PETUNJUK PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI DASAR

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO 2008

KATA PENGANTAR
Buku/Diktat petunjuk praktikum Mikrobiologi ini disusun dengan maksud dan tujuan membantu mahasiswa dalam melaksanakan praktikum Mikrobiologi Dasar. Keahlian dan keterampilan kerja di laboratorium sangat membantu dalam memahami teori yang telah diperoleh di kuliah sehingga dapat tercipta korelasi yang saling membangun antara teori dengan kenyataan. Diktat praktikum ini disusun rinci dan sistematis, dilengkapi dengan gambar sehingga memudahkan praktikan memahami dan mempersiapkan diri sebelum melakukan kegiatan praktikum. Materi yang disajikan dalam diktat ini mencakup teknik dasar yang lazim dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi pada umumnya. Harapan kami, buku ini dapat bermanfaat bagi praktikan mikrobiologi dasar serta bagi mahasiswa yang memerlukannya. Segala kritik dan saran yang bersifat membangun tentang isi buku ini sangat dihargai demi perbaikan kualitas lebih lanjut.

Purwokerto, Februari 2008

Tim Penyusun

TATA TERTIB PRAKTIKUM
Untuk menjaga keamanan 1. Praktikan harus telah mengenakan jas lab saat memasuki laboratorium dan bekerja dengan peralatan di laboratorium untuk menghindari kontaminasi dan terkena khemikalia 2. Dilarang keras makan, merokok dan minum di laboratorium 3. Sebelum dan sesudah bekerja, meja praktikum dibersihkan dengan desinfektan 4. Praktikan berambut panjang harus mengikat rambutnya sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu kerja dan menghindari dari hal-hal yang tidak diinginkan 5. Pengambilan kultur cair atau suspensi dan khemikal harus menggunakan pipet dengan bantuan filler atau menggunakan mikropipet. 6. Dilarang membuang biakan sisa atau habis pakai dan pewarna sisa disembarang tempat. Bahan tersebut harus dibuang di tempat yang telah disediakan oleh asisten. 7. Laporkan segera jika terjadi kecelakaan seperti kebakaran, biakan tumpah ada yang menelan bahan kimia, atau biakan kepada asisten 8. Jika menggunakan jarum inokulum, ujung jarum dibakar sampai memijar sesudah dan sebelum bekerja menggunakan alat ini 9. Sebelum meninggalkan laboratorium disarankan untuk mencuci tangan dengan seksama. Untuk kelancaran praktikum 1. Praktikan diwajibkan memakai jas laboratorium sebelum memasuki laboratorium dan dilepas di luar laboratorium. 2. Praktikan wajib memakai sepatu pada saat praktikum. 3. Praktikan dilarang berbicara yang tidak perlu dan membuat gaduh 4. Memakai pakaian yang sopan pada saat praktikum (baju berkrah untuk laki-laki) 5. Praktikan yang datang terlambat lebih dari 10 menit mengganti di akhir acara. 6. Praktikan yang datang terlambat lebih dari 20 menit maka wajib inhal. 7. Kuis akan dilaksanakan pada awal acara sebelum memulai praktikum untuk mengetahui sejauh mana kompetensi yang dicapai. 8. Inhal kuis akan diadakan satu kali dan nilai yang diambil adalah nilai terbaik. 9. Bagi praktikan yang akan berpindah jadwal praktikum harus seizin koordinator praktikum mikrodas dengan menyerahkan surat pengantar paling lambat dua hari berikutnya. 10. Praktikan yang tidak hadir praktikum (absen), maka disarankan ikut inhal praktikum, di mana harus membayar untuk mengganti biaya praktikum dan tenaga asisten 11. Praktikan akan dinilai keterampilannya selama praktikum oleh asisten 12. Praktikan yang tidak mengikuti asistensi tanpa keterangan tidak mendapatkan nilai pretest, tapi jika ada izin tertulis maka dapat mengikuti pretest susulan. 13. Praktikan yang tidak mengikuti pengamatan harus mengikuti pengamatan susulan. 14. Laporan harus dibawa saat masuk pada praktikum sebagai syarat masuk. 15. Praktikan yang tidak membawa laporan karena tertinggal, tetap diizinkan mengikuti praktikum tetapi harus mengambil laporan yang tertinggal pada hari itu juga dan menyerahkkannya ke asisten. 16. Aturan-aturan / tata tertib yang belum tercantum akan diputuskan kemudian.

............................ Morfologi Mikroorganisme ....... Pengenalan Alat ......... 7.............................................................................. 3....................................................... 9.......................................................................................... Pembuatan Media ............................ DAFTAR ISI .............................................. Isolasi Mikroorganisme ................................ Daya Oligodinamik dan Antimikroba .........................DAFTAR ISI Halaman KATA PENGANTAR ................................................................ 2.............. Menentukan Jumlah dan Ukuran Mikroorganisme ............... Pengaruh Faktor Lingkungan Terhadap Pertumbuhan Mikroorganisme ................ Aktivitas Enzimatik Mikroorganisme ................................... 8.............................. 1.................................. 5........................................................................................................................................ 6..................... 4...................... .................................... TATA TERTIB PRAKTIKUM ......................... Sterilisasi ............

PENGENALAN ALAT Kompetensi : mahasiswa mengenal dan mengetahui fungsi dari tiap-tiap alat Berikut daftar alat-alat mikrobiologi yang perlu dikenal: Alat-alat elektrik  Mikroskop cahaya  Mikroskop stereo  Autoklaf elektrik  Incubator  Hot plate & stirrer  Colony counter  Biological Safety Cabinet (BSC)  Mikropipet Alat-alat gelas dan keramik  Cawan Petri  Pipet ukur  Pipet tetes  Tabung reaksi  Labu Erlenmeyer  Glass beads  Mortar & pestle  Beaker glass  Buncen burner  Gelas ukur  Batang L / Drugalsky  Tabung durham Alat-alat non gelas  Jarum inokulum / ose  Pinset  Rubber bulb  pH meter universal .

Condenser (condenser) Untuk mengumpulkan cahaya supaya tertuju ke lensa objektif 6. Revolving nosepiece (pemutar lensa objektif) Untuk memutar objektif sehingga mengubah perbesaran 3. Mikroskop Cahaya (Brightfield Microscope) Salah satu alat untuk melihat sel mikroorganisme adalah mikroskop cahaya. Condenser adjustment knob (sekrup pengatur kondenser) Untuk menaik-turunkan kondenser . Diopter adjustmet ring (cincin pengatur diopter) Untuk menyamakan focus antara mata kanan dan kiri 10. berikut merupakan uraian tentang cara penggunaan bagian-bagiandan spesifikasi mikroskop cahaya merk Olympus CH20 yang dimiliki Laboratorium Mikrobiologi. Illuminator (sumber cahaya) 13. Interpupillar distance adjustment knob (pengatur jarak interpupillar) 11. Observation tube securing knob (sekrup pengencang tabung okuler) 18. Horizontal feed knob (sekrup pengatur horizontal) Untuk menggeser ke kanan / kiri objek glas 15. Bagian-bagian Mikroskop: 1. Stage (meja benda) Spesimen diletakkan di sini 5. Pada umumnya mata tidak mampu membedakan benda dengan diameter lebih kecil dari 0. Eyepiece / oculars (lensa okuler) Untuk memperbesar bayangan yang dibentuk lensa objektif 2. Specimen holder (penjepit spesimen) 12. Vertical feed knob (sekrup pengatur vertikal) Untuk menaikkan atau menurunkan object glass 14. Brightness adjustment knob (pengatur kekuatan lampu) Untuk memperbesar dan memperkecil cahaya lampu 8. Objective lense (lensa objektif) Memperbesar spesimen 7. Main switch (tombol on-off) 9.1 mm. Fine focus knob (sekrup fokus halus) Menaik turunkan meja benda secara halus dan lambat 17. Observation tube (tabung pengamatan / tabung okuler) 4. Coarse focus knob (sekrup fokus kasar) Menaik turunkan meja benda (untuk mencari fokus) secara kasar dan cepat 16. Dengan mikroskop kita dapat mengamati sel bakteri yang tidak dapat dilihat dengan mata telanjang.

kemudian putar sekrup halus (16) untuk mendapatkan fokusnya c.Cari bagian dari objek glas yang terdapat preparat ulas (dicari dan diperkirakan memiliki gambar yang jelas) dengan memutar sekrup vertikal dan horizontal (13) dan (14) 3. Jika meja benda belum turun. Tambahan a. hal ini akan mengubah dua bayangan yang akan diterima oleh 2 mata menjadi gambar yang tunggal sehingga sangat membantu dalam mengatasi kelelahan mata b.29 Catatan: Setelah mendapatkkan fokus pada perbesaran tetentu. Pengaturan condenser (5) akan memperjelas bayangan yang tampak dengan mensetting pada posisi tertinggi (cahaya penuh) Perbesaran total Ukuran specimen yang diamati dapat diperoleh dengan mengalikan perbesaran lensa okuler dengan lensa objektif. Jika perlu diopter adjustment knob (9) dapat diatur untuk memperoleh bayangan focus yang seimbang antara mata kanan dan kiri c. dan ingin memutar objektif ke perbesaran 100x. Menyalakan lampu a. misal 40x. Menempatkan spesimen pada meja benda a.Prosedur Operasi 1. Letakan objek glas diatas meja benda (4) kemudian jepit dengan (11).53 60x 0.Setelah fokus perbesaran 4 x 10 didapatkan. maka meja benda tidak perlu diturunkan dan tidak perlu khawatir bahwa lensa objektif akan menggesek cover glass karena terdapat sisa jarak A yang lebih kecil antara cover glass dengan lensa objektif (lihat tabel diatas). diturunkan dengan sekrup kasar (15) b. Misal = Okuler (10x) x Objektif (40x) = 400x Penggunaan minyak imersi Semakin kecil nilai daya pisah.3 40x 0. Memfokuskan a. maka putar (2) pada perbesaran selanjutnya yaitu perbesaran objektif 10x. atur kekuatan lampu dengan memutar bagian (7) 2. Biasanya dapat digunakan minyak imersi untuk meningkatkan indeks bias pada perbesaran 10 x 100 . Lakukan hal yang sama jika menggunakan perbesaran yang lebih tinggi Berikut adalah tabel yang menunjukan jarak antara spesimen dengan lensa objektif jika okus telah didapatkan Perbesaran objektif Jarak A (mm) 4x 29 10x 6. Daya pisah dapat diperkuat dengan memperbesarkan indeks bias atau menggunakan cahaya yang memiliki panjang gelombang (λ) pendek. Putar Revolving nosepiece (2) pada perbesaran objektif 4x lalu putar sekrup kasar (15) sehingga meja benda bergerak ke atas untuk mencari fokus b. akan semakin kuat kemampuan lensa untuk memisahkan dua titikyang berdekatan pada preparat sehingga struktur benda terlihat lebih jelas. 4. tekan tombol on (8) b. Jika perlu interpupillar distance adjustment knob (10) dapat digeser.

Berikut merupakan uraian tentang mikroskop stereo yang dimiliki Laboratorium Mikrobiologi yaitu Zoom Stereo Microscope. Jika fokus pada perbesaran 10 x 40 telah didapatkan maka putar ke perbesaran objektif 100x b.67 x 0. Jika ingin mendapatkan bayangan yang lebih besar.9 x 10 x 1x 2x 4x total 6. mikroskop stereo biasanya digunakan untuk mengamati secara detail bentuk koloni dan jamur. Focusing knob (sekrup pengatur fokus) 5. Stage clip (penjepit spesimen / preparat) Prosedur operasi 1. 1. tetesi minyak imersi 1 – 2 tetes dari sisi lensa c. Jika telah selesai menggunakan mikroskop. Stage plate (pelat tempat specimen diletakkan) 6. Atur perbesaran pada perbesaran terkecil dengan memutar Zoom Control Knob (3) kemudian dicari fokusnya dengan memutar Focusing Knob (4) 3.7 x 9x 10 x 20 x 40 x . Oculars eyepiece (lensa okuler) 2. Diopter adjustment ring (cincin pengatur diopter) 3.a. putar Zoom Control Knob (3) ke perbesaran yang lebih tinggi kemudian dicari fokusnya Mikroskop ini memiliki pilihan perbesaran: Okuler Objektif 0. Olimpus SZ3060. jepit jika perlu 2. Zoom control knob (sekrup pengatur pembesaran) 4. bersihkan lensa objektif 100x dengan kertas lensa yang dibasahi xylol 1  2 1 2 Mikroskop stereo (Zoom Stereo Microscope) Mikroskop ini berfungsi untuk melihat objek yang membutuhkan perbesaran tidak terlalu besar. Di Laboratorium Mikrobiologi. Letakkan spesimen / preparat di stage plate (5).

Cara Penggunaan : 1. Termometer 7. 5. kelep pengaman 5. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf.  Inkubator (Incubator) Inkubator adalah alat untuk menginkubasi atau memeram mikroba pada suhu yang terkontrol. Katup pengeluaran uap 3. 3. maka dapat ditambah air sampai batas tersebut. maka tutup harus dikendorkan. Lempeng sumber panas 8. Tombol pengatur waktu mundur (timer) 2. Jika mensterilisasi botol beretutup ulir. Aquades (dH2O) 9. untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat. Nyalakan autoklaf. Masukkan peralatan dan bahan. Kemudian klep pengaman ditutup (dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. batas penambahan air Autoclave adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan. 4. . Jika air kurang dari batas yang ditentukan. Klep pengaman jangan dikencangkan terlebih dahulu. Lama sterilisasi yang dilakukan biasanya 15 menit untuk 121oC. diatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu 121oC. Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan keluarkan isi autoklaf dengan hati-hati. maka tunggu tekanan dalam kompartemen turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure gauge menunjuk ke angka nol). Tunggu samapai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf dan terdesak keluar dari klep pengaman. Sekrup pengaman 10.. Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi2 (15 Psi = 15 pounds per square inch). Tombol on-off 6. Alat ini dilengkapi dengan pengatur suhu dan pengatur waktu. Jika alarm tanda selesai berbunyi. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu 121oC (250oF). 2. Kisaran suhu untuk inkubator produksi Heraeus B5042 misalnya adalah 10-70oC. Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang keluar dari bibir autoklaf. pengukur tekanan 4. Autoklaf (Autoclave) Diagram autoklaf vertical 1. 6. Gunakan air hasil destilasi. Penghitungan waktu 15’ dimulai sejak tekanan mencapai 2 atm.

Purifier™ Biological Safety Cabinet dari LABCONCO yang dimiliki laboratorium mikrobiologi adalah sebagai berikut: 1. Prosedur penggunaan BSC seri 36212. Pengadukan dengan bantuan batang magnet Hot plate dan magnetic stirrer seri SBS-100 dari SBS® misalnya mampu menghomogenkan sampai 10 L. Selain itu alat tersebut dilengkapi dengan skala/ kuadran yang sangat berguna untuk pengamatan pertumbuhan koloni sangat banyak. Usap permukaan interior BSC dengan alkohol 70 % atau desinfektan yang cocok dan biarkan menguap 7. biarkan 2-3 menit supaya kontaminan tidak keluar dari BSC .  Colony counter Alat ini berguna untuk mempermudah perhitungan koloni yang tumbuh setelah diinkubasi di dalam cawankarena adanya kaca pembesar. Hot plate stirrer dan Stirre bar Hot plate stirrer dan Stirrer bar (magnetic stirrer) berfungsi untuk menghomogenkan suatu larutan dengan pengadukan. Cuci tangan dan lengan dengan sabun gemisidal / alkohol 70 % 6. Kerja secara aseptis dan jangan sampai pola aliran udara terganggu oleh aktivitas kerja 11. Atur alat dan bahan yang telah dimasukan ke BSC sedemikian rupa sehingga efektif dalam bekerja dan tercipta areal yang benar-benar steril 9. Jumlah koloni pada cawan Petri dapat ditandai dan dihitung otomatis yang dapat di-reset. dengan kecepatan sangat lambat sampai 1600 rpm dan dapat dipanaskan sampai 425oC. Nyalakan lampu neon dan blower 4. Hidupkan lampu UV selama 2 jam. setelah selesai bekerja. jangan terlalu penuh (overload) karena memperbesar resiko kontaminan 8. masukkan alat dan bahan yang akan dikerjakan. selanjutnya matikan segera sebelum mulai bekerja 2. Biarkan selama 5 menit 5. Pastikan kaca penutup terkunci dan pada posisi terendah 3.  Biological Safety Cabinet Biological Safety Cabinet (BSC) atau dapat juga disebut Laminar Air Flow (LAF) adalah alat yang berguna untuk bekerja secara aseptis karena BSC mempunyai pola pengaturan dan penyaring aliran udara sehingga menjadi steril dan aplikasisinar UV beberapa jam sebelum digunakan. 10. Jangan menggunakan pembakar Bunsen dengan bahan bakar alkohol tapi gunakan yang berbahan bakar gas. Pelat (plate) yang terdapat dalam alat ini dapat dipanaskan sehingga mampu mempercepat proses homogenisasi.

Cawan petri tersedia dalam berbagai macam ukuran. Jika ingin melepas tip putar Thumb Knob searah jarum jam dan ditekan maka tip akan terdorong keluar dengan sendirinya. diameter cawan yang biasa berdiameter 15 cm dapat menampung media sebanyak 15-20 ml. jangan ditekan lebih ke dalam lagi. Pindahkan ujung tip ke tempat penampung yang diinginkan. Tahan pipet dalam posisi vertikal kemudian lepaskan tekanan dari Thumb Knob maka cairan akan masuk ke tip. hanya tersedia satu pilihan volume (fixed volume pipette) misalnya mikropipet 5 µl. 6. atau mikropipet yang tidak bisa diatur volumenya. Masukkan Tip bersih ke dalam Nozzle / ujung mikropipet. 3. biasanya kurang dari 1000 µl. Banyak pilihan kapasitas dalam mikropipet. Tekan Thumb Knob sampai hambatan kedua / second stop atau tekan semaksimal mungkin maka semua cairan akan keluar dari ujung tip. Sebelum digunakan Thumb Knob sebaiknya ditekan berkali-kali untuk memastikan lancarnya mikropipet. misalnya mikropipet yang dapat diatur volume pengambilannya (adjustable volume pipette) antara 1µl sampai 20 µl. 4. Mikropipet tip Cara Penggunaan : 1. mukropipet memerlukan tip. Tekan Thumb Knob sampai hambatan pertama / first stop. atau menggunakan alat tambahan yang berfungsi mendorong tip keluar.  Cawan Petri (Petri Dish) Cawan petri berfungsi untuk membiakkan (kultivasi) mikroorganisme. sedangkan cawan berdiameter 9 cm kira-kira cukup diisi media sebanyak 10 ml. 5. 2. dalam penggunaannya. 7. 8.12. Medium dapat dituang ke cawan bagian bawah dan cawan bagian atas sebagai penutup. Matikan lampu neon dan blower  Mikropipet (Micropippete) dan Tip Mikropipet adalah alat untuk memindahkan cairan yang bervolume cukup kecil. . Masukkan tip ke dalam cairan sedalam 3-4 mm. Usap permukaan interior BSC dengan alkohol 70 % dan biarkan menguap lalu tangan dibasuh dengan desinfektan 13.

namun volume yang dipindahkan tidak diketahui.  Tabung reaksi (Reaction Tube / Test Tube) Di dalam mikrobiologi. penambahan reagen ada uji biokimia. Untuk membuat agar miring. Salah satu penerapannya adalah dalam menambahkan HCl / NaOH saat mengatur pH media. Tersedia berbagai macam ukuran kapasitas pipet ukur. Pipet Ukur (Measuring Pippete) Pipet ukur merupakan alat untuk memindahkan larutan dengan volume yang diketahui. Terdapat beberapa pilihan berdasarkan volume cairan yang dapat ditampungnya yaitu 25 ml. tabung reaksi digunakan untuk uji-uji biokimiawi dan menumbuhkan mikroba. media yang ditambahkan berkisar 10-12 ml tiap tabung. Cara penggunaanya adalah cairan disedot dengan pipet ukur dengan bantuan filler sampai dengan volume yang diingini. yaitu media agar tegak (deep tube agar) dan agar miring (slants agar). Volume yang dipindahkan dikeluarkan menikuti skala yang tersedia (dilihat bahwa skala harus tepat sejajar dengan mensikus cekung cairan) dengan cara menyamakan tekanan filler dengan udara sekitar. 250 ml. dll. Media padat yang dimasukkan ke tabung reaksi dapat diatur menjadi 2 bentuk menurut fungsinya. kultivasi mikroba dalam kultur cair. . bahan atau cairan yang.  Labu Erlenmeyer (Erlenmeyer Flask) Berfungsi untuk menampung larutan.Tabung reaksi dapat diisi media padat maupun cair. tutup metal. 300 ml. Labu Erlenmeyer dapat digunakan untuk meracik dan menghomogenkan bahan-bahan komposisi media. 100 ml. 500 ml. 1000 ml. menampung akuades. diantaranya pipet berukuran 1 ml. Tutup tabung reaksi dapat berupa kapas.  Pipet tetes (Pasteur Pippete) Fungsinya sama dengan pipet ukur. 50 ml. dsb. 5 ml dan 10 ml. perlu diperhatikan tentang kemiringan media yaitu luas permukaan yang kontak dengan udara tidak terlalu sempit atau tidak terlalu lebar dan hindari jarak media yang terlalu dekat dengan mulut tabung karena memperbesar resiko kontaminasi. Untuk alas an efisiensi. tutup plastik atau aluminium foil. dll.

Di dalam mikrobiologi.  Mortar dan Pestle Mortar dan penumbuk (pastle) digunakan untuk menumbuk atau menghancurkan materi cuplikan. dapat digunakan untuk preparasi media media. Perubahan bunsen dapat menggunakan bahan bakar gas atau metanol.  Batang L (L Rod) Batang L bermanfaat untuk menyebarkan cairan di permukaan agar supaya bakteri yang tersuspensi dalam cairan tersebut tersebar merata. Api yang menyala dapat membuat aliran udara karena oksigen dikonsumsi dari bawah dan diharapkan kontaminan ikut terbakar dalam pola aliran udara tersebut. Alat ini juga disebut spreader. gelas ukur memiliki beberapa pilihan berdasarkan skala volumenya.  Pembakar Bunsen (Bunsen Burner) Salah satu alat yang berfungsi untuk menciptakan kondisi yang steril adalah pembakar bunsen. sebaiknya volume tersebut ditentukan berdasarkan meniskus cekung larutan. roti atau tanah sebelum diproses lebih lanjut. . Glass beads digunakan pada teknik spread plate yang fungsinya sama dengan batang L atau Spreader.  Beaker Glass Beaker glass merupakan alat yang memiliki banyak fungsi. Gelas ukur (Graduated Cylinder) Berguna untuk mengukur volume suatu cairan. Untuk sterilisasi jarum ose atau yang lain. seperti labu erlenmeyer. menampung akuades dll. misal daging..  Glass Beads Glass Beads adalah manik-manik gelas kecil yang digunakan untuk meratakan suspensi biakan dengan menyebarkan beberapa butir di atas permukaan agar dan digoyang merata. Pada saat mengukur volume larutan. bagian api yang paling cocok untuk memijarkannya adalah bagian api yang berwarna biru (paling panas).

Karet sebagai bahan filler merupakan karet yang resisten bahan kimia. Jarum inokulum biasanya terbuat dari kawat nichrome atau platinum sehingga dapat berpijar jika terkena panas. Inoculating loop cocok untuk melakukan streak di permukaan agar.  Pinset Pinset memiliki banyak fungsi diantaranya adalah untuk mengambil benda dengan menjepit misalnya saat memindahkan cakram antibiotik. Kertas pH indikator dicelupkan sampai tidak ada perubahan warna kemudian strip warna dicocokkan dengan skala warna acuan. Hal ini sangat penting dalam pembuatan media karena pH pada media berpengaruh terhadap petumbuhan mikroba. Penempatannya terbalik dalam tabung reaksi dan harus terendam sempurna dalam media (jangan sampai ada sisa udara). Jarum inokulum ini akan sangat bermanfaat saat membelah agar untuk preprasi Heinrich’s Slide Culture.  pH Indikator Universal berguna untuk mengukur/mengetahui pH suatu larutan. S (suction) merupakan katup yang jika ditekan maka cairan dari ujung pipet akan tersedot ke atas. Tabung Durham Tabung durham berbentuk mirip dengan tabung reaksi namun ukurannya lebih kecil dan berfungsi untuk menampung/menjebak gas yang terbentuk akibat metabolisme pada bakteri yang diujikan.  Pipet Filler / Rubber Bulb Filler adalah alat untuk menyedot larutan yang dapat dipasang pada pangkal pipet ukur. Kemudian katup E (exhaust) berfungsi untuk mengeluarkan cairan dari pipet ukur. dan yang berbentuk lurus disebut inoculating needle/Transfer needle. .  Jarum Inokulum Jarum inokulum berfungsi untuk memindahkan biakan untuk ditanam/ditumbuhkan ke media baru. Filler memiliki 3 saluran yang masing-masing saluran memiliki katup. Katup yang bersimbol A (aspirate) berguna untuk mengeluarkan udara dari gelembung. Bentuk ujung jarum dapat berbentuk lingkaran (loop) dan disebut ose atau inoculating loop/transfer loop. sedangkan inoculating needle cocok digunakan untuk inokulasi secara tusukan pada agar tegak (stab inoculating).

