PENENTUAN KUALITAS DAN KUANTITAS ASAM NUKLEAT MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETER

Oleh: Nama NIM Kelompok Rombongan Asisten : Siti Nur Azizah : B1J011086 :3 : II : Puspa Dwi Pratiwy

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2013

Terdapat beberapa cara yaitu spektrofotometri Vis (visible). kemudian dilakukan dengan uji kualitatif DNA dengan metode elektroforesis gel agarosa. Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Rasio OD260/OD280 antara 1. 2009).0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein. baru dilanjutkan dengan uji kuantitatif DNA dengan metode spekrofotometri. spektrofotometri UV (ultra violet). 2009). Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan fotometer. Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan/jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan cara uji kualitatif (Larasati. Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm.I. Uji ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan DNA dalam larutan contoh. Latar Belakang Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara yaitu secara kualitatif dengan metode Elektroforesis Gel Agarose dan secara kuantitatif dengan metode spektrofotometri. yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml (Suharsono dan Widyastuti. Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume.8-2. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu. maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 256 nm (260 nm). Uji kuantitatif DNA diawali dengan isolasi DNA. Spektrofotometri UV-Vis (ultra violet – visible) dan Spektrofotometri Infra Red (Riyadi. Setelah itu. sementara fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi (Riyadi. Hal ini bertujuan untuk mengeluarkan DNA yang berada dalam inti sel dari organism. PENDAHULUAN A. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi. 2006) . Pengujian kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometri. Untuk mengetahui jumlah DNA. 2011).

. Tujuan Praktikum kali ini bertujuan untuk melakukan pengukuran kualitas dan kuantitas DNA hasil isolasi dan mengetahui pengaruh perbedaan perlakuan isolasi DNA terhadap kualitas dan kuantitas DNA yang diperoleh.B.

000 μL akuades.II. 5. dan 320 nm. 3. DNA hasil isolasi dari buah dan bakteri Escherichia coli. 4. 6. Untuk mengetahui kemurnian DNA dari protein. B. Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum kali ini meliputi akuades steril. Metode 1. lakukan pembagian nilai absorbansi 260 nm dengan nilai absorbansi 280 nm. 260 nm. Nyalakan mesin spektrofotometer dan tunggulah 15 menit supaya stabil. Kuvet dan Mikropipet beserta Tip. Sebanyak 10 μL DNA hasil isolasi dilarutkan dalam 3. lakukan pembagian nilai absorbansi 260 nm dengan nilai absorbansi 230 nm. 7. MATERI DAN METODE A. 2. 280 nm. Materi Alat-alat yang digunakan pada praktikum kali ini meliputi tissue. Spektrofotometer UV (dalam praktikum ini digunakan UV-VIS Spectrophotometer Shimadzu model UV Mini 1240). Nilai absorbansi 260 nm yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam rumus untuk menghitung konsentrasi DNA. Kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 230 nm. Catatlah semua data dan bandingkan antara DNA hasil isolasi dari tanaman dan dari bakteri. . Untuk mengetahui ada tidaknya kontaminasi karbohidrat dan kemikalia.

389 0.A[B] 0.023 0.012 0. Perhitugan Konsentrasi DNA terhadap kontaminasi protein dan kemikalia No.023 -0.012 λ 280 A[S] .A[B] 0.A[B] 0.162 0. Hasil Tabel 1.4 2.026 0.011 0.069 0.3 0.533 1.012 -0.013 λ 230 A[S] .160 0.08 1.016 0.622 1. 1 2 3 4 5 6 Sampel Strawbery Alpukat Pepaya Mangga Buah naga Escherichia coli λ 230 A[S] .130 ~ .046 0.009 Tabel 2.015 0.025 0.015 -0.A[B] 0.150 1250 1150 1300 -600 λ 280 1. Perhitungan konsentrasi DNA Kel.063 0. 1 2 3 4 5 6 λ 260 1300 3.923 λ 230 0.045 0.037 0.012 0.011 0.III.019 0.625 1.026 -0. HASIL DAN PEMBAHASAN A.023 λ 260 A[S] .733 0.

Apabila kepadatan optik (optical density) atau disebut OD260 sama dengan satu maka konsentrasi molekul DNA setara 50 µg/ml (untuk DNA heliks ganda) atau setara 40 µg/ml (untuk RNA atau DNA untai tunggal) atau setara 20 µg/ml (untuk oligonukleotida untai tunggal) (Muladno. Pembahasan Jumlah dan kualitas DNA dapat diketahui dengan menggunakan alat spektrofotometer atau dengan melihat intensitas molekul DNA dalam gel. coli didapatkan -600 ng/µL. Hal tersebut berguna untuk menguji kemurnian DNA. sedangkan penyerapan maksimal oleh protein dicapai pada panjang gelombang 280 nm. 2002). A280.. Sampel dipipet pada platspektrofotometer untuk memperoleh OD (Optical Density). Hal ini menunjukkan adanya kontaminasi dari kemikalia/karbohidrat dengan ditunjukkan nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 nm yang didapatkan kurang dari . 280. konsentrasi DNA E. A320). Konsentrasi DNA dalam mikrogram per mililiter kemudian diberikan oleh persamaan c (DNA) = 50 · A * 260 dikalikan dengan faktor pengenceran (Dospivova. ataupun zat lain yang dapat mengganggu kuantisasi DNA. sedangkan konsentrasi DNA buah adalah 1250 ng/µL. 2012).5212 sedangkan apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 didapatkan hasil 0.923. Pada spektrofotometer digunakan metode panjang gelombang tunggal (Single Wave Length) dan OD diukur pada panjang gelombang 260 nm. Kemurnian akan menjamin tidak terdapatya kontaminasi dari protein. Penyerapan iradiasi sinar UV secara maksimal oleh DNA dicapai pada panjang gelombang 260 nm. Pengukuran DNA melalui spektrofotometer didasarkan pada prinsip iradiasi ultraviolet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan. dan 320 nm (A260. Hasil pengukuran kualitas dan kuantitas DNA terhadap kontaminasi protein dan karbohidrat/kemikalia setelah diuji di spektrofotometer apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 didapatkan hasil 0. Cara pengukuran kuantitas DNA juga diungkapkan oleh (2012) yang menyatakan bahwa Jumlah DNA dihitung dengan menggunakan spektrofometri dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa panjang gelombang misalnya 260. Konsentrasi DNA dari nilai OD sampel dapat dihitung dengan menggunakan persamaan: Konsentrasi DNA (μg/ml) = A260 x 50 x Faktor Pengenceran (Restu et al.B. Nilai konsentrasi sampel DNA hasil ekstraksi diukur dengan mengambil 50 µl sampel pada masing-masing tahap. 2012). Berdasarkan perhitungan.

hal ini ditunjukkan dari nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm yang didapatkan kurang dari 1. materi organik lain atau pun kemikalia yang terbawa saat dilakukan proses isolasi. Hal ini menunjukkan adanya kontaminasi dari kemikalia/karbohidrat. hal ini ditunjukkan dari nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm yang didapatkan lebih dari 1. selain itu juga DNA buah papaya terkontaminasi oleh RNA. Kemurnian asam nukleat dari pengotor karbohidrat atau pun materi organik lain dan kemikalia ditentukan berdasarkan perbandingan nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm terhadap absorbansi pada panjang gelombang 230 nm. yaitu suatu alat yang di gunakan untuk menentukan suatu senyawa baik secara kuantitatif maupun . jika perbandingan nilai absorbansi tersebut lebih tinggi dari 2.2. dikatakan bahwa asam nukleat terkontaminasi oleh karbohidrat.8. Kualitas DNA pada hasil elektroforesis menunjukan hasil berbanding lurus dengan konsentrasi DNA. bila nilai tersebut lebih rendah dari 2. 2009) yang menyatakan bahwa kualitas asam nukleat ditentukan berdasarkan atas tingkat kemurniannya.8. bila nilai perbandingan tersebut lebih tinggi dari 1. Namun.8. dikatakan bahwa sampel asam nukleat yang diukur murni. dan menunjukkan pita tunggal (Komalasari. Hal ini sesuai dengan pernyataan (Faatih. 2009). hal ini menandakan penggunaan blanko yang tidak sesuai dengan pelarut DNA atau RNA yang digunakan. Bila nilai perbandingan tersebut lebih rendah dari 1. sedangkan apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 didapatkan hasil 2. selain itu juga DNA E. Kemurnian RNA sendiri dikatakan tertinggi jika nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm mendekati 2. ditunjukkan dari nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 nm yang didapatkan kurang dari 2. dikatakan bahwa DNA terkontaminasi oleh RNA.8. coli terkontaminasi oleh protein. kemurnian dikatakan tertinggi apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm mendekati 1. untuk DNA.08. Alat yang digunakan adalah spektrofotometer. Hasil pengamatan kualitas DNA buah papaya didapatkan hasil bahwa konsentrasi DNA terhadap kontaminasi protein dan karbohidrat/kemikalia setelah diuji di spektrofotometer apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 yaitu 0.2. Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar makromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan fototube atau tabung foton hampa.8.2. Sebaliknya. Bila nilai perbandingan absorbansi tersebut berkisar dari 2 hingga 2. dikatakan bahwa DNA terkontaminasi oleh protein.3. Sebaliknya.

biru. Sedangkan pengukuran menggunakan spektrofotometer ini. sedangkan dalam kalorimetri perbedaan panjang gelombang dapat lebih besar (Hardjadi. metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri (Riyadi 2009). Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Spektrofotometer menghasilkan sinar dan spectrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi. panjang gelombang yang benar-benar terseleksi dapat diperoleh dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma. monokromator. Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Sedangkan pada spektrofotometer. hijau.. maka sinar tersebut termasuk ke dalam . Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita. selama ia dapat dilihat oleh mata. Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi. sinar yang digunakan merupakan satu berkas yang panjangnya tidak berbeda banyak antara satu dengan yang lainnya. Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. entah itu putih. merah. Pada fotometer filter dari berbagai warna yang mempunyai spesifikasi melewatkan trayek panjang gelombang tertentu.kualitatif dengan mengukur transmitan atau absorbansi dari suatu cuplikan sebagai fungsi dari konsentrasi. 2002). sel pengabsorbsi untuk larutan sampel blanko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan absorbsi antara sampel dan blanko ataupun pembanding (Khopkar. atau celah optis. Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Pada fotometer filter tidak mungkin diperoleh panjang gelombang 30-40 nm. Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombang dan dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda. Pada titrasi spektrofotometri. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum tampak yang kontinyu. apapun. Pada spektrofotometri visible yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). 1990). Kebetulan spektrofotometer dibandingkan dengan fotometer adalah panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih terseleksi dan ini diperoleh dengan alat pengurai seperti prisma. grating.

DNA kromosom dengan nilai A260:A280 >1.82. Hasil pengamatan kualitas DNA dengan spektrofotometer menunjukkan bahwa rata-rata isolat menghasilkan DNA plas-id dengan nilai perbandingan serapan < 1. 2002). Hal ini memang telah diperkirakan sebelumnya.0 jika ditemukan kontaminasi dari protein atau fenol. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium. Kualitas DNA dapat ditentukan dengan cara menghitung rasio antara nilai OD260 dan nilai OD280 pada sampel DNA yang diukur melalui spektrofotometer. Proses pemisahan DNA dari materi-materi di dalam sel seperti protein. Bening dan transparan. 2009). proses pelisisan dinding . pada spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Oleh karena itu.8-2. karena tidak ada perlakuan dengan RNAse dalam isolasi DNA kromosom ini. (1989) menjelaskan bahwa rasio OD akan lebih besar atau lebih kecil dari nilai 1. Nilai perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 dan 280 nm dapat digunakan sebagai indikator kemurnian DNA.0 (Muladno. 2007). sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu.8-2. lipid dan lain-lain merupakan ekstraksi DNA. Namun perlu diingat. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Hal ini menunjukkan masih besarnya kontaminasi RNA dalam sampel. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Berbeda dengan spektrofotometri visible. DNA dikatakan terkontaminasi RNA jika memiliki rasio OD260/OD280 lebih dari dua (Khosravinia et al. Sejalan dengan berkembangnya teknik ekstraksi DNA. DNA dinyatakan murni apabila memiliki nilai perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 dan 280 nm berkisar 1. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi (Riyadi 2009).8. DNA dinyatakan murni jika memiliki nilai rasio OD260/OD280 (optical density) berkisar antara 1.sinar tampak (visible) (Riyadi 2009). Tingkat kemurnian DNA berkorelasi dengan kualitas DNA.. karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita. Sambrook et al. RNA.8 kemungkinan mengandung asam nukleat dan nilai A260:A280 <1. Prosedur analisis DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. secara umum dilakukan melalui beberapa tahap yaitu isoloasi dari jaringan. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna.6 kemungkinan mengandung kontaminan seperti protein serta senyawa-senyawa organik lainnya (Faatih. sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau sentrifugasi. maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna.

metode chilex. dan metode boom. purifikasi dan kemudian presipitasi atau pemadatan. .dan membran sel. metode membran dialisis.1997). Kontaminan tersebut dapat berupa bahan biologis individu lain seperti protein. Kontaminan lain yaitu bahan abiotik tempat bahan diambil contohnya tanah (Krings et all . lemak. Kualitas dan kuantitas hasil ekstraksi DNA dipengaruhi oleh beberapa faktor salah satunya adalah bahan yang digunakan sebagai sumber DNA. Metode fenol kloroform yang diperkenalkan Sambrook dan Russel dalam Toha (2001) adalah metode ekstraksi yang umum dan konvensional. Ekstraksi DNA memiliki beberapa variasi metode dalam pengerjaannya yaitu dengan metode fenol-kloroform. ekstraksi dalam larutan. Keberhasilan analisis DNA sangat ditentukan oleh kualitas dan kuantitas hasil ekstraksi DNA. Bahan yang digunakan harus bebas kontaminan dan proses saat ekstraksi DNA . dan RNA.

Jumlah dan kualitas DNA dapat diketahui dengan menggunakan alat spektrofotometer. coli terkontaminasi kemikalia/karbohidrat selain itu juga DNA E. B. sedangkan DNA buah hasil isolasi menunjukkan adanya kontaminasi dari kemikalia/karbohidrat serta terkontaminasi oleh RNA. 2. Saran Sebaiknya mahasiswa atau praktikan mencoba menggunakan spektrofotometer. Supaya praktikan dapat lebih menguasai teknik dalam menggunakan spektrofotometri. .III. dapat diambil kesimpulan sebagai berikut: 1. coli terkontaminasi oleh protein. coli dan DNA buah hasil isolasi setelah diuji secara kuantitatif dengan menggunakan spektrofotometer E. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kualitas DNA E. Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan.

Jurnal Penelitian Sains & Teknologi. Ilmu Kima Analitik Dasar. 2002.W. and N. Kristyna Smerkova. Muladno. International Journal of Electrochemical Science. A. R. and Pääbo S. Konsep Dasar Kimia Analitik. Cold Spring Harbor Laboratory Press.. 1990. 2001. D. com. A. 2009. http://wahyuriyadi. Stone A. Mukrimin dan Gusmiaty. Restu. Tomas Eckschlager. J. Vol. Isolasi Dan Digesti DNA Kromosom. Underwood. 2009. 2009. Marketa Ryvolova. and T.com. http://wahyuriyadi. H. 90:19-30. Maniatis. Biokimia : Metabolisme Biomolekul. Khopkar. Cell. 2nd edition. Riyadi. Pirany. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Parasad. T. Universitas Indonesia: Jakarta. 2007. 2012.. Hardjadi. 2009: 61 – 67. Vojtech Adam.) untuk Analisis Keragaman Genetik berdasarkanRandom Amplified PolymorphicDNA (RAPD). New York. Sambrook. Fritsch.blogspot. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika.. Macam Spektrofotometri dan Perbedaannya (Vis. David Hynek. A.. PT Gramedia: Jakarta. African J. L dan R. Analisis Kimia Kuantitatif edisi Kelima. Diakses tanggal 7 Juni 2013. 6 (4): 481-486. Pavel Kopel. (1997): Neandertal DNA sequences and the origin of modern humans. Mukhlissul. Khosravinia. Intstitut Pertanian Bogor: Bogor. H. 1. Penerbit Erlangga: Jakarta. UV dan IR). Kokom. Riyadi. Schmitz R.. of Biotech. Faatih. J. Komalasari. Pustaka Wirausaha Muda: Bogor. Catalytic Electrochemical Analysis of Platinum in Pt-DNA Adducts.blogspot. 1996. H.A. Jaromir Hubalek and Rene Kizek. 2012. 10. Alfabeta. F. No. Februari 2012: 138-142 ISSN 1410-9379. Dana. Toha. Krainitzki H. E. W. 2002. Narasimha Murthy. Prinsip Dasar Spektrofotometer Visible. Day. . N. Jurnal Natur Indonesia 14(2).. Pengaruh Perbandingan Volume Darah Dan Lisis Buffer Serta Kecepatan Sentrifugasi Terhadap Kualitas Produk Dna Pada Sapi Friesian Holstein (Fh). W. 1989. Optimizing factors influencing DNA extraction from fresh whole avian blood. Krings M. 7 (2012) 3072 – 3088..DAFTAR REFERENSI Dospivova. [Skripsi]. Vol. Stoneking M. Optimalisasi Teknik Ekstraksi dan Isolasi DNA Tanaman Suren (Toona Sureni Merr. Muh.. Diakses tanggal 8 Juni 2013. Marie Stiborova. 2009. Bandung.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful