PENENTUAN KUALITAS DAN KUANTITAS ASAM NUKLEAT MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETER

Oleh: Nama NIM Kelompok Rombongan Asisten : Siti Nur Azizah : B1J011086 :3 : II : Puspa Dwi Pratiwy

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2013

sementara fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi (Riyadi. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi. 2009).I. 2009). Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan/jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan cara uji kualitatif (Larasati. Uji ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan DNA dalam larutan contoh. PENDAHULUAN A. Uji kuantitatif DNA diawali dengan isolasi DNA. spektrofotometri UV (ultra violet). 2011). Hal ini bertujuan untuk mengeluarkan DNA yang berada dalam inti sel dari organism. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu. Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. Setelah itu. Spektrofotometri UV-Vis (ultra violet – visible) dan Spektrofotometri Infra Red (Riyadi. kemudian dilakukan dengan uji kualitatif DNA dengan metode elektroforesis gel agarosa. baru dilanjutkan dengan uji kuantitatif DNA dengan metode spekrofotometri. Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan fotometer. Latar Belakang Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara yaitu secara kualitatif dengan metode Elektroforesis Gel Agarose dan secara kuantitatif dengan metode spektrofotometri. 2006) .8-2. Untuk mengetahui jumlah DNA. yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml (Suharsono dan Widyastuti.0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein. Pengujian kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometri. maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 256 nm (260 nm). Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Terdapat beberapa cara yaitu spektrofotometri Vis (visible). Rasio OD260/OD280 antara 1.

B. Tujuan Praktikum kali ini bertujuan untuk melakukan pengukuran kualitas dan kuantitas DNA hasil isolasi dan mengetahui pengaruh perbedaan perlakuan isolasi DNA terhadap kualitas dan kuantitas DNA yang diperoleh. .

280 nm. DNA hasil isolasi dari buah dan bakteri Escherichia coli. Untuk mengetahui kemurnian DNA dari protein. Materi Alat-alat yang digunakan pada praktikum kali ini meliputi tissue. B. lakukan pembagian nilai absorbansi 260 nm dengan nilai absorbansi 230 nm. MATERI DAN METODE A. 5. 2. Untuk mengetahui ada tidaknya kontaminasi karbohidrat dan kemikalia. Kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 230 nm. 6. Spektrofotometer UV (dalam praktikum ini digunakan UV-VIS Spectrophotometer Shimadzu model UV Mini 1240). Metode 1. Catatlah semua data dan bandingkan antara DNA hasil isolasi dari tanaman dan dari bakteri. 4. . 7. 3. 260 nm. dan 320 nm. lakukan pembagian nilai absorbansi 260 nm dengan nilai absorbansi 280 nm. Kuvet dan Mikropipet beserta Tip.000 μL akuades. Sebanyak 10 μL DNA hasil isolasi dilarutkan dalam 3.II. Nyalakan mesin spektrofotometer dan tunggulah 15 menit supaya stabil. Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum kali ini meliputi akuades steril. Nilai absorbansi 260 nm yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam rumus untuk menghitung konsentrasi DNA.

389 0.013 λ 230 A[S] .622 1.150 1250 1150 1300 -600 λ 280 1.011 0.015 -0.026 -0.011 0.162 0.923 λ 230 0.012 0.III.733 0.A[B] 0.023 λ 260 A[S] .069 0. HASIL DAN PEMBAHASAN A.A[B] 0.3 0.015 0. 1 2 3 4 5 6 λ 260 1300 3.012 0.045 0.016 0.130 ~ .009 Tabel 2.025 0.023 0.063 0.023 -0.4 2.037 0. Hasil Tabel 1.026 0.012 -0.A[B] 0. 1 2 3 4 5 6 Sampel Strawbery Alpukat Pepaya Mangga Buah naga Escherichia coli λ 230 A[S] . Perhitungan konsentrasi DNA Kel.625 1.160 0.019 0.046 0.08 1.A[B] 0.533 1. Perhitugan Konsentrasi DNA terhadap kontaminasi protein dan kemikalia No.012 λ 280 A[S] .

2002).5212 sedangkan apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 didapatkan hasil 0.923. 2012). konsentrasi DNA E. Pengukuran DNA melalui spektrofotometer didasarkan pada prinsip iradiasi ultraviolet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan. Konsentrasi DNA dalam mikrogram per mililiter kemudian diberikan oleh persamaan c (DNA) = 50 · A * 260 dikalikan dengan faktor pengenceran (Dospivova. Pada spektrofotometer digunakan metode panjang gelombang tunggal (Single Wave Length) dan OD diukur pada panjang gelombang 260 nm. Hal ini menunjukkan adanya kontaminasi dari kemikalia/karbohidrat dengan ditunjukkan nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 nm yang didapatkan kurang dari . Pembahasan Jumlah dan kualitas DNA dapat diketahui dengan menggunakan alat spektrofotometer atau dengan melihat intensitas molekul DNA dalam gel. Apabila kepadatan optik (optical density) atau disebut OD260 sama dengan satu maka konsentrasi molekul DNA setara 50 µg/ml (untuk DNA heliks ganda) atau setara 40 µg/ml (untuk RNA atau DNA untai tunggal) atau setara 20 µg/ml (untuk oligonukleotida untai tunggal) (Muladno. sedangkan konsentrasi DNA buah adalah 1250 ng/µL. 2012). Nilai konsentrasi sampel DNA hasil ekstraksi diukur dengan mengambil 50 µl sampel pada masing-masing tahap. dan 320 nm (A260. A320). Sampel dipipet pada platspektrofotometer untuk memperoleh OD (Optical Density). sedangkan penyerapan maksimal oleh protein dicapai pada panjang gelombang 280 nm. coli didapatkan -600 ng/µL.. 280. Konsentrasi DNA dari nilai OD sampel dapat dihitung dengan menggunakan persamaan: Konsentrasi DNA (μg/ml) = A260 x 50 x Faktor Pengenceran (Restu et al. A280. Hasil pengukuran kualitas dan kuantitas DNA terhadap kontaminasi protein dan karbohidrat/kemikalia setelah diuji di spektrofotometer apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 didapatkan hasil 0.B. Cara pengukuran kuantitas DNA juga diungkapkan oleh (2012) yang menyatakan bahwa Jumlah DNA dihitung dengan menggunakan spektrofometri dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa panjang gelombang misalnya 260. Penyerapan iradiasi sinar UV secara maksimal oleh DNA dicapai pada panjang gelombang 260 nm. Hal tersebut berguna untuk menguji kemurnian DNA. Berdasarkan perhitungan. Kemurnian akan menjamin tidak terdapatya kontaminasi dari protein. ataupun zat lain yang dapat mengganggu kuantisasi DNA.

Hal ini sesuai dengan pernyataan (Faatih. selain itu juga DNA buah papaya terkontaminasi oleh RNA. bila nilai tersebut lebih rendah dari 2. ditunjukkan dari nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 nm yang didapatkan kurang dari 2.2. Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar makromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan fototube atau tabung foton hampa.8. coli terkontaminasi oleh protein.8. sedangkan apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 didapatkan hasil 2. Bila nilai perbandingan tersebut lebih rendah dari 1. jika perbandingan nilai absorbansi tersebut lebih tinggi dari 2.8. dan menunjukkan pita tunggal (Komalasari. Namun. Kemurnian RNA sendiri dikatakan tertinggi jika nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm mendekati 2. 2009) yang menyatakan bahwa kualitas asam nukleat ditentukan berdasarkan atas tingkat kemurniannya.2. materi organik lain atau pun kemikalia yang terbawa saat dilakukan proses isolasi. 2009). Bila nilai perbandingan absorbansi tersebut berkisar dari 2 hingga 2. Hal ini menunjukkan adanya kontaminasi dari kemikalia/karbohidrat. dikatakan bahwa sampel asam nukleat yang diukur murni. Sebaliknya. selain itu juga DNA E. kemurnian dikatakan tertinggi apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm mendekati 1. dikatakan bahwa DNA terkontaminasi oleh RNA. bila nilai perbandingan tersebut lebih tinggi dari 1. hal ini ditunjukkan dari nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm yang didapatkan lebih dari 1. hal ini ditunjukkan dari nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm yang didapatkan kurang dari 1. Sebaliknya. yaitu suatu alat yang di gunakan untuk menentukan suatu senyawa baik secara kuantitatif maupun . Kemurnian asam nukleat dari pengotor karbohidrat atau pun materi organik lain dan kemikalia ditentukan berdasarkan perbandingan nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm terhadap absorbansi pada panjang gelombang 230 nm. Hasil pengamatan kualitas DNA buah papaya didapatkan hasil bahwa konsentrasi DNA terhadap kontaminasi protein dan karbohidrat/kemikalia setelah diuji di spektrofotometer apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 yaitu 0. dikatakan bahwa asam nukleat terkontaminasi oleh karbohidrat.8.8. dikatakan bahwa DNA terkontaminasi oleh protein. Alat yang digunakan adalah spektrofotometer. hal ini menandakan penggunaan blanko yang tidak sesuai dengan pelarut DNA atau RNA yang digunakan. Kualitas DNA pada hasil elektroforesis menunjukan hasil berbanding lurus dengan konsentrasi DNA.08.2. untuk DNA.3.

