glukosa yang sangat sedikit (lebih sedikit dibanding laktosa dan sukrosa) sehingga jumlah asam pada permukaan (slant) hilang secara .1%. Sel lebih memilih untuk mendegradasi glukosa terlebih dahulu karena glukosa adalah monosakarida yang dapat langsung massuk ke dalam jalur metabolisme (glikolisis). dan mengandung glukosa dengan konsentrasi yang lebih rendah yaitu 0. sedangkan fermentasi laktosa dan sukrosa tidak terjadi. Perubahan warna menjadi kuning menandakan asam. = slant merah (alkali) sedangkan butt kuning (asam) dengan atau tanpa produksi gas  hanya terjadi fermentasi glukosa.antara gelembung yang muncul dari sel dengan kumpulan sel yang mengambang akibat ditambahi reagen). Indikator pH (Phenol Red) ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan pH akibat fermentasi karbohidrat. Perbedaan ini didasarkan pada pola fermentasi karbohidrat dan produksi H2S pada tabung reaksi. yang bersifat gram negatif dan memfermentasikan glukosa membentuk asam sehingga dapat dibedakan dengan bakteri gram negatif intestinal lain. Inkubasi pada 37oC selama 24-48 jam. Cara kerja : Inokulasikan biakan pada media TSIA dengan cara inokulasi tusuk kemudian dilanjutkan dengan diulaskan lurus tegak pada agar miring (lihat gambar). Interpretasikan hasil dengan melihat keterangan dibawah ini. Konsentrasi ini akan berpengaruh terhadap penggunaan karbohidrat dan keadaan asam yang terbentuk. Untuk mengamati fermentasi karbohidrat. Uji Triple Sugar Iron Agar TSIA adalah uji yang dirancang untuk membedakan beberapa jenis bakteri yang termasuk kelompok Enterobacteriaceae. Warna media mula-mula adalah merah-orange. Selain itu ditambahkan FeSO4 untuk mendeteksi adanya gas H2S. sedangkan pepton yang ada digunakan untuk sumber energi dalam keadaan aerob atau anaerob sehingga meningkatkan pH karena produksi amonia meningkat sebagai hasil samping metabolisme protein.    = slant dan butt merah (alkali) atau tidak terjadi perubahan warna  tidak terjadi fermentasi karbohidrat.

= slant dan butt kuning (asam) dengan atau tidak adanya gas  telah terjadi fermentasi glukosa. H2S ini merupakan hasil dari metabolisme protein media pecah atau terangkat  timbul gas sebagai hasil samping fermentasi .cepat menjadi basa. laktosa dan atau sukrosa karena laktosa dan sukrosa memiliki konsentrasi yang lebih tinggi sehingga dapat dimanfaatkan untuk substrat fermentasi lanjutan (jika glukosa habis) menghasilkan asam yang ditandai warna kuning setelah 24 jam. karena pada mulanya bagian slant telah menjadi kuning tapi dalam waktu lebih dari 24 jam sel akan kehabisan glukosa dan memilih untuk memanfaatkan protein sehingga media menjadi merah. = butt berwarna kehitaman  adanya H2S yang bereaksi dengan senyawa besi FeSO4 pada media menghasilkan FeS yang berwarna kehitam-hitaman.