2 Berdasarkan komposisi c. Mg dan unsur pelikan/trace element. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya. N. lemak. Pembuatan Nutrient Agar dan Nutrient Broth e. H. Kekurangannnya adalah lebih banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar.3 Berdasarkan tujuan d.1 Bahan dasar b. Bahan-bahan media pertumbuhan 1. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekulmolekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel.3 Bahan tambahan b. Jasad heterotrof memerlukan sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat. Fungsinya juga sebagai pemadat media.2 Nutrisi atau zat makanan b. 2.  gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar.  Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik atau anorganik esuai dengan sifat mikrobanya. yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Pembuatan Potato Dextrose Agar Pengertian dan Fungsi Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Bahan-bahan media pertumbuhan b. unsur mikro seperti Fe. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan media bagi mikroorganisme autotrof obligat. Pengertian dan fungsi b.1 Berdasarkan sifat fisik c. Agar sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45 o C.MEDIA PERTUMBUHAN Kompetensi : Mahasiswa dapat membuat media pertumbuhan Nutrient Agar dan Potato Dextrose Agar Media pertumbuhan : a. Macam-macam media pertumbuhan c. protein dan asam organik. Nutrisi atau zat makanan Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C. O. .  Silica gel. Gelatin adalah polimer asam amino yang diproduksi dari kolagen. P. Bahan dasar  air (H2O) sebagai pelarut  agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media.4 Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media c.

Bahan tambahan Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan tujuan tertentu. sukrosa. liver. Sumber nitrogen mencakup asam amino. Yeast extract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alcohol. Antibiotik ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba nontarget/kontaminan.3-0. galaktosa. Meat extract mengandung basa organik terbuat dari otak. darah. 3. casein. pencairan dan pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan kekuatan agar. protein atau senyawa bernitrogen lain.  Yeast extract. Medium berdasarkan sifat fisik  Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media menjadi padat. contohnya adalah NB (Nutrient Broth). Untuk melarutkannya harus diasuk dan dipanasi. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media. Kegunaannya adalah sebagai pemadat (gelling) yang pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther Hesse untuk membuat media. Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0.  Vitamin-vitamin.  Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar.4% sehingga menjadi sedikit kenyal.  Meat extract.  Karbohidrat. tidak begitu cair. limpa. agar tidak akan larut. Medium berdasarkan komposisi .5-1%. fruktosa. LB (Lactose Broth). terutama pada pH yang asam  Peptone. 4. jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Jika dicampur dengan air dingin. glukosa. Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media  Agar. misalnya pada media Nitrate Broth. 2. susu.  Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0. Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam amino dan gas dari karbohidrat. Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya. dll. lactalbumin. granula atau bubuk dan terbuat dari beberapa jenis rumput laut.. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen. manitol. gelatin dan kedelai. peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (B complex). Macam-Macam Media Pertumbuhan 1. Jenis karbohidrat yang umumnya digunkan dalam amilum. Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media. plasenta dan daging sapi. misalnya phenol red (indikator asam basa) ditambahkan untuk indikator perubahan pH akibat produksi asam organik hasil metabolisme. agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan. tidak padat.

Contohnya adalah Nitrate Broth. Lactose Broth.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka. Ampiciline. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak. Bile Agar. yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon. Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba. Serum Agar. kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya. misalnya Tomato Juice Agar.  Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti. Arginine Agar. dekstrosa dan ekstrak kentang. kuning telur. Pancreatic Extract.  Media diperkaya (enrichment) Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah.  Media diferensial Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial.  Media selektif/penghambat Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. misalnya Glucose Agar. misalnya Nutrient Broth. misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk. warna. Contohnya adalah Koser’s Citrate medium. dll. tetapi membutuhkan komponen kompleks. Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E. misalnya Blood Tellurite Agar.  Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti. Untuk bahan ekstrak kentang.. ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni. Mac Conkey Agar.3. serum.  Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu.. Salt broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam. Blood Agar. .  Media untuk peremajaan kultur Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur  Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik. Medium berdasarkan tujuan  Media untuk isolasi Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba.  Media untuk karakterisasi bakteri Media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu mikroba. Brain Heart Infusion Agar.

d 1000 ml . Dapat menggunakan kompor gas atau hot plate stirrer (jangan sampai overheat.d 1000 ml  Akuades sebanyak 100 ml dibagi menjadi dua satu bagian untuk melarutkan Beef extract dan peptone dan sebagian lagi untuk melarutkan agar.  Setelah keduanya larut.  Pembuatan Nutrient Broth Komposisi untuk media NB sama dengan NA tetapi tidak memakai agar sebagai pemadat. Jika pH tidak netral maka dapat ditambahkan HCl/NaOH. Proses pembuatan ini tidak memerlukan panas. Jika diinginkan media tegak atau miring pada point ke 5. media langsung dituang ke tabung kemudian disterilisasi. Kemudian pH media diukur dengan mencelupkan kertas pH indikator. Proses pembuatannyapun lebih sederhana.Pembuatan Nutrient Agar dan Nutrient Broth  Pembuatan Nutrient Agar  Timbang komponen medium dengan menggunakan timbangan analitis untuk volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut:  Beef extract 3g  Peptone 5g  Agar 15 g  Akuades s. tinggal melarutkan peptone dan beef extract kemudian ditampung dalam labu Erlenmeyer atau tabung reaksi dan siap disterilisasi. larutan dituangkan ke larutan agar dan diaduk sampai homogen.  Sementara itu sebagian akuades digunakan untuk melarutkan peptone dan beef extract.  Tuang media steril ke cawan petri steril secara aseptis. peptone dan beef extract akan mudah larut sempurna pada air suhu kamar jika diaduk Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA)  Timbang komponen media dengan menggunakan timbangan analitis untuk volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut:  Potato/kentang 3g  Peptone 5g  Agar 15 g  Akuades s. cukup dengan pengadukan. karena akan terbentuk busa dan memuai sehingga tumpah). Sebaiknya air untuk melarutkan agar lebih banyak  Larutkan agar pada sebagian air tersebut dengan mengaduk secara konstan dan diberi panas.  Setelah itu media dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan disterilisasi dengan autoklaf.

sebaiknya kentang dikupas dan diiris kecil-kecil)  Rebus kentang dalam sebagian akuades tadi selama 1-3 jam sampai lunak. Atur pH media menjadi 5-6 dengan meneteskan HCl/NaOH. Setelah semua larut.   . ekstrak kentang dan agar-dekstrosa dicampur dan dihomogenkan. Agar dilarutkan dengan Hot Plate Stirrer dalam 50 ml akuades lalu setelah larut dapat ditambahkan dekstrosa dan dihomogenkan lagi. Media dituang ke dalam Erlenmeyer atau ke tabung reaksi kemudian siap untuk disterilisasi.  (sebelum ditimbang. kemudian diambil ekstraknya dengan menyaring dan memerasnya menggunakan kertas saring lalu ditampung di Beaker glass baru.

Sterilisasi secara kimia  dengan larutan disinfektan 3.Uap air panas .Panas kering .Dengan api langsung . Pipetting 4. Macam-macam sterilisasi a. Pengertian sterilisasi 2. Sterilisasi dengan cara penyaringan 6. Prinsip cara kerja autoklaf 5. Prinsip kerja Biological Safety Cabinet .STERILISASI Kompetensi : mahasiswa mengetahui sterilisasi dengan autoklaf. Sterilisasi dengan udara panas 8. Tyndalisasi 7. Sterilisasi secara fisik  Pemanasan . Menuang media d. Memindahkan biakan (streak) c.Uap air panas bertekanan  Penyinaran UV c. filtrasi. tyndalisasi mahasiswa dapat melakukan kerja aseptis Sterilisasi : 1. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) b. Prosedur/Teknik aseptis a. Mensterilkan meja kerja b.

 Pemanasan a. 2. 1. batang L. Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung. Sterilisai secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0. contoh alat : jarum inokulum. pinset. tabung reaksi dll. Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Macam-macam sterilisasi Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik. b. . Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas. misal nya larutan enzim dan antibiotik. Sterilisaisi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol.22mikron atau 0. Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-1800C. misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV 3. Uap air panas bertekanan : menggunalkan autoklaf  Penyinaran dengan UV Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi.Pengertian Sterilisasi yaitu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda dari semua bentuk kehidupan. fisik dan kimiawi. c. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer.45 mikrob) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Bahan yang mengandung air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi. d. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran. dll.

Berbagai prosedur umum kerja dalam mikrobiologi yang membutuhkan teknik aseptis Desinfeksi meja kerja .

Pinset. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut . Usahakan bagian alat yang diharapkan dalam kondisi steril didekatkan ke bagian api. Sebelum membuka ruangan atau bagian steril di dalam tabung/cawan/erlenmeyer sebaiknya bagian mulut (bagian yang memungkinkan kontaminan masuk) dibakar/dilewatkan api terlebih dahulu. Biasanya untuk mesterilkan media digunakan suhu 1210C dan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103.4 Kpa) selama 15 menit. Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas. 2.8 0F adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. 4. 5. batang L. autoklaf adalah alat untuk memsterilkan berbagai macam alat & bahan yang menggunakan tekanan 15 psi (2 atm) dan suhu 1210C. Untuk cara kerja penggunaan autoklaf telah disampaikan di depan. dll dapat disemprot dengan alkohol terlebih dahulu lalu dibakar. 3. Ujung jarum inokulum yang sudah dipijarkan harus ditunggu dingin dahulu atau dapat ditempelkan tutup cawan bagian dalam untuk mempercepat transfer panas yang terjadi. Alasan digunakan suhu 1210C atau 249.Saran-saran kerja aseptis : 1. Jika kerja di Safety Cabinet tidak perlu memakai pembakar bunsen tetapi jika di luar Safety Cabinet maka semakin banyak sumber api maka semakin terjamin kondisi aseptisnya Prinsip cara kerja autoklaf Seperti yang telah dijelaskan sebagian pada bab pengenalan alat.

Misalnya autoklaf diletakkan pada ketinggian 2700 kaki dpl. pencoklatan (media menjadi coklat) dan hancurnya substrat dapat dilakukan pencegahan sbb :  Glukosa disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa fosfat  Senyawa fosfat disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa garam mineral lain. seperti SDS Untuk mencegah terjadinya presipitasi. Setelah proses sterilisai lalu ditumbuhkan pada media. katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik.5 jangan disterilkan dengan autoklaf  Jangan mensterilisasi larutan agar dengan pH < 6. seperti fenol  Buffer engan kandungan detergen. menggunakan tekanan 15 psi maka air akan memdididh pada suhu 1210C. maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur. jika dilaboratorium terletak pada ketinggian tertentu. sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di ketinggian sama. Cairan yang disterilisasi dilewatkan ke suatu saringan (ditekan dengan gaya sentrifugasi atau pompa vakum) yang berpori dengan diameter yang cukup kecil untuk menyaring bakteri. Beberapa media atau bahan yang tidak disterilkan dengan autoklaf adalah :  Bahan tidak tahan panas seperti serum.(sea level) air mendidih pada suhu 1000C. lazimnya mikroba ini tersedia secara komersial dalam bentuk spore strip.. Ingat kejadian ini hanya berlaku untuk sea level. vitamin. dan enzim  Paelarut organik. Jika media tetap bening maka menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan baik. Setelah semua udara dalam autoklaf diganti dengan uap air. air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. Pada saat sumber panas dinyalakan. . Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai. maka tekanan dinaikkan menjadi 20 psi supaya tercapai suhu 1210C untuk mendidihkan air. maka pengaturan tekanan perlu disetting ulang. Virus tidak akan tersaring dengan metode ini. Kertas spore strip ini dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan. sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi. sisa ruang dibirkan kosong.0 Erlenmeyer hanya boleh diisi media maksimum ¾ dari total volumenya. Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi) Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk mensterilisasi cairan yagn mudah rusak jika terkena panas atu mudah menguap (volatile). antibiotik.  Senyawa garam mineral disterilkan terpisah dengan agar  Media yang memiliki pH > 7. Setelah proses sterilisasi selesai. Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi. Jika mensterilkan media 1L yang ditampung pada erlenmeyer 2L maka sterilisasi diatur dengan waktu 30 menit. Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan sempurna dapat digunakan mikroba pengguji yang bersifat termofilik dan memiliki endospora yaitu Bacillus stearothermophillus. Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 1210C dan tekanan 15 psi selama 15 menit.

