PENENTUAN KUALITAS DAN KUANTITAS ASAM NUKLEAT MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETER

Oleh: Nama NIM Kelompok Rombongan Asisten : Siti Nur Azizah : B1J011086 :3 : II : Puspa Dwi Pratiwy

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2013

2009). Uji ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan DNA dalam larutan contoh. PENDAHULUAN A. sementara fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi (Riyadi. Pengujian kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometri. 2011). Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu. Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan/jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan cara uji kualitatif (Larasati. baru dilanjutkan dengan uji kuantitatif DNA dengan metode spekrofotometri. Latar Belakang Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara yaitu secara kualitatif dengan metode Elektroforesis Gel Agarose dan secara kuantitatif dengan metode spektrofotometri.8-2. Spektrofotometri UV-Vis (ultra violet – visible) dan Spektrofotometri Infra Red (Riyadi. Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan fotometer. yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml (Suharsono dan Widyastuti. Setelah itu. kemudian dilakukan dengan uji kualitatif DNA dengan metode elektroforesis gel agarosa. 2006) . spektrofotometri UV (ultra violet). Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi. Untuk mengetahui jumlah DNA. Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. Uji kuantitatif DNA diawali dengan isolasi DNA. 2009). Rasio OD260/OD280 antara 1. Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Terdapat beberapa cara yaitu spektrofotometri Vis (visible). maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 256 nm (260 nm). Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm.I.0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein. Hal ini bertujuan untuk mengeluarkan DNA yang berada dalam inti sel dari organism.

B. Tujuan Praktikum kali ini bertujuan untuk melakukan pengukuran kualitas dan kuantitas DNA hasil isolasi dan mengetahui pengaruh perbedaan perlakuan isolasi DNA terhadap kualitas dan kuantitas DNA yang diperoleh. .

Spektrofotometer UV (dalam praktikum ini digunakan UV-VIS Spectrophotometer Shimadzu model UV Mini 1240). Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum kali ini meliputi akuades steril.II. Sebanyak 10 μL DNA hasil isolasi dilarutkan dalam 3. 2. B. 7. 280 nm. Nilai absorbansi 260 nm yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam rumus untuk menghitung konsentrasi DNA. Untuk mengetahui kemurnian DNA dari protein. 5. dan 320 nm. . Catatlah semua data dan bandingkan antara DNA hasil isolasi dari tanaman dan dari bakteri. Untuk mengetahui ada tidaknya kontaminasi karbohidrat dan kemikalia. MATERI DAN METODE A. Kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 230 nm. 3. Kuvet dan Mikropipet beserta Tip. Metode 1. DNA hasil isolasi dari buah dan bakteri Escherichia coli. Materi Alat-alat yang digunakan pada praktikum kali ini meliputi tissue. Nyalakan mesin spektrofotometer dan tunggulah 15 menit supaya stabil. 6. 260 nm. lakukan pembagian nilai absorbansi 260 nm dengan nilai absorbansi 230 nm.000 μL akuades. lakukan pembagian nilai absorbansi 260 nm dengan nilai absorbansi 280 nm. 4.

1 2 3 4 5 6 Sampel Strawbery Alpukat Pepaya Mangga Buah naga Escherichia coli λ 230 A[S] .013 λ 230 A[S] .009 Tabel 2. HASIL DAN PEMBAHASAN A.08 1.015 -0.023 0.923 λ 230 0.III.046 0.015 0.012 0.011 0.A[B] 0.625 1.069 0.A[B] 0.733 0.A[B] 0.622 1.023 -0.023 λ 260 A[S] .012 0.026 0. Hasil Tabel 1.063 0.019 0.A[B] 0.037 0.533 1.026 -0.3 0.011 0. Perhitungan konsentrasi DNA Kel.160 0.012 -0.130 ~ .045 0.016 0. Perhitugan Konsentrasi DNA terhadap kontaminasi protein dan kemikalia No.4 2.025 0. 1 2 3 4 5 6 λ 260 1300 3.389 0.162 0.012 λ 280 A[S] .150 1250 1150 1300 -600 λ 280 1.

923. Konsentrasi DNA dalam mikrogram per mililiter kemudian diberikan oleh persamaan c (DNA) = 50 · A * 260 dikalikan dengan faktor pengenceran (Dospivova.B. Konsentrasi DNA dari nilai OD sampel dapat dihitung dengan menggunakan persamaan: Konsentrasi DNA (μg/ml) = A260 x 50 x Faktor Pengenceran (Restu et al. Pengukuran DNA melalui spektrofotometer didasarkan pada prinsip iradiasi ultraviolet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan.5212 sedangkan apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 didapatkan hasil 0. A320). 280. Kemurnian akan menjamin tidak terdapatya kontaminasi dari protein. Hasil pengukuran kualitas dan kuantitas DNA terhadap kontaminasi protein dan karbohidrat/kemikalia setelah diuji di spektrofotometer apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 didapatkan hasil 0. 2002). Hal tersebut berguna untuk menguji kemurnian DNA. Penyerapan iradiasi sinar UV secara maksimal oleh DNA dicapai pada panjang gelombang 260 nm. sedangkan penyerapan maksimal oleh protein dicapai pada panjang gelombang 280 nm. Berdasarkan perhitungan. Nilai konsentrasi sampel DNA hasil ekstraksi diukur dengan mengambil 50 µl sampel pada masing-masing tahap. 2012). ataupun zat lain yang dapat mengganggu kuantisasi DNA. 2012). Pembahasan Jumlah dan kualitas DNA dapat diketahui dengan menggunakan alat spektrofotometer atau dengan melihat intensitas molekul DNA dalam gel. dan 320 nm (A260. sedangkan konsentrasi DNA buah adalah 1250 ng/µL. Hal ini menunjukkan adanya kontaminasi dari kemikalia/karbohidrat dengan ditunjukkan nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 nm yang didapatkan kurang dari . coli didapatkan -600 ng/µL. Apabila kepadatan optik (optical density) atau disebut OD260 sama dengan satu maka konsentrasi molekul DNA setara 50 µg/ml (untuk DNA heliks ganda) atau setara 40 µg/ml (untuk RNA atau DNA untai tunggal) atau setara 20 µg/ml (untuk oligonukleotida untai tunggal) (Muladno.. Cara pengukuran kuantitas DNA juga diungkapkan oleh (2012) yang menyatakan bahwa Jumlah DNA dihitung dengan menggunakan spektrofometri dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa panjang gelombang misalnya 260. A280. Pada spektrofotometer digunakan metode panjang gelombang tunggal (Single Wave Length) dan OD diukur pada panjang gelombang 260 nm. Sampel dipipet pada platspektrofotometer untuk memperoleh OD (Optical Density). konsentrasi DNA E.

hal ini ditunjukkan dari nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm yang didapatkan lebih dari 1.8. Bila nilai perbandingan tersebut lebih rendah dari 1. sedangkan apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 didapatkan hasil 2. Alat yang digunakan adalah spektrofotometer. dan menunjukkan pita tunggal (Komalasari. coli terkontaminasi oleh protein.8. bila nilai tersebut lebih rendah dari 2. 2009) yang menyatakan bahwa kualitas asam nukleat ditentukan berdasarkan atas tingkat kemurniannya. yaitu suatu alat yang di gunakan untuk menentukan suatu senyawa baik secara kuantitatif maupun . Kualitas DNA pada hasil elektroforesis menunjukan hasil berbanding lurus dengan konsentrasi DNA. hal ini ditunjukkan dari nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm yang didapatkan kurang dari 1. Namun.3.8.2. bila nilai perbandingan tersebut lebih tinggi dari 1.2. selain itu juga DNA E. 2009). Hasil pengamatan kualitas DNA buah papaya didapatkan hasil bahwa konsentrasi DNA terhadap kontaminasi protein dan karbohidrat/kemikalia setelah diuji di spektrofotometer apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 yaitu 0. hal ini menandakan penggunaan blanko yang tidak sesuai dengan pelarut DNA atau RNA yang digunakan.8.08. untuk DNA. dikatakan bahwa asam nukleat terkontaminasi oleh karbohidrat. Sebaliknya. materi organik lain atau pun kemikalia yang terbawa saat dilakukan proses isolasi. jika perbandingan nilai absorbansi tersebut lebih tinggi dari 2. Sebaliknya.2. dikatakan bahwa DNA terkontaminasi oleh RNA. kemurnian dikatakan tertinggi apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm mendekati 1. ditunjukkan dari nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 nm yang didapatkan kurang dari 2. dikatakan bahwa DNA terkontaminasi oleh protein. Kemurnian asam nukleat dari pengotor karbohidrat atau pun materi organik lain dan kemikalia ditentukan berdasarkan perbandingan nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm terhadap absorbansi pada panjang gelombang 230 nm. dikatakan bahwa sampel asam nukleat yang diukur murni. selain itu juga DNA buah papaya terkontaminasi oleh RNA. Hal ini sesuai dengan pernyataan (Faatih. Bila nilai perbandingan absorbansi tersebut berkisar dari 2 hingga 2. Hal ini menunjukkan adanya kontaminasi dari kemikalia/karbohidrat.8. Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar makromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan fototube atau tabung foton hampa. Kemurnian RNA sendiri dikatakan tertinggi jika nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm mendekati 2.

Pada spektrofotometri visible yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). monokromator.kualitatif dengan mengukur transmitan atau absorbansi dari suatu cuplikan sebagai fungsi dari konsentrasi. Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi. 1990). sinar yang digunakan merupakan satu berkas yang panjangnya tidak berbeda banyak antara satu dengan yang lainnya. merah. maka sinar tersebut termasuk ke dalam . Sedangkan pengukuran menggunakan spektrofotometer ini. biru. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombang dan dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda. atau celah optis. Kebetulan spektrofotometer dibandingkan dengan fotometer adalah panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih terseleksi dan ini diperoleh dengan alat pengurai seperti prisma. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum tampak yang kontinyu. 2002). apapun. Spektrofotometer menghasilkan sinar dan spectrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi. Sedangkan pada spektrofotometer. Pada fotometer filter dari berbagai warna yang mempunyai spesifikasi melewatkan trayek panjang gelombang tertentu. Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. grating. hijau. Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. sel pengabsorbsi untuk larutan sampel blanko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan absorbsi antara sampel dan blanko ataupun pembanding (Khopkar. Pada titrasi spektrofotometri. Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. panjang gelombang yang benar-benar terseleksi dapat diperoleh dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma. selama ia dapat dilihat oleh mata. metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri (Riyadi 2009).. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita. entah itu putih. Pada fotometer filter tidak mungkin diperoleh panjang gelombang 30-40 nm. sedangkan dalam kalorimetri perbedaan panjang gelombang dapat lebih besar (Hardjadi.

karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna. Namun perlu diingat. Bening dan transparan. pada spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sambrook et al.82. lipid dan lain-lain merupakan ekstraksi DNA. DNA dinyatakan murni apabila memiliki nilai perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 dan 280 nm berkisar 1. 2002). Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi (Riyadi 2009). (1989) menjelaskan bahwa rasio OD akan lebih besar atau lebih kecil dari nilai 1.0 jika ditemukan kontaminasi dari protein atau fenol. maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Sejalan dengan berkembangnya teknik ekstraksi DNA. Nilai perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 dan 280 nm dapat digunakan sebagai indikator kemurnian DNA. DNA dinyatakan murni jika memiliki nilai rasio OD260/OD280 (optical density) berkisar antara 1. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. proses pelisisan dinding .8-2. Tingkat kemurnian DNA berkorelasi dengan kualitas DNA. secara umum dilakukan melalui beberapa tahap yaitu isoloasi dari jaringan. Hasil pengamatan kualitas DNA dengan spektrofotometer menunjukkan bahwa rata-rata isolat menghasilkan DNA plas-id dengan nilai perbandingan serapan < 1. sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau sentrifugasi. 2009).. Prosedur analisis DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. 2007). RNA. Oleh karena itu. sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu.8 kemungkinan mengandung asam nukleat dan nilai A260:A280 <1.0 (Muladno.sinar tampak (visible) (Riyadi 2009).8. Berbeda dengan spektrofotometri visible. DNA kromosom dengan nilai A260:A280 >1. Proses pemisahan DNA dari materi-materi di dalam sel seperti protein. Hal ini menunjukkan masih besarnya kontaminasi RNA dalam sampel.6 kemungkinan mengandung kontaminan seperti protein serta senyawa-senyawa organik lainnya (Faatih. Hal ini memang telah diperkirakan sebelumnya. DNA dikatakan terkontaminasi RNA jika memiliki rasio OD260/OD280 lebih dari dua (Khosravinia et al. Kualitas DNA dapat ditentukan dengan cara menghitung rasio antara nilai OD260 dan nilai OD280 pada sampel DNA yang diukur melalui spektrofotometer.8-2. karena tidak ada perlakuan dengan RNAse dalam isolasi DNA kromosom ini.

purifikasi dan kemudian presipitasi atau pemadatan.dan membran sel. Keberhasilan analisis DNA sangat ditentukan oleh kualitas dan kuantitas hasil ekstraksi DNA. metode chilex. Kontaminan tersebut dapat berupa bahan biologis individu lain seperti protein. dan metode boom. ekstraksi dalam larutan. Ekstraksi DNA memiliki beberapa variasi metode dalam pengerjaannya yaitu dengan metode fenol-kloroform. Metode fenol kloroform yang diperkenalkan Sambrook dan Russel dalam Toha (2001) adalah metode ekstraksi yang umum dan konvensional. Kualitas dan kuantitas hasil ekstraksi DNA dipengaruhi oleh beberapa faktor salah satunya adalah bahan yang digunakan sebagai sumber DNA. lemak. dan RNA. Bahan yang digunakan harus bebas kontaminan dan proses saat ekstraksi DNA . . Kontaminan lain yaitu bahan abiotik tempat bahan diambil contohnya tanah (Krings et all . metode membran dialisis.1997).

Supaya praktikan dapat lebih menguasai teknik dalam menggunakan spektrofotometri. 2. dapat diambil kesimpulan sebagai berikut: 1. B. sedangkan DNA buah hasil isolasi menunjukkan adanya kontaminasi dari kemikalia/karbohidrat serta terkontaminasi oleh RNA. coli terkontaminasi kemikalia/karbohidrat selain itu juga DNA E. Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan. Saran Sebaiknya mahasiswa atau praktikan mencoba menggunakan spektrofotometer. coli dan DNA buah hasil isolasi setelah diuji secara kuantitatif dengan menggunakan spektrofotometer E. coli terkontaminasi oleh protein. Jumlah dan kualitas DNA dapat diketahui dengan menggunakan alat spektrofotometer. . Kualitas DNA E.III. KESIMPULAN DAN SARAN A.

DAFTAR REFERENSI Dospivova. Cell. J. D. com. 2009. Optimalisasi Teknik Ekstraksi dan Isolasi DNA Tanaman Suren (Toona Sureni Merr. 1. 1989.W. Diakses tanggal 7 Juni 2013. New York... J. Underwood. E. Mukrimin dan Gusmiaty. R. Jurnal Penelitian Sains & Teknologi. David Hynek. Riyadi. Sambrook. (1997): Neandertal DNA sequences and the origin of modern humans. Kristyna Smerkova. A. Fritsch. Prinsip Dasar Spektrofotometer Visible. T.. Pengaruh Perbandingan Volume Darah Dan Lisis Buffer Serta Kecepatan Sentrifugasi Terhadap Kualitas Produk Dna Pada Sapi Friesian Holstein (Fh). Penerbit Erlangga: Jakarta. Isolasi Dan Digesti DNA Kromosom. 2002. L dan R. 2009. Marie Stiborova. 2007. Parasad. H. and N. Diakses tanggal 8 Juni 2013. and T. UV dan IR). 2009. Optimizing factors influencing DNA extraction from fresh whole avian blood. Komalasari. Khopkar. [Skripsi]. Pirany. Macam Spektrofotometri dan Perbedaannya (Vis. Day. Catalytic Electrochemical Analysis of Platinum in Pt-DNA Adducts. F. Marketa Ryvolova. 2002. Februari 2012: 138-142 ISSN 1410-9379. PT Gramedia: Jakarta.. Jurnal Natur Indonesia 14(2). Jaromir Hubalek and Rene Kizek. 90:19-30. http://wahyuriyadi.com. Hardjadi. 2nd edition. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. H. Narasimha Murthy. 1990. Vol. 2012. Khosravinia. Kokom. 2012. Maniatis. International Journal of Electrochemical Science. Ilmu Kima Analitik Dasar. Toha. Dana. Intstitut Pertanian Bogor: Bogor. Konsep Dasar Kimia Analitik. and Pääbo S. Biokimia : Metabolisme Biomolekul. Alfabeta. 7 (2012) 3072 – 3088. Vol. Universitas Indonesia: Jakarta. Muladno. 1996. African J. Riyadi. . No.A. Faatih.. Stoneking M. Cold Spring Harbor Laboratory Press. A.blogspot. Tomas Eckschlager. Restu.) untuk Analisis Keragaman Genetik berdasarkanRandom Amplified PolymorphicDNA (RAPD). 2001. A. N. Bandung. Pustaka Wirausaha Muda: Bogor. Stone A.blogspot... 6 (4): 481-486.. Krainitzki H. 2009. W. H. W. Pavel Kopel. Muh. Vojtech Adam. Krings M. of Biotech. Schmitz R. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Analisis Kimia Kuantitatif edisi Kelima. 10. 2009: 61 – 67. http://wahyuriyadi. Mukhlissul.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful