PETUNJUK PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI DASAR

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PURWOKERTO 2008

KATA PENGANTAR
Buku/Diktat petunjuk praktikum Mikrobiologi ini disusun dengan maksud dan tujuan membantu mahasiswa dalam melaksanakan praktikum Mikrobiologi Dasar. Keahlian dan keterampilan kerja di laboratorium sangat membantu dalam memahami teori yang telah diperoleh di kuliah sehingga dapat tercipta korelasi yang saling membangun antara teori dengan kenyataan. Diktat praktikum ini disusun rinci dan sistematis, dilengkapi dengan gambar sehingga memudahkan praktikan memahami dan mempersiapkan diri sebelum melakukan kegiatan praktikum. Materi yang disajikan dalam diktat ini mencakup teknik dasar yang lazim dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi pada umumnya. Harapan kami, buku ini dapat bermanfaat bagi praktikan mikrobiologi dasar serta bagi mahasiswa yang memerlukannya. Segala kritik dan saran yang bersifat membangun tentang isi buku ini sangat dihargai demi perbaikan kualitas lebih lanjut.

Purwokerto, Februari 2008

Tim Penyusun

TATA TERTIB PRAKTIKUM
Untuk menjaga keamanan 1. Praktikan harus telah mengenakan jas lab saat memasuki laboratorium dan bekerja dengan peralatan di laboratorium untuk menghindari kontaminasi dan terkena khemikalia 2. Dilarang keras makan, merokok dan minum di laboratorium 3. Sebelum dan sesudah bekerja, meja praktikum dibersihkan dengan desinfektan 4. Praktikan berambut panjang harus mengikat rambutnya sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu kerja dan menghindari dari hal-hal yang tidak diinginkan 5. Pengambilan kultur cair atau suspensi dan khemikal harus menggunakan pipet dengan bantuan filler atau menggunakan mikropipet. 6. Dilarang membuang biakan sisa atau habis pakai dan pewarna sisa disembarang tempat. Bahan tersebut harus dibuang di tempat yang telah disediakan oleh asisten. 7. Laporkan segera jika terjadi kecelakaan seperti kebakaran, biakan tumpah ada yang menelan bahan kimia, atau biakan kepada asisten 8. Jika menggunakan jarum inokulum, ujung jarum dibakar sampai memijar sesudah dan sebelum bekerja menggunakan alat ini 9. Sebelum meninggalkan laboratorium disarankan untuk mencuci tangan dengan seksama. Untuk kelancaran praktikum 1. Praktikan diwajibkan memakai jas laboratorium sebelum memasuki laboratorium dan dilepas di luar laboratorium. 2. Praktikan wajib memakai sepatu pada saat praktikum. 3. Praktikan dilarang berbicara yang tidak perlu dan membuat gaduh 4. Memakai pakaian yang sopan pada saat praktikum (baju berkrah untuk laki-laki) 5. Praktikan yang datang terlambat lebih dari 10 menit mengganti di akhir acara. 6. Praktikan yang datang terlambat lebih dari 20 menit maka wajib inhal. 7. Kuis akan dilaksanakan pada awal acara sebelum memulai praktikum untuk mengetahui sejauh mana kompetensi yang dicapai. 8. Inhal kuis akan diadakan satu kali dan nilai yang diambil adalah nilai terbaik. 9. Bagi praktikan yang akan berpindah jadwal praktikum harus seizin koordinator praktikum mikrodas dengan menyerahkan surat pengantar paling lambat dua hari berikutnya. 10. Praktikan yang tidak hadir praktikum (absen), maka disarankan ikut inhal praktikum, di mana harus membayar untuk mengganti biaya praktikum dan tenaga asisten 11. Praktikan akan dinilai keterampilannya selama praktikum oleh asisten 12. Praktikan yang tidak mengikuti asistensi tanpa keterangan tidak mendapatkan nilai pretest, tapi jika ada izin tertulis maka dapat mengikuti pretest susulan. 13. Praktikan yang tidak mengikuti pengamatan harus mengikuti pengamatan susulan. 14. Laporan harus dibawa saat masuk pada praktikum sebagai syarat masuk. 15. Praktikan yang tidak membawa laporan karena tertinggal, tetap diizinkan mengikuti praktikum tetapi harus mengambil laporan yang tertinggal pada hari itu juga dan menyerahkkannya ke asisten. 16. Aturan-aturan / tata tertib yang belum tercantum akan diputuskan kemudian.

................................................................................. 8............ Pembuatan Media ......................... Daya Oligodinamik dan Antimikroba ... Isolasi Mikroorganisme ... TATA TERTIB PRAKTIKUM ....................... 1........................................................................................................................................ .................................. Aktivitas Enzimatik Mikroorganisme ..............................DAFTAR ISI Halaman KATA PENGANTAR . 4.............................. 5.......................................... 7.................. 3..................... 2... Sterilisasi ............................................................. Menentukan Jumlah dan Ukuran Mikroorganisme .......................................................... 9.............................. 6...................................................... Pengaruh Faktor Lingkungan Terhadap Pertumbuhan Mikroorganisme ...................... DAFTAR ISI ......................................................... Pengenalan Alat ..................................................... Morfologi Mikroorganisme .............................................................

PENGENALAN ALAT Kompetensi : mahasiswa mengenal dan mengetahui fungsi dari tiap-tiap alat Berikut daftar alat-alat mikrobiologi yang perlu dikenal: Alat-alat elektrik  Mikroskop cahaya  Mikroskop stereo  Autoklaf elektrik  Incubator  Hot plate & stirrer  Colony counter  Biological Safety Cabinet (BSC)  Mikropipet Alat-alat gelas dan keramik  Cawan Petri  Pipet ukur  Pipet tetes  Tabung reaksi  Labu Erlenmeyer  Glass beads  Mortar & pestle  Beaker glass  Buncen burner  Gelas ukur  Batang L / Drugalsky  Tabung durham Alat-alat non gelas  Jarum inokulum / ose  Pinset  Rubber bulb  pH meter universal .

Coarse focus knob (sekrup fokus kasar) Menaik turunkan meja benda (untuk mencari fokus) secara kasar dan cepat 16. Stage (meja benda) Spesimen diletakkan di sini 5. Illuminator (sumber cahaya) 13. Eyepiece / oculars (lensa okuler) Untuk memperbesar bayangan yang dibentuk lensa objektif 2. Interpupillar distance adjustment knob (pengatur jarak interpupillar) 11. Condenser (condenser) Untuk mengumpulkan cahaya supaya tertuju ke lensa objektif 6. Fine focus knob (sekrup fokus halus) Menaik turunkan meja benda secara halus dan lambat 17. Diopter adjustmet ring (cincin pengatur diopter) Untuk menyamakan focus antara mata kanan dan kiri 10. Specimen holder (penjepit spesimen) 12. Pada umumnya mata tidak mampu membedakan benda dengan diameter lebih kecil dari 0. Observation tube securing knob (sekrup pengencang tabung okuler) 18. Main switch (tombol on-off) 9. Condenser adjustment knob (sekrup pengatur kondenser) Untuk menaik-turunkan kondenser .1 mm. Observation tube (tabung pengamatan / tabung okuler) 4. berikut merupakan uraian tentang cara penggunaan bagian-bagiandan spesifikasi mikroskop cahaya merk Olympus CH20 yang dimiliki Laboratorium Mikrobiologi. Vertical feed knob (sekrup pengatur vertikal) Untuk menaikkan atau menurunkan object glass 14. Dengan mikroskop kita dapat mengamati sel bakteri yang tidak dapat dilihat dengan mata telanjang. Revolving nosepiece (pemutar lensa objektif) Untuk memutar objektif sehingga mengubah perbesaran 3. Mikroskop Cahaya (Brightfield Microscope) Salah satu alat untuk melihat sel mikroorganisme adalah mikroskop cahaya. Brightness adjustment knob (pengatur kekuatan lampu) Untuk memperbesar dan memperkecil cahaya lampu 8. Objective lense (lensa objektif) Memperbesar spesimen 7. Bagian-bagian Mikroskop: 1. Horizontal feed knob (sekrup pengatur horizontal) Untuk menggeser ke kanan / kiri objek glas 15.

53 60x 0.Prosedur Operasi 1. Biasanya dapat digunakan minyak imersi untuk meningkatkan indeks bias pada perbesaran 10 x 100 . Jika perlu interpupillar distance adjustment knob (10) dapat digeser. misal 40x. Lakukan hal yang sama jika menggunakan perbesaran yang lebih tinggi Berikut adalah tabel yang menunjukan jarak antara spesimen dengan lensa objektif jika okus telah didapatkan Perbesaran objektif Jarak A (mm) 4x 29 10x 6. atur kekuatan lampu dengan memutar bagian (7) 2. Tambahan a.29 Catatan: Setelah mendapatkkan fokus pada perbesaran tetentu. Misal = Okuler (10x) x Objektif (40x) = 400x Penggunaan minyak imersi Semakin kecil nilai daya pisah. Jika perlu diopter adjustment knob (9) dapat diatur untuk memperoleh bayangan focus yang seimbang antara mata kanan dan kiri c. Jika meja benda belum turun. dan ingin memutar objektif ke perbesaran 100x.Setelah fokus perbesaran 4 x 10 didapatkan. diturunkan dengan sekrup kasar (15) b. maka putar (2) pada perbesaran selanjutnya yaitu perbesaran objektif 10x. Memfokuskan a.Cari bagian dari objek glas yang terdapat preparat ulas (dicari dan diperkirakan memiliki gambar yang jelas) dengan memutar sekrup vertikal dan horizontal (13) dan (14) 3. hal ini akan mengubah dua bayangan yang akan diterima oleh 2 mata menjadi gambar yang tunggal sehingga sangat membantu dalam mengatasi kelelahan mata b. Pengaturan condenser (5) akan memperjelas bayangan yang tampak dengan mensetting pada posisi tertinggi (cahaya penuh) Perbesaran total Ukuran specimen yang diamati dapat diperoleh dengan mengalikan perbesaran lensa okuler dengan lensa objektif. kemudian putar sekrup halus (16) untuk mendapatkan fokusnya c. Daya pisah dapat diperkuat dengan memperbesarkan indeks bias atau menggunakan cahaya yang memiliki panjang gelombang (λ) pendek. tekan tombol on (8) b. Menyalakan lampu a. 4. Putar Revolving nosepiece (2) pada perbesaran objektif 4x lalu putar sekrup kasar (15) sehingga meja benda bergerak ke atas untuk mencari fokus b.3 40x 0. maka meja benda tidak perlu diturunkan dan tidak perlu khawatir bahwa lensa objektif akan menggesek cover glass karena terdapat sisa jarak A yang lebih kecil antara cover glass dengan lensa objektif (lihat tabel diatas). Menempatkan spesimen pada meja benda a. akan semakin kuat kemampuan lensa untuk memisahkan dua titikyang berdekatan pada preparat sehingga struktur benda terlihat lebih jelas. Letakan objek glas diatas meja benda (4) kemudian jepit dengan (11).

9 x 10 x 1x 2x 4x total 6. Letakkan spesimen / preparat di stage plate (5). Jika fokus pada perbesaran 10 x 40 telah didapatkan maka putar ke perbesaran objektif 100x b. Jika ingin mendapatkan bayangan yang lebih besar. 1. Stage clip (penjepit spesimen / preparat) Prosedur operasi 1. Jika telah selesai menggunakan mikroskop. tetesi minyak imersi 1 – 2 tetes dari sisi lensa c. Focusing knob (sekrup pengatur fokus) 5. Oculars eyepiece (lensa okuler) 2. Olimpus SZ3060. Atur perbesaran pada perbesaran terkecil dengan memutar Zoom Control Knob (3) kemudian dicari fokusnya dengan memutar Focusing Knob (4) 3. putar Zoom Control Knob (3) ke perbesaran yang lebih tinggi kemudian dicari fokusnya Mikroskop ini memiliki pilihan perbesaran: Okuler Objektif 0.a. mikroskop stereo biasanya digunakan untuk mengamati secara detail bentuk koloni dan jamur. Berikut merupakan uraian tentang mikroskop stereo yang dimiliki Laboratorium Mikrobiologi yaitu Zoom Stereo Microscope.67 x 0. bersihkan lensa objektif 100x dengan kertas lensa yang dibasahi xylol 1  2 1 2 Mikroskop stereo (Zoom Stereo Microscope) Mikroskop ini berfungsi untuk melihat objek yang membutuhkan perbesaran tidak terlalu besar. Stage plate (pelat tempat specimen diletakkan) 6. jepit jika perlu 2. Diopter adjustment ring (cincin pengatur diopter) 3. Di Laboratorium Mikrobiologi. Zoom control knob (sekrup pengatur pembesaran) 4.7 x 9x 10 x 20 x 40 x .

Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang keluar dari bibir autoklaf. 3. Alat ini dilengkapi dengan pengatur suhu dan pengatur waktu. . Termometer 7. Katup pengeluaran uap 3. Aquades (dH2O) 9. Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan keluarkan isi autoklaf dengan hati-hati. Klep pengaman jangan dikencangkan terlebih dahulu. 4. 5. maka dapat ditambah air sampai batas tersebut. maka tutup harus dikendorkan. 2. batas penambahan air Autoclave adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan. Penghitungan waktu 15’ dimulai sejak tekanan mencapai 2 atm. Nyalakan autoklaf. Autoklaf (Autoclave) Diagram autoklaf vertical 1. Gunakan air hasil destilasi. Lama sterilisasi yang dilakukan biasanya 15 menit untuk 121oC. Lempeng sumber panas 8. kelep pengaman 5. Jika mensterilisasi botol beretutup ulir. Tunggu samapai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf dan terdesak keluar dari klep pengaman. Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi2 (15 Psi = 15 pounds per square inch).  Inkubator (Incubator) Inkubator adalah alat untuk menginkubasi atau memeram mikroba pada suhu yang terkontrol. pengukur tekanan 4. Sekrup pengaman 10. 6. Jika air kurang dari batas yang ditentukan. diatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu 121oC. Kemudian klep pengaman ditutup (dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. Jika alarm tanda selesai berbunyi.. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu 121oC (250oF). Cara Penggunaan : 1. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Masukkan peralatan dan bahan. Tombol pengatur waktu mundur (timer) 2. maka tunggu tekanan dalam kompartemen turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure gauge menunjuk ke angka nol). Tombol on-off 6. Kisaran suhu untuk inkubator produksi Heraeus B5042 misalnya adalah 10-70oC. untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat.

 Hot plate stirrer dan Stirre bar Hot plate stirrer dan Stirrer bar (magnetic stirrer) berfungsi untuk menghomogenkan suatu larutan dengan pengadukan. Usap permukaan interior BSC dengan alkohol 70 % atau desinfektan yang cocok dan biarkan menguap 7. Hidupkan lampu UV selama 2 jam.  Colony counter Alat ini berguna untuk mempermudah perhitungan koloni yang tumbuh setelah diinkubasi di dalam cawankarena adanya kaca pembesar. Prosedur penggunaan BSC seri 36212. Atur alat dan bahan yang telah dimasukan ke BSC sedemikian rupa sehingga efektif dalam bekerja dan tercipta areal yang benar-benar steril 9. setelah selesai bekerja. Jumlah koloni pada cawan Petri dapat ditandai dan dihitung otomatis yang dapat di-reset. masukkan alat dan bahan yang akan dikerjakan. Biarkan selama 5 menit 5. 10. Pastikan kaca penutup terkunci dan pada posisi terendah 3. Cuci tangan dan lengan dengan sabun gemisidal / alkohol 70 % 6. Pengadukan dengan bantuan batang magnet Hot plate dan magnetic stirrer seri SBS-100 dari SBS® misalnya mampu menghomogenkan sampai 10 L. Jangan menggunakan pembakar Bunsen dengan bahan bakar alkohol tapi gunakan yang berbahan bakar gas. Selain itu alat tersebut dilengkapi dengan skala/ kuadran yang sangat berguna untuk pengamatan pertumbuhan koloni sangat banyak. selanjutnya matikan segera sebelum mulai bekerja 2. dengan kecepatan sangat lambat sampai 1600 rpm dan dapat dipanaskan sampai 425oC. Kerja secara aseptis dan jangan sampai pola aliran udara terganggu oleh aktivitas kerja 11. biarkan 2-3 menit supaya kontaminan tidak keluar dari BSC . Purifier™ Biological Safety Cabinet dari LABCONCO yang dimiliki laboratorium mikrobiologi adalah sebagai berikut: 1. jangan terlalu penuh (overload) karena memperbesar resiko kontaminan 8. Pelat (plate) yang terdapat dalam alat ini dapat dipanaskan sehingga mampu mempercepat proses homogenisasi. Nyalakan lampu neon dan blower 4.  Biological Safety Cabinet Biological Safety Cabinet (BSC) atau dapat juga disebut Laminar Air Flow (LAF) adalah alat yang berguna untuk bekerja secara aseptis karena BSC mempunyai pola pengaturan dan penyaring aliran udara sehingga menjadi steril dan aplikasisinar UV beberapa jam sebelum digunakan.

mukropipet memerlukan tip. Mikropipet tip Cara Penggunaan : 1. Cawan petri tersedia dalam berbagai macam ukuran. Masukkan Tip bersih ke dalam Nozzle / ujung mikropipet. 8. atau menggunakan alat tambahan yang berfungsi mendorong tip keluar. dalam penggunaannya. Tekan Thumb Knob sampai hambatan kedua / second stop atau tekan semaksimal mungkin maka semua cairan akan keluar dari ujung tip. Medium dapat dituang ke cawan bagian bawah dan cawan bagian atas sebagai penutup. Matikan lampu neon dan blower  Mikropipet (Micropippete) dan Tip Mikropipet adalah alat untuk memindahkan cairan yang bervolume cukup kecil. atau mikropipet yang tidak bisa diatur volumenya. Tahan pipet dalam posisi vertikal kemudian lepaskan tekanan dari Thumb Knob maka cairan akan masuk ke tip. hanya tersedia satu pilihan volume (fixed volume pipette) misalnya mikropipet 5 µl. biasanya kurang dari 1000 µl. sedangkan cawan berdiameter 9 cm kira-kira cukup diisi media sebanyak 10 ml. 4. Pindahkan ujung tip ke tempat penampung yang diinginkan. misalnya mikropipet yang dapat diatur volume pengambilannya (adjustable volume pipette) antara 1µl sampai 20 µl. Banyak pilihan kapasitas dalam mikropipet.12. 5. Usap permukaan interior BSC dengan alkohol 70 % dan biarkan menguap lalu tangan dibasuh dengan desinfektan 13. Sebelum digunakan Thumb Knob sebaiknya ditekan berkali-kali untuk memastikan lancarnya mikropipet. 2. . 6. diameter cawan yang biasa berdiameter 15 cm dapat menampung media sebanyak 15-20 ml. 7. 3.  Cawan Petri (Petri Dish) Cawan petri berfungsi untuk membiakkan (kultivasi) mikroorganisme. Masukkan tip ke dalam cairan sedalam 3-4 mm. Tekan Thumb Knob sampai hambatan pertama / first stop. Jika ingin melepas tip putar Thumb Knob searah jarum jam dan ditekan maka tip akan terdorong keluar dengan sendirinya. jangan ditekan lebih ke dalam lagi.

penambahan reagen ada uji biokimia. dll. Terdapat beberapa pilihan berdasarkan volume cairan yang dapat ditampungnya yaitu 25 ml. Pipet Ukur (Measuring Pippete) Pipet ukur merupakan alat untuk memindahkan larutan dengan volume yang diketahui. dll. 250 ml. Tersedia berbagai macam ukuran kapasitas pipet ukur. 500 ml. Untuk alas an efisiensi.  Labu Erlenmeyer (Erlenmeyer Flask) Berfungsi untuk menampung larutan. 1000 ml. 300 ml. Untuk membuat agar miring. . bahan atau cairan yang. tutup metal. media yang ditambahkan berkisar 10-12 ml tiap tabung. Media padat yang dimasukkan ke tabung reaksi dapat diatur menjadi 2 bentuk menurut fungsinya. 5 ml dan 10 ml. tutup plastik atau aluminium foil. Tutup tabung reaksi dapat berupa kapas. yaitu media agar tegak (deep tube agar) dan agar miring (slants agar). menampung akuades.  Tabung reaksi (Reaction Tube / Test Tube) Di dalam mikrobiologi. Cara penggunaanya adalah cairan disedot dengan pipet ukur dengan bantuan filler sampai dengan volume yang diingini. Salah satu penerapannya adalah dalam menambahkan HCl / NaOH saat mengatur pH media. Volume yang dipindahkan dikeluarkan menikuti skala yang tersedia (dilihat bahwa skala harus tepat sejajar dengan mensikus cekung cairan) dengan cara menyamakan tekanan filler dengan udara sekitar. dsb. diantaranya pipet berukuran 1 ml. Labu Erlenmeyer dapat digunakan untuk meracik dan menghomogenkan bahan-bahan komposisi media. namun volume yang dipindahkan tidak diketahui.  Pipet tetes (Pasteur Pippete) Fungsinya sama dengan pipet ukur. 100 ml. tabung reaksi digunakan untuk uji-uji biokimiawi dan menumbuhkan mikroba.Tabung reaksi dapat diisi media padat maupun cair. kultivasi mikroba dalam kultur cair. 50 ml. perlu diperhatikan tentang kemiringan media yaitu luas permukaan yang kontak dengan udara tidak terlalu sempit atau tidak terlalu lebar dan hindari jarak media yang terlalu dekat dengan mulut tabung karena memperbesar resiko kontaminasi.

 Batang L (L Rod) Batang L bermanfaat untuk menyebarkan cairan di permukaan agar supaya bakteri yang tersuspensi dalam cairan tersebut tersebar merata. Untuk sterilisasi jarum ose atau yang lain. Glass beads digunakan pada teknik spread plate yang fungsinya sama dengan batang L atau Spreader. gelas ukur memiliki beberapa pilihan berdasarkan skala volumenya. Pada saat mengukur volume larutan. Alat ini juga disebut spreader. Gelas ukur (Graduated Cylinder) Berguna untuk mengukur volume suatu cairan.  Mortar dan Pestle Mortar dan penumbuk (pastle) digunakan untuk menumbuk atau menghancurkan materi cuplikan. roti atau tanah sebelum diproses lebih lanjut. . bagian api yang paling cocok untuk memijarkannya adalah bagian api yang berwarna biru (paling panas). Api yang menyala dapat membuat aliran udara karena oksigen dikonsumsi dari bawah dan diharapkan kontaminan ikut terbakar dalam pola aliran udara tersebut. sebaiknya volume tersebut ditentukan berdasarkan meniskus cekung larutan. misal daging. menampung akuades dll. Perubahan bunsen dapat menggunakan bahan bakar gas atau metanol. dapat digunakan untuk preparasi media media.  Pembakar Bunsen (Bunsen Burner) Salah satu alat yang berfungsi untuk menciptakan kondisi yang steril adalah pembakar bunsen.  Glass Beads Glass Beads adalah manik-manik gelas kecil yang digunakan untuk meratakan suspensi biakan dengan menyebarkan beberapa butir di atas permukaan agar dan digoyang merata. Di dalam mikrobiologi.  Beaker Glass Beaker glass merupakan alat yang memiliki banyak fungsi. seperti labu erlenmeyer..

Kemudian katup E (exhaust) berfungsi untuk mengeluarkan cairan dari pipet ukur. dan yang berbentuk lurus disebut inoculating needle/Transfer needle. Katup yang bersimbol A (aspirate) berguna untuk mengeluarkan udara dari gelembung. . Filler memiliki 3 saluran yang masing-masing saluran memiliki katup. Karet sebagai bahan filler merupakan karet yang resisten bahan kimia.  Pipet Filler / Rubber Bulb Filler adalah alat untuk menyedot larutan yang dapat dipasang pada pangkal pipet ukur. Jarum inokulum ini akan sangat bermanfaat saat membelah agar untuk preprasi Heinrich’s Slide Culture. S (suction) merupakan katup yang jika ditekan maka cairan dari ujung pipet akan tersedot ke atas. Tabung Durham Tabung durham berbentuk mirip dengan tabung reaksi namun ukurannya lebih kecil dan berfungsi untuk menampung/menjebak gas yang terbentuk akibat metabolisme pada bakteri yang diujikan. Kertas pH indikator dicelupkan sampai tidak ada perubahan warna kemudian strip warna dicocokkan dengan skala warna acuan. Bentuk ujung jarum dapat berbentuk lingkaran (loop) dan disebut ose atau inoculating loop/transfer loop. Inoculating loop cocok untuk melakukan streak di permukaan agar.  pH Indikator Universal berguna untuk mengukur/mengetahui pH suatu larutan.  Pinset Pinset memiliki banyak fungsi diantaranya adalah untuk mengambil benda dengan menjepit misalnya saat memindahkan cakram antibiotik. Jarum inokulum biasanya terbuat dari kawat nichrome atau platinum sehingga dapat berpijar jika terkena panas.  Jarum Inokulum Jarum inokulum berfungsi untuk memindahkan biakan untuk ditanam/ditumbuhkan ke media baru. sedangkan inoculating needle cocok digunakan untuk inokulasi secara tusukan pada agar tegak (stab inoculating). Penempatannya terbalik dalam tabung reaksi dan harus terendam sempurna dalam media (jangan sampai ada sisa udara). Hal ini sangat penting dalam pembuatan media karena pH pada media berpengaruh terhadap petumbuhan mikroba.

H. yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekulmolekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Bahan dasar  air (H2O) sebagai pelarut  agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. N. Gelatin adalah polimer asam amino yang diproduksi dari kolagen. Pembuatan Nutrient Agar dan Nutrient Broth e. Fungsinya juga sebagai pemadat media. protein dan asam organik. P. .  gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar. O. lemak. Agar sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45 o C. Bahan-bahan media pertumbuhan b.2 Berdasarkan komposisi c.1 Bahan dasar b. Nutrisi atau zat makanan Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan media bagi mikroorganisme autotrof obligat. Macam-macam media pertumbuhan c. Kekurangannnya adalah lebih banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar. unsur mikro seperti Fe.4 Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media c.3 Berdasarkan tujuan d.  Silica gel.3 Bahan tambahan b. Mg dan unsur pelikan/trace element. Pengertian dan fungsi b.MEDIA PERTUMBUHAN Kompetensi : Mahasiswa dapat membuat media pertumbuhan Nutrient Agar dan Potato Dextrose Agar Media pertumbuhan : a. 2. Bahan-bahan media pertumbuhan 1. Jasad heterotrof memerlukan sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat.  Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik atau anorganik esuai dengan sifat mikrobanya.1 Berdasarkan sifat fisik c. Pembuatan Potato Dextrose Agar Pengertian dan Fungsi Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya.2 Nutrisi atau zat makanan b.

granula atau bubuk dan terbuat dari beberapa jenis rumput laut.  Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0. Jenis karbohidrat yang umumnya digunkan dalam amilum. plasenta dan daging sapi.  Meat extract. Sumber nitrogen mencakup asam amino. 2. galaktosa. Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media  Agar. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (B complex). Bahan tambahan Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan tujuan tertentu. LB (Lactose Broth). lactalbumin. Antibiotik ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba nontarget/kontaminan. susu. misalnya phenol red (indikator asam basa) ditambahkan untuk indikator perubahan pH akibat produksi asam organik hasil metabolisme. manitol. pencairan dan pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan kekuatan agar. Untuk melarutkannya harus diasuk dan dipanasi. fruktosa. peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot.  Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar. Medium berdasarkan sifat fisik  Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media menjadi padat.  Yeast extract. gelatin dan kedelai. Kegunaannya adalah sebagai pemadat (gelling) yang pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther Hesse untuk membuat media. tidak begitu cair.3-0. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen. limpa. 4. Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya. jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur.  Vitamin-vitamin. kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media. Medium berdasarkan komposisi . contohnya adalah NB (Nutrient Broth). Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam amino dan gas dari karbohidrat. Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea.. 3.  Karbohidrat. Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan. Jika dicampur dengan air dingin. Meat extract mengandung basa organik terbuat dari otak. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media. sukrosa. Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0. casein. Macam-Macam Media Pertumbuhan 1. glukosa. terutama pada pH yang asam  Peptone. darah. misalnya pada media Nitrate Broth. liver.4% sehingga menjadi sedikit kenyal. dll. Yeast extract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alcohol. tidak padat.5-1%. protein atau senyawa bernitrogen lain. agar tidak akan larut.

 Media diferensial Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial.  Media untuk karakterisasi bakteri Media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu mikroba.  Media untuk peremajaan kultur Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur  Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.  Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti.  Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti. misalnya Blood Tellurite Agar. Serum Agar. Lactose Broth. Arginine Agar. . misalnya Nutrient Broth. Brain Heart Infusion Agar. yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon. misalnya Glucose Agar. misalnya Tomato Juice Agar.  Media selektif/penghambat Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka.3. Contohnya adalah Nitrate Broth. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak. kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya. Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba.. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Blood Agar. dekstrosa dan ekstrak kentang. tetapi membutuhkan komponen kompleks.. Mac Conkey Agar. warna. Ampiciline.  Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya. serum. kuning telur.  Media diperkaya (enrichment) Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Bile Agar. Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E. Medium berdasarkan tujuan  Media untuk isolasi Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba. Untuk bahan ekstrak kentang. ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni. Contohnya adalah Koser’s Citrate medium. dll. Pancreatic Extract. misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar. Salt broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam. misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk.

karena akan terbentuk busa dan memuai sehingga tumpah). Jika diinginkan media tegak atau miring pada point ke 5.  Setelah itu media dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan disterilisasi dengan autoklaf.  Sementara itu sebagian akuades digunakan untuk melarutkan peptone dan beef extract. Proses pembuatan ini tidak memerlukan panas.  Pembuatan Nutrient Broth Komposisi untuk media NB sama dengan NA tetapi tidak memakai agar sebagai pemadat. Sebaiknya air untuk melarutkan agar lebih banyak  Larutkan agar pada sebagian air tersebut dengan mengaduk secara konstan dan diberi panas. tinggal melarutkan peptone dan beef extract kemudian ditampung dalam labu Erlenmeyer atau tabung reaksi dan siap disterilisasi. larutan dituangkan ke larutan agar dan diaduk sampai homogen. peptone dan beef extract akan mudah larut sempurna pada air suhu kamar jika diaduk Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA)  Timbang komponen media dengan menggunakan timbangan analitis untuk volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut:  Potato/kentang 3g  Peptone 5g  Agar 15 g  Akuades s. Kemudian pH media diukur dengan mencelupkan kertas pH indikator.  Setelah keduanya larut.Pembuatan Nutrient Agar dan Nutrient Broth  Pembuatan Nutrient Agar  Timbang komponen medium dengan menggunakan timbangan analitis untuk volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut:  Beef extract 3g  Peptone 5g  Agar 15 g  Akuades s.  Tuang media steril ke cawan petri steril secara aseptis. Proses pembuatannyapun lebih sederhana.d 1000 ml  Akuades sebanyak 100 ml dibagi menjadi dua satu bagian untuk melarutkan Beef extract dan peptone dan sebagian lagi untuk melarutkan agar. Jika pH tidak netral maka dapat ditambahkan HCl/NaOH. Dapat menggunakan kompor gas atau hot plate stirrer (jangan sampai overheat. cukup dengan pengadukan.d 1000 ml . media langsung dituang ke tabung kemudian disterilisasi.

sebaiknya kentang dikupas dan diiris kecil-kecil)  Rebus kentang dalam sebagian akuades tadi selama 1-3 jam sampai lunak.  (sebelum ditimbang. Setelah semua larut. Agar dilarutkan dengan Hot Plate Stirrer dalam 50 ml akuades lalu setelah larut dapat ditambahkan dekstrosa dan dihomogenkan lagi. Atur pH media menjadi 5-6 dengan meneteskan HCl/NaOH.   . kemudian diambil ekstraknya dengan menyaring dan memerasnya menggunakan kertas saring lalu ditampung di Beaker glass baru. ekstrak kentang dan agar-dekstrosa dicampur dan dihomogenkan. Media dituang ke dalam Erlenmeyer atau ke tabung reaksi kemudian siap untuk disterilisasi.

tyndalisasi mahasiswa dapat melakukan kerja aseptis Sterilisasi : 1.Panas kering . Prinsip kerja Biological Safety Cabinet . Macam-macam sterilisasi a. Pipetting 4. Sterilisasi dengan udara panas 8. Pengertian sterilisasi 2. Memindahkan biakan (streak) c.Uap air panas . Menuang media d. Tyndalisasi 7.Dengan api langsung . Sterilisasi secara fisik  Pemanasan . Mensterilkan meja kerja b. Sterilisasi dengan cara penyaringan 6. filtrasi. Prinsip cara kerja autoklaf 5.STERILISASI Kompetensi : mahasiswa mengetahui sterilisasi dengan autoklaf. Prosedur/Teknik aseptis a. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) b. Sterilisasi secara kimia  dengan larutan disinfektan 3.Uap air panas bertekanan  Penyinaran UV c.

dll. Sterilisai secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0. Sterilisaisi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol. . contoh alat : jarum inokulum.  Pemanasan a. pinset. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer. Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi. Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung. misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV 3. Macam-macam sterilisasi Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik. Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-1800C. misal nya larutan enzim dan antibiotik. d. c.22mikron atau 0. 2. Uap air panas bertekanan : menggunalkan autoklaf  Penyinaran dengan UV Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi. fisik dan kimiawi. 1. batang L.45 mikrob) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut.Pengertian Sterilisasi yaitu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda dari semua bentuk kehidupan. tabung reaksi dll. b.

Berbagai prosedur umum kerja dalam mikrobiologi yang membutuhkan teknik aseptis Desinfeksi meja kerja .

dll dapat disemprot dengan alkohol terlebih dahulu lalu dibakar. Sebelum membuka ruangan atau bagian steril di dalam tabung/cawan/erlenmeyer sebaiknya bagian mulut (bagian yang memungkinkan kontaminan masuk) dibakar/dilewatkan api terlebih dahulu.Saran-saran kerja aseptis : 1. Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut .4 Kpa) selama 15 menit. batang L. 2. Pinset.8 0F adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. Biasanya untuk mesterilkan media digunakan suhu 1210C dan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103. 3. Usahakan bagian alat yang diharapkan dalam kondisi steril didekatkan ke bagian api. Ujung jarum inokulum yang sudah dipijarkan harus ditunggu dingin dahulu atau dapat ditempelkan tutup cawan bagian dalam untuk mempercepat transfer panas yang terjadi. 4. Untuk cara kerja penggunaan autoklaf telah disampaikan di depan. Jika kerja di Safety Cabinet tidak perlu memakai pembakar bunsen tetapi jika di luar Safety Cabinet maka semakin banyak sumber api maka semakin terjamin kondisi aseptisnya Prinsip cara kerja autoklaf Seperti yang telah dijelaskan sebagian pada bab pengenalan alat. Alasan digunakan suhu 1210C atau 249. 5. autoklaf adalah alat untuk memsterilkan berbagai macam alat & bahan yang menggunakan tekanan 15 psi (2 atm) dan suhu 1210C.

Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi. Jika mensterilkan media 1L yang ditampung pada erlenmeyer 2L maka sterilisasi diatur dengan waktu 30 menit.. . Kertas spore strip ini dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan. antibiotik. Virus tidak akan tersaring dengan metode ini. dan enzim  Paelarut organik.  Senyawa garam mineral disterilkan terpisah dengan agar  Media yang memiliki pH > 7. menggunakan tekanan 15 psi maka air akan memdididh pada suhu 1210C. air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. Jika media tetap bening maka menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan baik. maka pengaturan tekanan perlu disetting ulang. Setelah proses sterilisai lalu ditumbuhkan pada media. Pada saat sumber panas dinyalakan. seperti SDS Untuk mencegah terjadinya presipitasi. lazimnya mikroba ini tersedia secara komersial dalam bentuk spore strip. katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik. Setelah proses sterilisasi selesai. sisa ruang dibirkan kosong. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai. Beberapa media atau bahan yang tidak disterilkan dengan autoklaf adalah :  Bahan tidak tahan panas seperti serum. jika dilaboratorium terletak pada ketinggian tertentu. vitamin. sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi.(sea level) air mendidih pada suhu 1000C. maka tekanan dinaikkan menjadi 20 psi supaya tercapai suhu 1210C untuk mendidihkan air. pencoklatan (media menjadi coklat) dan hancurnya substrat dapat dilakukan pencegahan sbb :  Glukosa disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa fosfat  Senyawa fosfat disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa garam mineral lain.5 jangan disterilkan dengan autoklaf  Jangan mensterilisasi larutan agar dengan pH < 6. Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi) Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk mensterilisasi cairan yagn mudah rusak jika terkena panas atu mudah menguap (volatile). Ingat kejadian ini hanya berlaku untuk sea level. Setelah semua udara dalam autoklaf diganti dengan uap air. sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di ketinggian sama. Misalnya autoklaf diletakkan pada ketinggian 2700 kaki dpl. Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 1210C dan tekanan 15 psi selama 15 menit. maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur. Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan sempurna dapat digunakan mikroba pengguji yang bersifat termofilik dan memiliki endospora yaitu Bacillus stearothermophillus.0 Erlenmeyer hanya boleh diisi media maksimum ¾ dari total volumenya. seperti fenol  Buffer engan kandungan detergen. Cairan yang disterilisasi dilewatkan ke suatu saringan (ditekan dengan gaya sentrifugasi atau pompa vakum) yang berpori dengan diameter yang cukup kecil untuk menyaring bakteri.

Chamberland Zeitz).Volume kurang dari 1 ml Cara kerja menggunakan Non-disposable filtration apparatus  Sterilkan saringan (dapat menggunakan saringan Bekerfeld.Disedot dengan pompa vakum . .Disedot dengan pompa vakum . membran penyaring (kertas saring) dan erlenmeyer penampung. lalu isi corong dengan larutan yang akan disterilkan.Sterilisasi dengan penyaringan dapat dilakukan dengan berbagai cara :  Non-disposable filtration apparatus .Volume 1-20 ml  Spin filters .Ditekan dengan gaya setrifugasi .Ditekan seperti jarum suntik .  Hubungkan katup erlenmeyer dengan pompa vakum kemudian hidupkan pompa. maka larutan dapat dipindahkan kedalam gelas penampung lain yang sudah steril dan tutup dengan kapas atau aluminium foil yang steril.Volume 20-1000 ml  Disposable filter cup unit .Volume 15-1000 ml  Syringe filters .Volume 15-1000 ml  Disposable filtration unit dengan botol penyimpan .Disedot dengan pompa vakum .  setelah semua larutan melewati membran filter dan tertampung dierlenmeyer.  Pasang atau rakit alat-alat tersebut secara aseptis (sesuai gambar).

sedang waktu ini dimaksudkan untuk memberi kesempatan spora atau sel vegetatif yang belum mati untuk tumbuh sehingga mudah dibunuh. Perlindungan untuk praktikan/pen elitian Kelas I Sebagian. Bahan yang mengandung air dan tidak tahan tekanan atau suhu tinggi lebih tepat disterilkan dengan metode ini.  Bungkus alat-alat gelas dengan kertas payung atau aluminium foil  Atur pengatur suhu oven menjadi 1800C dan alat disterilkan selama 2-3 jam. BSC memiliki suatu pengatur aliran udara yang menciptakan aliran udara kotor (dimungkinkan ada kontaminan) untuk disaring dan diresirkulasi melalui filter. Alat gelas yang disterilisasi dengan udara panas tidak akan timbul kondensasi sehingga tidak ada tetes air (embun) didalam alat gelas. dan juga dikenal dengan Laminar flow hood atau Class II vertical flow cabinet yang menyediakan alat filtrasi dan aliran udara yang bersirkulasi didalam ruang kerja. pipet ukur dan labu erlenmyer.  Setelah selesai alat sterilisasi dimatikan dan bahan yang steril dikeluarkan. untuk mencegah kontaminasi dari luar dan pencemaran bakteri dari ruang BSC. Prinsip kerja Biological Saferty Cabinet Biological Safety Cabinet merupakan kabinet kerja yang sterilkan untuk kerja mikrobiologi. aliran udara keluar disaring dengan saringan HEPA Kelas III Semua. Aliran udara diatur untuk menghambat udara luar masuk dan udara di dalam keluar.  Nyalakan sumber panas dan tunggu hingga termometer menunjukkan suhu 1000C kemudian hitung waktu mundur hingga 30 menit (uap panas yang terbentuk akan mematikan mikroba). Sterilisasi dengan udara panas (Dry heat sterilization) Sterilisasi dengan metode ini biasanya digunakan untuk peralatan gelas seperti cawan petri. Cara kerja :  Bahan dimasukkan kedalam erlenmeyer atau botol dan ditutup rapat dengan sumbat atau aluminium foil. bahan tersebut di sterilkan lagi dengan cara yang sama. aliran udara keluar disaring dengan saringan HEPA Kelas II Sebagaian.  Setelah 24 jam. Misalnya susu yang disterilkan dengan suhu tinggi akan mengalami koagulasi dan bahan yang berpati disterilkan pada suhu bertekanan pada kondisi pH asam akan terhidrolisis.  Erlenmeyer/botol lalu dimasukkan kedalam alat sterilisasi (alat standar menggunakan Arnold Steam Sterilizen atau dandang).Tyndalisasi Konsep kerja metode ini merip dengan mengukus. terdapat perlindungan sempurna (Gloves box) dan udara disaring dengan saringan HEPA . BSC juga disebut biosafety hood. Berbagai kelas Biological Safety Cabinet. Udara yang keluar disaring melewati penyaring sehingga sel-sel yang berbahaya tidak lepas keluar ke ruangan lain.

Udara yang berasal dari luar kabinet akan langsung terserap masuk kesaluran bawah yang bergabung dengan udara dari meja kerja yang dimungkinkan mengandung bakteri yang digunakan untuk kerja.Perlindungan untuk alat dan bahan Tidak ada. udara masuk disaring dan memiliki sirkulasi udara yang lebih sederhana Kerja dengan bahan kimia yang sangat berbahaya atau dengan mikroorganisme yang sangat patogen Cocok untuk Kerja untuk membiakkan sel atau kerja mikrobiologi BSC yang dimiliki Lab mikrobiologi merupakan BSC kelas II yang memiliki konfigurasi udara seperti gambar disamping ini. Kemudian udara kotor ini disaring oleh penyaring HEPA dan disirkulasikan keluar kabinet atau kembali lagi ke meja kerja sebagai udara bersih. tidak ada area kerja yang steril karena uadara luar dapat masuk melewati area kerja Kerja dengan bahan kimia yang karsinigen bahan kimia beradiasi rendah. larutan yang volatil Ada. . udara masuk disaring terlebih dahulu Ada. Udara dari meja kerja disedot dari depan meja kerja.

Prosedur isolasi jamur dari sampel Pengertian Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya. Berikut merupakan prosedur pengambilan sampel. Pengertian b. jika ingin mengambil sampel dari air keran maka sebelumya keran dialirkan dulu beberapa saat dan mulut kran dibakar. Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang. Sampel air Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. botol dapat dicelupkan dengan tali. maka cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan.ISOLASI MIKROORGANISME Kompetensi: mahasiswa dapat memisahkan mikroba dari campurannya sehingga didapat kultur murni. Isolasi Mikroorganisme: a. tetapi terdiri dari campuran berbagai macam sel. Teknik Pengambilan sample c. Misal jika yang diinginkan mikroorganisma rhizosfer maka sampel diambil dari sekitar perakaran dekat permukaan hingga ujung perakaran. sifat dan kemampuan biokimiawinya. . Jika beerasal dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir botol melawan arus air. Di dalam laboratorium populasi bakteri inidapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi. Teknik Pengambilan Sampel Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel. Isolasi dengan cara pengenceran 1) Teknik preparasi suspensi  Swab  Rinse  Maserasi 2) Teknik pengenceran bertingkat 3) Teknik penanaman  Dari suspensi (spread dan pour plate)  Dengan goresan (streak dan quadrant streak inoculation) d.. 1. 2. Sampel tanah Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah. Prosedur isolasi bakteri dari sampel e.

Contoh sampelnya antar alain bakso. b. buah dll. Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil. Contohnya sampel daun diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan akuades 45 ml yang terdapat dalam beaker glass. sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air. batang kayu dll. dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel yang memiliki permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut. Macam-macam preparsi bergantung kepada bentuk sampel : a. Swab (ulas). biji. Penentuan besarnya atau banyaknya . Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. misalnya daun bunga dll. Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan permukaan sampel. batu.Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution) 1. Unutk sampel dari tanh tak perlu dimaserasi 2. Contohnya adalah meja. Perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v). Rinse merupakan prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9 (w/v). Maseration (pengancuran). Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke dalam larutan atraktan semisal pepton water. Teknik Pengenceran Bertingkat Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Teknik Preparasi Suspensi Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. c.

tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel.  Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar supaya tetesan suspensi merata. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan cairan dari sumber yang sama.  Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar diatas bunsen beberapa saat. Teknik penanaman dari suspensi Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet ukur steril yang berbeda/baru. Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya (pengocokan yang benar dapat dilihat pada gambar disamping) b. sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya.1 ml dengan pipet ukur kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat. a. Teknik Penanaman a. Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan adalah sebagai berikut :  Ambil suspensi cairan senamyak 0. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh . penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama. kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa detik.1. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya. Perbandingan berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 dan ingat akuades yang digunakan jika memakai teknik rinse dan swab sudah termasuk pengencer 10-1. Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung 10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogen. Spread Plate (agar tabur ulas) Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni. Pour Plate (agar tuang) Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan harus selalu diganti. 3.  Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas. Cara Kerja : a. Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi suspensi).2. a.

b. Adapun prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut : Siapkan cawan steril.suspensi sel kedalam cawan kosong  Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untuk  menghomogenkan suspensi bakteri dan media. kemudian lanjutkan streak zig-zag pada daerah 2 (streak pada gambar). o  Jangan pijarkan loop. b. b.dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen. Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak) Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru.1 ml untuk spread plate dan 1 ml untuk pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja. melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru. lalu putar cawan 180 C lanjutkan goresan sampai habis. Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna  Lakukan hal yang sama pada daerah 3 . kemudian diinkubasi. Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal. tabung pengenceran yang akan ditanam dan media  padat yang masih cair (>45oC) Teteskan 1 ml secara aseptis.2 Goresan T Cara kerja :  Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker  Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag  Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin. sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate.1 Goresan Sinambung Cara kerja :  Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar.

B.3 Goresan Kuadran (Streak quadrant) Cara kerja : Hampir sama dengan goresan T. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisma. namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi empat. setelah selesai. .Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal. Cara Kerja Isolasi Bakteri dari Sampel Tanah :  Tanah seberat 1 g dimasukan ke dalam tabung pengenceran 10-1 secara aseptis dan selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10-8  Tiga pengenceran terakhir diambil 0. diinkubasi pada 37oC selama 1x24 jam  Koloni akan tumbuh pada ketiga cawan tersebut kemudian dipilih koloni yang relatif terpisah dari koloni lain dan koloni yang mudah dikenali  Koloni yang terpilih kemudian ditumbuhkan atau dimurnikan ke NA baru dengan teknik streak kuadran  Inkubasi 1x24 jam.1 ml untuk ditanam secara spread plate pada medium NA.

Kemudian diinkubnasi pada suhu ruang 5-7 hari  Koloni jamur yang tumbuh dimurnikan dan ditanam pada medium PDA baru.Cara Kerja Isolasi Jamur dari Tanah :  Tanah dalam cawan petri dipanaskan dengan oven pada suhu 80oC selama 30 menit dengan cawan petri untuk membunuh sel vegetatiftetap bertahan  Tanah yang telah dioven diambil 1 g kemudian dimasukan ke dalam tabung pengenceran bertingkat  Tiga pengenceran terakhir diambil untuk ditanama secara spread plate ke media PDA yang ditambah streptomycin atau penicillin. .  Inkubasi pada suhu ruang 5-7 hari.

psikrofilik(0-200C). 3%. 3. mesofilik Mesofilik (20-300C). pengaruh suhu terhadap pertumbuhan mikroorganisme b.coli dan Bacillus sp. Pengaruh tekanan osmotik terhadap pertumbuhan mikroorganisme Keberadaan mikroorganisma dilingkungan dapat dipengaruhi kepekatan suspensi/cairan di lingkungan. Sebaliknya kepekatan suspensi di lingkungan rendah maka akan terjadi pergerakan massa cair ke dalam sel Cara Kerja:  buat 4 buah cawan Nutrient Agar yang mengandung NaCl 0. pengaruh tekanan osmotik terhadap pertumbuhan mikroorganisme c. Suhu rendah menyebabkan aktiivtas enzim menurun dan jika suhu terlalu tinggi dapat mendenaturasi protein enzim. Setelah diinokulasi dengan bekteri yang berbeda. Suhu merupakan faktor lingkungan yang sangat menentukan kehidupan mikroorganisme.coli dan Bacillus sp. dengan streak kontinyu  Gunakan kontrol untuk masing-masing biakan dengan media yang tidak ditambahi NaCl.) diberi label . diinkubasi sesuai suhu yang tertera  setelah ditumbuhkan selama 48 jam. dan 500C dan mikroorganisma yang berbeda (E. tekanan sinar UV dan pH terhadap pertumbuhuan Mikroorganisme Faktor lingkungan : a.coli dan Bacillus sp. Bila kepekatan suspensi di lingkungan tinggi maka isi sel akan ke luar. 5% dan 15%. termofilik (50-1000C). 2.  Inkubasi selama 48 jam dan amati pertumbuhannya . bandingkan derajat kekeruhannya. 370C.FAKTOR LINGKUNGAN YANG BERPENGARUH TERHADAP PERTUMBUHAN MIKROORGANISME Kompetensi: mahasiswa mengetahui pengaruh suhu. Cara Kerja :  8x2 tabung yang berisi Nutrient Broth untuk suhu inkubasi 50C. cawan dibagi menjadi 2 dengan spidol kemudian labeli dengan bakteri E. pengaruh pH terhadap pertumbuhan mikroorganisme Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan mikroorganisme Berdasarkan suhu optimum untuk pertumbuhan maka dapat dikelompokan menjadi 3 yaitu : 1.  Setiap konsentrasi.  Inokulasikan E. 250C. pengaruh sinar ultraviolet tehadap pertumbuhan mikroorganisme d. pengaruh suhu berhubungan dengan aktivitas enzim.5%.

Basofilik Cara Kerja :  Buatlah tabung reaksi berisi NB dan atur pH-nya (pH 3.  Dedahkan ketiga cawan tersebut pada sinar UV dengan panjang 254 nm selama 1 menit. Jarak antar UV dan cawan sekitar 12 inchi  Gunakan kontrol untuk masing-masing biakan dengan tidak memaparkan pada sinar UV  Inkubasi selama 48 jam dan amati pertumbuhan koloninya Pengaruh pH terhadap pertumbuhan mikroorgansime pH berpengaruh terhadap sel dengan mempengaruhi metabolisme..Pengaruh sinar ultraviolet terhadap pertumbuhan mikroorganisme Sinar UV panjang gelombang 210-300 nm dapat membunuh mikroorganisme jika di paparkan. Acidofilik. Cara Kerja:  Inokulasikan Aspergillus sp.0). 7 dan 9) masing-masing 2 tabung untuk tiap nilai pH  Labeli dengan nama bakteri yang akan diinokulasikan  Inokulasi tiap tabung dengan Bacillus sp dan E. 2 Mesofilik/Neutrofilik dan 3.coli lalu diinkubasi pada suhu 370C selama 48 jam  Amati perbedaan kekeruhan pada tiap nilai pH . dan 15 menit (ingat tutup cawan dibuka dan diusahakan lingkungan sekitar steril). Berdasarkan nilai pH yang dibutuhkan untuk kehidupannya dikenal 3 kelompok mikroorganisme yaitu : 1. E. 5 menit.coli dan Bacillus sp. pada 3 cawan NA. pada umumnya bakteri tumbuh dengan baik pada pH netral (7. Komponen seluler yang dapat menyerap sinar UV adalah asam nukleat sehingga dapat rusak dan menyebabkan kematian.

2 mengamati morfologi sel yeast (dengan pewarnaan sederhana) c.2 mengamati morfologi sel kapang (dengan metode slide culture) Bakteri A.1 mengamati morfologi koloni yeast (pada agar cawan) b. khususnya untuk tujuan identifikasi.2.1 pada media cawan a.1 mengamati morfologi koloni bakteri a.1. pinpoint/punctiform (titik) Small (kecil) Moderate (sedang) Large (besar) .3 dengan pewarnaan gram a.2 pada agar miring a.2 pengamatan tidak langsung b.MORFOLOGI MIKROBA Kompetensi : mahasiswa dapat mengenali bentuk dan morfologi sel dan koloni mikroorganisme a.1 mengamati morfologi koloni kapang (pada agar cawan) c.4 dengan pewarnaan endospora a.1 pengamatan langsung a.3.2.3 mengamati motilitas bakteri a. Yeast b.1 dengan pewarnaan sederhana a. Cara Kerja :  Tumbuhkan biakan pada media NA cawan dengan streak kuadran  Tumbuhkan biakan pada media NA miring dengan pola inokulasi yang tegak lurus  Tumbuhkan biakan pada media NA tegak dengan stab inoculation  Tumbuhkan biakan pada media NB A.3.2 mengamati morfologi sel bakteri a.3 pada agar tegak a.1.1.2.4 pada media cair a. Bakteri a. Kapang c. Mengamati Morfologi Koloni Bakteri Kegiatan ini merupakan tindakan pertama kali jika ingin mempelajari suatu jenis bakteri lebih lanjut. Setelah mendapatkan kultur murni maka biakan yang diinginkan ditumbuhkan ke berbagai bentuk media untuk dikenali ciri koloninya.1.2 dengan pewarnaan negatif a.1. Pertumbuhan pada Cawan Petri Ciri-ciri yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut :  Ukuran.2.

Translucent (dapat ditembus cahaya sebagian). Transparant (bening)  Bentuk : Circular Elevasi : Flat Irregular Raised Spindle Convex Filamentous Umbonate Rhizoid   Permukaan : Halus mengkilap Kasar Berkerut Kering seperti bubuk Margins : Entire Lobate Undulate Serrate Felamentous Curled A. Opaque (tidak dapat ditembus cahaya). beberapa jenis lain memproduksi pigmen ekstraseluler yang dapat terlarut dalam media Karakteristik optik : diamati berdasarkan jumlah cahaya yang melewati koloni. Pertumbuhan pada Agar Miring Ciri-ciri koloni diperoleh dengan menggoreskan jarum inokulum tegak dan lurus Ciri koloni berdasarkan bentuk: .  Pigmentasi : mikroorganisme kromogenik sering memproduksi pigmen intraseluler.2.

A.3 Pertumbuhan pada Agar Tegak Cara penanaman adalah dengan menusukkan jarum inokulum needle ke dalam media agar tegak. Ciri-ciri koloni berdasar bentuk : Ciri koloni berdasar kebutuhan O2 : .

Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri.  Pewarnaan khusus . sel bakteri sulit terlihat. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Congo Red dll. tapi jika suspensi bakteri terlalu encer. Malachite Green dll. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa.4 Pertumbuhan pada Media Cair Pola pertumbuhan berdasarkan kebutuhan O2 A. Base Fuchsin. . Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan.pewarnaan acid fast dll. B.pewarnaan gram . Pada zat warna basa.pewarnaan positif .pewarnaan endospora . maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop.pewarnaan negatif  Pewarnaan diferensial . Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya.1. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet. Methylene Blue. sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan. Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif) Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi.pewarnaan flagella dll. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat.A. Mengamati Morfologi Bakteri Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Safranin. Pewarnaan  Pewarnaan sederhana .

jangan difiksasi atau dipanaskan di atas api. Prosedur:  Ambil dua object glass.Cara Kerja :  Bersihkan object glass dengan kapas  Jika perlu tulislah kode atau nama bakteri pada sudut object glass  Bila menggunakan biakan cair maka pindahkan setetes biakan dengan pipet tetes atau dapat juga dipindahkan dengan jarum inokulum. maka biakan dipindahkan dengan jarum inokulum. Crystal Violet) dan tunggu kurang lebih 30 detik.  Cuci dengan akuades kemudian keringkan dengan kertas tissue  Periksa dengan mikroskop (perbesaran 100 x 10).  Keringkan ulasan tersebut sambil memfiksasinya dengan api bunsen (lewatkan di atas api 2-3 kali)  Setelah benar-benar kering dan tersebar selanjutnya ditetesi dengan pewarna (dapat digunakan Methylen blue. Tapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. teteskan nigrosin atau tinta cina di ujung kanan salah satu object glass  Biakan diambil lalu diulaskan atau diteteskan dalam tetesan nigrosin tadi. Jangan lupa biakan dikocok terlebih dahulu. Safranin. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya. B.2 Pewarnaan Negatif Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. satu ulasan saja kemudian diberi akuades dan disebarkan supaya sel merata. sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam. Jika digunakan biakan padat. . lalu dicampurkan  Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan ke samping kiri  Biarkan preparat mengering di udara.

Lactobacilus. (rod). micrococcus Sarcina . Spirillum. pediococcus.1 2 3 4 Setelah dilihat di mikroskop. Acinetobacter Escherichia. Veillonella. Berikut merupakan berbagai bentuk sel bakteri Bentuk Contoh jenis Coccus (sphere) Coccobacilli Bacilli. Moraxela Streptococcus Bacillus. maka akan tampak bentuk sel bakteri. Bdellovibrio. blunt end Helical (spirillum) Diplococcus Streptococcus Streptobacillus Staphylococcus Tetrad (Gaffkya) Sarcina (cuboid packets) Neisseria. rounded ends Vibrio (curved) Bacilli (Rod). campylobacter Neisseria. Ancylobacter dll Bacillus Spirochaeta. Mycobacterium Staphylococcus Deinococci. Enterococcus Moraxella. clostridium Vibrio.

Cuci dengan akuades mengalir 4.Cuci dengan akuades mengalir 10. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.3.Teteskan mordant (lugol.Beri larutan pemucat (ethanol 96%/ aseton) setetes demi setetes hingga etanol yang jatuh berwarna jernih. Counterstain hanya berfungsi sebagai pengontras saja 9. Pada gram positif dapat terbentuk CV iodinribonukleat pada dinding sel 5. sedangkan gram positif tidak terpengaruh.A.Keringkan preparat dengan kertas tissue yang ditempelkan di sisi ulasan (jangan sampai merusak ulasan) lalu biarkan mengering di udara. Pewarnaan Gram Adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi.s iodine) Adanya lugol’s iodine menyebabkan lalu tunggu ± 1 menit adanya ikatan CV dengan iodine yang akan meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri.Teteskan counterstain (safranin) dan Safranin akan mewarnai sel gram tunggu selama ± 45 detik negatif menjadi berwarna merah. sehingga komplek CV-iodine akan lepas dari permukaan sel gram negatif. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif.Cuci dengan akuades mengalir 8.Berikut merupakan prosedur pewarnaan Gram: Cara Kerja : Dampak/Hasil 1.Teteskan kristal violet sebagai Kristal ungu akan mewarnai seluruh pewarna utama pada kedua preparat . sel gram negatif menjadi bening 7.Cuci dengan akuades mengalir 6.Buat preparat ulas (smear) yang Sel bakteri tertempel pada permukaan telah difiksasi dari bakteri gram kaca (object glas) positif misal Bacillus subtilis dan gram negatif misal Escherichia coli 2. Jangan sampai terlalu banyak (overdecolorize) Penetesan etanol absolut menyebabkan terbentuknya pori-pori pada gram negatif yang memiliki banyak lapisn lemak (lipid larut dalam etanol). sedangkan pada gram positif CV-iodine tetap menempel di dinding sel. . karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. permukaan sel bakteri gram positif dan usahakan semua ulasan terwarnai dan negatif tunggu selama ± 1 menit 3.

 Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sbb: Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam . Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif.

sel vegetatif berwarna). sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas. Berikut merupakan prosedur pewarnaan endospora dengan metode Schaeffer-Fulton.Setelah dingin. Endospora sukar menyerap zat warna. sehingga diperlukan teknik pewarnaan endospora.Cuci kering anginkan . warna ini tidak mempengaruhi warna hijau endospora. radiasi dan bahan kimia. Jika bagian pinggir mulai mengering. khususnya pada gram positif. Biarkan 5 menit. tambahkan lagi Malachite Green.4. Setelah perlakuan di atas Malachite green tidak melekat kuat dengan sel vegetatif. Walaupun ada beberapa species yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel. dingin. penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif. B. Untuk mewarnainya dilakukan pemanasan untuk mempermudah penetrasi Malachite green ke dinding endospora. endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (keduaduanya transparan. 4. Cara Kerja : 1. warna tersebut sulit dilunturkan. Air digunakan sebagai agen dekolorasi sel. sehingga pembedaannya tampak jelas.Buat preparat ulas dari Bacillus subtilis lalu tutup dengan kertas merang 2. bilas object glass dengan akuades mengalir Dampak/Hasil Sel bakteri menempel pada permukaan object glass Malachite green akan mewarnai sel vegetatif bakteri. Namun jika dengan pewarnaan sederhana. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV). sekali diberi zat warna.Tetesi dengan safranin sebagai counter stain. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif. Letakan di atas air yang mendidih. Dijaga jangan sampai kering. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif. kering. 3. Desulfomaculatum dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Pembilasan dengan akuades akan melunturkan Malachite green pada sel vegetatif Safranin akan mewarnai sel vegetatif menjadi merah. diamkan selama + 45 detik 5. sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Pewarnaan Endospora Anggota dari genus Clostridium.Tetesi ulasan pada object glass dengan Malachite green di atas kertas merang.

Pemberian Malachite green Pelunturan dengan air mengalir Penambahan safranin Cuci dan keringkan .

Mengamati morfologi koloni yeast  Tanam biakan yeast (dapat berupa Sacharomyces cereviceae atau Candida albicans) pada PDA dengan cara streak quadrant. Mengamati motilitas C. hasil negatif menunjukan bakteri hanya tumbuh pada daerah tusukan saja Bakteri motil akan bermigrasi ke seluruh permukaan agar dan bekas tusukan Yeast / Khamir A. C.coli ke object glass (sebaiknya dari biakan cair).  Inkubasi pada suhu 370 C selama 1x 24 jam  Hasil positif (motil) jika bakteri tumbuh pada seluruh permukaan media. Jika digunakan biakan padat maka ulas dengan jarum inokulum lalu ditambah akuades satu tetes. Bakteri akan tampak transparan dan pola pergerakannya tidak beraturan.  Inkubasi selama 2x24 jam. . ratakan. Hati-hati jangan salah membedakan antara sel yang bergerak sendiri karena flagel atau bergerak terkena aliran air.Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya : C.2 Pengamatan tidak langsung Cara Kerja :  Tanam biakan pada media NA tegak atau Media Motilitas dengan cara tusuk (Stab inoculation) sedalam + 5 mm.1 Pengamatan Langsung Cara Kerja :  Teteskan biakan bakteri motil seperti Bacillus atau E.  Tutup dengan cover glass  Amati menggunakan mikroskop dengan perbesaran maksimak.

 Tutup preparat dengan cover glass. Hifa dapat berekat (septat) dengan inti tunggal/ lebih dan hifa tidak bersekat (aseptat). Morfologi koloninya dapat dengan mudah dibedakan dengan bakteri walaupun ada beberapa jenis bakteri yang koloninya mirip jamur. Koloni kapang memiliki keragaman warna yang muncul dari sporanya. B. Panasi preparat dengan api bunsen selama + 30 detik (sampai timbul uap).2 Melihat bentuk spora sel Yeast Cara kerja :  Buat preparat ulas dari biakan yeast pada Goodkowa Agar yang berumur 10 hari. B. Mengamati morfologi koloni kapang Cara kerja :  Tanam/pindahkan biakan kapang dengan jarum inokulum needle yang diletakan di tenganh-tengah cawan petri. Mengamati Morfologi Sel Yeast Yeast merupakan fungi mikroskopik uniseluler. . Bentuk selnya bervariasi dapat berbentuk bulat. Beberapa spesies yeast memiliki sifat dimorfisme yaitu bentuk sel tunggal dan bentuk hifa atau pseudohifa. bulat telur. B. bulat memanjang dengan ukuran 1-9x20 µm. Penampakan morfologi koloni pada umumnya seperti benang (filamentous) yang pertumbuhannya membentuk lingkaran. Setelah didapatkan koloni tunggal.1 Melihat bentuk sel Yeast Cara Kerja :  Tumbuhkan Sacharomyces cereviceae pada glukosa cair selama 24 jam.  Ulaskan suspensi biakan pada object glass lalu teteskan Methilene Blue hingga rata (jangan difiksasi). tidak membentuk hifa (beberapa spesies dapat membentuk pseudohifa). Keringkan dengan tissue kemudian biarkan pada udara terbuka.  Fiksasi dengan api bunsen. Morfologi internal sel mudah dilihat dan terdiri dari inti dan organel seperti mitkondria. Perhatikan spora yang berwarna Kapang / Jamur Jamur merupakan mikroba dengan struktur talus berupa benang-benang (hifa) yang terjalin seperti jala (myselium). tetapi tidak melepaskan diri dari induk. A. pengamatan ciri-ciri morfologi koloni hampir sama dengan ciri morfologi bakteri.  Inkubasi selam beberapa hari.  Warnai dengan cara Shager dan Fulgen yaitu: Tetesi preparat dengan Malachite Green dan biarkan 30-60 detik.  Amati dengan perbesaran 40x10 atau 100x10. grannula lemak dan glikogen. seperti dari kelompok Actinomycetes atau Bacillus mycoides. Cuci preparat dengan air mengalir. Amati di bawah mikroskop. Pseudohifa adalah hifa yeast yang terbentuk dari rangkaian sel hasil pembelahan aseksual secara budding.

 Tutup dengan cover glass. B. B.  Inkubasi pada suhu kamar selama 3x24 jam. cara kerja :  Siapkan object glass. Amati pertumbuhan koloni (miselium) yang menyebar. tissue basah yang dimasukkan dalam cawan dan sterilkan dengan autoclave. Berikan sampai setengah luasan cover glass.  Setelah selesai sterilisasi berikan lilin (parafin-petrolatum) steril pada sebelah kiri dan kanan tempat yang akan ditutup cover glass (aseptis).1 Metode Heinrich’s. Pengamatan struktur spora dan miselium dapat juga dilakukan dengan preparat ulas seperti yang telah diuraikan di depan. B.  Inokulasikan spora jamur pada bagian atau potongan agar. Dengan teknik ini. cover glass. cara kerja :  Persiapan sama seperti di atas  Setelah semua steril. Namun seringkali miselium atau susunan spora menjadi pecah atau terputus sehingga penampakan di mikroskop dapat membingungkan.  Ambil preparat dan amati di bawah mikroskop. Tekan cover galss secara media merata. .  Teteskan suspensi spora jamur dalam media cair pada media cover glass yang tidak diberi lilin.  Tutup potongan agar dengan cover glass. potong media Saboraud Dextrose Agar steril berbentuk kubus dan letakkan di atas object glass. spora dan miselium tumbuh langsung pada slide sehingga dapat mengatasi masalah tersebut. 2 Metode Riddel. Mengamati sel morfologi kapang dengan metode Slide Culture (Microculture) Teknik ini bertujuan untuk mengamati sel kapang dengan menumbuhkan spora pada object glass yang ditetesi media pertumbuhan.  Inkubasi pada suhu kamar selama 3x24 jam.

B.  Amati pertumbuhan miselium dan spora pada object glass dengan perbesaran sedang .  Inkubasi selama 2x24 jam.  Ulaskan spora jamur yang akan diamati pada belahan tersebut.  Belah media yang memadat dengan jarum inokulum yang berujung L.  Tutup dengan cover glass tepat di atas media dan tekan hingga merata. cara kerja :  Sterilkan cawan petri yang berisi kapas yang di atasnya terdapat object glass dan cover glass.  Siapkan media PDA dan dijaga supaya tetap cair.  Teteskan media PDA pada object glass secara aseptis lalu tunggu memadat (teteskan jangan terlalu banyak).3 Prosedur yang lebih sederhana. Ambil preparat dan diamati di bawah mikroskop.

1. 1 skala micrometer objektif = 0. Menentukan ukuran mikroba Menggunakan mikrometer b. Jarak ini dapat ditentukan dengan mengkalibrasi antara mikrometer okuler dan objektif.1..1.1 SPC b.1.1.D = Okuler Division) Jarak skala pada mikrometer okuler = 0. Menentukan jumlah mikroba (enumerasi) b.2 penghitungan jumlah bakteri secara keseluruhan (penghitungan langsung dengan haemocytometer  Menentukan Ukuran Mikroorganisme Mikroba berukuran sangat kecil dan untuk mengetahuinya digunakan mikrometer.2 TPC b. Jarak antar garis skala pada mikrometer okuler tergantung pada perbesaran lensa objektif yang digunakan yang menentukan lapang pandang mikroskop. Kalibrasi dilakukan dengan menghimpitkan skala mikrometer objektif dan okuler pada perbesaran yang diinginkan. Mikrometer objektif memiliki skala yang telah diketahui.01 mm / 10 µm.1.1. MPN dan dengan haemocytometer Menentukan jumlah dan ukuran mikroba a.MENENTUKAN JUMLAH & UKURAN MIKROBA Kompetensi : Mahasiswa dapat melakukan pengukuran sel mikroorganisme Mahasiswa dapat melakukan perhitungan mikroba dengan cara Plate Count. Mikrometer okuler dipasang pada lensa okuler mikroskop. menjadi tolak ukur untuk menentukan ukuran skala micrometer okuler. Dari hasil tersebut dapat diketahui satu satuan panjang pada skala mikrometer okuler itu berdasarkan beberapa jumlah skala kecil mikrometer objektif yang berada di antara garis yang berhimpit tadi. Skala ke nol (garis pertama) kedua mikrometer disimpulkan menjadi 1 garis kemudian dilihat pada skala ke berapa kedua jenis mikrometer tersebut bertemu/berhimpit kembali. Mikrometer merupakan kaca berskala dan dikenal 2 jenis micrometer yaitu mikrometer okuler dan mikrometer objektif.1.2 MPN b. 1 skala okuler = Jarak yang diketahui antara 2 garis pada mik. Objektif (O.01 X Skala Objektif Skala Okuler 10 X Skala Ob Skala Ok (mm) = (µm) .1 Plate count (hitungan cawan) b.1 penghitungan jumlah bakteri hidup (penghitungan tidak langsung) b.3 cara kerja SPC dan TPC b. sedangkan micrometer objektif berbentuk slide yang ditempatkan pada meja preparat mikroskop.

 Tentukan perbesaran yang digunakan.  Ganti dengan preparat ulas yang telah disiapkan  Cari fokus dari preparat tersebut dengan perbesaran yang sama.  Hitung besarnya skala okuler dengan rumus di atas.01 x 2/13 0. 1 Skala Okuler = = 0. (misalnya 40 X 10) kemudian cari gambar perbesaran dari skala mikrometer objektif.  Hitung panjang dan lebar sel sebenarnya : .  Setelah fokus didapat.54 µm 13 Cara Kerja : Kalibrasi  Letakkan mikrometer objektif pada meja benda dan pasang mikrometer okuler pada tabung lensa okuler.00154 mm = 1.Misal : jika skala ke 0 mikrometer okuler berhimpit dengan skala ke 0 mikrometer objektif lalu skala ke 13 mikrometer okuler berhimpit dengan skala ke 2 mikrometer objektif maka beberapa 1 skala okuler.  Hitung berapa panjang sel dengan menghitung skala mikrometer okuler.  Cari dengan teliti skala ke berapa antara mikrometer objektif dan okuler yang berhimpit lagi. Tabung lensa okuler dapat diputar dan dicari posisi yang pas.  Jika diperlukan hitung lebar sel dengan cara yang sama. : Cara kalibrasi cara mengukur mikroba Penentuan ukuran mikroba  Lepaskan mikrometer objektif dari meja benda.02 = 0. kemudian selanjutnya himpitkan skala ke nol mikrometer objektif dan okuler.

Satu koloni dihitung 1 koloni.Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan) tidah dihitung. Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah sebagai berikut “ . . penghitungan jumlah bakteri hidup (tidak langsung) a.1 ml = 500 000 000 CFU’s / ml = 5x108 CFU’s / ml = 50 x 106 CFU’s / 1 ml = 50 000 000 CFU’s / 0.Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni. .1.7 µm 2 X 1. Perhitungan mengacu kepada standar atau peraturan yang telah ditentukan. Standard Plate Count (SPC) Koloni yang dipilih untuk dihitung menggunakan cara SPC memiliki syarat khusus berdasarkan statistic untuk memperkecil kesalahan dalam perhitungan. Setelah diinkubasi.1.1 ml koloni = 50 Fp = 1/10 -6 SP = 1 ml Pour plate : = 50 x 106 CFU’s / 0.54 = 7. -6 dengan Spread plate : koloni = 50 Fp = 1/10 -6 SP = 0.1 ml = 50 000 000 CFU’s / 0. koloni yang tumbuh berasal dari suspensi yang diperoleh menggunakan pengenceran bertingkat dari sebuah sampel yang ingin diketahui jumlah bakterinya. Cara menghitung sel relatif / CFU’s per ml CFU’s / ml = jumlah koloni X faktor pengenceran Misal : penanaman dilakukan dari tabung pengenceran 10 metode Spread Plate dan Pour Plate. .Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni.Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni. Berdasarkan hal tersebut digunakan istilah Coloni Forming Units (CFU’s) per ml. Syaratsyaratnya sebagai berikut : . .x skala okuler X hasil kalibrasi y skala okuler X hasil kalibrasi misal : 5 X 1.Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni. jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut.08 µm  Menentukan jumlah mikroorganisme (enumerasi) A. . Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel mikroorganisme karena beberapa mikroorganisme tertentu cenderung membentuk kelompok atau berantai.1 ml = 5x107 CFU’s / ml a.1.54 = 3. Plate Count (hitungan cawan) Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai.

trtgg(10-3) Bila ada 2 cawan.000)/2=b 285 40 7 Dilap. terendah 275 35 5 (27.34 X 104 menjadi 2.500>2 45.000/29.9X104 135 45 5 (13.35 X 104 menjadi 2. missal 2.000/10.500+16. < 30 = TFTC (Too Few To Count). 10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan 4 234 20 5 2.- Pilih cawan yang ditumbuhi koloni dengan jumlah 30-300 koloni.3X105 650 >300 6 TNTC TNTC 195 2X10 TNTC >300 Jumlah koloni yang dilaporkan terdiri dari 2 digit yaitu angka satuan dan angka sepersepuluh yang dikalikan dengan kelipatan 10 (eksponensial).500>2 4 165 45 8 = 1. Bila diperoleh perhitungan < 30 dari semua pengenceran.800)/2 15 dan 20 <30 208 20 2 = 1.000/13. maka jumlah angka yang digunakan adalah rata-rata dari kedua nilai jumlah masingmasing setelah diperhitungkan.500+40.4 X 104.3X104 rata-rata 25 dan 28 <30 (29.000<2 28.500/35.5X10 40.4X104 35.500/35.000<2 (28. missal 2.500+20. masing-masing dari pengenceran rendah dan tinggi yang berurutan dengan jumlah koloni 30-300 dan hasil bagi dari jumlah koloni pengenceran tertinggi dan terendah ≤ 2. Hasil (a+b)/2 = 3.34 X 104.5X103 Semua <30 Bila diperoleh perhitungan > 300 dari semua pengenceran.3X105 Pngc. > 300 = TNTC (Too Numerous To Count) atau TBUD (Terlalu Banyak Untuk Dihitung). 10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan 4 295 40 5 3.3 X 104.000)/2=a 27.500/40.000+30. pembulatan keatas dilakukan pada angka seperseratus yang sama atau lebih besar dari lima. 10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan TNTC TNTC 358 3. Pengc. maka jumlah yang dilaporkan adalah nilai rata-rata.3 X 104. atau 2.500<2 140 35 1 1.trtgg(10-4) TNTC 325 18 3.5X10 Dilap.000/14. 10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan 15 1 0 1. maka hanya dari pengenceran terendah yang dilaporkan.000)/2 = 290 25 5 meskipun 3X104 305>300 305 28 0 - - - - - .3X10 28 dan 5 <30 650 127 10 1. maka hanya dari pengenceran tertinggi yang dilaporkan.000>2 Apabila setiap pengenceran digunakan 2 cawan petri (duplo).500)/2 45. bukan 2. Jika hasil bagi dari pengenceran tertinggi dan terendah > 2 maka jumlah yang dilaporkan adalah dari cawan dengan pengenceran terendah.6X106 Pngc. 10-2 10-3 10-4 SPC Keterangan 175 15 5 (17.

Transek dibuat dengan spidol/marker di bagian bawah cawan petri. Dari 3 pengenceran terakhir diplating (ditanam) ke media NA (Nutrien Agar) atau PCA (Plate Count Agar) sebanyak dua kali tiap pengenceran (duplo). Penghitungan koloni pada cawan sebaiknya dibuat transek atau dibagi-bagi jika koloni yang tumbuh terlalu banyak. dapat digunakan batang L atau glass beads.3 Prosedur perhitungan jumlah bakteri dengan metode Plate Count.1.      Lakukan preparasi suspensi kepada sampel terlebih dahulu (swab. Masukkan sampel ke tabung berisi 9 ml akuades untuk pengenceran pertama. koloni dihitung dengan persyaratan yang telah diuraikan di depan. Jika secara Spread Plate. Setelah tumbuh. Inkubasi pada suhu 30º C selama 1-2 x 24 jam. selanjutnya diencerkan sampai tingkat pengenceran (misalnya sampai 10-8) tertentu. Plating dapat secara Spread Plate atau Pour Plate. Pola . maserasi dan rinse) (jika perlu).Bagan alur persyaratan SPC a.

1 ml dimasukkan pada media LBSS (Lactose Broth Single Stegth) yang berkomposisi sama tapi hanya kadar laktosa setengah dari LBDS yaitu 5 gr. a. memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi dalam waktu 24 jam inkubasi pada 37º C. . peptone (5 gr). maka bakteri ini dapat memfermentasikan laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi oleh berubahnya warna dan gas dalam tabung durham. Ciri-ciri utamanya yaitu bakteri gram negatif. dan jika dipakai 5 tabung maka disebut 5 seri. Untuk sampel 1 ml dan 0. Media pada tabung adalah Lactose Broth yang diberi indikator perubahan pH dan ditambah tabung durham. Penghitungan akan lebih mudah bila memakai Coloni Counter. MPN didasarkan pada metode statistik (teori kemungkinan). Berdasar sifat coliform. Sampel ditumbuhkan pada seri tabung sebanyak 3 atau 5 buah tabung untuk setiap kelompok.2 Most Probable Number (MPN) Pendekatan lain untuk enumerasi bakteri hidup adalah dengan metode MPN. Apabila dipakai 3 tabung maka disebut seri 3. Untuk sampel sebanyak 10 ml ditumbuhkan pada media LBDS (Lactose Broth Double Stegth) yang memiliki komposisi Beef extract (3 gr).2 %) per liternya. tergantung kebutuhan. tidak membentuk spora. Pemberian sampel pada tiap seri tabung berbeda-beda. lactose (10 gr) dan Bromthymol Blue (0.transek dapat dibuat bervariasi. Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri pada air khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri koliform yang merupakan kontaminan utama sumber air minum. Nilai MPN ditentukan dengan kombinasi jumlah tabung positif (asam dan gas) tiap serinya setelah diinkubasi. batang pendek.

 Kocok botol yang berisi air sampel. Atur kesembilan tabung menjadi 3 seri (seperti di gambar). . secara aseptis. secara aseptis. Misal : didapatkan kombinasi jumlah tabung positif : 321 maka jumlah bakteri coliform adalah 150 sel/100 ml.  Inkubasi semua tabung pada suhu 37º C selama 48 jam.  Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing tabung seri ketiga (3 tabung LBSS).  Lihat tabung gas positif (asam dan gas .Cara kerja :  Sediakan 3 tabung berisi LBDS (9 ml tiap tabung) dan 6 tabung berisi LBSS (9 ml tiap tabung) lengkap dengan tabung durham.  Pindahkan suspensi air sample sebanyak 10 ml ke masing-masing tabung seri pertama (3 tabung LBDS). Kombinasi angka tersebut lalu dicocokkan dengan tabel MPN untuk seri 3 sehingga diperoleh jumlah mikroba sebenarnya. harus ada keduanya). secara aseptis. lalu hitung tabung positif untuk tiap seri. Tulis kombinasi tabung positif tiap seri (misal : 3 2 1).  Pindahkan suspensi air sampel sebanyak 1 ml ke masing-masing tabung seri kedua (3 tabung LBSS).

. Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil.2 mm. dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0.1 mm. Penghitungan jumlah bakteri secara keseluruhan (langsung) Penghitungan secara langsung dapat dilakukan secara mikroskopis yaitu dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Sel nakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0. Jumlah cairan yang terdapat antara coverglass dan alat ini mempunyai volume tertentu sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu bujur sangkar juga tertentu. Alat yang digunakan adalah Petroff-Hauser Chamber atau Haemocytometer. Satu kotak besar di tengah.B. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil.

Hasil perhitungan dirata-rata kemudian hasil rataan dimasukkan rumus untuk kotak sedang.04 mm2 Volume kotak sedang : = 0.  Biarkan sejenak sehingga sel diam di tempat (tidak terkena aliran air dari efek kapilaritas).  Lakukan perhitungan secara kasar apakah diperlukan pengenceran atau tidak. .  Hitung sampel.1 mm = 0.5 x 105 Kotak sedang : Jumlah sel/ml = jumlah sel x 2.2 x 0.5 x 105 jadi misalnya diperoleh: 20 sel dalam satu kotak sedang maka jumlah sel keseluruhan : = 20 x (1/4) x 106 = 5 x 106 sel/ml Dengan perhitungan yang sama maka diperoleh rumus untuk kotak kecil : Jumlah sel/ml = jumlah sel x 4 x 106 Cara kerja (digunakan kotak sedang) :  Bersihkan Petroff-Hauser Counting Chamber atau Haemocytometer dengan alkohol 70 % lalu keringkan dengan tissue.004 mm3 = 0. Jika dilakukan pengenceran maka jumlah sel/ml dikalikan faktor pengenceran. Suspensi sel akan menyebar karena daya kapilaritas.2 = 0. Jika dalam satu kotak sedang terdapat sel-sel yang banyak dan bertumpuk maka perhitungan akan tidak akurat dan diperlukan pengenceran dengan perbandingan 1:5 atau 1:10.  Letakkan alat hitung pada meja benda kemudian cari fokusnya pada perbesaran 40x10.000004 cm3 = 4x10-6 ml Sel/ml : = jumlah sel/4x10-6 ml = (jumlah sel/4) x 106 = jumlah sel x (¼) x 106 = jumlah sel x 2.  Letakkan cover glass di atas alat hitung.04 mm2 x 0.004 mm3 Karena 1 ml = 1cm2 Maka : = 0.  Tambahkan ± 50 µl suspensi sel yeast (kira-kira 1 tetes) dengan cara meneteskan pada parit kaca pada alat hitung. paling tidak sebanyak 5 kotak sedang (lebih banyak lebih baik).Luas kotak sedang : =pxl = 0.

Disinfektan yaitu suatu senyawa kimia yang dapat menekan pertumbuhan mikroorganisme pada permukaan benda mati seperti meja. Cara kerja pengujian disinfektan  Pengujian zat disinfektan dengan kertas cakram  Pengujian pengaruh daya oligodinamik c. misalnya kulit. Pengertian dan jenis disinfektan b. pH dan jenis tempat mikroba hidup Beberapa jenis disinfektan diantaranya adalah: Jenis Senyawa fenol : Fenol Cresol Hexaclhorophene Recorcinol Thymol Alkohol : Ethyl Isopropil Senyawa halogen : Senyawa chlorin : Sodium hipochlorite Chloramine Senyawa iodine : Povidone-iodine (betadine) Keterangan Merusak membran sel Mendenaturasi protein Konsentrasi kerja : 2-5% Pelarut lemak Denaturasi dan koagulasi protein Konsentrasi kerja : 50-75% Agen oksidasi Presipitasi protein Klorin bereaksi dengan air membentuk asam hipoklorit yang bersifat bakterisidal . Efisiensi dan efektivitas disinfektan dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu:     Konsentrasi Waktu terpapar Jenis mikroba Kondisi lingkungan: temperatur.DAYA KERJA ANTIMIKROBA DAN OLIGODINAMIK Kompetensi : mahasiswa mengetahui cara kerja pengujian oligodinamik dan zat antimikroba a. Zat antimikroba dapat bersifat membunuh mikroorganisme (microbicidal) atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme (microbiostatic). Pengertian Antibiotik  Cara kerja pengujian antibiotik dengan metode Kirby-Bauer Pengertian dan Jenis Disinfektan Zat antimikroba adalah senyawa yang dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Adapun antiseptik adalah senyawa kimia yang digunakan untuk menekan pertumbuhan mikroorganisme pada jaringan tubuh. lantai dan pisau bedah.

LysoI 5%. .  Inkubasi selama 48 jam pada 37 0C.  Zona hambat yang terbentuk diukur diameternya.  Kertas cakram steril dicelupkan ke dalam larutan disinfektan (alkohol 70%. dan hipoklorit 5%). Pada NA cawan sengan streak kontinyu. Agen aktif permukaan : Sabun Detergen emulsifier Senyawa kationik : Senyawa amonium kuartener benzalconiumclhoride Senyawa anionik : Sodium Tertradecyl Sulphate Asam (H+) Basa (OH-) Pewarna : Crystal Violet Bereaksi dengan gugus SH (sufihidril) pada enzim yang menyebabkan denaturasi. Menciptakan tegangan permukaan yang rendah Merusak membran sel Memindahkan sel secara mekanis Tegangan permukaan yang rendah Daya kerja sama dengan senyawa aktif permukaan Merusak dinding sel dan membran sel Koagulasi protein Memiliki avinitas terhadap asam nukleat Pengujian zat disinfektan dengan kertas cakram Cara kerja :  Inokulasikan E. Setelah diangkat. coli dan Bacillus sp.Logam berat : Senyawa Hg Senyawa Zn Senyawa Cu dll. Tekan dengan pinset supaya kertas cakram benar-benar menempel pada agar.  Kertas cakram diletakkan dipermukaan agar dengan pinset. sisa tetes larutan yang berlebihan pada kertas cakram diulaskan pada dinding wadah karena dikhawatirkan larutan akan meluas di permukaan agar jika larutan terlalu banyak. bandingkan daya kerja berbagai disinfektan. betadin.

Ag dan Pb bersifat racun terhadap sel meskipun hanya dalam kadar rendah.Pengujian pengaruh daya oligodinamik Logam-logam berat seperti Hg. Adapun penamaannya biasanya berdasarkan gugus kimiawinya ataupun mikroorganisma produsernya. Cu. Antibiotik dikelompokkan berdasarkan gugus aktifnya.coli dan Bacillus sp. Daya hambat atau mematikan dari logam dengan konsentrasi yang rendah disebut daya oligodinamik. antimikroba peptida. pada cawan NA dengan streak kontinyu  Letakan koin tembaga dan seng ke dalam cawan dengan pinset  Inkubasi 370C selama 48 jam  Hitung zona hambat yang terbentuk dengan mengukur diameter daerah yang jernih atau tidak ada pertumbuhan Pengertian dan Jenis Antibiotik Antibiotik adalah bahan yang dihasilkan oleh mikroorganisme atau sintetis yang dalam jumlah kecil mampu menekan menghambat atau membunuh mikroorganisme lainnya. Cara Kerja :  Inokulasikan E. misalnya:  ragam antibakteria:  Penicillin dan cephalosporin         Erythromycine Sulfa drugs Trimethoprim dan sulfamethoxazole Polymyxin B Quinolone Tetracycline  Antifungi : Nystatin Azoles . misal antibiotik macrolide. Logam mengalami ionisasi dan ion-ion tersebut bereaksi dengan bagian sulfihidril pada protein sel sehingga menyebabkan denaturasi. Antibiotik memiliki spektrum aktivitas antibiosis yang beragam.

Semakin besar diameternya maka semakin terhambat pertumbuhannya. sehingga diperlukan standar acuan untuk menentukan apakah bakteri itu resisten atau peka terhadap suatu antibiotik.Konsentrasi mikroba uji . Faktor yang mempengaruhi metode Kirby-Bauer : . .  Menghambat replikasi DNA.pH medium.Konsentrasi antibiotik yang terdapat dalam cakram . Sensitivitas suatu bakteri terhadap antibiotik ditentukan oleh diameter zona hambat yang terbentuk. Cara kerja pengujian antibiotik dengan metode Kirby-Bauer :  Celupkan cotton bud (cotton swab) dalam biakan bakteri kemudian tekan kapas ke sisi tabung agar air tiris  Ulaskan pada seluruh permukaan cawan Mueller-Hinton Agar secara merata  Biarkan cawan selama 5 menit  Kertas cakram dicelupkan dalam larutan antibiotik dengan konsentrasi tertentu.Mekanisme kerja antibiotik antara lain :  Menghambat dsintesis dinding sel  Merusak permeabilitas membran sel.Jenis antibiotik.  Menghambat sintesis RNA (proses transkripsi)  Menghambat sintesis protein (proses translasi). Prosedur difusi-kertas cakram-agar yang distandardisasikan (metode KirbyBauer) merupakan cara untuk menentukan sensitivitas antibiotik untuk bakteri. .

Resistent : tahan Intermediate : medium Susceptible : peka . Tabel Penentuan Sensitivitas Antibiotik (diameter zona hambat dalam mm) Cara menginterpretasikan : Ukur diameter zona hambat (zona jernih) Misal didapatkan zona hambat suatu bakteri berdiameter 26 mm untuk Eryhtromycin. Angkat.  Kertas cakram ditekan menggunakan pinset supaya menempel sempurna di permukaan agar. selanjutnya letakkan kertas cakram pada permukaan agar. biarkan sejenak agar tiris. sensitivitas antibiotik. Maka interpretasinya adalah bakteri tersebut peka terhadap antibiotik Eryhtromycin.  Ukur diameter zona hambat (mm) kemudian bandingkan dengan tabel.  Inkubasi pada suhu 37 0C selama 24-48 jam.

sedangkan hasil negatif ditunjukkan warna sekitar koloni tetap biru hitam. Prosedur di bawah ini menunjukkan aktivitas amilase. Aktivitas enzimatis mikroorganisme : a. Degradasi amilum membutuhkan enzim amilase yang akan memecah/menghidrolisis menjadi polisakarida yang lebih pendek (dextrin).coli dan Bacillus sp. Hidrolisis akhir maltosa menghasilkan glukosa terlarut yang dapat ditransport masuk ke dalam sel. terdiri atas polimer glukosa yang bercabang-cabang yang diikat dengan ikatan glikosidik. NA yang tersuspensi pati digunakan sebagai media.AKTIVITAS ENZIMATIS MIKROORGANISME Kompetensi : mahasiswa mengetahui beberapa teknik uji aktivitas enzimatik. Amilum akan bereaksi dengan iodine membentuk warna biru hitam yang terlihat pada media. Amilum akan bereaksi dengan iodine membentuk komplex warna biru hitam yang terlihat pada media.  Inkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC  Setelah selesai inkubasi. Warna biru hitam terjadi jika iodine masuk ke dalam bagian kosong pada amilum yang berbentuk spiral. tetesi cawan dengan lugol’s iodine secukupnya sehingga seluruh permukaan media terkena. Uji aktivitas endoenzim :  Uji oksidase  Uji katalase  Uji Triple Sugar Iron Agar Uji Amilolitik Amilum adalah senyawa yang memiliki berat molekul tinggi. secara streak. Indikator yang dipakai pada uji amilolitik adalah iodine. dan selanjutnya menjadi maltosa.  Hidrolisis zat pati terlihat sebagai zona jernih di sekeliling koloni. Indikator yang dipakai adalah iodine. Uji aktivitas eksoenzim :  Uji amilolitik  Uji lipolitik  Uji proteolitik b. . Cara Kerja :  Inokulasi Nutrient Agar yang mengandung pati (2 g/l) dengan E.

coli pada media Tributyrin Agar dengan indikator neutral red  Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam.Uji Lipolitik Lipid misalnya trigliserida merupakan sumber energi bagi sejumlah mikroorganisma. dan E. sedangkan reaksi negatif ditandai oleh bercak-bercak yang tetap berwarna merah.  Reaksi positif ditandai oleh bercak-bercak kuning disekeliling koloni. mikroba menghasilkan enzim lipase dan esterase yang memecah ikatan ester menghasilkan gliserol dan asam lemak. Terdapat berbagai macam prosedur untuk mengetahui aktivitas lipase diantaranya adalah dengan menggunakan media Trybutirin Agar. Rodhamine Agar dan Spirit Blue Agar. Untuk mendapatkan energi dari lipid. Uji proteolitik Uji proteolitik ditujukan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme menghasilkan enzim protease. Cara Kerja :  Inokulasikan Bacillus sp. Pada prinsipnya metode-metode di atas menggunakan indikator yang mampu mendeteksi keberadaan asam lemak yang terbentuk akibat hidrolisis lemak. Pada praktikum ini protein yang digunakan dalam .

Tidak adanya perubahan warna mengindikasikan bahwa uji yang dilakukan negatif. Mikroorganisme ini menggunakan oksigen.bentuk kasein susu. Proses ini dinamakan peptonisasi atau proteolisis Cara Kerja :  Inokulasikan Bacillus sp. Reagen akan mendonorkan elektron terhadap enzim ini sehingga akan teroksidasi membentuk senyawa yang berwarna biru kehitaman.  Aktivitas proteolitik ditunjukkan oleh terbentuknya zone jernih di sekeliling koloni. Positif tertunda (warna biru muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi) menandakan bahwa bakteri uji memiliki sedikit enzim. Dan E. . Uji Oksidase Enzim oksidase memegang peranan penting dalam transport elektron selama respirasi aerobik. Hidrolisis kasein secara bertahap akan menghasilkan monomernya berupa asam amino. Kemampuan bakteri memproduksi sitokrom oksidase dapat diketahui dari reaksi yang ditimbulkan setelah pemberian reagen oksidase pada koloni bakteri. fakultatif anaerob. Sitokrom oksidase mengkatalisis oksidasi dan reduksi sitokrom oleh molekul oksigen. Reagen yang digunakan adalah tetramethyl-D-phenylenediamine dihydrocloride. Enzim ini merupakan bagian dari kompleks enzim yang berperan dalam proses fosforilasi oksidatif. Enzim oksidase dihasilkan oleh bakteri aerob. sebagai akseptor elektron terakhir selama penguraian karbohidrat untuk menghsilkan energi. coli pada Skim Milk Agar (SMA)  Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. dan mikroaerofilik.

   Superoksida dismutase adalah enzim yang bertanggung jawab untuk penguraian khususnya superoksida pada organisme aerob yang bersifat katalase negatif. Senyawa ini dihasilkan oleh mikroorganisme aerobik. Diatas object glass diberi kertas merang yang sehingga tetesan tersebar pada kertas. fakultatif aerob maupun mikroaerofilik yang menggunakan jalur respirasi aerobik. lalu lihat perubahan yang terjadi Jika warna berubah menjadi biru marun maka hasil uji positif. Senyawa ini dalam jumlah besar akan menyebabkan kematian pada mikroorganisme. 3% H2O2 diteteskan pada Object glass secukupnya. Cara Kerja : Koloni bakteri diambil satu ose secara aseptis dan diinokulasikan pada Object glass. Tetesi dengan reagen. mikroorganisme menghasilkan hidrogen peroksida. Uji Katalase Selama respirasi aerobik (proses fosforilasi oksidatif). berarti bakteri tersebut mampu memproduksi enzim katalase. Hasil uji positif tertunda jika warna biru muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi.    Cara Kerja : Koloni bakteri diambil satu tetes (sebaiknya dari biakan cair) secara aseptis dan diinokulasikan pada Object glass. Jika tidak dihasilkan gelembung gas berarti uji katalase dinyatakan negatif. Dengan menggunakan pipet tetes. sedangkan bila tidak terjadi perubahan maka hasil uji negatif. Amati adanya gelembung untuk hasil positif dan tidak ada gelembung untuk hasil negatif (hati-hati membedakan . bahkan ada yang menghasilkan superoksida yang sangat beracun. Produksi katalase bisa diidentifikasi dengan menanmbahkan reagen H2O2 pada suspensi bakteri. Jika dihasilkan gelembung gas.

Perubahan warna menjadi kuning menandakan asam. Cara kerja : Inokulasikan biakan pada media TSIA dengan cara inokulasi tusuk kemudian dilanjutkan dengan diulaskan lurus tegak pada agar miring (lihat gambar). dan mengandung glukosa dengan konsentrasi yang lebih rendah yaitu 0. Inkubasi pada 37oC selama 24-48 jam. Perbedaan ini didasarkan pada pola fermentasi karbohidrat dan produksi H2S pada tabung reaksi. = slant merah (alkali) sedangkan butt kuning (asam) dengan atau tanpa produksi gas  hanya terjadi fermentasi glukosa. Selain itu ditambahkan FeSO4 untuk mendeteksi adanya gas H2S. sedangkan pepton yang ada digunakan untuk sumber energi dalam keadaan aerob atau anaerob sehingga meningkatkan pH karena produksi amonia meningkat sebagai hasil samping metabolisme protein.antara gelembung yang muncul dari sel dengan kumpulan sel yang mengambang akibat ditambahi reagen).1%. Uji Triple Sugar Iron Agar TSIA adalah uji yang dirancang untuk membedakan beberapa jenis bakteri yang termasuk kelompok Enterobacteriaceae. media TSIA mengandung laktosa dan sukrosa dengan konsentrasi 1%. Media mengandung glukosa yang sangat sedikit (lebih sedikit dibanding laktosa dan sukrosa) sehingga jumlah asam pada permukaan (slant) hilang secara . Warna media mula-mula adalah merah-orange. Jika kemerahan lebih pekat pada slant maka terjadi degradasi aerobik peptone. sedangkan warna merah pekat tampak di semua media maka interpretasinya adalah degradasi peptone secara aerob maupun anaerob. sedangkan fermentasi laktosa dan sukrosa tidak terjadi. Untuk mengamati fermentasi karbohidrat.    = slant dan butt merah (alkali) atau tidak terjadi perubahan warna  tidak terjadi fermentasi karbohidrat. sedangkan warna menjadi lebih merah menendakan media menjadi basa. Sel lebih memilih untuk mendegradasi glukosa terlebih dahulu karena glukosa adalah monosakarida yang dapat langsung massuk ke dalam jalur metabolisme (glikolisis). yang bersifat gram negatif dan memfermentasikan glukosa membentuk asam sehingga dapat dibedakan dengan bakteri gram negatif intestinal lain. Konsentrasi ini akan berpengaruh terhadap penggunaan karbohidrat dan keadaan asam yang terbentuk. Indikator pH (Phenol Red) ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan pH akibat fermentasi karbohidrat. Interpretasikan hasil dengan melihat keterangan dibawah ini.

H2S ini merupakan hasil dari metabolisme protein media pecah atau terangkat  timbul gas sebagai hasil samping fermentasi . = butt berwarna kehitaman  adanya H2S yang bereaksi dengan senyawa besi FeSO4 pada media menghasilkan FeS yang berwarna kehitam-hitaman. laktosa dan atau sukrosa karena laktosa dan sukrosa memiliki konsentrasi yang lebih tinggi sehingga dapat dimanfaatkan untuk substrat fermentasi lanjutan (jika glukosa habis) menghasilkan asam yang ditandai warna kuning setelah 24 jam. = slant dan butt kuning (asam) dengan atau tidak adanya gas  telah terjadi fermentasi glukosa. karena pada mulanya bagian slant telah menjadi kuning tapi dalam waktu lebih dari 24 jam sel akan kehabisan glukosa dan memilih untuk memanfaatkan protein sehingga media menjadi merah.cepat menjadi basa.