Disedot dengan pompa vakum . membran penyaring (kertas saring) dan erlenmeyer penampung.  setelah semua larutan melewati membran filter dan tertampung dierlenmeyer.Disedot dengan pompa vakum .Volume 20-1000 ml  Disposable filter cup unit .Ditekan dengan gaya setrifugasi .Volume 1-20 ml  Spin filters . maka larutan dapat dipindahkan kedalam gelas penampung lain yang sudah steril dan tutup dengan kapas atau aluminium foil yang steril.Volume 15-1000 ml  Disposable filtration unit dengan botol penyimpan .Volume 15-1000 ml  Syringe filters .Ditekan seperti jarum suntik . .  Pasang atau rakit alat-alat tersebut secara aseptis (sesuai gambar).Disedot dengan pompa vakum .Sterilisasi dengan penyaringan dapat dilakukan dengan berbagai cara :  Non-disposable filtration apparatus .  Hubungkan katup erlenmeyer dengan pompa vakum kemudian hidupkan pompa.Volume kurang dari 1 ml Cara kerja menggunakan Non-disposable filtration apparatus  Sterilkan saringan (dapat menggunakan saringan Bekerfeld. Chamberland Zeitz). lalu isi corong dengan larutan yang akan disterilkan.

pipet ukur dan labu erlenmyer.  Bungkus alat-alat gelas dengan kertas payung atau aluminium foil  Atur pengatur suhu oven menjadi 1800C dan alat disterilkan selama 2-3 jam. bahan tersebut di sterilkan lagi dengan cara yang sama. BSC memiliki suatu pengatur aliran udara yang menciptakan aliran udara kotor (dimungkinkan ada kontaminan) untuk disaring dan diresirkulasi melalui filter. BSC juga disebut biosafety hood.Tyndalisasi Konsep kerja metode ini merip dengan mengukus. Misalnya susu yang disterilkan dengan suhu tinggi akan mengalami koagulasi dan bahan yang berpati disterilkan pada suhu bertekanan pada kondisi pH asam akan terhidrolisis. dan juga dikenal dengan Laminar flow hood atau Class II vertical flow cabinet yang menyediakan alat filtrasi dan aliran udara yang bersirkulasi didalam ruang kerja. sedang waktu ini dimaksudkan untuk memberi kesempatan spora atau sel vegetatif yang belum mati untuk tumbuh sehingga mudah dibunuh. Sterilisasi dengan udara panas (Dry heat sterilization) Sterilisasi dengan metode ini biasanya digunakan untuk peralatan gelas seperti cawan petri.  Nyalakan sumber panas dan tunggu hingga termometer menunjukkan suhu 1000C kemudian hitung waktu mundur hingga 30 menit (uap panas yang terbentuk akan mematikan mikroba).  Erlenmeyer/botol lalu dimasukkan kedalam alat sterilisasi (alat standar menggunakan Arnold Steam Sterilizen atau dandang). Udara yang keluar disaring melewati penyaring sehingga sel-sel yang berbahaya tidak lepas keluar ke ruangan lain. Perlindungan untuk praktikan/pen elitian Kelas I Sebagian. Cara kerja :  Bahan dimasukkan kedalam erlenmeyer atau botol dan ditutup rapat dengan sumbat atau aluminium foil. Bahan yang mengandung air dan tidak tahan tekanan atau suhu tinggi lebih tepat disterilkan dengan metode ini.  Setelah 24 jam. Alat gelas yang disterilisasi dengan udara panas tidak akan timbul kondensasi sehingga tidak ada tetes air (embun) didalam alat gelas. Berbagai kelas Biological Safety Cabinet. terdapat perlindungan sempurna (Gloves box) dan udara disaring dengan saringan HEPA . aliran udara keluar disaring dengan saringan HEPA Kelas III Semua. Aliran udara diatur untuk menghambat udara luar masuk dan udara di dalam keluar. Prinsip kerja Biological Saferty Cabinet Biological Safety Cabinet merupakan kabinet kerja yang sterilkan untuk kerja mikrobiologi. aliran udara keluar disaring dengan saringan HEPA Kelas II Sebagaian. untuk mencegah kontaminasi dari luar dan pencemaran bakteri dari ruang BSC.  Setelah selesai alat sterilisasi dimatikan dan bahan yang steril dikeluarkan.

udara masuk disaring dan memiliki sirkulasi udara yang lebih sederhana Kerja dengan bahan kimia yang sangat berbahaya atau dengan mikroorganisme yang sangat patogen Cocok untuk Kerja untuk membiakkan sel atau kerja mikrobiologi BSC yang dimiliki Lab mikrobiologi merupakan BSC kelas II yang memiliki konfigurasi udara seperti gambar disamping ini. udara masuk disaring terlebih dahulu Ada. . Udara dari meja kerja disedot dari depan meja kerja.Perlindungan untuk alat dan bahan Tidak ada. tidak ada area kerja yang steril karena uadara luar dapat masuk melewati area kerja Kerja dengan bahan kimia yang karsinigen bahan kimia beradiasi rendah. Udara yang berasal dari luar kabinet akan langsung terserap masuk kesaluran bawah yang bergabung dengan udara dari meja kerja yang dimungkinkan mengandung bakteri yang digunakan untuk kerja. Kemudian udara kotor ini disaring oleh penyaring HEPA dan disirkulasikan keluar kabinet atau kembali lagi ke meja kerja sebagai udara bersih. larutan yang volatil Ada.

. Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang. Prosedur isolasi jamur dari sampel Pengertian Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya. botol dapat dicelupkan dengan tali. Isolasi Mikroorganisme: a. Teknik Pengambilan sample c. Berikut merupakan prosedur pengambilan sampel. Sampel tanah Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah. 2. tetapi terdiri dari campuran berbagai macam sel. Teknik Pengambilan Sampel Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel. Di dalam laboratorium populasi bakteri inidapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi. maka cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan. Isolasi dengan cara pengenceran 1) Teknik preparasi suspensi  Swab  Rinse  Maserasi 2) Teknik pengenceran bertingkat 3) Teknik penanaman  Dari suspensi (spread dan pour plate)  Dengan goresan (streak dan quadrant streak inoculation) d.ISOLASI MIKROORGANISME Kompetensi: mahasiswa dapat memisahkan mikroba dari campurannya sehingga didapat kultur murni. Sampel air Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. Misal jika yang diinginkan mikroorganisma rhizosfer maka sampel diambil dari sekitar perakaran dekat permukaan hingga ujung perakaran. Jika beerasal dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir botol melawan arus air. Pengertian b.. 1. sifat dan kemampuan biokimiawinya. jika ingin mengambil sampel dari air keran maka sebelumya keran dialirkan dulu beberapa saat dan mulut kran dibakar. Prosedur isolasi bakteri dari sampel e.

sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air. misalnya daun bunga dll. Contohnya sampel daun diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan akuades 45 ml yang terdapat dalam beaker glass. batu.Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution) 1. Unutk sampel dari tanh tak perlu dimaserasi 2. Penentuan besarnya atau banyaknya . biji. Macam-macam preparsi bergantung kepada bentuk sampel : a. Contoh sampelnya antar alain bakso. Maseration (pengancuran). b. buah dll. Rinse merupakan prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9 (w/v). Perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v). dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel yang memiliki permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut. Teknik Pengenceran Bertingkat Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. c. Contohnya adalah meja. Swab (ulas). Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan permukaan sampel. Teknik Preparasi Suspensi Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke dalam larutan atraktan semisal pepton water. Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil. Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. batang kayu dll.

3. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan cairan dari sumber yang sama. Cara Kerja : a. Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung 10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogen. sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya. Spread Plate (agar tabur ulas) Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni.tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir. hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan harus selalu diganti.  Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar supaya tetesan suspensi merata. Pour Plate (agar tuang) Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama. Teknik Penanaman a. Perbandingan berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 dan ingat akuades yang digunakan jika memakai teknik rinse dan swab sudah termasuk pengencer 10-1. penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar. kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa detik.  Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar diatas bunsen beberapa saat. Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan adalah sebagai berikut :  Ambil suspensi cairan senamyak 0. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya.1 ml dengan pipet ukur kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat.1.2. a. Teknik penanaman dari suspensi Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh . Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya (pengocokan yang benar dapat dilihat pada gambar disamping) b. Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi suspensi).  Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas. a. artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet ukur steril yang berbeda/baru.

Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak) Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru. o  Jangan pijarkan loop. b.1 ml untuk spread plate dan 1 ml untuk pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja. sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate.1 Goresan Sinambung Cara kerja :  Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar. Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna  Lakukan hal yang sama pada daerah 3 . kemudian lanjutkan streak zig-zag pada daerah 2 (streak pada gambar). Adapun prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut : Siapkan cawan steril. b. tabung pengenceran yang akan ditanam dan media  padat yang masih cair (>45oC) Teteskan 1 ml secara aseptis. kemudian diinkubasi. Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0. b. Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal. melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.2 Goresan T Cara kerja :  Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker  Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag  Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin. lalu putar cawan 180 C lanjutkan goresan sampai habis.suspensi sel kedalam cawan kosong  Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untuk  menghomogenkan suspensi bakteri dan media.dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen.

1 ml untuk ditanam secara spread plate pada medium NA.B.Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal. Cara Kerja Isolasi Bakteri dari Sampel Tanah :  Tanah seberat 1 g dimasukan ke dalam tabung pengenceran 10-1 secara aseptis dan selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10-8  Tiga pengenceran terakhir diambil 0. .3 Goresan Kuadran (Streak quadrant) Cara kerja : Hampir sama dengan goresan T. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisma. namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi empat. setelah selesai. diinkubasi pada 37oC selama 1x24 jam  Koloni akan tumbuh pada ketiga cawan tersebut kemudian dipilih koloni yang relatif terpisah dari koloni lain dan koloni yang mudah dikenali  Koloni yang terpilih kemudian ditumbuhkan atau dimurnikan ke NA baru dengan teknik streak kuadran  Inkubasi 1x24 jam.

. Kemudian diinkubnasi pada suhu ruang 5-7 hari  Koloni jamur yang tumbuh dimurnikan dan ditanam pada medium PDA baru.Cara Kerja Isolasi Jamur dari Tanah :  Tanah dalam cawan petri dipanaskan dengan oven pada suhu 80oC selama 30 menit dengan cawan petri untuk membunuh sel vegetatiftetap bertahan  Tanah yang telah dioven diambil 1 g kemudian dimasukan ke dalam tabung pengenceran bertingkat  Tiga pengenceran terakhir diambil untuk ditanama secara spread plate ke media PDA yang ditambah streptomycin atau penicillin.  Inkubasi pada suhu ruang 5-7 hari.

coli dan Bacillus sp.5%.FAKTOR LINGKUNGAN YANG BERPENGARUH TERHADAP PERTUMBUHAN MIKROORGANISME Kompetensi: mahasiswa mengetahui pengaruh suhu. Suhu merupakan faktor lingkungan yang sangat menentukan kehidupan mikroorganisme. tekanan sinar UV dan pH terhadap pertumbuhuan Mikroorganisme Faktor lingkungan : a. pengaruh pH terhadap pertumbuhan mikroorganisme Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan mikroorganisme Berdasarkan suhu optimum untuk pertumbuhan maka dapat dikelompokan menjadi 3 yaitu : 1. pengaruh suhu terhadap pertumbuhan mikroorganisme b.) diberi label . psikrofilik(0-200C). 2. cawan dibagi menjadi 2 dengan spidol kemudian labeli dengan bakteri E. 250C. 3. dan 500C dan mikroorganisma yang berbeda (E. pengaruh suhu berhubungan dengan aktivitas enzim.  Inokulasikan E.  Setiap konsentrasi. Cara Kerja :  8x2 tabung yang berisi Nutrient Broth untuk suhu inkubasi 50C. pengaruh tekanan osmotik terhadap pertumbuhan mikroorganisme c. pengaruh sinar ultraviolet tehadap pertumbuhan mikroorganisme d. Bila kepekatan suspensi di lingkungan tinggi maka isi sel akan ke luar. Setelah diinokulasi dengan bekteri yang berbeda. bandingkan derajat kekeruhannya. termofilik (50-1000C). dengan streak kontinyu  Gunakan kontrol untuk masing-masing biakan dengan media yang tidak ditambahi NaCl. Pengaruh tekanan osmotik terhadap pertumbuhan mikroorganisme Keberadaan mikroorganisma dilingkungan dapat dipengaruhi kepekatan suspensi/cairan di lingkungan. 3%.coli dan Bacillus sp. Suhu rendah menyebabkan aktiivtas enzim menurun dan jika suhu terlalu tinggi dapat mendenaturasi protein enzim. mesofilik Mesofilik (20-300C). 370C. Sebaliknya kepekatan suspensi di lingkungan rendah maka akan terjadi pergerakan massa cair ke dalam sel Cara Kerja:  buat 4 buah cawan Nutrient Agar yang mengandung NaCl 0.  Inkubasi selama 48 jam dan amati pertumbuhannya . diinkubasi sesuai suhu yang tertera  setelah ditumbuhkan selama 48 jam.coli dan Bacillus sp. 5% dan 15%.

2 Mesofilik/Neutrofilik dan 3. pada umumnya bakteri tumbuh dengan baik pada pH netral (7.coli dan Bacillus sp.  Dedahkan ketiga cawan tersebut pada sinar UV dengan panjang 254 nm selama 1 menit. Komponen seluler yang dapat menyerap sinar UV adalah asam nukleat sehingga dapat rusak dan menyebabkan kematian. E. pada 3 cawan NA. Cara Kerja:  Inokulasikan Aspergillus sp. Acidofilik..Pengaruh sinar ultraviolet terhadap pertumbuhan mikroorganisme Sinar UV panjang gelombang 210-300 nm dapat membunuh mikroorganisme jika di paparkan. 5 menit. Basofilik Cara Kerja :  Buatlah tabung reaksi berisi NB dan atur pH-nya (pH 3. dan 15 menit (ingat tutup cawan dibuka dan diusahakan lingkungan sekitar steril).0). 7 dan 9) masing-masing 2 tabung untuk tiap nilai pH  Labeli dengan nama bakteri yang akan diinokulasikan  Inokulasi tiap tabung dengan Bacillus sp dan E. Jarak antar UV dan cawan sekitar 12 inchi  Gunakan kontrol untuk masing-masing biakan dengan tidak memaparkan pada sinar UV  Inkubasi selama 48 jam dan amati pertumbuhan koloninya Pengaruh pH terhadap pertumbuhan mikroorgansime pH berpengaruh terhadap sel dengan mempengaruhi metabolisme.coli lalu diinkubasi pada suhu 370C selama 48 jam  Amati perbedaan kekeruhan pada tiap nilai pH . Berdasarkan nilai pH yang dibutuhkan untuk kehidupannya dikenal 3 kelompok mikroorganisme yaitu : 1.

3. khususnya untuk tujuan identifikasi.1.2.2 pada agar miring a.4 dengan pewarnaan endospora a.MORFOLOGI MIKROBA Kompetensi : mahasiswa dapat mengenali bentuk dan morfologi sel dan koloni mikroorganisme a.2.1. Setelah mendapatkan kultur murni maka biakan yang diinginkan ditumbuhkan ke berbagai bentuk media untuk dikenali ciri koloninya. Mengamati Morfologi Koloni Bakteri Kegiatan ini merupakan tindakan pertama kali jika ingin mempelajari suatu jenis bakteri lebih lanjut.2 dengan pewarnaan negatif a. Cara Kerja :  Tumbuhkan biakan pada media NA cawan dengan streak kuadran  Tumbuhkan biakan pada media NA miring dengan pola inokulasi yang tegak lurus  Tumbuhkan biakan pada media NA tegak dengan stab inoculation  Tumbuhkan biakan pada media NB A.2.2 mengamati morfologi sel bakteri a.1 mengamati morfologi koloni yeast (pada agar cawan) b.3 mengamati motilitas bakteri a.4 pada media cair a.2 mengamati morfologi sel kapang (dengan metode slide culture) Bakteri A. Bakteri a.2 mengamati morfologi sel yeast (dengan pewarnaan sederhana) c.1.1 mengamati morfologi koloni kapang (pada agar cawan) c. pinpoint/punctiform (titik) Small (kecil) Moderate (sedang) Large (besar) .1.2 pengamatan tidak langsung b.3 pada agar tegak a.3 dengan pewarnaan gram a.1 dengan pewarnaan sederhana a.2.1 mengamati morfologi koloni bakteri a.3.1 pengamatan langsung a.1.1 pada media cawan a. Kapang c. Yeast b. Pertumbuhan pada Cawan Petri Ciri-ciri yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut :  Ukuran.

Transparant (bening)  Bentuk : Circular Elevasi : Flat Irregular Raised Spindle Convex Filamentous Umbonate Rhizoid   Permukaan : Halus mengkilap Kasar Berkerut Kering seperti bubuk Margins : Entire Lobate Undulate Serrate Felamentous Curled A. Translucent (dapat ditembus cahaya sebagian). Opaque (tidak dapat ditembus cahaya).  Pigmentasi : mikroorganisme kromogenik sering memproduksi pigmen intraseluler.2. beberapa jenis lain memproduksi pigmen ekstraseluler yang dapat terlarut dalam media Karakteristik optik : diamati berdasarkan jumlah cahaya yang melewati koloni. Pertumbuhan pada Agar Miring Ciri-ciri koloni diperoleh dengan menggoreskan jarum inokulum tegak dan lurus Ciri koloni berdasarkan bentuk: .

A. Ciri-ciri koloni berdasar bentuk : Ciri koloni berdasar kebutuhan O2 : .3 Pertumbuhan pada Agar Tegak Cara penanaman adalah dengan menusukkan jarum inokulum needle ke dalam media agar tegak.

Congo Red dll.pewarnaan gram . Pada zat warna basa. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet.A. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin.pewarnaan endospora .pewarnaan positif .1. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Pewarnaan  Pewarnaan sederhana . .4 Pertumbuhan pada Media Cair Pola pertumbuhan berdasarkan kebutuhan O2 A. Malachite Green dll. Base Fuchsin. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya.  Pewarnaan khusus . sel bakteri sulit terlihat. maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Mengamati Morfologi Bakteri Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif.pewarnaan negatif  Pewarnaan diferensial .pewarnaan flagella dll. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Methylene Blue. tapi jika suspensi bakteri terlalu encer. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel.pewarnaan acid fast dll. B. Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif) Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Safranin. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan.

Safranin. satu ulasan saja kemudian diberi akuades dan disebarkan supaya sel merata. teteskan nigrosin atau tinta cina di ujung kanan salah satu object glass  Biakan diambil lalu diulaskan atau diteteskan dalam tetesan nigrosin tadi.Cara Kerja :  Bersihkan object glass dengan kapas  Jika perlu tulislah kode atau nama bakteri pada sudut object glass  Bila menggunakan biakan cair maka pindahkan setetes biakan dengan pipet tetes atau dapat juga dipindahkan dengan jarum inokulum. jangan difiksasi atau dipanaskan di atas api. B. Jangan lupa biakan dikocok terlebih dahulu. Jika digunakan biakan padat. lalu dicampurkan  Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan ke samping kiri  Biarkan preparat mengering di udara. Crystal Violet) dan tunggu kurang lebih 30 detik.2 Pewarnaan Negatif Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. maka biakan dipindahkan dengan jarum inokulum. .  Keringkan ulasan tersebut sambil memfiksasinya dengan api bunsen (lewatkan di atas api 2-3 kali)  Setelah benar-benar kering dan tersebar selanjutnya ditetesi dengan pewarna (dapat digunakan Methylen blue. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya. Prosedur:  Ambil dua object glass. Tapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam.  Cuci dengan akuades kemudian keringkan dengan kertas tissue  Periksa dengan mikroskop (perbesaran 100 x 10).

(rod). Ancylobacter dll Bacillus Spirochaeta. micrococcus Sarcina . Veillonella. Bdellovibrio. pediococcus.1 2 3 4 Setelah dilihat di mikroskop. Berikut merupakan berbagai bentuk sel bakteri Bentuk Contoh jenis Coccus (sphere) Coccobacilli Bacilli. Moraxela Streptococcus Bacillus. Enterococcus Moraxella. campylobacter Neisseria. Mycobacterium Staphylococcus Deinococci. Spirillum. rounded ends Vibrio (curved) Bacilli (Rod). blunt end Helical (spirillum) Diplococcus Streptococcus Streptobacillus Staphylococcus Tetrad (Gaffkya) Sarcina (cuboid packets) Neisseria. Lactobacilus. clostridium Vibrio. maka akan tampak bentuk sel bakteri. Acinetobacter Escherichia.

s iodine) Adanya lugol’s iodine menyebabkan lalu tunggu ± 1 menit adanya ikatan CV dengan iodine yang akan meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri. sedangkan pada gram positif CV-iodine tetap menempel di dinding sel. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri.Buat preparat ulas (smear) yang Sel bakteri tertempel pada permukaan telah difiksasi dari bakteri gram kaca (object glas) positif misal Bacillus subtilis dan gram negatif misal Escherichia coli 2. Counterstain hanya berfungsi sebagai pengontras saja 9. Pewarnaan Gram Adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi.Beri larutan pemucat (ethanol 96%/ aseton) setetes demi setetes hingga etanol yang jatuh berwarna jernih.Cuci dengan akuades mengalir 8. sel gram negatif menjadi bening 7.Teteskan counterstain (safranin) dan Safranin akan mewarnai sel gram tunggu selama ± 45 detik negatif menjadi berwarna merah.Keringkan preparat dengan kertas tissue yang ditempelkan di sisi ulasan (jangan sampai merusak ulasan) lalu biarkan mengering di udara. karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi.Cuci dengan akuades mengalir 4. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel. .Cuci dengan akuades mengalir 6. sedangkan gram positif tidak terpengaruh.Berikut merupakan prosedur pewarnaan Gram: Cara Kerja : Dampak/Hasil 1. sehingga komplek CV-iodine akan lepas dari permukaan sel gram negatif.Teteskan kristal violet sebagai Kristal ungu akan mewarnai seluruh pewarna utama pada kedua preparat .Teteskan mordant (lugol.Cuci dengan akuades mengalir 10.A. permukaan sel bakteri gram positif dan usahakan semua ulasan terwarnai dan negatif tunggu selama ± 1 menit 3.3. Pada gram positif dapat terbentuk CV iodinribonukleat pada dinding sel 5. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Jangan sampai terlalu banyak (overdecolorize) Penetesan etanol absolut menyebabkan terbentuknya pori-pori pada gram negatif yang memiliki banyak lapisn lemak (lipid larut dalam etanol). Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif.

Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sbb: Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam .

Cuci kering anginkan . warna ini tidak mempengaruhi warna hijau endospora. B. Desulfomaculatum dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya.Setelah dingin. Namun jika dengan pewarnaan sederhana. sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif. Cara Kerja : 1.4. radiasi dan bahan kimia.Tetesi dengan safranin sebagai counter stain. endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (keduaduanya transparan. Walaupun ada beberapa species yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. khususnya pada gram positif. penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Biarkan 5 menit. sehingga pembedaannya tampak jelas. diamkan selama + 45 detik 5.Buat preparat ulas dari Bacillus subtilis lalu tutup dengan kertas merang 2. dingin. sekali diberi zat warna. 3. 4. Letakan di atas air yang mendidih. warna tersebut sulit dilunturkan. bilas object glass dengan akuades mengalir Dampak/Hasil Sel bakteri menempel pada permukaan object glass Malachite green akan mewarnai sel vegetatif bakteri. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel. sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Untuk mewarnainya dilakukan pemanasan untuk mempermudah penetrasi Malachite green ke dinding endospora. Pembilasan dengan akuades akan melunturkan Malachite green pada sel vegetatif Safranin akan mewarnai sel vegetatif menjadi merah. Air digunakan sebagai agen dekolorasi sel. Berikut merupakan prosedur pewarnaan endospora dengan metode Schaeffer-Fulton. sel vegetatif berwarna). tambahkan lagi Malachite Green. Dijaga jangan sampai kering. Pewarnaan Endospora Anggota dari genus Clostridium. Jika bagian pinggir mulai mengering. Endospora sukar menyerap zat warna. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV). sehingga diperlukan teknik pewarnaan endospora. Setelah perlakuan di atas Malachite green tidak melekat kuat dengan sel vegetatif. kering.Tetesi ulasan pada object glass dengan Malachite green di atas kertas merang.

Pemberian Malachite green Pelunturan dengan air mengalir Penambahan safranin Cuci dan keringkan .

Hati-hati jangan salah membedakan antara sel yang bergerak sendiri karena flagel atau bergerak terkena aliran air. hasil negatif menunjukan bakteri hanya tumbuh pada daerah tusukan saja Bakteri motil akan bermigrasi ke seluruh permukaan agar dan bekas tusukan Yeast / Khamir A.  Tutup dengan cover glass  Amati menggunakan mikroskop dengan perbesaran maksimak.1 Pengamatan Langsung Cara Kerja :  Teteskan biakan bakteri motil seperti Bacillus atau E.2 Pengamatan tidak langsung Cara Kerja :  Tanam biakan pada media NA tegak atau Media Motilitas dengan cara tusuk (Stab inoculation) sedalam + 5 mm. Jika digunakan biakan padat maka ulas dengan jarum inokulum lalu ditambah akuades satu tetes.  Inkubasi selama 2x24 jam.Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya : C. ratakan. Mengamati motilitas C.  Inkubasi pada suhu 370 C selama 1x 24 jam  Hasil positif (motil) jika bakteri tumbuh pada seluruh permukaan media. Bakteri akan tampak transparan dan pola pergerakannya tidak beraturan. Mengamati morfologi koloni yeast  Tanam biakan yeast (dapat berupa Sacharomyces cereviceae atau Candida albicans) pada PDA dengan cara streak quadrant. C.coli ke object glass (sebaiknya dari biakan cair). .

Mengamati Morfologi Sel Yeast Yeast merupakan fungi mikroskopik uniseluler. Hifa dapat berekat (septat) dengan inti tunggal/ lebih dan hifa tidak bersekat (aseptat). Setelah didapatkan koloni tunggal. seperti dari kelompok Actinomycetes atau Bacillus mycoides. B. tidak membentuk hifa (beberapa spesies dapat membentuk pseudohifa). Morfologi koloninya dapat dengan mudah dibedakan dengan bakteri walaupun ada beberapa jenis bakteri yang koloninya mirip jamur. A.2 Melihat bentuk spora sel Yeast Cara kerja :  Buat preparat ulas dari biakan yeast pada Goodkowa Agar yang berumur 10 hari. Panasi preparat dengan api bunsen selama + 30 detik (sampai timbul uap). Mengamati morfologi koloni kapang Cara kerja :  Tanam/pindahkan biakan kapang dengan jarum inokulum needle yang diletakan di tenganh-tengah cawan petri. Bentuk selnya bervariasi dapat berbentuk bulat. Beberapa spesies yeast memiliki sifat dimorfisme yaitu bentuk sel tunggal dan bentuk hifa atau pseudohifa. B.  Tutup preparat dengan cover glass. tetapi tidak melepaskan diri dari induk. B. Perhatikan spora yang berwarna Kapang / Jamur Jamur merupakan mikroba dengan struktur talus berupa benang-benang (hifa) yang terjalin seperti jala (myselium).1 Melihat bentuk sel Yeast Cara Kerja :  Tumbuhkan Sacharomyces cereviceae pada glukosa cair selama 24 jam. Penampakan morfologi koloni pada umumnya seperti benang (filamentous) yang pertumbuhannya membentuk lingkaran. Keringkan dengan tissue kemudian biarkan pada udara terbuka. bulat memanjang dengan ukuran 1-9x20 µm.  Warnai dengan cara Shager dan Fulgen yaitu: Tetesi preparat dengan Malachite Green dan biarkan 30-60 detik.  Fiksasi dengan api bunsen. Amati di bawah mikroskop. pengamatan ciri-ciri morfologi koloni hampir sama dengan ciri morfologi bakteri. Cuci preparat dengan air mengalir. Morfologi internal sel mudah dilihat dan terdiri dari inti dan organel seperti mitkondria. .  Ulaskan suspensi biakan pada object glass lalu teteskan Methilene Blue hingga rata (jangan difiksasi). grannula lemak dan glikogen.  Inkubasi selam beberapa hari. Koloni kapang memiliki keragaman warna yang muncul dari sporanya. Pseudohifa adalah hifa yeast yang terbentuk dari rangkaian sel hasil pembelahan aseksual secara budding. bulat telur.  Amati dengan perbesaran 40x10 atau 100x10.

 Setelah selesai sterilisasi berikan lilin (parafin-petrolatum) steril pada sebelah kiri dan kanan tempat yang akan ditutup cover glass (aseptis).1 Metode Heinrich’s. tissue basah yang dimasukkan dalam cawan dan sterilkan dengan autoclave. Pengamatan struktur spora dan miselium dapat juga dilakukan dengan preparat ulas seperti yang telah diuraikan di depan. spora dan miselium tumbuh langsung pada slide sehingga dapat mengatasi masalah tersebut.  Tutup potongan agar dengan cover glass. Dengan teknik ini. Amati pertumbuhan koloni (miselium) yang menyebar.  Tutup dengan cover glass. B. potong media Saboraud Dextrose Agar steril berbentuk kubus dan letakkan di atas object glass.  Teteskan suspensi spora jamur dalam media cair pada media cover glass yang tidak diberi lilin. cover glass. 2 Metode Riddel. . Tekan cover galss secara media merata. Mengamati sel morfologi kapang dengan metode Slide Culture (Microculture) Teknik ini bertujuan untuk mengamati sel kapang dengan menumbuhkan spora pada object glass yang ditetesi media pertumbuhan. cara kerja :  Persiapan sama seperti di atas  Setelah semua steril. cara kerja :  Siapkan object glass.  Inokulasikan spora jamur pada bagian atau potongan agar.  Ambil preparat dan amati di bawah mikroskop.  Inkubasi pada suhu kamar selama 3x24 jam. B. Namun seringkali miselium atau susunan spora menjadi pecah atau terputus sehingga penampakan di mikroskop dapat membingungkan.  Inkubasi pada suhu kamar selama 3x24 jam. B. Berikan sampai setengah luasan cover glass.

 Inkubasi selama 2x24 jam.3 Prosedur yang lebih sederhana.  Belah media yang memadat dengan jarum inokulum yang berujung L. Ambil preparat dan diamati di bawah mikroskop. B.  Ulaskan spora jamur yang akan diamati pada belahan tersebut.  Tutup dengan cover glass tepat di atas media dan tekan hingga merata.  Teteskan media PDA pada object glass secara aseptis lalu tunggu memadat (teteskan jangan terlalu banyak).  Amati pertumbuhan miselium dan spora pada object glass dengan perbesaran sedang . cara kerja :  Sterilkan cawan petri yang berisi kapas yang di atasnya terdapat object glass dan cover glass.  Siapkan media PDA dan dijaga supaya tetap cair.

Dari hasil tersebut dapat diketahui satu satuan panjang pada skala mikrometer okuler itu berdasarkan beberapa jumlah skala kecil mikrometer objektif yang berada di antara garis yang berhimpit tadi. Kalibrasi dilakukan dengan menghimpitkan skala mikrometer objektif dan okuler pada perbesaran yang diinginkan.1.01 X Skala Objektif Skala Okuler 10 X Skala Ob Skala Ok (mm) = (µm) .1.1. Menentukan jumlah mikroba (enumerasi) b. menjadi tolak ukur untuk menentukan ukuran skala micrometer okuler. Skala ke nol (garis pertama) kedua mikrometer disimpulkan menjadi 1 garis kemudian dilihat pada skala ke berapa kedua jenis mikrometer tersebut bertemu/berhimpit kembali. Mikrometer merupakan kaca berskala dan dikenal 2 jenis micrometer yaitu mikrometer okuler dan mikrometer objektif. Jarak ini dapat ditentukan dengan mengkalibrasi antara mikrometer okuler dan objektif.1.3 cara kerja SPC dan TPC b. Jarak antar garis skala pada mikrometer okuler tergantung pada perbesaran lensa objektif yang digunakan yang menentukan lapang pandang mikroskop. Mikrometer objektif memiliki skala yang telah diketahui. Menentukan ukuran mikroba Menggunakan mikrometer b.1.D = Okuler Division) Jarak skala pada mikrometer okuler = 0. 1 skala micrometer objektif = 0.2 MPN b..MENENTUKAN JUMLAH & UKURAN MIKROBA Kompetensi : Mahasiswa dapat melakukan pengukuran sel mikroorganisme Mahasiswa dapat melakukan perhitungan mikroba dengan cara Plate Count. MPN dan dengan haemocytometer Menentukan jumlah dan ukuran mikroba a.1 SPC b.1. Objektif (O.2 penghitungan jumlah bakteri secara keseluruhan (penghitungan langsung dengan haemocytometer  Menentukan Ukuran Mikroorganisme Mikroba berukuran sangat kecil dan untuk mengetahuinya digunakan mikrometer.01 mm / 10 µm. Mikrometer okuler dipasang pada lensa okuler mikroskop.1 Plate count (hitungan cawan) b. 1 skala okuler = Jarak yang diketahui antara 2 garis pada mik.1 penghitungan jumlah bakteri hidup (penghitungan tidak langsung) b. sedangkan micrometer objektif berbentuk slide yang ditempatkan pada meja preparat mikroskop.2 TPC b.1.1.

Misal : jika skala ke 0 mikrometer okuler berhimpit dengan skala ke 0 mikrometer objektif lalu skala ke 13 mikrometer okuler berhimpit dengan skala ke 2 mikrometer objektif maka beberapa 1 skala okuler. : Cara kalibrasi cara mengukur mikroba Penentuan ukuran mikroba  Lepaskan mikrometer objektif dari meja benda.00154 mm = 1.  Cari dengan teliti skala ke berapa antara mikrometer objektif dan okuler yang berhimpit lagi. Tabung lensa okuler dapat diputar dan dicari posisi yang pas.  Hitung panjang dan lebar sel sebenarnya : .  Hitung berapa panjang sel dengan menghitung skala mikrometer okuler.  Jika diperlukan hitung lebar sel dengan cara yang sama.02 = 0.  Hitung besarnya skala okuler dengan rumus di atas. (misalnya 40 X 10) kemudian cari gambar perbesaran dari skala mikrometer objektif. 1 Skala Okuler = = 0.  Setelah fokus didapat. kemudian selanjutnya himpitkan skala ke nol mikrometer objektif dan okuler.  Tentukan perbesaran yang digunakan.54 µm 13 Cara Kerja : Kalibrasi  Letakkan mikrometer objektif pada meja benda dan pasang mikrometer okuler pada tabung lensa okuler.  Ganti dengan preparat ulas yang telah disiapkan  Cari fokus dari preparat tersebut dengan perbesaran yang sama.01 x 2/13 0.

Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni. Perhitungan mengacu kepada standar atau peraturan yang telah ditentukan. jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut. koloni yang tumbuh berasal dari suspensi yang diperoleh menggunakan pengenceran bertingkat dari sebuah sampel yang ingin diketahui jumlah bakterinya.Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan) tidah dihitung.1 ml koloni = 50 Fp = 1/10 -6 SP = 1 ml Pour plate : = 50 x 106 CFU’s / 0. Berdasarkan hal tersebut digunakan istilah Coloni Forming Units (CFU’s) per ml. Syaratsyaratnya sebagai berikut : .Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni.Satu koloni dihitung 1 koloni. -6 dengan Spread plate : koloni = 50 Fp = 1/10 -6 SP = 0.1. . penghitungan jumlah bakteri hidup (tidak langsung) a.7 µm 2 X 1.1 ml = 5x107 CFU’s / ml a. Setelah diinkubasi.x skala okuler X hasil kalibrasi y skala okuler X hasil kalibrasi misal : 5 X 1.1 ml = 50 000 000 CFU’s / 0. Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel mikroorganisme karena beberapa mikroorganisme tertentu cenderung membentuk kelompok atau berantai.1.Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni.54 = 7.54 = 3. .1 ml = 500 000 000 CFU’s / ml = 5x108 CFU’s / ml = 50 x 106 CFU’s / 1 ml = 50 000 000 CFU’s / 0. Cara menghitung sel relatif / CFU’s per ml CFU’s / ml = jumlah koloni X faktor pengenceran Misal : penanaman dilakukan dari tabung pengenceran 10 metode Spread Plate dan Pour Plate. Standard Plate Count (SPC) Koloni yang dipilih untuk dihitung menggunakan cara SPC memiliki syarat khusus berdasarkan statistic untuk memperkecil kesalahan dalam perhitungan. . . Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah sebagai berikut “ .08 µm  Menentukan jumlah mikroorganisme (enumerasi) A.Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni. Plate Count (hitungan cawan) Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. .1.

500)/2 45.500<2 140 35 1 1.5X10 Dilap.4 X 104.000+30.9X104 135 45 5 (13. < 30 = TFTC (Too Few To Count).6X106 Pngc. 10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan 175 15 5 (17.3X10 28 dan 5 <30 650 127 10 1.trtgg(10-3) Bila ada 2 cawan.500/35. atau 2. Pengc.3X104 rata-rata 25 dan 28 <30 (29.500/40.500/35.3 X 104. maka hanya dari pengenceran tertinggi yang dilaporkan.500>2 4 165 45 8 = 1.3X105 650 >300 6 TNTC TNTC 195 2X10 TNTC >300 Jumlah koloni yang dilaporkan terdiri dari 2 digit yaitu angka satuan dan angka sepersepuluh yang dikalikan dengan kelipatan 10 (eksponensial).000/14. Jika hasil bagi dari pengenceran tertinggi dan terendah > 2 maka jumlah yang dilaporkan adalah dari cawan dengan pengenceran terendah.4X104 35.000)/2 = 290 25 5 meskipun 3X104 305>300 305 28 0 - - - - - .000/29. bukan 2.500+40. maka jumlah angka yang digunakan adalah rata-rata dari kedua nilai jumlah masingmasing setelah diperhitungkan. maka jumlah yang dilaporkan adalah nilai rata-rata. pembulatan keatas dilakukan pada angka seperseratus yang sama atau lebih besar dari lima. 10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan 15 1 0 1.000>2 Apabila setiap pengenceran digunakan 2 cawan petri (duplo).- Pilih cawan yang ditumbuhi koloni dengan jumlah 30-300 koloni. Hasil (a+b)/2 = 3.35 X 104 menjadi 2. 10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan TNTC TNTC 358 3. terendah 275 35 5 (27.000/10.5X103 Semua <30 Bila diperoleh perhitungan > 300 dari semua pengenceran.5X10 40.3X105 Pngc.34 X 104 menjadi 2.800)/2 15 dan 20 <30 208 20 2 = 1.3 X 104.000/13.500+20.500>2 45. Bila diperoleh perhitungan < 30 dari semua pengenceran. missal 2. 10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan 4 295 40 5 3.000<2 28.000)/2=b 285 40 7 Dilap. maka hanya dari pengenceran terendah yang dilaporkan. > 300 = TNTC (Too Numerous To Count) atau TBUD (Terlalu Banyak Untuk Dihitung). missal 2. masing-masing dari pengenceran rendah dan tinggi yang berurutan dengan jumlah koloni 30-300 dan hasil bagi dari jumlah koloni pengenceran tertinggi dan terendah ≤ 2.000)/2=a 27.trtgg(10-4) TNTC 325 18 3. 10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan 4 234 20 5 2.500+16.34 X 104.000<2 (28.

koloni dihitung dengan persyaratan yang telah diuraikan di depan.1. Inkubasi pada suhu 30º C selama 1-2 x 24 jam.Bagan alur persyaratan SPC a.3 Prosedur perhitungan jumlah bakteri dengan metode Plate Count. Jika secara Spread Plate. Pola . Penghitungan koloni pada cawan sebaiknya dibuat transek atau dibagi-bagi jika koloni yang tumbuh terlalu banyak. Masukkan sampel ke tabung berisi 9 ml akuades untuk pengenceran pertama. maserasi dan rinse) (jika perlu).      Lakukan preparasi suspensi kepada sampel terlebih dahulu (swab. selanjutnya diencerkan sampai tingkat pengenceran (misalnya sampai 10-8) tertentu. Transek dibuat dengan spidol/marker di bagian bawah cawan petri. Setelah tumbuh. Plating dapat secara Spread Plate atau Pour Plate. dapat digunakan batang L atau glass beads. Dari 3 pengenceran terakhir diplating (ditanam) ke media NA (Nutrien Agar) atau PCA (Plate Count Agar) sebanyak dua kali tiap pengenceran (duplo).

transek dapat dibuat bervariasi.1 ml dimasukkan pada media LBSS (Lactose Broth Single Stegth) yang berkomposisi sama tapi hanya kadar laktosa setengah dari LBDS yaitu 5 gr. MPN didasarkan pada metode statistik (teori kemungkinan). lactose (10 gr) dan Bromthymol Blue (0. a. Apabila dipakai 3 tabung maka disebut seri 3.2 %) per liternya. Pemberian sampel pada tiap seri tabung berbeda-beda. batang pendek. Untuk sampel sebanyak 10 ml ditumbuhkan pada media LBDS (Lactose Broth Double Stegth) yang memiliki komposisi Beef extract (3 gr). Penghitungan akan lebih mudah bila memakai Coloni Counter. peptone (5 gr). . Nilai MPN ditentukan dengan kombinasi jumlah tabung positif (asam dan gas) tiap serinya setelah diinkubasi. Ciri-ciri utamanya yaitu bakteri gram negatif. tergantung kebutuhan. Sampel ditumbuhkan pada seri tabung sebanyak 3 atau 5 buah tabung untuk setiap kelompok. maka bakteri ini dapat memfermentasikan laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi oleh berubahnya warna dan gas dalam tabung durham. memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi dalam waktu 24 jam inkubasi pada 37º C. dan jika dipakai 5 tabung maka disebut 5 seri. Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri pada air khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri koliform yang merupakan kontaminan utama sumber air minum. Berdasar sifat coliform.2 Most Probable Number (MPN) Pendekatan lain untuk enumerasi bakteri hidup adalah dengan metode MPN. Untuk sampel 1 ml dan 0. Media pada tabung adalah Lactose Broth yang diberi indikator perubahan pH dan ditambah tabung durham. tidak membentuk spora.

Kombinasi angka tersebut lalu dicocokkan dengan tabel MPN untuk seri 3 sehingga diperoleh jumlah mikroba sebenarnya. Atur kesembilan tabung menjadi 3 seri (seperti di gambar). harus ada keduanya).  Inkubasi semua tabung pada suhu 37º C selama 48 jam. Tulis kombinasi tabung positif tiap seri (misal : 3 2 1).  Pindahkan suspensi air sample sebanyak 10 ml ke masing-masing tabung seri pertama (3 tabung LBDS). secara aseptis. secara aseptis.  Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing tabung seri kedua (3 tabung LBSS). Misal : didapatkan kombinasi jumlah tabung positif : 321 maka jumlah bakteri coliform adalah 150 sel/100 ml.  Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing tabung seri ketiga (3 tabung LBSS). lalu hitung tabung positif untuk tiap seri. secara aseptis.  Kocok botol yang berisi air sampel.Cara kerja :  Sediakan 3 tabung berisi LBDS (9 ml tiap tabung) dan 6 tabung berisi LBSS (9 ml tiap tabung) lengkap dengan tabung durham.  Lihat tabung gas positif (asam dan gas . .

Satu kotak besar di tengah. Jumlah cairan yang terdapat antara coverglass dan alat ini mempunyai volume tertentu sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu bujur sangkar juga tertentu.2 mm. Penghitungan jumlah bakteri secara keseluruhan (langsung) Penghitungan secara langsung dapat dilakukan secara mikroskopis yaitu dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil.B. . Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0. Sel nakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui. Alat yang digunakan adalah Petroff-Hauser Chamber atau Haemocytometer.1 mm. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0.

5 x 105 jadi misalnya diperoleh: 20 sel dalam satu kotak sedang maka jumlah sel keseluruhan : = 20 x (1/4) x 106 = 5 x 106 sel/ml Dengan perhitungan yang sama maka diperoleh rumus untuk kotak kecil : Jumlah sel/ml = jumlah sel x 4 x 106 Cara kerja (digunakan kotak sedang) :  Bersihkan Petroff-Hauser Counting Chamber atau Haemocytometer dengan alkohol 70 % lalu keringkan dengan tissue.  Tambahkan ± 50 µl suspensi sel yeast (kira-kira 1 tetes) dengan cara meneteskan pada parit kaca pada alat hitung.2 = 0.2 x 0.004 mm3 = 0. paling tidak sebanyak 5 kotak sedang (lebih banyak lebih baik). Jika dalam satu kotak sedang terdapat sel-sel yang banyak dan bertumpuk maka perhitungan akan tidak akurat dan diperlukan pengenceran dengan perbandingan 1:5 atau 1:10.5 x 105 Kotak sedang : Jumlah sel/ml = jumlah sel x 2.004 mm3 Karena 1 ml = 1cm2 Maka : = 0. Suspensi sel akan menyebar karena daya kapilaritas.000004 cm3 = 4x10-6 ml Sel/ml : = jumlah sel/4x10-6 ml = (jumlah sel/4) x 106 = jumlah sel x (¼) x 106 = jumlah sel x 2.04 mm2 x 0. .  Letakkan cover glass di atas alat hitung.  Biarkan sejenak sehingga sel diam di tempat (tidak terkena aliran air dari efek kapilaritas).Luas kotak sedang : =pxl = 0. Hasil perhitungan dirata-rata kemudian hasil rataan dimasukkan rumus untuk kotak sedang.1 mm = 0.  Letakkan alat hitung pada meja benda kemudian cari fokusnya pada perbesaran 40x10.04 mm2 Volume kotak sedang : = 0. Jika dilakukan pengenceran maka jumlah sel/ml dikalikan faktor pengenceran.  Hitung sampel.  Lakukan perhitungan secara kasar apakah diperlukan pengenceran atau tidak.

Disinfektan yaitu suatu senyawa kimia yang dapat menekan pertumbuhan mikroorganisme pada permukaan benda mati seperti meja. pH dan jenis tempat mikroba hidup Beberapa jenis disinfektan diantaranya adalah: Jenis Senyawa fenol : Fenol Cresol Hexaclhorophene Recorcinol Thymol Alkohol : Ethyl Isopropil Senyawa halogen : Senyawa chlorin : Sodium hipochlorite Chloramine Senyawa iodine : Povidone-iodine (betadine) Keterangan Merusak membran sel Mendenaturasi protein Konsentrasi kerja : 2-5% Pelarut lemak Denaturasi dan koagulasi protein Konsentrasi kerja : 50-75% Agen oksidasi Presipitasi protein Klorin bereaksi dengan air membentuk asam hipoklorit yang bersifat bakterisidal . Pengertian dan jenis disinfektan b. Efisiensi dan efektivitas disinfektan dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu:     Konsentrasi Waktu terpapar Jenis mikroba Kondisi lingkungan: temperatur.DAYA KERJA ANTIMIKROBA DAN OLIGODINAMIK Kompetensi : mahasiswa mengetahui cara kerja pengujian oligodinamik dan zat antimikroba a. lantai dan pisau bedah. Adapun antiseptik adalah senyawa kimia yang digunakan untuk menekan pertumbuhan mikroorganisme pada jaringan tubuh. misalnya kulit. Cara kerja pengujian disinfektan  Pengujian zat disinfektan dengan kertas cakram  Pengujian pengaruh daya oligodinamik c. Zat antimikroba dapat bersifat membunuh mikroorganisme (microbicidal) atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme (microbiostatic). Pengertian Antibiotik  Cara kerja pengujian antibiotik dengan metode Kirby-Bauer Pengertian dan Jenis Disinfektan Zat antimikroba adalah senyawa yang dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme.

Menciptakan tegangan permukaan yang rendah Merusak membran sel Memindahkan sel secara mekanis Tegangan permukaan yang rendah Daya kerja sama dengan senyawa aktif permukaan Merusak dinding sel dan membran sel Koagulasi protein Memiliki avinitas terhadap asam nukleat Pengujian zat disinfektan dengan kertas cakram Cara kerja :  Inokulasikan E. sisa tetes larutan yang berlebihan pada kertas cakram diulaskan pada dinding wadah karena dikhawatirkan larutan akan meluas di permukaan agar jika larutan terlalu banyak.  Kertas cakram diletakkan dipermukaan agar dengan pinset. coli dan Bacillus sp. .  Inkubasi selama 48 jam pada 37 0C. betadin. dan hipoklorit 5%). Agen aktif permukaan : Sabun Detergen emulsifier Senyawa kationik : Senyawa amonium kuartener benzalconiumclhoride Senyawa anionik : Sodium Tertradecyl Sulphate Asam (H+) Basa (OH-) Pewarna : Crystal Violet Bereaksi dengan gugus SH (sufihidril) pada enzim yang menyebabkan denaturasi. LysoI 5%. Tekan dengan pinset supaya kertas cakram benar-benar menempel pada agar.  Zona hambat yang terbentuk diukur diameternya.  Kertas cakram steril dicelupkan ke dalam larutan disinfektan (alkohol 70%. Pada NA cawan sengan streak kontinyu.Logam berat : Senyawa Hg Senyawa Zn Senyawa Cu dll. bandingkan daya kerja berbagai disinfektan. Setelah diangkat.

pada cawan NA dengan streak kontinyu  Letakan koin tembaga dan seng ke dalam cawan dengan pinset  Inkubasi 370C selama 48 jam  Hitung zona hambat yang terbentuk dengan mengukur diameter daerah yang jernih atau tidak ada pertumbuhan Pengertian dan Jenis Antibiotik Antibiotik adalah bahan yang dihasilkan oleh mikroorganisme atau sintetis yang dalam jumlah kecil mampu menekan menghambat atau membunuh mikroorganisme lainnya. Antibiotik dikelompokkan berdasarkan gugus aktifnya. Cara Kerja :  Inokulasikan E. misal antibiotik macrolide. misalnya:  ragam antibakteria:  Penicillin dan cephalosporin         Erythromycine Sulfa drugs Trimethoprim dan sulfamethoxazole Polymyxin B Quinolone Tetracycline  Antifungi : Nystatin Azoles . antimikroba peptida.coli dan Bacillus sp. Ag dan Pb bersifat racun terhadap sel meskipun hanya dalam kadar rendah.Pengujian pengaruh daya oligodinamik Logam-logam berat seperti Hg. Daya hambat atau mematikan dari logam dengan konsentrasi yang rendah disebut daya oligodinamik. Antibiotik memiliki spektrum aktivitas antibiosis yang beragam. Adapun penamaannya biasanya berdasarkan gugus kimiawinya ataupun mikroorganisma produsernya. Logam mengalami ionisasi dan ion-ion tersebut bereaksi dengan bagian sulfihidril pada protein sel sehingga menyebabkan denaturasi. Cu.

. Sensitivitas suatu bakteri terhadap antibiotik ditentukan oleh diameter zona hambat yang terbentuk.Konsentrasi mikroba uji . Prosedur difusi-kertas cakram-agar yang distandardisasikan (metode KirbyBauer) merupakan cara untuk menentukan sensitivitas antibiotik untuk bakteri. Faktor yang mempengaruhi metode Kirby-Bauer : .Jenis antibiotik. sehingga diperlukan standar acuan untuk menentukan apakah bakteri itu resisten atau peka terhadap suatu antibiotik.Mekanisme kerja antibiotik antara lain :  Menghambat dsintesis dinding sel  Merusak permeabilitas membran sel. Cara kerja pengujian antibiotik dengan metode Kirby-Bauer :  Celupkan cotton bud (cotton swab) dalam biakan bakteri kemudian tekan kapas ke sisi tabung agar air tiris  Ulaskan pada seluruh permukaan cawan Mueller-Hinton Agar secara merata  Biarkan cawan selama 5 menit  Kertas cakram dicelupkan dalam larutan antibiotik dengan konsentrasi tertentu. .  Menghambat sintesis RNA (proses transkripsi)  Menghambat sintesis protein (proses translasi).  Menghambat replikasi DNA.Konsentrasi antibiotik yang terdapat dalam cakram .pH medium. Semakin besar diameternya maka semakin terhambat pertumbuhannya.

 Angkat. Resistent : tahan Intermediate : medium Susceptible : peka . Maka interpretasinya adalah bakteri tersebut peka terhadap antibiotik Eryhtromycin. biarkan sejenak agar tiris. selanjutnya letakkan kertas cakram pada permukaan agar. sensitivitas antibiotik.  Kertas cakram ditekan menggunakan pinset supaya menempel sempurna di permukaan agar. Tabel Penentuan Sensitivitas Antibiotik (diameter zona hambat dalam mm) Cara menginterpretasikan : Ukur diameter zona hambat (zona jernih) Misal didapatkan zona hambat suatu bakteri berdiameter 26 mm untuk Eryhtromycin.  Inkubasi pada suhu 37 0C selama 24-48 jam.  Ukur diameter zona hambat (mm) kemudian bandingkan dengan tabel.

Uji aktivitas endoenzim :  Uji oksidase  Uji katalase  Uji Triple Sugar Iron Agar Uji Amilolitik Amilum adalah senyawa yang memiliki berat molekul tinggi. Amilum akan bereaksi dengan iodine membentuk warna biru hitam yang terlihat pada media. Warna biru hitam terjadi jika iodine masuk ke dalam bagian kosong pada amilum yang berbentuk spiral. Hidrolisis akhir maltosa menghasilkan glukosa terlarut yang dapat ditransport masuk ke dalam sel. Aktivitas enzimatis mikroorganisme : a. Indikator yang dipakai adalah iodine. terdiri atas polimer glukosa yang bercabang-cabang yang diikat dengan ikatan glikosidik. NA yang tersuspensi pati digunakan sebagai media. Amilum akan bereaksi dengan iodine membentuk komplex warna biru hitam yang terlihat pada media.  Inkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC  Setelah selesai inkubasi. dan selanjutnya menjadi maltosa. Cara Kerja :  Inokulasi Nutrient Agar yang mengandung pati (2 g/l) dengan E. Uji aktivitas eksoenzim :  Uji amilolitik  Uji lipolitik  Uji proteolitik b. secara streak.AKTIVITAS ENZIMATIS MIKROORGANISME Kompetensi : mahasiswa mengetahui beberapa teknik uji aktivitas enzimatik. Indikator yang dipakai pada uji amilolitik adalah iodine.  Hidrolisis zat pati terlihat sebagai zona jernih di sekeliling koloni. Prosedur di bawah ini menunjukkan aktivitas amilase.coli dan Bacillus sp. sedangkan hasil negatif ditunjukkan warna sekitar koloni tetap biru hitam. Degradasi amilum membutuhkan enzim amilase yang akan memecah/menghidrolisis menjadi polisakarida yang lebih pendek (dextrin). . tetesi cawan dengan lugol’s iodine secukupnya sehingga seluruh permukaan media terkena.

Uji proteolitik Uji proteolitik ditujukan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme menghasilkan enzim protease. sedangkan reaksi negatif ditandai oleh bercak-bercak yang tetap berwarna merah.Uji Lipolitik Lipid misalnya trigliserida merupakan sumber energi bagi sejumlah mikroorganisma. coli pada media Tributyrin Agar dengan indikator neutral red  Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Untuk mendapatkan energi dari lipid. Pada prinsipnya metode-metode di atas menggunakan indikator yang mampu mendeteksi keberadaan asam lemak yang terbentuk akibat hidrolisis lemak. Terdapat berbagai macam prosedur untuk mengetahui aktivitas lipase diantaranya adalah dengan menggunakan media Trybutirin Agar.  Reaksi positif ditandai oleh bercak-bercak kuning disekeliling koloni. Rodhamine Agar dan Spirit Blue Agar. mikroba menghasilkan enzim lipase dan esterase yang memecah ikatan ester menghasilkan gliserol dan asam lemak. dan E. Pada praktikum ini protein yang digunakan dalam . Cara Kerja :  Inokulasikan Bacillus sp.

Reagen akan mendonorkan elektron terhadap enzim ini sehingga akan teroksidasi membentuk senyawa yang berwarna biru kehitaman.  Aktivitas proteolitik ditunjukkan oleh terbentuknya zone jernih di sekeliling koloni. Enzim ini merupakan bagian dari kompleks enzim yang berperan dalam proses fosforilasi oksidatif. Mikroorganisme ini menggunakan oksigen. Tidak adanya perubahan warna mengindikasikan bahwa uji yang dilakukan negatif. Kemampuan bakteri memproduksi sitokrom oksidase dapat diketahui dari reaksi yang ditimbulkan setelah pemberian reagen oksidase pada koloni bakteri. Enzim oksidase dihasilkan oleh bakteri aerob. coli pada Skim Milk Agar (SMA)  Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Proses ini dinamakan peptonisasi atau proteolisis Cara Kerja :  Inokulasikan Bacillus sp. Uji Oksidase Enzim oksidase memegang peranan penting dalam transport elektron selama respirasi aerobik. Reagen yang digunakan adalah tetramethyl-D-phenylenediamine dihydrocloride. Hidrolisis kasein secara bertahap akan menghasilkan monomernya berupa asam amino. sebagai akseptor elektron terakhir selama penguraian karbohidrat untuk menghsilkan energi.bentuk kasein susu. . Dan E. dan mikroaerofilik. fakultatif anaerob. Positif tertunda (warna biru muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi) menandakan bahwa bakteri uji memiliki sedikit enzim. Sitokrom oksidase mengkatalisis oksidasi dan reduksi sitokrom oleh molekul oksigen.

    Cara Kerja : Koloni bakteri diambil satu tetes (sebaiknya dari biakan cair) secara aseptis dan diinokulasikan pada Object glass. 3% H2O2 diteteskan pada Object glass secukupnya. mikroorganisme menghasilkan hidrogen peroksida. Jika tidak dihasilkan gelembung gas berarti uji katalase dinyatakan negatif. Senyawa ini dalam jumlah besar akan menyebabkan kematian pada mikroorganisme. Produksi katalase bisa diidentifikasi dengan menanmbahkan reagen H2O2 pada suspensi bakteri. Dengan menggunakan pipet tetes. fakultatif aerob maupun mikroaerofilik yang menggunakan jalur respirasi aerobik. sedangkan bila tidak terjadi perubahan maka hasil uji negatif. lalu lihat perubahan yang terjadi Jika warna berubah menjadi biru marun maka hasil uji positif.    Superoksida dismutase adalah enzim yang bertanggung jawab untuk penguraian khususnya superoksida pada organisme aerob yang bersifat katalase negatif. bahkan ada yang menghasilkan superoksida yang sangat beracun. Tetesi dengan reagen. berarti bakteri tersebut mampu memproduksi enzim katalase. Uji Katalase Selama respirasi aerobik (proses fosforilasi oksidatif). Amati adanya gelembung untuk hasil positif dan tidak ada gelembung untuk hasil negatif (hati-hati membedakan . Diatas object glass diberi kertas merang yang sehingga tetesan tersebar pada kertas. Cara Kerja : Koloni bakteri diambil satu ose secara aseptis dan diinokulasikan pada Object glass. Jika dihasilkan gelembung gas. Hasil uji positif tertunda jika warna biru muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi. Senyawa ini dihasilkan oleh mikroorganisme aerobik.

1%. Perbedaan ini didasarkan pada pola fermentasi karbohidrat dan produksi H2S pada tabung reaksi. sedangkan warna merah pekat tampak di semua media maka interpretasinya adalah degradasi peptone secara aerob maupun anaerob. Inkubasi pada 37oC selama 24-48 jam. Untuk mengamati fermentasi karbohidrat.antara gelembung yang muncul dari sel dengan kumpulan sel yang mengambang akibat ditambahi reagen). sedangkan warna menjadi lebih merah menendakan media menjadi basa. = slant merah (alkali) sedangkan butt kuning (asam) dengan atau tanpa produksi gas  hanya terjadi fermentasi glukosa. Selain itu ditambahkan FeSO4 untuk mendeteksi adanya gas H2S. yang bersifat gram negatif dan memfermentasikan glukosa membentuk asam sehingga dapat dibedakan dengan bakteri gram negatif intestinal lain. Cara kerja : Inokulasikan biakan pada media TSIA dengan cara inokulasi tusuk kemudian dilanjutkan dengan diulaskan lurus tegak pada agar miring (lihat gambar). dan mengandung glukosa dengan konsentrasi yang lebih rendah yaitu 0. Sel lebih memilih untuk mendegradasi glukosa terlebih dahulu karena glukosa adalah monosakarida yang dapat langsung massuk ke dalam jalur metabolisme (glikolisis). Konsentrasi ini akan berpengaruh terhadap penggunaan karbohidrat dan keadaan asam yang terbentuk. sedangkan pepton yang ada digunakan untuk sumber energi dalam keadaan aerob atau anaerob sehingga meningkatkan pH karena produksi amonia meningkat sebagai hasil samping metabolisme protein. sedangkan fermentasi laktosa dan sukrosa tidak terjadi. Jika kemerahan lebih pekat pada slant maka terjadi degradasi aerobik peptone. Interpretasikan hasil dengan melihat keterangan dibawah ini. media TSIA mengandung laktosa dan sukrosa dengan konsentrasi 1%.    = slant dan butt merah (alkali) atau tidak terjadi perubahan warna  tidak terjadi fermentasi karbohidrat. Indikator pH (Phenol Red) ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan pH akibat fermentasi karbohidrat. Perubahan warna menjadi kuning menandakan asam. Media mengandung glukosa yang sangat sedikit (lebih sedikit dibanding laktosa dan sukrosa) sehingga jumlah asam pada permukaan (slant) hilang secara . Uji Triple Sugar Iron Agar TSIA adalah uji yang dirancang untuk membedakan beberapa jenis bakteri yang termasuk kelompok Enterobacteriaceae. Warna media mula-mula adalah merah-orange.

= slant dan butt kuning (asam) dengan atau tidak adanya gas  telah terjadi fermentasi glukosa.cepat menjadi basa. H2S ini merupakan hasil dari metabolisme protein media pecah atau terangkat  timbul gas sebagai hasil samping fermentasi . laktosa dan atau sukrosa karena laktosa dan sukrosa memiliki konsentrasi yang lebih tinggi sehingga dapat dimanfaatkan untuk substrat fermentasi lanjutan (jika glukosa habis) menghasilkan asam yang ditandai warna kuning setelah 24 jam. = butt berwarna kehitaman  adanya H2S yang bereaksi dengan senyawa besi FeSO4 pada media menghasilkan FeS yang berwarna kehitam-hitaman. karena pada mulanya bagian slant telah menjadi kuning tapi dalam waktu lebih dari 24 jam sel akan kehabisan glukosa dan memilih untuk memanfaatkan protein sehingga media menjadi merah.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful