PENENTUAN KUALITAS DAN KUANTITAS ASAM NUKLEAT MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETER

Oleh: Nama NIM Kelompok Rombongan Asisten : Siti Nur Azizah : B1J011086 :3 : II : Puspa Dwi Pratiwy

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2013

Terdapat beberapa cara yaitu spektrofotometri Vis (visible). Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan fotometer.0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein. Rasio OD260/OD280 antara 1. Spektrofotometri UV-Vis (ultra violet – visible) dan Spektrofotometri Infra Red (Riyadi. 2009). Uji kuantitatif DNA diawali dengan isolasi DNA. Untuk mengetahui jumlah DNA. sementara fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi (Riyadi. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi. 2011). Setelah itu. kemudian dilakukan dengan uji kualitatif DNA dengan metode elektroforesis gel agarosa. yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml (Suharsono dan Widyastuti. Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. 2009). maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 256 nm (260 nm). Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Uji ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan DNA dalam larutan contoh. Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan/jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan cara uji kualitatif (Larasati.8-2. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu.I. Latar Belakang Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara yaitu secara kualitatif dengan metode Elektroforesis Gel Agarose dan secara kuantitatif dengan metode spektrofotometri. PENDAHULUAN A. Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. 2006) . baru dilanjutkan dengan uji kuantitatif DNA dengan metode spekrofotometri. Pengujian kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometri. spektrofotometri UV (ultra violet). Hal ini bertujuan untuk mengeluarkan DNA yang berada dalam inti sel dari organism.

Tujuan Praktikum kali ini bertujuan untuk melakukan pengukuran kualitas dan kuantitas DNA hasil isolasi dan mengetahui pengaruh perbedaan perlakuan isolasi DNA terhadap kualitas dan kuantitas DNA yang diperoleh.B. .

000 μL akuades. lakukan pembagian nilai absorbansi 260 nm dengan nilai absorbansi 280 nm. DNA hasil isolasi dari buah dan bakteri Escherichia coli. Untuk mengetahui kemurnian DNA dari protein. 2. MATERI DAN METODE A. Kuvet dan Mikropipet beserta Tip. 7. Catatlah semua data dan bandingkan antara DNA hasil isolasi dari tanaman dan dari bakteri. . 5. Materi Alat-alat yang digunakan pada praktikum kali ini meliputi tissue. Spektrofotometer UV (dalam praktikum ini digunakan UV-VIS Spectrophotometer Shimadzu model UV Mini 1240). Untuk mengetahui ada tidaknya kontaminasi karbohidrat dan kemikalia. Nilai absorbansi 260 nm yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam rumus untuk menghitung konsentrasi DNA. Metode 1. 4.II. Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum kali ini meliputi akuades steril. Nyalakan mesin spektrofotometer dan tunggulah 15 menit supaya stabil. 260 nm. 280 nm. dan 320 nm. B. 6. Sebanyak 10 μL DNA hasil isolasi dilarutkan dalam 3. Kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 230 nm. lakukan pembagian nilai absorbansi 260 nm dengan nilai absorbansi 230 nm. 3.

130 ~ .026 -0. Hasil Tabel 1.011 0.733 0.150 1250 1150 1300 -600 λ 280 1.3 0.023 0.III.015 -0.037 0.160 0.023 -0.923 λ 230 0.625 1.622 1.025 0.016 0.012 -0.045 0.4 2.069 0. 1 2 3 4 5 6 Sampel Strawbery Alpukat Pepaya Mangga Buah naga Escherichia coli λ 230 A[S] .013 λ 230 A[S] .063 0. Perhitungan konsentrasi DNA Kel.A[B] 0.023 λ 260 A[S] .012 0.A[B] 0. Perhitugan Konsentrasi DNA terhadap kontaminasi protein dan kemikalia No.015 0.08 1.A[B] 0.026 0.533 1.162 0.A[B] 0.389 0.012 0.046 0.019 0. HASIL DAN PEMBAHASAN A.009 Tabel 2. 1 2 3 4 5 6 λ 260 1300 3.011 0.012 λ 280 A[S] .

Pada spektrofotometer digunakan metode panjang gelombang tunggal (Single Wave Length) dan OD diukur pada panjang gelombang 260 nm. 280. sedangkan konsentrasi DNA buah adalah 1250 ng/µL. 2002). Konsentrasi DNA dari nilai OD sampel dapat dihitung dengan menggunakan persamaan: Konsentrasi DNA (μg/ml) = A260 x 50 x Faktor Pengenceran (Restu et al. Sampel dipipet pada platspektrofotometer untuk memperoleh OD (Optical Density). 2012).5212 sedangkan apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 didapatkan hasil 0. Pengukuran DNA melalui spektrofotometer didasarkan pada prinsip iradiasi ultraviolet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan. A280. Apabila kepadatan optik (optical density) atau disebut OD260 sama dengan satu maka konsentrasi molekul DNA setara 50 µg/ml (untuk DNA heliks ganda) atau setara 40 µg/ml (untuk RNA atau DNA untai tunggal) atau setara 20 µg/ml (untuk oligonukleotida untai tunggal) (Muladno. Nilai konsentrasi sampel DNA hasil ekstraksi diukur dengan mengambil 50 µl sampel pada masing-masing tahap. 2012). Pembahasan Jumlah dan kualitas DNA dapat diketahui dengan menggunakan alat spektrofotometer atau dengan melihat intensitas molekul DNA dalam gel.923. Penyerapan iradiasi sinar UV secara maksimal oleh DNA dicapai pada panjang gelombang 260 nm. Hasil pengukuran kualitas dan kuantitas DNA terhadap kontaminasi protein dan karbohidrat/kemikalia setelah diuji di spektrofotometer apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 didapatkan hasil 0. konsentrasi DNA E. ataupun zat lain yang dapat mengganggu kuantisasi DNA..B. Konsentrasi DNA dalam mikrogram per mililiter kemudian diberikan oleh persamaan c (DNA) = 50 · A * 260 dikalikan dengan faktor pengenceran (Dospivova. Berdasarkan perhitungan. dan 320 nm (A260. Hal ini menunjukkan adanya kontaminasi dari kemikalia/karbohidrat dengan ditunjukkan nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 nm yang didapatkan kurang dari . sedangkan penyerapan maksimal oleh protein dicapai pada panjang gelombang 280 nm. A320). coli didapatkan -600 ng/µL. Kemurnian akan menjamin tidak terdapatya kontaminasi dari protein. Hal tersebut berguna untuk menguji kemurnian DNA. Cara pengukuran kuantitas DNA juga diungkapkan oleh (2012) yang menyatakan bahwa Jumlah DNA dihitung dengan menggunakan spektrofometri dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa panjang gelombang misalnya 260.

08.3. hal ini ditunjukkan dari nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm yang didapatkan lebih dari 1. Hasil pengamatan kualitas DNA buah papaya didapatkan hasil bahwa konsentrasi DNA terhadap kontaminasi protein dan karbohidrat/kemikalia setelah diuji di spektrofotometer apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 yaitu 0. Kemurnian asam nukleat dari pengotor karbohidrat atau pun materi organik lain dan kemikalia ditentukan berdasarkan perbandingan nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm terhadap absorbansi pada panjang gelombang 230 nm. dikatakan bahwa DNA terkontaminasi oleh RNA. Sebaliknya.8. Hal ini sesuai dengan pernyataan (Faatih. Bila nilai perbandingan absorbansi tersebut berkisar dari 2 hingga 2. selain itu juga DNA buah papaya terkontaminasi oleh RNA. coli terkontaminasi oleh protein. hal ini ditunjukkan dari nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm yang didapatkan kurang dari 1. Alat yang digunakan adalah spektrofotometer.8. 2009).2.2. Namun. jika perbandingan nilai absorbansi tersebut lebih tinggi dari 2. materi organik lain atau pun kemikalia yang terbawa saat dilakukan proses isolasi. kemurnian dikatakan tertinggi apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm mendekati 1. untuk DNA. dikatakan bahwa sampel asam nukleat yang diukur murni.2. Sebaliknya. bila nilai perbandingan tersebut lebih tinggi dari 1. dan menunjukkan pita tunggal (Komalasari. Bila nilai perbandingan tersebut lebih rendah dari 1. Kualitas DNA pada hasil elektroforesis menunjukan hasil berbanding lurus dengan konsentrasi DNA. Kemurnian RNA sendiri dikatakan tertinggi jika nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm mendekati 2.8. Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar makromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan fototube atau tabung foton hampa. dikatakan bahwa DNA terkontaminasi oleh protein. ditunjukkan dari nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 nm yang didapatkan kurang dari 2. dikatakan bahwa asam nukleat terkontaminasi oleh karbohidrat. Hal ini menunjukkan adanya kontaminasi dari kemikalia/karbohidrat.8. selain itu juga DNA E. hal ini menandakan penggunaan blanko yang tidak sesuai dengan pelarut DNA atau RNA yang digunakan.8. bila nilai tersebut lebih rendah dari 2. 2009) yang menyatakan bahwa kualitas asam nukleat ditentukan berdasarkan atas tingkat kemurniannya. yaitu suatu alat yang di gunakan untuk menentukan suatu senyawa baik secara kuantitatif maupun . sedangkan apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 didapatkan hasil 2.

Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi. monokromator. Pada spektrofotometri visible yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). sel pengabsorbsi untuk larutan sampel blanko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan absorbsi antara sampel dan blanko ataupun pembanding (Khopkar. selama ia dapat dilihat oleh mata. Pada fotometer filter tidak mungkin diperoleh panjang gelombang 30-40 nm. 1990).kualitatif dengan mengukur transmitan atau absorbansi dari suatu cuplikan sebagai fungsi dari konsentrasi. 2002). atau celah optis.. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum tampak yang kontinyu. Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. Sedangkan pada spektrofotometer. apapun. hijau. biru. maka sinar tersebut termasuk ke dalam . Pada fotometer filter dari berbagai warna yang mempunyai spesifikasi melewatkan trayek panjang gelombang tertentu. entah itu putih. merah. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita. Sedangkan pengukuran menggunakan spektrofotometer ini. grating. Kebetulan spektrofotometer dibandingkan dengan fotometer adalah panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih terseleksi dan ini diperoleh dengan alat pengurai seperti prisma. metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri (Riyadi 2009). Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Pada titrasi spektrofotometri. Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombang dan dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda. Spektrofotometer menghasilkan sinar dan spectrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi. sinar yang digunakan merupakan satu berkas yang panjangnya tidak berbeda banyak antara satu dengan yang lainnya. panjang gelombang yang benar-benar terseleksi dapat diperoleh dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma. sedangkan dalam kalorimetri perbedaan panjang gelombang dapat lebih besar (Hardjadi. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm.

Oleh karena itu. karena tidak ada perlakuan dengan RNAse dalam isolasi DNA kromosom ini.sinar tampak (visible) (Riyadi 2009). 2007).6 kemungkinan mengandung kontaminan seperti protein serta senyawa-senyawa organik lainnya (Faatih. sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau sentrifugasi.8 kemungkinan mengandung asam nukleat dan nilai A260:A280 <1. RNA. Tingkat kemurnian DNA berkorelasi dengan kualitas DNA. DNA kromosom dengan nilai A260:A280 >1. Bening dan transparan. lipid dan lain-lain merupakan ekstraksi DNA. proses pelisisan dinding . Hal ini menunjukkan masih besarnya kontaminasi RNA dalam sampel. Sambrook et al. sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. DNA dinyatakan murni jika memiliki nilai rasio OD260/OD280 (optical density) berkisar antara 1. DNA dinyatakan murni apabila memiliki nilai perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 dan 280 nm berkisar 1.0 (Muladno. Hasil pengamatan kualitas DNA dengan spektrofotometer menunjukkan bahwa rata-rata isolat menghasilkan DNA plas-id dengan nilai perbandingan serapan < 1. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Proses pemisahan DNA dari materi-materi di dalam sel seperti protein. Berbeda dengan spektrofotometri visible. Hal ini memang telah diperkirakan sebelumnya. Sejalan dengan berkembangnya teknik ekstraksi DNA. 2009).82.8. (1989) menjelaskan bahwa rasio OD akan lebih besar atau lebih kecil dari nilai 1. Prosedur analisis DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA.8-2. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna. maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita. DNA dikatakan terkontaminasi RNA jika memiliki rasio OD260/OD280 lebih dari dua (Khosravinia et al.. Nilai perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 dan 280 nm dapat digunakan sebagai indikator kemurnian DNA. Namun perlu diingat. Kualitas DNA dapat ditentukan dengan cara menghitung rasio antara nilai OD260 dan nilai OD280 pada sampel DNA yang diukur melalui spektrofotometer. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi (Riyadi 2009).0 jika ditemukan kontaminasi dari protein atau fenol. secara umum dilakukan melalui beberapa tahap yaitu isoloasi dari jaringan.8-2. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium. pada spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. 2002).

Bahan yang digunakan harus bebas kontaminan dan proses saat ekstraksi DNA . dan metode boom. Keberhasilan analisis DNA sangat ditentukan oleh kualitas dan kuantitas hasil ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA memiliki beberapa variasi metode dalam pengerjaannya yaitu dengan metode fenol-kloroform. Kontaminan tersebut dapat berupa bahan biologis individu lain seperti protein. metode membran dialisis. ekstraksi dalam larutan. Kualitas dan kuantitas hasil ekstraksi DNA dipengaruhi oleh beberapa faktor salah satunya adalah bahan yang digunakan sebagai sumber DNA. Kontaminan lain yaitu bahan abiotik tempat bahan diambil contohnya tanah (Krings et all . dan RNA. metode chilex.1997).dan membran sel. . lemak. Metode fenol kloroform yang diperkenalkan Sambrook dan Russel dalam Toha (2001) adalah metode ekstraksi yang umum dan konvensional. purifikasi dan kemudian presipitasi atau pemadatan.

Supaya praktikan dapat lebih menguasai teknik dalam menggunakan spektrofotometri. Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan. 2.III. coli terkontaminasi kemikalia/karbohidrat selain itu juga DNA E. . Kualitas DNA E. sedangkan DNA buah hasil isolasi menunjukkan adanya kontaminasi dari kemikalia/karbohidrat serta terkontaminasi oleh RNA. KESIMPULAN DAN SARAN A. B. Saran Sebaiknya mahasiswa atau praktikan mencoba menggunakan spektrofotometer. Jumlah dan kualitas DNA dapat diketahui dengan menggunakan alat spektrofotometer. coli terkontaminasi oleh protein. dapat diambil kesimpulan sebagai berikut: 1. coli dan DNA buah hasil isolasi setelah diuji secara kuantitatif dengan menggunakan spektrofotometer E.

Restu. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Muladno. 2002. Faatih. Schmitz R. Jaromir Hubalek and Rene Kizek. F. Pustaka Wirausaha Muda: Bogor. Krings M. http://wahyuriyadi.. Tomas Eckschlager. Toha. 2009. 7 (2012) 3072 – 3088. Marie Stiborova.. [Skripsi]. 2012. Khosravinia.A. David Hynek. Muh. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cell. Intstitut Pertanian Bogor: Bogor. com. H. J. 2009. Stone A. http://wahyuriyadi.com.DAFTAR REFERENSI Dospivova. UV dan IR). Vojtech Adam. D. 90:19-30. Jurnal Natur Indonesia 14(2). 2001.. W. of Biotech. (1997): Neandertal DNA sequences and the origin of modern humans. 2009. Sambrook. Riyadi. Jurnal Penelitian Sains & Teknologi. African J. R. Maniatis. 2009: 61 – 67. New York. Optimizing factors influencing DNA extraction from fresh whole avian blood. Mukrimin dan Gusmiaty. Underwood. 2002. 10.. A. Ilmu Kima Analitik Dasar. Bandung. Marketa Ryvolova. Diakses tanggal 8 Juni 2013.. 1989. Mukhlissul. Macam Spektrofotometri dan Perbedaannya (Vis. Isolasi Dan Digesti DNA Kromosom. Khopkar. and N. E. Narasimha Murthy. Dana. Februari 2012: 138-142 ISSN 1410-9379. Diakses tanggal 7 Juni 2013. PT Gramedia: Jakarta. Biokimia : Metabolisme Biomolekul. Parasad. Vol. and Pääbo S. . and T.. A.W. Alfabeta. Hardjadi. Catalytic Electrochemical Analysis of Platinum in Pt-DNA Adducts.blogspot. Komalasari. 1996. H. 2007. 6 (4): 481-486. Day. Riyadi. Prinsip Dasar Spektrofotometer Visible. Kokom. Universitas Indonesia: Jakarta. L dan R. Penerbit Erlangga: Jakarta. No.. H.) untuk Analisis Keragaman Genetik berdasarkanRandom Amplified PolymorphicDNA (RAPD). A. 1. Vol. Analisis Kimia Kuantitatif edisi Kelima. Optimalisasi Teknik Ekstraksi dan Isolasi DNA Tanaman Suren (Toona Sureni Merr. Pavel Kopel.blogspot. Krainitzki H. T. 1990. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Pirany. 2009. Kristyna Smerkova.. Konsep Dasar Kimia Analitik. 2nd edition. Pengaruh Perbandingan Volume Darah Dan Lisis Buffer Serta Kecepatan Sentrifugasi Terhadap Kualitas Produk Dna Pada Sapi Friesian Holstein (Fh). Stoneking M. N. Fritsch. International Journal of Electrochemical Science. W. 2012. J.