KULTUR IN VITRO ANGGREK

Oleh : Nama NIM Kelompok Rombongan Asisten : Pety Wulandari : B1J010121 :2 :I : Asna H.

LAPORAN PRAKTIKUM ORKHIDOLOGI

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2013

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Kegiatan kultur in vitro merupakan kelanjutan dari perbanyakan cara konvensional. Teknik in vitro ini bertujuan agar perbanyakan generatif dan vegetatif dilakukan dengan cepat dan efisien. Terdapat beberapa cara pelaksanaan kultur in vitro, tergantung bahan tanam dan media yang digunakan. Bahan tanaman dipilih dari biji dan mata tunas. Buah atau biji hasil persilangan disemai dengan cara teknik kultur biji. Untuk mendapatkan persediaan bibit secara cepat dan missal, maka digunakan metode kultur mata tunas. Metode itu menghasilkan anggrek dengan pertumbuhan seragam dan mempunyai sifat genetic serupa induknya. Dengan menumbuhkan satu jaringan meristem saja berpotensi menghasilkan 4 juta calon bibit per tahun. Itu sama artinya dengan satu tahun lebih cepat dibandingkan perbanyakan bibit lewat biji (TRUBUS, 2005). Menurut Hendaryono et.al. (1994), kegunaan utama dari kultur jaringan adalah untuk mendapatkan tanaman baru dalam jumlah banyak dan dalam waktu yang relatif singkat, yang mempunyai sifat fisiologi dan morfologi sama persis dengan tanaman induknya. Teknik kultur jaringan diharapkan memperoleh tanaman baru yang bersifat unggul. Kultur in vitro dikelompokkan menjadi tiga yaitu meristem culture, organ culture, serta sel yang mempunyai tipe khusus. Teknik kultur in vitro akan berhasil dengan baik apabila syarat-syarat yang diperlukan terpenuhi. Syarat-syarat tersebut meliputi pemilihan eksplan sebagai bahan dasar untuk pembentukan kalus, penggunaan medium yang cocok, keadaan yang aseptik dan pengaturan udara yang baik terutama untuk kultur cair. Prinsipnya semua jenis sel dapat ditumbuhkan, tetapi sebaiknya dipilih bagian tanaman yang masih muda dan mudah tumbuh yaitu bagian meristem, seperti : daun muda, ujung akar, ujung batang, keeping biji dan sebagainya. Bila menggunakan bagian embrio bagian biji-biji yang lain sebagai eksplan, yang perlu diperhatikan adalah kemasakan embrio, waktu imbibisi, temperature, dan dormansi (Abdullah, 2009). Menurut Sagawa (1976) beberapa keuntungan dapat diperoleh dengan menggunakan kultur in vitro tersebut antara lain merupakan perbanyakan yang

cepat dan efisien, mempermudah seleksi mutan, menghindari sterilisasi yang menghambat program hibridisasi, menghasilhan tanaman bebas pathogen dan sebagai pelestarian plasma nutfah. Dalam penerapannya, bahan yang digunakan sebagai eksplan adalah : 1. 2. Generatif (biji) dikenal dengan seed culture. Vegetatif (jaringan) dikenal dengan tissue culture. Perbanyakan generatif dilakukan dengan cara menyemai biji anggrek yang dihasilkan dari penyerbukan. Anggrek membutuhkan waktu 4-6 bulan untuk mematangkan buah secara sempurna. Buah anggrek yang sudah matang berwarna hijau kekuningan. Media yang dapat digunakan untuk menanam biji anggrek adalah knudson C (AgroMedia, 2006).

B. Tujuan Tujuan dari praktikum Kultur In Vitro Anggrek adalah dapat : 1. Mengetahui tahapan subkultur 2. Menumbuhkan biji-biji anggrek hasil penyilangan. 3. Menyeterilkan biji-biji anggrek yang akan ditanam.

II. MATERI DAN METODE

A. Materi Alat yang digunakan pada praktikum kultur in vitro anggrek adalah pembakar spirtus, scalpel, pinset, kertas saring, aluminium foil, cawan petri, botol kultur dan wrapper. Sedangkan, bahan yang digunakan pada praktikum kultur in vitro anggrek adalah eksplan anggrek , HgCl 0,1 %, alkohol 70%, alkihol 96 % dan media VW (Vacin-Went).

B. Metode 1. Kultur Biji (Seed Culture) a. Biji anggrek distrerilisasi terlebih dahulu dengan cara biji dimasukkan kedalam larutan HgCl 0.1% dan digojlok selama 10 menit, lalu larutan dibuang dan diganti dengan Alkohol 70% dan digojlok selama 5 menit. Lalu biji dibilas dengan menggunakan aquades selama 5 menit dengan pengulangan sebanyak tiga kali. Semua kegiatan sterilisasi dilakukan didalam Laminar Air Flow cabinet. b. Memotong biji anggrek yang sudah steril dibelah menjadi dua secara membujur dengan menggunakan scalpel steril. c. Mengambil biji anggrek dengan menggunakan pinset steril, kemudian diletakkan pada permukaan media secara hati-hati. d. Menutup kembali botol yang telah ditaburi biji-biji anggrek dan diletakkan dalam rak inkubasi dengan mengatur suhu ruangan serta pencahayaan yang dapat merangsang perkecambahan biji anggrek. e. Diamati selama 2 minggu lalu hasilnya dicatat. 2. Kultur Organ 1. LAF disterilisasi dengan menggunakan alkohol dengan cara disemprot dan di lap. 2. Lampu spirtus dinyalakan, serta alat dan bahan di tata di LAF agar memudahkan kerja. 3. Plentet anggrek diambil untuk disubkultur dari media dan diletakkan di dalam cawan petri yang berisi kertas saring.

4. Alat yang digunakan untuk menanam disterilisasi dengan cara dicelupkan dalam alkohol lalu di flaming dan ditiriskan. 5. Ambil biji-biji anggrek menggunakan jarum ose steril, kemudian letakkan biji-biji tersebut di atas permukaan media agar secara hatihati. 6. Ambil sedikit demi sedikit biji-biji anggrek dan taburkan secara merata di atas media yang telah disiapkan. 7. Tutup kembali botol-botol yang telah ditaburi biji-biji anggrek dan letakkan dalam rak inkubasi dengan mengatur suhu ruangan serta pencahayaan yang dapat merangsang perkecambahan biji anggrek. 8. Bila biji-biji telah lepas setelah sterilisasi selesai dan di cuci tambahkan sedikit akuades steril untuk mempermudah dalam penaburan biji tersebut. Disini penaburan biji-biji menggunakan pipet yang telah disterilkan. 9. Setelah beberapa minggu biji-biji tersebut akan tumbuh menjadi protocorm. Selanjutnya biji akan bertunas, berakar, kemudian menjadi anak tanaman anggrek (seedling).

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil 1. Kultur biji (seed culture) Dendrobium sp. 2. Kultur organ Phaleonopsis sp. Biji anggrek tidak menampakkan perubahan selama 2 minggu. Organ tidak mengalami pertumbuhan dan terdapat kontaminan didalam botol media.

B. C. D.

B. Pembahasan Praktikum kultur in vitro dilakukan dua macam kultur yaitu kultur biji dan kultur jaringan, serta dilakukan subkultur. Pada kultur biji digunakan anggrek Dendrobium sp. yang ditanam bijinya kedalam media kultur, dan setelah diamati 2 minggu tidak terjadi perubahan pada biji. Kultur organ digunakan anggrek Phaleonopsis sp. yang bagian akar, daun dan batangnya dipotong. Kultur organ ini tidak mengalami pertumbuhan dan terdapat mikroba kontaminan, hal ini dapat disebabkan karena pada saat melaksanakan kultur suasana ruangan tidak aseptik. Kultur biji secara in vitro merupakan metode yang efektif untuk menghasilkan plantlet anggrek dalam jumlah banyak. Anggrek menghasilkan biji yang berlimpah dalam tiap kapsul buahnya. Beberapa studi dilaporkan bahwa satu kapsul buah dapat menghasilkan 4 juta biji. Biji anggrek dalam jumlah banyak akan berkecambah pada kondisi in vitro jika dikulturkan pada media. Berdasarkan metode ini, perbanyakan biji anggrek akan menghasilkan jumlah

tanaman yang banyak. Respon setiap jenis anggrek terhadap setiap jenis media tumbuh dapat berbeda (Widiyatmanto, 2012) Kultur jaringan merupakan suatu teknik untuk mengisolasi bagian tanaman (eksplan) seperti protoplasma, sel, jaringan dan organ, kemudian menumbuhkannya pada media buatan dalam kondisi aseptik. Teknik ini akan membuka peluang untuk memperbanyak tanaman anggrek dan memperoleh bibit anggrek yang bebas hama serta penyakit yang berkualitas baik. Prinsip dalam teknik menanam eksplan dalam botol adalah menanam eksplan dengan kondisi steril. Karenanya setiap menbuka botol kultur, mulut botol harus digarang di atas api. Benda-benda yang dimasukan ke dalam LAF atau enkas harus disemprot dengan alkohol, termasuk tangan penanam. Eksplan diberi label dan diinkubasi selama 3 bulan dan dilakukan pengamatan (Sandra, 2003). Hasil praktikum menunjukan bahwa kultur biji pada Phalaenopsis sp., terjadi kontaminasi yang berupa browning dan jamur. Browning dan jamur adalah kontaminasi yang terjadi karena kekurang sterilnya praktikan dan kesalahan dalam pemotongan sehingga mengakibatkan luka. Kultur jaringan lebih cepat menghasilkan anakan yang banyak dalam waktu yang singkat sedangkan pada kultur biji lama. Hal ini disebabkan karena biji anggrek tidak memiliki cadangan makanan oleh karena itu untuk mengalami perkecambahan dibutuhkan waktu yang lama. Sedangkan subkultur dilakukan untuk menjaga tanaman agar tetap hidup dan menjaga agar makanan yang dibutuhkan oleh tanaman tetap ada. Sterilisasi biji anggrek digunakan larutan HgCl 0.1% yang berfungsi sebagai pembunuh mikroba yang terdapat pada kulit buah, lalu dimasukkan kedalam alkohol 70% selama 5 menit sebanyak tiga kali, larutan ini berfungsi sebagai penghilang larutan HgCl yang melekat pada kulit buah. Sedangkan aquades berfungsi sebagai pembilas yaitu menghilangkan alkohol yang menempel. Anggrek adalah salah satu kelompok tanaman yang unik, sangat estetika, serta telah menjadi salah satu komoditas ekspor yang penting, seperti produksi bunga anggrek dan dalam

Dendrobium yang digunakan untuk

pengobatan tradisional Cina. Dendrobium dapat dikultur dengan menggunakan

kultur jaringan oleh "protocorm-seperti tubuh", tetapi pertumbuhan sangat lambat, dalam kultur jaringan anggrek, beberapa efek TDZ telah dilaporkan, seperti

peningkatan protocorm, tingkat proliferasi, diinduksi tubuh protocorm-seperti, ditingkatkan inisiasi tunas adventif. Konsentrasi 0,05-0,1 uM Thidiazuron lebih aktif dibandingkan 4-10 uM BA (Demasabu, et al., 1998). Auksin sintetis (NAA, IBA dan 2,4-D) pada umumnya menyebabkan pembentukan akar sedangkan sitokinin (BA dan TDZ) sering digunakan untuk merangsang pertumbuhan dan perkembangan. Konsentrasi yang lebih tinggi (1 - 10 mg / l), dapat menginduksi pembentukan tunas adventif. Jaringan tanaman budaya tertentu yang cocok untuk membandingkan pengaruh TDZ dan BA pada tanaman yang tumbuh dan berkembang biak perlahan-lahan, seperti anggrek (Rizky, 2010). Tanaman anggrek dapat dibiakkan secara vegetatif dan generatif. Secara generatif anggrek tersebut berasal dari biji dan dapat tumbuh jika bersimbiosis dengan mikoriza, hal tersebut disebabkan biji anggrek hanya mengandung embrio dan testa (pelindung embrio) tanpa cadangan makanan atau endosperm yang menyebabkan biji anggrek sulit berkecambah Salah satu alternatifnya mengatasi hal tersebut adalah melalui teknik kultur jaringan. Kultur jaringan merupakan suatu teknik untuk mengisolasi bagian tanaman (eksplan) seperti protoplasma, sel, jaringan dan organ, kemudian menumbuhkannya pada media buatan dalam kondisi aseptik. Kultur biji yaitu mengisolasi biji steril ke dalam media VW steril untuk menghasilkan tanaman baru yang viable. Kultur Jaringan yaitu mengisolasi bagian tanaman seperti daun, batang, akar yang masih muda ke dalam media baru yang steril. Sedangkan sbkultur yaitu megisolasi bagian tanaman hasil kultur kedalam media baru yang steril (Silalahi et al., 2008). Embriogenesis somatik atau embriogenesis aseksual adalah proses dimana sel-sel soma berkembang menjadi embrio melalui tahap-tahap morfologi yang khas tanpa melalui fusi gamet. Embrio somatik yang berasal dari kultur sel, jaringan, atau organ dapat terbentuk secara langsung dan tidak langsung. Embrio somatik yang terbentuk secara langsung meliputi pembentukan embrio dari sel tunggal atau kelompok sel yang menyusun jaringan eksplan tanpa melalui pembentukan kalus, sedangkan embrio yang terbentuk secara tidak langsung adalah pembentukan embrio melalui fase kalus. Keberhasilan embriogenesis

melalui kultur

in vitro dipengaruhi beberapa faktor. Faktor-faktor dimaksud

adalah (1) genotip tanaman donor, (2) kondisi fisiologis tanaman donor, (3) jenis medium dan kondisi fisik medium, (4) lingkungan kultur, dan (5) Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) (Utami et al., 2007). Menurut Parnata (2005), semua bagian tanaman biasanya digunakan untuk eksplan, namun tidak semua jaringan tanaman itu mudah ditumbuhkan. Bagian tanaman yang baiknya digunakan adalah : 1. Bagian tanaman yang sedang mengalami pertumbuhan pesat atau sebagai pusat pertumbuhan (bagian meristem, pucuk tanaman, daun muda, tunas muda dan bagian buku tanaman anggrek). 2. Ekspan yang digunakan berukuran besar sekitar 4-10 cm. yang digunakan steril, terbebas dari kuman-kuman dan

3. Eksplan

mikroorganisme penyebab penyakit. Media kultur pada praktikum kali ini ditambahkan hormon IAA sebanyak 1 ml dan BAP sebanyak 1ml, ada pula penambahan pada medianya berupa arang aktif, air kelapa dan kentang. Penambahan air kelapa dimaksudkan karena air kelapa sebagai cadangan makanan yang mengandung vitamin dan zat tumbuh, sehingga dapat menstimulir perkecambahan. Air kelapa mengandung zat atau bahan seperti; vitamin, asam amino, asam nukleat fosfor, dan zat tumbuh auksin dan asam giberelat, yang berfungsi sebagai penstimulir dalam proliferasi jaringan, memperlancar metabolisme dan respirasi (Suryanto, 2009). Untari, et al., (2002) menyatakan media dasar yang cocok digunakan untuk kultur jaringan tanaman anggrek hitam adalah media Vacin-Went (VW) yang telah dimodifikasi dengan penambahan gula pasir, air kelapa, dan agar. Demasabu, et al., (1998) menyatakan bahwa penambahan air kelapa pada anggrek Vanda meningkatkan jumlah tunas dan berat bibit. Lebih lanjut lagi Widiastoety dan Syafril (19934menemukan bahwa pemberian air kelapa 150 ml/l ditambah sukrosa 20 g/l dalam media kultur memberikan hasil yang baik terhadap protocorm like bodies (plbs) anggrek Dendrobium. Media tumbuh merupakan salah satu faktor utama penentu keberhasilan dalam kultur biji anggrek secara in vitro. Berbagai komposisi media tumbuh telah diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman

yang dikulturkan. Media tumbuh yang biasa digunakan untuk perkecambahan biji anggrek adalah media Vacin and Went (VW), Knudson C (KC), dan Murashige dan Skoog (MS) yang garamgaram mineralnya dikurangi menjadi setengahnya atau penuh, terdapat beberapa fase pertumbuhan dan perkembangan biji anggrek yakni fase 0 (biji tidak berkecambah), fase 1 (protokorm), fase 2 (protokorm dengan primordia daun), fase 3 (protokorm dengan daun dan rhizoid), fase 4 (protokorm dengan beberapa daun dan rhizoids), dan fase 5 (plantlets). Pertumbuhan dan perkembangan biji sampai menjadi plantlet ini berlangsung kurang lebih 3 bulan. Kultur biji secara in vitro merupakan metode yang efektif untuk menghasilkan plantlet anggrek dalam jumlah banyak. Anggrek

menghasilkan biji yang berlimpah dalam tiap kapsul buahnya. Pada beberapa studi dilaporkan bahwa satu kapsul buah dapat menghasilkan 4 juta biji (Widiyatmanto, 2012). Media yang digunakan untuk kultur adalah media Vacin dan Went (VW), formula dari media VW ini menurut Parnata (2005) adalah : Tabel 1. Formula Kultur Jaringan Vacin dan went Komposisi Kalium nitrat KNO3 Amonium sulfat (NH4)2SO4 Potasium dihirosulfat MgSO4 Magnesium sulfat MgSO Kalsium fosfat Ca3(PO4)2 Besi tartrat Fe2(C4H4O6)3H2O Mangan sulfat MnSo4 Agar Sukrosa Air kelapa Air Jumlah per Liter Larutan 0,525 gram 0,5 gram 0,25 0,25 0,2 0,028 0,0075 8 20 150 850

IV. KESIMPULAN

Berdasarkan hasil dan pembahasan yang didapat maka dapat ditarik kesimpulan bahwa : 1. Teknik kultur jaringan akan berhasil dengan baik apabila syarat-syarat yang diperlukan terpenuhi. 2. Dipilih bagian tanaman yang masih muda dan mudah tumbuh yaitu bagian meristem, seperti daun muda, ujung akar, ujung batang, keeping biji dan sebagainya. 3. Kultur jaringan lebih cepat menghasilkan anakan yang banyak dalam waktu yang singkat sedangkan pada kultur biji lama.

DAFTAR REFERENSI

Abdullah, Tegar. 2009. Pengertian Kultur Jaringan. Diakses tanggal 30 Mei 2010. Daisy, P et.al., 1994. Teknik Kultur Jaringan. Kanisius. Yogyakarta. Demasabu, Sofia, Doodoh B. dan Kojoh, D. 1998. Penggunaan Limbah Air Kelapa dan Bahan Substitusi Agar pada Kultur Jaringan Pisang, Krisan dan Anggrek. Manado : Universitas Sam Ratulangi. Hendaryono, Ir. Daisy P. Sriyanti dan Ir. Ari Wijayani. 1994. Teknik Kultur Jaringan : Pengenalan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif-Modern. Kanisius. Yogyakarta. Parnata, A. S. 2005. Panduan Budi Daya dan Perawatan Anggrek. PT. ArgoMedia Pustaka, Jakarta. Rizky, W, H, Anne Nuraini, Erni Suminar and Karlina Syahruddin. 2010. Growth and development of protocorm like bodies hybrid dendrobium orchids on ms medium with cytokinin and auxin combination. Agriculture Faculty of Padjadjaran University, Jatinangor, Sumedang, Indonesia. Sandra, E. 2003. Kultur Jaringan Anggrek Skala Rumah Tangga. PT. ArgoMedia Pustaka, Jakarta. Sagawa, Y. 1976. Potential of in vitro culture technigues for improvement of holtikultural. 6:61-66. Silalahi, M., Juliana Lumbangaol dan Irni. 2008. The effect of adding benzyl amino purine (bap) and napthalene acetic acid (naa) to the growth of black orchid (Coelogyne pandurata lindl.) By using in vitro technique. Seminar Nasional Sains dan Teknologi-II 2008. Suryanto, E. 2009. Air Kelapa dalam Media Kultur Pembibitan Anggrek. http://wawaorchid.wordpress.com/2009/05/05/air-kelapa-dalammedia-kultur-pembibitan-anggrek/. Diakses 29 Mei 2010. Untari, R. 2003. Pengaruh Jenis Media Organik dan NAA terhadap Pertumbuhan Anggrek Hitam (Coelogyne pandurata Lindl.) di dalam Kultur In Vitro. Skripsi. Bogor : Institut Pertanian Bogor. Utami, Edy Setiti Wida, Issirep Sumardi, Taryono, dan Endang Semiarti. 2007. Pengaruh -Naphtaleneacetic Acid (NAA) Terhadap Embriogenesis Somatik Anggrek Bulan Phalaenopsis Amabilis (L.) Bl. Biodiversitas: Volume 8, Nomor 4 Halaman: 295-299. TRUBUS. 2005. Anggrek Dendrobium. Redaksi Trubus. Depok.

Widiyatmanto, P, P, Tutik Nurhidayati, dan Siti Nurfadilah. 2012. Pengaruh jenis media dan konsentrasi NAA (Naphthalene Acetic Acid) terhadap pertumbuhan dan perkembangan biji dendrobium capra j.j smith secara in vitro.