PENENTUAN KUALITAS DAN KUANTITAS ASAM NUKLEAT MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETER

Oleh: Nama NIM Kelompok Rombongan Asisten : Siti Nur Azizah : B1J011086 :3 : II : Puspa Dwi Pratiwy

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2013

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara yaitu secara kualitatif dengan metode Elektroforesis Gel Agarose dan secara kuantitatif dengan metode spektrofotometri. Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan/jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan cara uji kualitatif (Larasati, 2011). Pengujian kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometri. Terdapat beberapa cara yaitu spektrofotometri Vis (visible), spektrofotometri UV (ultra violet), Spektrofotometri UV-Vis (ultra violet visible) dan Spektrofotometri Infra Red (Riyadi, 2009). Uji kuantitatif DNA diawali dengan isolasi DNA. Hal ini bertujuan untuk mengeluarkan DNA yang berada dalam inti sel dari organism, kemudian dilakukan dengan uji kualitatif DNA dengan metode elektroforesis gel agarosa. Uji ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan DNA dalam larutan contoh. Setelah itu, baru dilanjutkan dengan uji kuantitatif DNA dengan metode

spekrofotometri. Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu, sementara fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi (Riyadi, 2009). Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. Untuk mengetahui jumlah DNA, maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 256 nm (260 nm). Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Rasio OD260/OD280 antara 1,8-2,0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi, yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml (Suharsono dan Widyastuti, 2006)

B. Tujuan Praktikum kali ini bertujuan untuk melakukan pengukuran kualitas dan kuantitas DNA hasil isolasi dan mengetahui pengaruh perbedaan perlakuan isolasi DNA terhadap kualitas dan kuantitas DNA yang diperoleh.

II. MATERI DAN METODE

A. Materi Alat-alat yang digunakan pada praktikum kali ini meliputi tissue,

Spektrofotometer UV (dalam praktikum ini digunakan UV-VIS Spectrophotometer Shimadzu model UV Mini 1240), Kuvet dan Mikropipet beserta Tip. Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum kali ini meliputi akuades steril, DNA hasil isolasi dari buah dan bakteri Escherichia coli.

B. Metode 1. Nyalakan mesin spektrofotometer dan tunggulah 15 menit supaya stabil. 2. Sebanyak 10 L DNA hasil isolasi dilarutkan dalam 3.000 L akuades. 3. Kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 230 nm, 260 nm, 280 nm, dan 320 nm. 4. Nilai absorbansi 260 nm yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam rumus untuk menghitung konsentrasi DNA. 5. Untuk mengetahui kemurnian DNA dari protein, lakukan pembagian nilai absorbansi 260 nm dengan nilai absorbansi 280 nm. 6. Untuk mengetahui ada tidaknya kontaminasi karbohidrat dan kemikalia, lakukan pembagian nilai absorbansi 260 nm dengan nilai absorbansi 230 nm. 7. Catatlah semua data dan bandingkan antara DNA hasil isolasi dari tanaman dan dari bakteri.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Tabel 1. Perhitungan konsentrasi DNA Kel. 1 2 3 4 5 6 Sampel Strawbery Alpukat Pepaya Mangga Buah naga Escherichia coli 230 A[S] - A[B] 0,019 0,162 0,069 0,037 0,023 -0,023 260 A[S] - A[B] 0,026 0,063 0,025 0,023 0,026 -0,012 280 A[S] - A[B] 0,016 0,045 0,012 0,015 0,015 -0,013 230 A[S] - A[B] 0,011 0,046 0,011 0,012 0,012 -0,009

Tabel 2. Perhitugan Konsentrasi DNA terhadap kontaminasi protein dan kemikalia No. 1 2 3 4 5 6 260 1300 3,150 1250 1150 1300 -600 280 1,625 1,4 2,08 1,533 1,733 0,923 230 0,160 0,389 0,3 0,622 1,130 ~

B. Pembahasan Jumlah dan kualitas DNA dapat diketahui dengan menggunakan alat spektrofotometer atau dengan melihat intensitas molekul DNA dalam gel.

Pengukuran DNA melalui

spektrofotometer didasarkan pada prinsip

iradiasi

ultraviolet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan. Penyerapan iradiasi sinar UV secara maksimal oleh DNA dicapai pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan penyerapan maksimal oleh protein dicapai pada panjang gelombang 280 nm. Apabila kepadatan optik (optical density) atau disebut OD260 sama dengan satu maka konsentrasi molekul DNA setara 50 g/ml (untuk DNA heliks ganda) atau setara 40 g/ml (untuk RNA atau DNA untai tunggal) atau setara 20 g/ml (untuk oligonukleotida untai tunggal) (Muladno, 2002). Nilai konsentrasi sampel DNA hasil ekstraksi diukur dengan mengambil 50 l sampel pada masing-masing tahap. Sampel dipipet pada platspektrofotometer untuk memperoleh OD (Optical Density). Pada spektrofotometer digunakan metode panjang gelombang tunggal (Single Wave Length) dan OD diukur pada panjang gelombang 260 nm. Konsentrasi DNA dari nilai OD sampel dapat dihitung dengan menggunakan persamaan: Konsentrasi DNA (g/ml) = A260 x 50 x Faktor Pengenceran (Restu et al., 2012). Cara pengukuran kuantitas DNA juga diungkapkan oleh (2012) yang menyatakan bahwa Jumlah DNA dihitung dengan menggunakan spektrofometri dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa panjang gelombang misalnya 260, 280, dan 320 nm (A260, A280, A320). Hal tersebut berguna untuk menguji kemurnian DNA. Kemurnian akan menjamin tidak terdapatya kontaminasi dari protein, ataupun zat lain yang dapat mengganggu kuantisasi DNA. Konsentrasi DNA dalam mikrogram per mililiter kemudian diberikan oleh persamaan c (DNA) = 50 A * 260 dikalikan dengan faktor pengenceran (Dospivova, 2012). Berdasarkan perhitungan, konsentrasi DNA E. coli didapatkan -600 ng/L, sedangkan konsentrasi DNA buah adalah 1250 ng/L. Hasil pengukuran kualitas dan kuantitas DNA terhadap kontaminasi protein dan karbohidrat/kemikalia setelah diuji di spektrofotometer apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 didapatkan hasil 0,5212 sedangkan apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 didapatkan hasil 0,923. Hal ini menunjukkan adanya kontaminasi dari kemikalia/karbohidrat dengan ditunjukkan nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 nm yang didapatkan kurang dari

2, selain itu juga DNA E. coli terkontaminasi oleh protein, hal ini ditunjukkan dari nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm yang didapatkan kurang dari 1,8. Hasil pengamatan kualitas DNA buah papaya didapatkan hasil bahwa konsentrasi DNA terhadap kontaminasi protein dan karbohidrat/kemikalia setelah diuji di spektrofotometer apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 yaitu 0,3, sedangkan apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 didapatkan hasil 2,08. Hal ini menunjukkan adanya kontaminasi dari kemikalia/karbohidrat, ditunjukkan dari nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 nm yang didapatkan kurang dari 2, selain itu juga DNA buah papaya terkontaminasi oleh RNA, hal ini ditunjukkan dari nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm yang didapatkan lebih dari 1,8. Hal ini sesuai dengan pernyataan (Faatih, 2009) yang menyatakan bahwa kualitas asam nukleat ditentukan berdasarkan atas tingkat kemurniannya, untuk DNA, kemurnian dikatakan tertinggi apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm mendekati 1,8. Bila nilai perbandingan

tersebut lebih rendah dari 1,8, dikatakan bahwa DNA terkontaminasi oleh protein. Sebaliknya, bila nilai perbandingan tersebut lebih tinggi dari 1,8, dikatakan bahwa DNA terkontaminasi oleh RNA. Kemurnian RNA sendiri dikatakan tertinggi jika nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm mendekati 2. Kemurnian asam nukleat dari pengotor karbohidrat atau pun materi organik lain dan kemikalia ditentukan berdasarkan perbandingan nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm terhadap absorbansi pada panjang gelombang 230 nm. Bila nilai perbandingan absorbansi tersebut berkisar dari 2 hingga 2,2, dikatakan bahwa sampel asam nukleat yang diukur murni. Namun, bila nilai tersebut lebih rendah dari 2, dikatakan bahwa asam nukleat terkontaminasi oleh karbohidrat, materi organik lain atau pun kemikalia yang terbawa saat dilakukan proses isolasi. Sebaliknya, jika perbandingan nilai absorbansi tersebut lebih tinggi dari 2,2, hal ini menandakan penggunaan blanko yang tidak sesuai dengan pelarut DNA atau RNA yang digunakan. Kualitas DNA pada hasil elektroforesis menunjukan hasil berbanding lurus dengan konsentrasi DNA, dan menunjukkan pita tunggal (Komalasari, 2009). Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar makromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan fototube atau tabung foton hampa. Alat yang digunakan adalah spektrofotometer, yaitu suatu alat yang di gunakan untuk menentukan suatu senyawa baik secara kuantitatif maupun

kualitatif dengan mengukur transmitan atau absorbansi dari suatu cuplikan sebagai fungsi dari konsentrasi. Pada titrasi spektrofotometri, sinar yang digunakan merupakan satu berkas yang panjangnya tidak berbeda banyak antara satu dengan yang lainnya, sedangkan dalam kalorimetri perbedaan panjang gelombang dapat lebih besar (Hardjadi, 1990). Spektrofotometer menghasilkan sinar dan spectrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi. Kebetulan spektrofotometer dibandingkan dengan fotometer adalah panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih terseleksi dan ini diperoleh dengan alat pengurai seperti prisma, grating, atau celah optis. Pada fotometer filter dari berbagai warna yang mempunyai spesifikasi melewatkan trayek panjang gelombang tertentu. Pada fotometer filter tidak mungkin diperoleh panjang gelombang 30-40 nm. Sedangkan pada spektrofotometer, panjang gelombang yang benar-benar terseleksi dapat diperoleh dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum tampak yang kontinyu, monokromator, sel pengabsorbsi untuk larutan sampel blanko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan absorbsi antara sampel dan blanko ataupun pembanding (Khopkar, 2002). Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Sedangkan pengukuran menggunakan spektrofotometer ini, metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri (Riyadi 2009). Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombang dan dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda. Pada spektrofotometri visible yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun.. selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam

sinar tampak (visible) (Riyadi 2009). Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium, karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan. Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau sentrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi (Riyadi 2009). Tingkat kemurnian DNA berkorelasi dengan kualitas DNA. Kualitas DNA dapat ditentukan dengan cara menghitung rasio antara nilai OD260 dan nilai OD280 pada sampel DNA yang diukur melalui spektrofotometer. DNA dinyatakan murni jika memiliki nilai rasio OD260/OD280 (optical density) berkisar antara 1,82,0 (Muladno, 2002). Sambrook et al. (1989) menjelaskan bahwa rasio OD akan lebih besar atau lebih kecil dari nilai 1,8-2,0 jika ditemukan kontaminasi dari protein atau fenol. DNA dikatakan terkontaminasi RNA jika memiliki rasio OD260/OD280 lebih dari dua (Khosravinia et al., 2007). Nilai perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 dan 280 nm dapat digunakan sebagai indikator kemurnian DNA. DNA dinyatakan murni apabila memiliki nilai perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 dan 280 nm berkisar 1,8-2. Hasil pengamatan kualitas DNA dengan spektrofotometer menunjukkan bahwa rata-rata isolat menghasilkan DNA plas-id dengan nilai perbandingan serapan < 1,8. Hal ini menunjukkan masih besarnya kontaminasi RNA dalam sampel. Hal ini memang telah diperkirakan sebelumnya, karena tidak ada perlakuan dengan RNAse dalam isolasi DNA kromosom ini. DNA kromosom dengan nilai A260:A280 >1,8 kemungkinan mengandung asam nukleat dan nilai A260:A280 <1,6 kemungkinan mengandung kontaminan seperti protein serta senyawa-senyawa organik lainnya (Faatih, 2009). Prosedur analisis DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Proses pemisahan DNA dari materi-materi di dalam sel seperti protein, RNA, lipid dan lain-lain merupakan ekstraksi DNA. Sejalan dengan berkembangnya teknik ekstraksi DNA, secara umum dilakukan melalui beberapa tahap yaitu isoloasi dari jaringan, proses pelisisan dinding

dan membran sel, ekstraksi dalam larutan, purifikasi dan kemudian presipitasi atau pemadatan. Ekstraksi DNA memiliki beberapa variasi metode dalam pengerjaannya yaitu dengan metode fenol-kloroform, metode membran dialisis, metode chilex, dan metode boom. Metode fenol kloroform yang diperkenalkan Sambrook dan Russel dalam Toha (2001) adalah metode ekstraksi yang umum dan konvensional. Keberhasilan analisis DNA sangat ditentukan oleh kualitas dan kuantitas hasil ekstraksi DNA. Kualitas dan kuantitas hasil ekstraksi DNA dipengaruhi oleh beberapa faktor salah satunya adalah bahan yang digunakan sebagai sumber DNA. Bahan yang digunakan harus bebas kontaminan dan proses saat ekstraksi DNA . Kontaminan tersebut dapat

berupa bahan biologis individu lain seperti protein, lemak, dan RNA. Kontaminan lain yaitu bahan abiotik tempat bahan diambil contohnya tanah (Krings et all ,1997).

III. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan, dapat diambil kesimpulan sebagai berikut: 1. Kualitas DNA E. coli dan DNA buah hasil isolasi setelah diuji secara kuantitatif dengan menggunakan spektrofotometer E. coli terkontaminasi kemikalia/karbohidrat selain itu juga DNA E. coli terkontaminasi oleh protein, sedangkan DNA buah hasil isolasi menunjukkan adanya kontaminasi dari kemikalia/karbohidrat serta

terkontaminasi oleh RNA. 2. Jumlah dan kualitas DNA dapat diketahui dengan menggunakan alat

spektrofotometer.

B. Saran Sebaiknya mahasiswa atau praktikan mencoba menggunakan spektrofotometer. Supaya praktikan dapat lebih menguasai teknik dalam menggunakan spektrofotometri.

DAFTAR REFERENSI

Dospivova, Dana, Kristyna Smerkova, Marketa Ryvolova, David Hynek, Vojtech Adam, Pavel Kopel, Marie Stiborova, Tomas Eckschlager, Jaromir Hubalek and Rene Kizek. 2012. Catalytic Electrochemical Analysis of Platinum in Pt-DNA Adducts. International Journal of Electrochemical Science., 7 (2012) 3072 3088. Faatih, Mukhlissul. 2009. Isolasi Dan Digesti DNA Kromosom. Jurnal Penelitian Sains & Teknologi, Vol. 10, No. 1, 2009: 61 67. Hardjadi. 1990. Ilmu Kima Analitik Dasar. PT Gramedia: Jakarta. Khopkar. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik. Universitas Indonesia: Jakarta. Khosravinia, H., H. N. Narasimha Murthy, D. T. Parasad, and N. Pirany. 2007. Optimizing factors influencing DNA extraction from fresh whole avian blood. African J. of Biotech. Vol. 6 (4): 481-486. Komalasari, Kokom. 2009. [Skripsi]. Pengaruh Perbandingan Volume Darah Dan Lisis Buffer Serta Kecepatan Sentrifugasi Terhadap Kualitas Produk Dna Pada Sapi Friesian Holstein (Fh). Intstitut Pertanian Bogor: Bogor. Krings M., Stone A., Schmitz R.W., Krainitzki H., Stoneking M., and Pbo S. (1997): Neandertal DNA sequences and the origin of modern humans. Cell, 90:19-30. Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda: Bogor. Restu, Muh, Mukrimin dan Gusmiaty. 2012. Optimalisasi Teknik Ekstraksi dan Isolasi DNA Tanaman Suren (Toona Sureni Merr.) untuk Analisis Keragaman Genetik berdasarkanRandom Amplified PolymorphicDNA (RAPD). Jurnal Natur Indonesia 14(2), Februari 2012: 138-142 ISSN 1410-9379. Riyadi, W. 2009. Macam Spektrofotometri dan Perbedaannya (Vis, UV dan IR). http://wahyuriyadi.blogspot.com. Diakses tanggal 8 Juni 2013. Riyadi, W. 2009. Prinsip Dasar Spektrofotometer Visible. http://wahyuriyadi.blogspot. com. Diakses tanggal 7 Juni 2013. Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Toha, A. H. A. 2001. Biokimia : Metabolisme Biomolekul. Alfabeta. Bandung. Underwood, A. L dan R.A. Day. J. R. 1996. Analisis Kimia Kuantitatif edisi Kelima. Penerbit Erlangga: Jakarta.