sinar yang digunakan merupakan satu berkas yang panjangnya tidak berbeda banyak antara satu dengan yang lainnya. atau celah optis. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum tampak yang kontinyu. Pada titrasi spektrofotometri. Sedangkan pengukuran menggunakan spektrofotometer ini.. Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. Pada spektrofotometri visible yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita. apapun. merah. Sedangkan pada spektrofotometer. Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. 2002). grating. Spektrofotometer menghasilkan sinar dan spectrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. biru. 1990).kualitatif dengan mengukur transmitan atau absorbansi dari suatu cuplikan sebagai fungsi dari konsentrasi. maka sinar tersebut termasuk ke dalam . panjang gelombang yang benar-benar terseleksi dapat diperoleh dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma. Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Kebetulan spektrofotometer dibandingkan dengan fotometer adalah panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih terseleksi dan ini diperoleh dengan alat pengurai seperti prisma. sel pengabsorbsi untuk larutan sampel blanko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan absorbsi antara sampel dan blanko ataupun pembanding (Khopkar. monokromator. Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombang dan dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda. Pada fotometer filter dari berbagai warna yang mempunyai spesifikasi melewatkan trayek panjang gelombang tertentu. Pada fotometer filter tidak mungkin diperoleh panjang gelombang 30-40 nm. selama ia dapat dilihat oleh mata. entah itu putih. hijau. sedangkan dalam kalorimetri perbedaan panjang gelombang dapat lebih besar (Hardjadi. metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri (Riyadi 2009).

maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Berbeda dengan spektrofotometri visible. Sambrook et al. Kualitas DNA dapat ditentukan dengan cara menghitung rasio antara nilai OD260 dan nilai OD280 pada sampel DNA yang diukur melalui spektrofotometer. Namun perlu diingat. Sejalan dengan berkembangnya teknik ekstraksi DNA. Hal ini menunjukkan masih besarnya kontaminasi RNA dalam sampel. lipid dan lain-lain merupakan ekstraksi DNA. Bening dan transparan. secara umum dilakukan melalui beberapa tahap yaitu isoloasi dari jaringan.0 jika ditemukan kontaminasi dari protein atau fenol. DNA kromosom dengan nilai A260:A280 >1. 2007). DNA dinyatakan murni jika memiliki nilai rasio OD260/OD280 (optical density) berkisar antara 1. proses pelisisan dinding . Prosedur analisis DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA.. pada spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. DNA dikatakan terkontaminasi RNA jika memiliki rasio OD260/OD280 lebih dari dua (Khosravinia et al. sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu.sinar tampak (visible) (Riyadi 2009). RNA. Hal ini memang telah diperkirakan sebelumnya. Proses pemisahan DNA dari materi-materi di dalam sel seperti protein. 2002). Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi (Riyadi 2009).0 (Muladno.8-2. karena tidak ada perlakuan dengan RNAse dalam isolasi DNA kromosom ini.6 kemungkinan mengandung kontaminan seperti protein serta senyawa-senyawa organik lainnya (Faatih. karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita. Tingkat kemurnian DNA berkorelasi dengan kualitas DNA. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna.82.8-2. sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau sentrifugasi. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi.8 kemungkinan mengandung asam nukleat dan nilai A260:A280 <1. Nilai perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 dan 280 nm dapat digunakan sebagai indikator kemurnian DNA. (1989) menjelaskan bahwa rasio OD akan lebih besar atau lebih kecil dari nilai 1. Hasil pengamatan kualitas DNA dengan spektrofotometer menunjukkan bahwa rata-rata isolat menghasilkan DNA plas-id dengan nilai perbandingan serapan < 1. DNA dinyatakan murni apabila memiliki nilai perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 dan 280 nm berkisar 1.8. Oleh karena itu. 2009). Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium.

dan membran sel. metode membran dialisis. Keberhasilan analisis DNA sangat ditentukan oleh kualitas dan kuantitas hasil ekstraksi DNA. lemak. Bahan yang digunakan harus bebas kontaminan dan proses saat ekstraksi DNA . Ekstraksi DNA memiliki beberapa variasi metode dalam pengerjaannya yaitu dengan metode fenol-kloroform. Kontaminan lain yaitu bahan abiotik tempat bahan diambil contohnya tanah (Krings et all . ekstraksi dalam larutan. metode chilex. dan RNA. Kontaminan tersebut dapat berupa bahan biologis individu lain seperti protein. .1997). Metode fenol kloroform yang diperkenalkan Sambrook dan Russel dalam Toha (2001) adalah metode ekstraksi yang umum dan konvensional. dan metode boom. purifikasi dan kemudian presipitasi atau pemadatan. Kualitas dan kuantitas hasil ekstraksi DNA dipengaruhi oleh beberapa faktor salah satunya adalah bahan yang digunakan sebagai sumber DNA.

Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan. coli terkontaminasi oleh protein. Jumlah dan kualitas DNA dapat diketahui dengan menggunakan alat spektrofotometer. B. Supaya praktikan dapat lebih menguasai teknik dalam menggunakan spektrofotometri. Kualitas DNA E. dapat diambil kesimpulan sebagai berikut: 1. sedangkan DNA buah hasil isolasi menunjukkan adanya kontaminasi dari kemikalia/karbohidrat serta terkontaminasi oleh RNA. Saran Sebaiknya mahasiswa atau praktikan mencoba menggunakan spektrofotometer.III. 2. . coli terkontaminasi kemikalia/karbohidrat selain itu juga DNA E. coli dan DNA buah hasil isolasi setelah diuji secara kuantitatif dengan menggunakan spektrofotometer E. KESIMPULAN DAN SARAN A.

Kokom.W. Narasimha Murthy. Kristyna Smerkova. com. PT Gramedia: Jakarta. 2012. http://wahyuriyadi. Diakses tanggal 8 Juni 2013. T. Cold Spring Harbor Laboratory Press.. 2002. Catalytic Electrochemical Analysis of Platinum in Pt-DNA Adducts. 2001. Fritsch. Parasad. Maniatis. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. New York. Biokimia : Metabolisme Biomolekul. Day. 1990. Khosravinia.. and Pääbo S. Mukhlissul. Prinsip Dasar Spektrofotometer Visible.. 2007. A. David Hynek. Universitas Indonesia: Jakarta. 1989. 2009.A.. Riyadi. 2012.) untuk Analisis Keragaman Genetik berdasarkanRandom Amplified PolymorphicDNA (RAPD). Tomas Eckschlager. Khopkar. Vol.. F. Krainitzki H. Analisis Kimia Kuantitatif edisi Kelima. A. Konsep Dasar Kimia Analitik. Krings M. E. Isolasi Dan Digesti DNA Kromosom. W. Februari 2012: 138-142 ISSN 1410-9379. African J. Bandung. Marketa Ryvolova. Muh. Muladno. Dana. N. 2009. Pirany. 90:19-30. A. Stoneking M. Penerbit Erlangga: Jakarta. Optimizing factors influencing DNA extraction from fresh whole avian blood. Jurnal Penelitian Sains & Teknologi. International Journal of Electrochemical Science. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. No. Komalasari. 2009. W.DAFTAR REFERENSI Dospivova. Cell. Underwood. H.blogspot. Restu. Macam Spektrofotometri dan Perbedaannya (Vis. . Intstitut Pertanian Bogor: Bogor. J. Sambrook. Alfabeta. L dan R. (1997): Neandertal DNA sequences and the origin of modern humans. [Skripsi]. 1996. 10. 6 (4): 481-486. Diakses tanggal 7 Juni 2013. Mukrimin dan Gusmiaty.. 2002. 2nd edition. Pustaka Wirausaha Muda: Bogor. Pavel Kopel. http://wahyuriyadi. H.. of Biotech. and N. Jurnal Natur Indonesia 14(2). D. UV dan IR). Optimalisasi Teknik Ekstraksi dan Isolasi DNA Tanaman Suren (Toona Sureni Merr. Faatih. 7 (2012) 3072 – 3088. and T.blogspot. R. J. Riyadi. Pengaruh Perbandingan Volume Darah Dan Lisis Buffer Serta Kecepatan Sentrifugasi Terhadap Kualitas Produk Dna Pada Sapi Friesian Holstein (Fh). Stone A. Hardjadi. Schmitz R. Marie Stiborova.com. Vol. Vojtech Adam. 1. Jaromir Hubalek and Rene Kizek. Ilmu Kima Analitik Dasar. H. 2009: 61 – 67.. Toha. 2009.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful