I.

JUDUL PERCOBAAN

: Identifikasi Mikroba

II. TUJUAN PERCOBAAN Mengamati morfologi dan fisiologi mikroba Membuat pewarnaan bakteri dan menerangkan reaksi kimia yang terlibat serta perbedaan reaksi yang terjadi

III. TEORI 3.1 Zat Warna Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme ataupun latar

belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan zat warna

memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan asam. Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif. Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna basa ialah bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian

yang berperan memberikan zat warna mempunyai muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan didinding sel, membran sel dan sitoplasma. Sewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas terlihat. Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif, pada metode ini mikroba dicampur dengan tinta cina atau nigrosin, kemudian digesekkan diatas kaca objek. Zat warna tidak akan mewarnai bakteri, akan tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri. Dengan mikroskop mikroba akan terlihat tidak berwarna dengan latar belakang hitam. Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh seorang ahli bioteknologi dari Denmark yang bernama Christian Gram pada tahun 1884. Ia menemukan metode pewarnaan secara tidak sengaja. dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negatif, yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. Pewarnaan itu merupakan tahap penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri (Wahyuni, 2012).

3.2 Pewarnaan Bakteri Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya (Rahman, 2010).

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap, yaitu : a. Pemberian cat warna utama (cairan Kristal violet) berwarna ungu. b. Pengintensifan cat warna dengan penambahan larutan mordan. c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alcohol asam. d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin (Wahyuni, 2012).

3.3 Faktor yang Mempengaruhi Pewarnaan Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu : a. Fiksasi b. Peluntur warna c. Substrat d. Intensifikasi pewarnaan e. Penggunaan zat warna penutup Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Rahman, 2010). Fiksasi dapat dilakukan dengan cara melewatkan preparat diatas api atau merendamnya dengan metanol. Fiksasi digunakan untuk : 1. Mengamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah diwarnai. 2. Melekatkan bakteri pada glass objek. 3. Mematikan bakteri (Wahyuni, 2012).

3.4 Teknik Pewarnaan Teknik pewarnaan pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu : a. Pengecatan sederhana b. Pengecatan negatif c. Pengecatan diferensial d. Pengecatan struktural Pemberian warna pada bakteri atau jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang

menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul (Rahman, 2010).

3.5 Aplikasi Pewarnaan Bakteri Uji Fisiologis Bakteri dengan Uji Biokimia Uji fisiologis biasanya identik dengan uji biokimia. Uji-uji biokimia yang biasanya dipakai dalam kegiatan identifikasi bakteri atau mikroorganisme yaitu antara lan uji koagulase, uji katalase, uji nitrit, hidrolisis gelatin, uji hidrogen sulfida (H2S) dan lain-lain. Beberapa uji Biokimia yang digunakan untuk identifikasi bakteri antara lain: a. Indol Media ini biasanya digunakan dalam identifikasi yang cepat. Hasil uji indol yang diperoleh negatif karena tidak terbentuk lapisan (cincin) berwarna merah muda pada permukaan biakan. b. MR-VP 1. Uji MR dengan hasil positif, terjadi perubahan warna menjadi merah setelah ditambahkan methyl red. Artinya, bakteri ini mengahasilkan asam campuran (metilen glikon) dari proses fermentasi glukosa yang terkandung dalam medium MR-VP. 2. Uji VP dengan hasil negatif, karena tidak terbentuk warna merah pada medium setelah ditambahkan -napthol dan KOH, artinya hasil akhir fermentasi bakteri ini bukan asetil metil karbinol (asetolin). c. Uji katalase merupakan suatu pengujian terhadap bakteri tertentu untuk mengetahui apakah bakteri tersebut merupakan bakteri aerob, anaerob fakultatif, atau anaerob obligat. (Sandiantono, 2012)

IV. METODOLOGI PERCOBAAN 4.1 Bahan dan Fungsi 1. Air Rendaman Buah Naga Fungsi : sebagai sampel yang akan diwarnai. 2. Air Kolam Pertanian Fungsi : sebagai sampel yang akan diamati morfologinya. 3. Kristal violet Fungsi : sebagai bahan pewarna primer. 4. Larutan iodin Fungsi : untuk memperkuat ikatan pewarna primer. 5. Aseton Alkohol Fungsi : sebagai zat pencuci larutan kristal violet. 6. Safranin Fungsi : sebagai larutan pewarna yang tetap/zat pewarna

4.2 Peralatan dan Fungsi 1. Kawat Inokulasi Fungsi : untuk mengambil mikroba dari media cair 2. Kaca Benda Fungsi : untuk tempat meletakkan mikroba bagi pengamatan dibawah mikroskop 3. Tissue Fungsi : untuk mengeringkan kaca benda dari cairan yang tersisa 4. Bunsen Fungsi : sebagai sumber api untuk melakukan fiksasi 5. Mikroskop Fungsi : untuk mengamati morfologi bakteri dengan pembesaran yang sesuai 6. Penjepit Tabung Fungsi : untuk menjepit kaca benda pada proses fiksasi dan pencucian 7. Pipet Tetes Fungsi : untuk mengambil bahan-bahan pewarna pada saat proses pewarnaan

4.3 Prosedur Percobaan 4.3.1 Prosedur Pengamatan Mikroba Lingkungan 1. Mikroskop diatur sedimikian rupa sehingga dapat digunakan dengan jelas dan baik, antara lain dengan membersihkan kaca dan cermin dengan tisu, serta mengatur penyinaran yang baik. 2. Kaca objek dibasahi dengan aquadest dan dilap dengan tisu hingga bersih. 3. Dengan memakai pipet tetes atau kawat inokulasi, sampel air kolam pertanian ditetes atau digoreskan pada kaca objek. 4. Preparat diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran yang sesuai dan diatur sejelas mungkin. 5. Digambarkan hasilnya. Hasil yang terlihat dibandingkan dengan referensi agar mikroba tersebut dapat diidentifikasi.

4.3.2 Prosedur Pewarnaan Gram 1. Mikroba dibiakkan selama 24 dan 48 jam dalam rendaman air buah naga. 2. Preparat diambil dengan menggunakan kawat inokulasi yang telah di serilkan terlebih dahulu dengan lilin. 3. Bakteri lalu digoreskan ke atas kaca objek lalu dibiarkan kering diudara terbuka kemudian kaja objek di fiksasi diatas api lilin. 4. Diamati di bawah mikroskop. 5. Digambar hasil yang didapat. 6. Preparat dibasahi dengan kristal violet dibiarkan selama 30-60 detik lalu dimiringkan untuk membuang cairan yang berlebih. 7. Kemudian preparat dibasahi dengan iodin dibiarkan selama 30-60 detik lalu preparat dimiringkan untuk membuang cairan yang berlebih. 8. Lalu dicuci dengan air dilanjutkan dengan alkohol-aseton dibiarkan selama 30-60 detik. Kemudian dicuci lagi dengan air. 9. Kemudian preparat dicuci dengan pewarna lengkap safranin dan

dibiarkan selama 30-60 detik. Kemudian dicuci lagi dengan air. 10. Preparat dikeringkan dengan tissue lalu diamati dengan mikroskop dan hasilnya digambar.

4.4 Flowchart Percobaan 4.4.1 Flowchart Pengamatan Mikroba Lingkungan

Mulai Mikroskop Disiapkan Dengan Penyinaran Yang baik Kaca Benda dan Penutup Dibersihkan Sampel Diambil Menggunakan Pipet Tetes Diteteskan ke Kaca Benda Diamati Menggunakan Mikroskop Hasil Dibandingkan Dengan Referensi

Selesai Gambar 4.1 Flowchart Pengamatan Mikroba Lingkungan

4.4.2 Flowchart Pewarnaan Gram Mulai

Mikroba dibiakkan selama 24 dan 48 jam dalam rendaman buah naga dan ditambahkan 3 sendok gula

Preparat diambil dengan menggunakan kawat inokulasi yang telah difiksasi terlebih dahulu dengan lilin

Diamati di bawah mikroskop dan digambar hasilnya

Preparat dibasahi dengan kristal violet dan dibiarkan selama 30-60 detik

Lalu dimiringkan untuk membuang cairan yang bersisa Dicuci dengan air

Preparat dibasahi dengan iodin dan dibiarkan selama 30-60 detik.

Lalu dimiringkan untuk membuang cairan yang bersisa

Dicuci dengan air

Preparat dicuci dengan alkohol-aseton dan dibiarkan selama 30-60 detik

Dicuci dengan air

Preparat dicuci dengan pewarna lengkap safranin dan dibiarkan selama 30-60 detik

Lalu dimiringkan untuk membuang cairan yang bersisa Dicuci dengan air Preparat dikeringkan dengan tisu

Diamati dengan mikroskop

Apakah tampak warna ungu ? Ya Tidak

Bakteri gram positif

Bakteri gram negatif

Hasilnya digambar

Selesai

Gambar 4.2 Flowchart Pewarnaan Gram

V. HASIL DAN PEMBAHASAN 5.1 Hasil Tabel 5.1 Pewarnaan Gram Waktu Sampel Peren daman Sebelum Pewarnaan Gambar Morfologi Setelah Pewarnaan Bakteri Nama Bakteri Keterangan

Rhodospiri Buah Naga 24 jam $$$$ llum Spiral rubrum Bakteri gram negatif (-)

Buah Naga

48 jam

Rhodospiri Spiral llum rubrum

Bakteri gram negatif (-)

Tabel 5.2 Pengamatan Mikroba Lingkungan Sampel Gambar Bakteri Morfologi Bakteri Nama Bakteri

Air Kolam Pertanian

Coccus

Amoeba

5.2 Pembahasan 5.2.1 Air Rendaman Buah Naga Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan maka didapatkan data pada tabel 5.1 Sampel pada percobaan ini adalah air rendaman buah naga 24 dan 48 jam, bakteri yang terlihat pada pengamatan di bawah mikroskop adalah Rhospirillum rubrum yang merupakan bakteri gram negatif yang berbentuk spiral. Taksonomi dari Rhodospirillum rubrum adalah: a. Kingdom b. Filum c. Kelas d. Ordo e. Famili f. Genus : Bacteria : Proteobacteria : Alphaproteobacteria : Rhodospirillales : Rhodospirillaceae : Rhodospirillum

Gambar 5.1 Rhodospirillum rubrum g. Spesies : Rhodospirillum rubrum (Amirin, 2011) (Amirin, 2011) Rhodospirillum rubrum merupakan bakteri nitrogen, yaitu, dapat mengekspresikan dan mengatur nitrogenase , sebuah kompleks protein yang dapat mengkatalisis konversi atmosfer dinitrogen menjadi amonia.

Rhodospirillum adalah genus bakteri fotosintetik dari Rhodospirillaceae keluarga. sel-sel mereka umumnya berbentuk spiral, polarly flagellated dan mengandung vesikuler, pipih membran fotosintesis ditumpuk. Mereka berkisar dari tiga sampai sepuluh mikrometer panjang dan satu-setengah sampai satu setengah mikrometer satu di lebar. R. rubrum adalah bakteri gram negatif yang mengandung asam lemak tak jenuh dan jenuh. Bakteri ini telah digunakan dalam banyak penelitian, misalnya, untuk mempelajari radiasi resistensi bakteri berpigmen dan fiksasi nitrogen. Berdasarkan teori yang ada, bakteri R. rubrum dapat tumbuh di bawah berbagai jenis kondisi termasuk lingkungan aerobik atau anaerobik. (Amirin, 2011). Pada percobaan yang dilakukan bakteri R.rubrum terdapat dalam sampel dan setelah diwarnai merupakan gram negatif sehingga sesuai dengan teori yang ada.

5.2.2

Air Kolam Pertanian Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan maka didapatkan data pada tabel 5.1 Sampel pada percobaan ini adalah air kolam pertanian, bakteri yang terlihat pada pengamatan di bawah mikroskop adalah Amoeba yang merupakan bakteri gram negatif yang berbentuk coccus. Klasifikasi Ilmiah : Kingdom: Filum Kelas Ordo Gambar 5.2 Amoeba (Adam, 2012) Family Genus : : : : : Protista Tubulinea Rhizopoda Tubulinida Amoebidae Amoeba

Amoeba adalah makhluk mikroskopis yang terdiri dari satu sel (unicellular). Seperti sebagian besar sel tumbuhan dan sel hewan, sel amoeba juga memiliki sitoplasma (cytoplasm), nukleus (nucleus), membran sel (cell membrane) dan ectoplasm dan endoplasma (bagian dari sitoplasma). Menurut klasifikasi Protozoa berdasarkan alat geraknya, amoeba termasuk ke dalam kelas Rhizopoda atau Sarcodina (protozoa yang bergerak menggunakan

Pseudopodia). Hidup bebas, di tanah atau tempat berair yang mengandung zat organik (Adam, 2012). Pada percobaan yang dilakukan bakteri Amoeba terdapat dalam sampel dan sesuai dengan teori yang ada.

VI. Kesimpulan Dan Saran 6.1 Kesimpulan 1. Bakteri yang terkandung pada rendaman buah naga selama 24 dan 48 jam adalah bakteri Rhodospirillum rubrum. 2. Bakteri pada rendaman buah naga selama 24 dan 48 jam merupakan golongan bakteri gram negatif. 3. Bakteri yang terdapat pada air kolam pertanian adalah bakteri Amoeba. 4. Morfologi bakteri Rhodospirillum rubrum adalah spiral. 5. Morfologi bakteri Amoeba adalah coccus.

6.2 Saran 1. Disarankan sebelum pengamatan dengan mikroskop preparat benar-benar dalam keadaan kering atau tidak ada cairan berlebih. 2. Pada saat penggoresan sumber mikroba pada kaca objek menggunakan kawat inokulasi, sebaiknya kawat dilewatkan diatas nyala api terlebih dahulu agar lebih steril. 3. Disarankan agar pengamatan dengan mikroskop dilakukan dua kali untuk menghindari kesalahan identifikasi mikroba. 4. Disarankan untuk lebih memperhatikan kesterilan alat yang digunakan, agar diperoleh identifikasi yang lebih akurat. 5. Disarankan pada saat penggoresan pada kaca objek, jangan terlalu banyak meletakkan sampel, agar mudah dalam pengamatan dengan mikroskop.

DAFTAR PUSTAKA
Adam, Chaidir. 2012. Amoeba-Microbiology. biologypunk.blogspot.com. Diakses pada tanggal 16 Maret 2013. Amirin, Roni. 2011. Rhodospirillum rubrum. roniamirin.blogspot.com. Diakses pada tanggal 16 Maret 2013. Rahman, Fatma Abdur. 2010. Pewarnaan Gram. Malang: Universitas

Muhammadiyah Malang. Sandiatono. 2012. Karakterisasi dan Identifikasi Mikroba. www.id.shvoong.com. Diakses pada 16 Maret 2013. Wahyuni, Ita Tri. 2012. Laporan Mikrobiologi Pewarnaan. Samarinda: Universitas Mulawarman.

LAMPIRAN A FOTO SAMPEL

LA.1 Foto Sampel Mikroba Aquatik Air Kolam Pertanian

Gambar A.1 Pengambilan Sampel Mikroba lingkungan

LA.2 Air Rendaman Buah Naga 24 Jam

Gambar A.2 Air Rendaman Buah Naga 24 jam

LA.3 Air Rendaman Buah Naga 48 Jam

Gambar A.3 Air Rendaman Buah Naga 48 jam

LA.4 Air Kolam Pertanian

Gambar A.4 Air Kolam Pertanian