PENENTUAN KUALITAS DAN KUANTITAS ASAM NUKLEAT MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETER

Oleh: Nama NIM Kelompok Rombongan Asisten : Siti Nur Azizah : B1J011086 :3 : II : Puspa Dwi Pratiwy

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2013

Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Latar Belakang Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara yaitu secara kualitatif dengan metode Elektroforesis Gel Agarose dan secara kuantitatif dengan metode spektrofotometri.8-2.0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein. spektrofotometri UV (ultra violet). PENDAHULUAN A.I. 2006) . yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml (Suharsono dan Widyastuti. Pengujian kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometri. Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 256 nm (260 nm). Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan/jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan cara uji kualitatif (Larasati. baru dilanjutkan dengan uji kuantitatif DNA dengan metode spekrofotometri. Uji kuantitatif DNA diawali dengan isolasi DNA. Uji ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan DNA dalam larutan contoh. sementara fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi (Riyadi. 2011). 2009). Hal ini bertujuan untuk mengeluarkan DNA yang berada dalam inti sel dari organism. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu. Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. Rasio OD260/OD280 antara 1. Spektrofotometri UV-Vis (ultra violet – visible) dan Spektrofotometri Infra Red (Riyadi. Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan fotometer. 2009). Setelah itu. kemudian dilakukan dengan uji kualitatif DNA dengan metode elektroforesis gel agarosa. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi. Terdapat beberapa cara yaitu spektrofotometri Vis (visible). Untuk mengetahui jumlah DNA.

B. . Tujuan Praktikum kali ini bertujuan untuk melakukan pengukuran kualitas dan kuantitas DNA hasil isolasi dan mengetahui pengaruh perbedaan perlakuan isolasi DNA terhadap kualitas dan kuantitas DNA yang diperoleh.

Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum kali ini meliputi akuades steril. dan 320 nm. 4. Untuk mengetahui kemurnian DNA dari protein. DNA hasil isolasi dari buah dan bakteri Escherichia coli.II.000 μL akuades. 7. MATERI DAN METODE A. 3. 5. Kuvet dan Mikropipet beserta Tip. 2. Materi Alat-alat yang digunakan pada praktikum kali ini meliputi tissue. Catatlah semua data dan bandingkan antara DNA hasil isolasi dari tanaman dan dari bakteri. lakukan pembagian nilai absorbansi 260 nm dengan nilai absorbansi 230 nm. Spektrofotometer UV (dalam praktikum ini digunakan UV-VIS Spectrophotometer Shimadzu model UV Mini 1240). 6. Nyalakan mesin spektrofotometer dan tunggulah 15 menit supaya stabil. Untuk mengetahui ada tidaknya kontaminasi karbohidrat dan kemikalia. lakukan pembagian nilai absorbansi 260 nm dengan nilai absorbansi 280 nm. 260 nm. Metode 1. Sebanyak 10 μL DNA hasil isolasi dilarutkan dalam 3. 280 nm. Kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 230 nm. Nilai absorbansi 260 nm yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam rumus untuk menghitung konsentrasi DNA. . B.

622 1.046 0.023 -0.012 λ 280 A[S] .063 0.045 0. Perhitungan konsentrasi DNA Kel. 1 2 3 4 5 6 λ 260 1300 3.019 0.733 0.150 1250 1150 1300 -600 λ 280 1. Perhitugan Konsentrasi DNA terhadap kontaminasi protein dan kemikalia No.012 0.3 0.037 0.162 0.069 0.625 1.009 Tabel 2.012 -0.A[B] 0.012 0.026 0.A[B] 0.923 λ 230 0. Hasil Tabel 1.08 1. 1 2 3 4 5 6 Sampel Strawbery Alpukat Pepaya Mangga Buah naga Escherichia coli λ 230 A[S] .023 0.III.533 1.023 λ 260 A[S] .389 0.025 0.011 0.013 λ 230 A[S] .011 0. HASIL DAN PEMBAHASAN A.A[B] 0.015 0.016 0.130 ~ .026 -0.015 -0.160 0.4 2.A[B] 0.

coli didapatkan -600 ng/µL. Konsentrasi DNA dari nilai OD sampel dapat dihitung dengan menggunakan persamaan: Konsentrasi DNA (μg/ml) = A260 x 50 x Faktor Pengenceran (Restu et al. Sampel dipipet pada platspektrofotometer untuk memperoleh OD (Optical Density). A320). 280. Apabila kepadatan optik (optical density) atau disebut OD260 sama dengan satu maka konsentrasi molekul DNA setara 50 µg/ml (untuk DNA heliks ganda) atau setara 40 µg/ml (untuk RNA atau DNA untai tunggal) atau setara 20 µg/ml (untuk oligonukleotida untai tunggal) (Muladno. ataupun zat lain yang dapat mengganggu kuantisasi DNA. Pengukuran DNA melalui spektrofotometer didasarkan pada prinsip iradiasi ultraviolet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan. konsentrasi DNA E.923. 2012). Konsentrasi DNA dalam mikrogram per mililiter kemudian diberikan oleh persamaan c (DNA) = 50 · A * 260 dikalikan dengan faktor pengenceran (Dospivova. Hasil pengukuran kualitas dan kuantitas DNA terhadap kontaminasi protein dan karbohidrat/kemikalia setelah diuji di spektrofotometer apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 didapatkan hasil 0. Pada spektrofotometer digunakan metode panjang gelombang tunggal (Single Wave Length) dan OD diukur pada panjang gelombang 260 nm.. Nilai konsentrasi sampel DNA hasil ekstraksi diukur dengan mengambil 50 µl sampel pada masing-masing tahap.5212 sedangkan apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 didapatkan hasil 0. Pembahasan Jumlah dan kualitas DNA dapat diketahui dengan menggunakan alat spektrofotometer atau dengan melihat intensitas molekul DNA dalam gel. A280. Penyerapan iradiasi sinar UV secara maksimal oleh DNA dicapai pada panjang gelombang 260 nm.B. sedangkan konsentrasi DNA buah adalah 1250 ng/µL. Cara pengukuran kuantitas DNA juga diungkapkan oleh (2012) yang menyatakan bahwa Jumlah DNA dihitung dengan menggunakan spektrofometri dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa panjang gelombang misalnya 260. Hal tersebut berguna untuk menguji kemurnian DNA. Berdasarkan perhitungan. 2002). dan 320 nm (A260. sedangkan penyerapan maksimal oleh protein dicapai pada panjang gelombang 280 nm. Kemurnian akan menjamin tidak terdapatya kontaminasi dari protein. 2012). Hal ini menunjukkan adanya kontaminasi dari kemikalia/karbohidrat dengan ditunjukkan nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 nm yang didapatkan kurang dari .

Hal ini menunjukkan adanya kontaminasi dari kemikalia/karbohidrat.8. dikatakan bahwa DNA terkontaminasi oleh RNA.8. selain itu juga DNA E. sedangkan apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 didapatkan hasil 2. ditunjukkan dari nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 nm yang didapatkan kurang dari 2. Kemurnian asam nukleat dari pengotor karbohidrat atau pun materi organik lain dan kemikalia ditentukan berdasarkan perbandingan nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm terhadap absorbansi pada panjang gelombang 230 nm. Bila nilai perbandingan absorbansi tersebut berkisar dari 2 hingga 2. yaitu suatu alat yang di gunakan untuk menentukan suatu senyawa baik secara kuantitatif maupun . Bila nilai perbandingan tersebut lebih rendah dari 1. coli terkontaminasi oleh protein. dikatakan bahwa asam nukleat terkontaminasi oleh karbohidrat. jika perbandingan nilai absorbansi tersebut lebih tinggi dari 2.8. 2009) yang menyatakan bahwa kualitas asam nukleat ditentukan berdasarkan atas tingkat kemurniannya. Kualitas DNA pada hasil elektroforesis menunjukan hasil berbanding lurus dengan konsentrasi DNA. bila nilai tersebut lebih rendah dari 2. selain itu juga DNA buah papaya terkontaminasi oleh RNA. Hal ini sesuai dengan pernyataan (Faatih. Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar makromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan fototube atau tabung foton hampa. Alat yang digunakan adalah spektrofotometer. dan menunjukkan pita tunggal (Komalasari.2. Kemurnian RNA sendiri dikatakan tertinggi jika nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm mendekati 2.8. Namun. hal ini ditunjukkan dari nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm yang didapatkan kurang dari 1. dikatakan bahwa DNA terkontaminasi oleh protein.08. untuk DNA.2. materi organik lain atau pun kemikalia yang terbawa saat dilakukan proses isolasi. bila nilai perbandingan tersebut lebih tinggi dari 1.8. Sebaliknya. hal ini menandakan penggunaan blanko yang tidak sesuai dengan pelarut DNA atau RNA yang digunakan.2. Hasil pengamatan kualitas DNA buah papaya didapatkan hasil bahwa konsentrasi DNA terhadap kontaminasi protein dan karbohidrat/kemikalia setelah diuji di spektrofotometer apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 yaitu 0. hal ini ditunjukkan dari nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm yang didapatkan lebih dari 1. Sebaliknya. kemurnian dikatakan tertinggi apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm mendekati 1. 2009).3. dikatakan bahwa sampel asam nukleat yang diukur murni.

Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombang dan dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda.kualitatif dengan mengukur transmitan atau absorbansi dari suatu cuplikan sebagai fungsi dari konsentrasi. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita. Kebetulan spektrofotometer dibandingkan dengan fotometer adalah panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih terseleksi dan ini diperoleh dengan alat pengurai seperti prisma. Sedangkan pada spektrofotometer. monokromator. sel pengabsorbsi untuk larutan sampel blanko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan absorbsi antara sampel dan blanko ataupun pembanding (Khopkar. entah itu putih. 2002). atau celah optis. hijau. panjang gelombang yang benar-benar terseleksi dapat diperoleh dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma. Spektrofotometer menghasilkan sinar dan spectrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi. apapun. sedangkan dalam kalorimetri perbedaan panjang gelombang dapat lebih besar (Hardjadi. Pada titrasi spektrofotometri. Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum tampak yang kontinyu. biru. Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Pada spektrofotometri visible yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). 1990). grating. maka sinar tersebut termasuk ke dalam . Sedangkan pengukuran menggunakan spektrofotometer ini.. Pada fotometer filter tidak mungkin diperoleh panjang gelombang 30-40 nm. metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri (Riyadi 2009). Pada fotometer filter dari berbagai warna yang mempunyai spesifikasi melewatkan trayek panjang gelombang tertentu. selama ia dapat dilihat oleh mata. merah. sinar yang digunakan merupakan satu berkas yang panjangnya tidak berbeda banyak antara satu dengan yang lainnya. Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube.

maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. 2002).8-2. Bening dan transparan.8 kemungkinan mengandung asam nukleat dan nilai A260:A280 <1. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium.. karena tidak ada perlakuan dengan RNAse dalam isolasi DNA kromosom ini. Namun perlu diingat. Hasil pengamatan kualitas DNA dengan spektrofotometer menunjukkan bahwa rata-rata isolat menghasilkan DNA plas-id dengan nilai perbandingan serapan < 1. Kualitas DNA dapat ditentukan dengan cara menghitung rasio antara nilai OD260 dan nilai OD280 pada sampel DNA yang diukur melalui spektrofotometer. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. (1989) menjelaskan bahwa rasio OD akan lebih besar atau lebih kecil dari nilai 1. sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau sentrifugasi. DNA kromosom dengan nilai A260:A280 >1. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Hal ini menunjukkan masih besarnya kontaminasi RNA dalam sampel.0 jika ditemukan kontaminasi dari protein atau fenol. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi (Riyadi 2009). RNA. Oleh karena itu. karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita.0 (Muladno. 2009). Berbeda dengan spektrofotometri visible. Tingkat kemurnian DNA berkorelasi dengan kualitas DNA. sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Sambrook et al. Sejalan dengan berkembangnya teknik ekstraksi DNA. DNA dikatakan terkontaminasi RNA jika memiliki rasio OD260/OD280 lebih dari dua (Khosravinia et al. lipid dan lain-lain merupakan ekstraksi DNA.8-2.sinar tampak (visible) (Riyadi 2009). proses pelisisan dinding . Nilai perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 dan 280 nm dapat digunakan sebagai indikator kemurnian DNA. Proses pemisahan DNA dari materi-materi di dalam sel seperti protein. Hal ini memang telah diperkirakan sebelumnya. DNA dinyatakan murni apabila memiliki nilai perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 dan 280 nm berkisar 1. secara umum dilakukan melalui beberapa tahap yaitu isoloasi dari jaringan. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna. DNA dinyatakan murni jika memiliki nilai rasio OD260/OD280 (optical density) berkisar antara 1.8. Prosedur analisis DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. pada spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV.82.6 kemungkinan mengandung kontaminan seperti protein serta senyawa-senyawa organik lainnya (Faatih. 2007).

Kontaminan tersebut dapat berupa bahan biologis individu lain seperti protein. Ekstraksi DNA memiliki beberapa variasi metode dalam pengerjaannya yaitu dengan metode fenol-kloroform. . ekstraksi dalam larutan. purifikasi dan kemudian presipitasi atau pemadatan. Kontaminan lain yaitu bahan abiotik tempat bahan diambil contohnya tanah (Krings et all . Bahan yang digunakan harus bebas kontaminan dan proses saat ekstraksi DNA .1997). metode chilex. dan RNA. metode membran dialisis. Kualitas dan kuantitas hasil ekstraksi DNA dipengaruhi oleh beberapa faktor salah satunya adalah bahan yang digunakan sebagai sumber DNA. Metode fenol kloroform yang diperkenalkan Sambrook dan Russel dalam Toha (2001) adalah metode ekstraksi yang umum dan konvensional. lemak. Keberhasilan analisis DNA sangat ditentukan oleh kualitas dan kuantitas hasil ekstraksi DNA.dan membran sel. dan metode boom.

2. Saran Sebaiknya mahasiswa atau praktikan mencoba menggunakan spektrofotometer. B.III. dapat diambil kesimpulan sebagai berikut: 1. . Jumlah dan kualitas DNA dapat diketahui dengan menggunakan alat spektrofotometer. sedangkan DNA buah hasil isolasi menunjukkan adanya kontaminasi dari kemikalia/karbohidrat serta terkontaminasi oleh RNA. Supaya praktikan dapat lebih menguasai teknik dalam menggunakan spektrofotometri. KESIMPULAN DAN SARAN A. coli terkontaminasi oleh protein. Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan. coli terkontaminasi kemikalia/karbohidrat selain itu juga DNA E. coli dan DNA buah hasil isolasi setelah diuji secara kuantitatif dengan menggunakan spektrofotometer E. Kualitas DNA E.

W. Prinsip Dasar Spektrofotometer Visible. Macam Spektrofotometri dan Perbedaannya (Vis. David Hynek. Pustaka Wirausaha Muda: Bogor. Sambrook. Fritsch. com. Restu.. Vol. Dana. and Pääbo S. R. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1996.. Muladno. Pengaruh Perbandingan Volume Darah Dan Lisis Buffer Serta Kecepatan Sentrifugasi Terhadap Kualitas Produk Dna Pada Sapi Friesian Holstein (Fh). Jurnal Penelitian Sains & Teknologi. A.. Parasad. F.. and N. H. Cell. 2009. Krings M. Analisis Kimia Kuantitatif edisi Kelima. Catalytic Electrochemical Analysis of Platinum in Pt-DNA Adducts. Maniatis. Mukhlissul. W. 2nd edition. Khopkar. UV dan IR). E.A. Februari 2012: 138-142 ISSN 1410-9379. 2001. 7 (2012) 3072 – 3088. Krainitzki H. Pirany. Jurnal Natur Indonesia 14(2).com. J. Bandung. Diakses tanggal 7 Juni 2013. Stone A. A. 6 (4): 481-486. No. Isolasi Dan Digesti DNA Kromosom. A. [Skripsi]. Underwood. Optimalisasi Teknik Ekstraksi dan Isolasi DNA Tanaman Suren (Toona Sureni Merr. Optimizing factors influencing DNA extraction from fresh whole avian blood. Komalasari. J.. International Journal of Electrochemical Science.) untuk Analisis Keragaman Genetik berdasarkanRandom Amplified PolymorphicDNA (RAPD). Schmitz R. W. Vojtech Adam. 1990.. Marketa Ryvolova. PT Gramedia: Jakarta. Cold Spring Harbor Laboratory Press. T. 2009: 61 – 67.blogspot. Intstitut Pertanian Bogor: Bogor. Pavel Kopel. Alfabeta. Narasimha Murthy. 2002. H. Riyadi. African J. Konsep Dasar Kimia Analitik. 2009. Riyadi. Toha. (1997): Neandertal DNA sequences and the origin of modern humans. of Biotech. 2012. 90:19-30. Marie Stiborova. 10. Mukrimin dan Gusmiaty. L dan R. Day. Jaromir Hubalek and Rene Kizek. N.blogspot. Diakses tanggal 8 Juni 2013. Biokimia : Metabolisme Biomolekul. http://wahyuriyadi. Ilmu Kima Analitik Dasar. Kokom. 2007. Hardjadi. New York.. Vol. 1989. 2002. Muh. Khosravinia. D. Stoneking M. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Universitas Indonesia: Jakarta. Tomas Eckschlager.. 1. 2009. Kristyna Smerkova.DAFTAR REFERENSI Dospivova. H. 2009. 2012. http://wahyuriyadi. Penerbit Erlangga: Jakarta. and T. . Faatih.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful