P. 1
Elektroforesis-Gel-Agarosa (Autosaved) (Autosaved) Fix

Elektroforesis-Gel-Agarosa (Autosaved) (Autosaved) Fix

|Views: 319|Likes:
Published by Siti Nur Azizah

More info:

Published by: Siti Nur Azizah on Jun 15, 2013
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOCX, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

05/06/2015

pdf

text

original

PENENTUAN KUALITAS DAN KUANTITAS ASAM NUKLEAT MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETER

Oleh: Nama NIM Kelompok Rombongan Asisten : Siti Nur Azizah : B1J011086 :3 : II : Puspa Dwi Pratiwy

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2013

Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. Uji ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan DNA dalam larutan contoh. Pengujian kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometri. Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan/jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan cara uji kualitatif (Larasati. Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Terdapat beberapa cara yaitu spektrofotometri Vis (visible). Rasio OD260/OD280 antara 1. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu.0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein. baru dilanjutkan dengan uji kuantitatif DNA dengan metode spekrofotometri. Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. 2009). PENDAHULUAN A. Hal ini bertujuan untuk mengeluarkan DNA yang berada dalam inti sel dari organism. Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan fotometer. Uji kuantitatif DNA diawali dengan isolasi DNA. 2006) . Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi. Setelah itu. 2011). Latar Belakang Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara yaitu secara kualitatif dengan metode Elektroforesis Gel Agarose dan secara kuantitatif dengan metode spektrofotometri. spektrofotometri UV (ultra violet). Untuk mengetahui jumlah DNA.8-2. maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 256 nm (260 nm). sementara fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi (Riyadi. kemudian dilakukan dengan uji kualitatif DNA dengan metode elektroforesis gel agarosa. 2009).I. yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml (Suharsono dan Widyastuti. Spektrofotometri UV-Vis (ultra violet – visible) dan Spektrofotometri Infra Red (Riyadi.

.B. Tujuan Praktikum kali ini bertujuan untuk melakukan pengukuran kualitas dan kuantitas DNA hasil isolasi dan mengetahui pengaruh perbedaan perlakuan isolasi DNA terhadap kualitas dan kuantitas DNA yang diperoleh.

B. . Metode 1. Spektrofotometer UV (dalam praktikum ini digunakan UV-VIS Spectrophotometer Shimadzu model UV Mini 1240).000 μL akuades. 5. Catatlah semua data dan bandingkan antara DNA hasil isolasi dari tanaman dan dari bakteri. Untuk mengetahui ada tidaknya kontaminasi karbohidrat dan kemikalia. 2. lakukan pembagian nilai absorbansi 260 nm dengan nilai absorbansi 230 nm. lakukan pembagian nilai absorbansi 260 nm dengan nilai absorbansi 280 nm. 7. Materi Alat-alat yang digunakan pada praktikum kali ini meliputi tissue. 260 nm. DNA hasil isolasi dari buah dan bakteri Escherichia coli.II. 280 nm. 6. Untuk mengetahui kemurnian DNA dari protein. Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum kali ini meliputi akuades steril. 3. Kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 230 nm. 4. dan 320 nm. Kuvet dan Mikropipet beserta Tip. Nilai absorbansi 260 nm yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam rumus untuk menghitung konsentrasi DNA. MATERI DAN METODE A. Nyalakan mesin spektrofotometer dan tunggulah 15 menit supaya stabil. Sebanyak 10 μL DNA hasil isolasi dilarutkan dalam 3.

3 0. Perhitugan Konsentrasi DNA terhadap kontaminasi protein dan kemikalia No.045 0.923 λ 230 0. 1 2 3 4 5 6 Sampel Strawbery Alpukat Pepaya Mangga Buah naga Escherichia coli λ 230 A[S] .012 λ 280 A[S] .026 -0.012 -0.011 0.012 0.A[B] 0.009 Tabel 2.013 λ 230 A[S] .389 0.150 1250 1150 1300 -600 λ 280 1.III.011 0.023 -0.037 0. 1 2 3 4 5 6 λ 260 1300 3.622 1.A[B] 0.015 0.A[B] 0.A[B] 0. HASIL DAN PEMBAHASAN A.733 0.016 0.012 0.130 ~ .063 0.08 1.625 1.160 0.162 0.4 2.026 0.533 1.023 λ 260 A[S] .025 0.069 0. Hasil Tabel 1.015 -0.046 0.019 0.023 0. Perhitungan konsentrasi DNA Kel.

2012). 2012). A280. konsentrasi DNA E. Hal ini menunjukkan adanya kontaminasi dari kemikalia/karbohidrat dengan ditunjukkan nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 nm yang didapatkan kurang dari . Hasil pengukuran kualitas dan kuantitas DNA terhadap kontaminasi protein dan karbohidrat/kemikalia setelah diuji di spektrofotometer apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 didapatkan hasil 0. Hal tersebut berguna untuk menguji kemurnian DNA. Kemurnian akan menjamin tidak terdapatya kontaminasi dari protein. Berdasarkan perhitungan. ataupun zat lain yang dapat mengganggu kuantisasi DNA.B. Apabila kepadatan optik (optical density) atau disebut OD260 sama dengan satu maka konsentrasi molekul DNA setara 50 µg/ml (untuk DNA heliks ganda) atau setara 40 µg/ml (untuk RNA atau DNA untai tunggal) atau setara 20 µg/ml (untuk oligonukleotida untai tunggal) (Muladno. Sampel dipipet pada platspektrofotometer untuk memperoleh OD (Optical Density). sedangkan penyerapan maksimal oleh protein dicapai pada panjang gelombang 280 nm. Konsentrasi DNA dari nilai OD sampel dapat dihitung dengan menggunakan persamaan: Konsentrasi DNA (μg/ml) = A260 x 50 x Faktor Pengenceran (Restu et al.5212 sedangkan apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 didapatkan hasil 0. 280. 2002). sedangkan konsentrasi DNA buah adalah 1250 ng/µL..923. coli didapatkan -600 ng/µL. Nilai konsentrasi sampel DNA hasil ekstraksi diukur dengan mengambil 50 µl sampel pada masing-masing tahap. Konsentrasi DNA dalam mikrogram per mililiter kemudian diberikan oleh persamaan c (DNA) = 50 · A * 260 dikalikan dengan faktor pengenceran (Dospivova. Penyerapan iradiasi sinar UV secara maksimal oleh DNA dicapai pada panjang gelombang 260 nm. Pengukuran DNA melalui spektrofotometer didasarkan pada prinsip iradiasi ultraviolet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan. A320). dan 320 nm (A260. Cara pengukuran kuantitas DNA juga diungkapkan oleh (2012) yang menyatakan bahwa Jumlah DNA dihitung dengan menggunakan spektrofometri dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa panjang gelombang misalnya 260. Pada spektrofotometer digunakan metode panjang gelombang tunggal (Single Wave Length) dan OD diukur pada panjang gelombang 260 nm. Pembahasan Jumlah dan kualitas DNA dapat diketahui dengan menggunakan alat spektrofotometer atau dengan melihat intensitas molekul DNA dalam gel.

Sebaliknya. Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar makromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan fototube atau tabung foton hampa. Hal ini sesuai dengan pernyataan (Faatih.2. Kemurnian asam nukleat dari pengotor karbohidrat atau pun materi organik lain dan kemikalia ditentukan berdasarkan perbandingan nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm terhadap absorbansi pada panjang gelombang 230 nm.8. Alat yang digunakan adalah spektrofotometer. ditunjukkan dari nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 nm yang didapatkan kurang dari 2. jika perbandingan nilai absorbansi tersebut lebih tinggi dari 2. Bila nilai perbandingan tersebut lebih rendah dari 1. dikatakan bahwa asam nukleat terkontaminasi oleh karbohidrat.8.2. Hasil pengamatan kualitas DNA buah papaya didapatkan hasil bahwa konsentrasi DNA terhadap kontaminasi protein dan karbohidrat/kemikalia setelah diuji di spektrofotometer apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/230 yaitu 0. dan menunjukkan pita tunggal (Komalasari.08. selain itu juga DNA E. Namun. bila nilai perbandingan tersebut lebih tinggi dari 1. 2009) yang menyatakan bahwa kualitas asam nukleat ditentukan berdasarkan atas tingkat kemurniannya. Bila nilai perbandingan absorbansi tersebut berkisar dari 2 hingga 2. hal ini ditunjukkan dari nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm yang didapatkan lebih dari 1. 2009). bila nilai tersebut lebih rendah dari 2.2. yaitu suatu alat yang di gunakan untuk menentukan suatu senyawa baik secara kuantitatif maupun .3.8. materi organik lain atau pun kemikalia yang terbawa saat dilakukan proses isolasi.8. hal ini menandakan penggunaan blanko yang tidak sesuai dengan pelarut DNA atau RNA yang digunakan. coli terkontaminasi oleh protein. Sebaliknya. dikatakan bahwa DNA terkontaminasi oleh RNA. selain itu juga DNA buah papaya terkontaminasi oleh RNA. untuk DNA. hal ini ditunjukkan dari nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm yang didapatkan kurang dari 1. dikatakan bahwa DNA terkontaminasi oleh protein. sedangkan apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 didapatkan hasil 2. Kualitas DNA pada hasil elektroforesis menunjukan hasil berbanding lurus dengan konsentrasi DNA. Hal ini menunjukkan adanya kontaminasi dari kemikalia/karbohidrat.8. kemurnian dikatakan tertinggi apabila nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm mendekati 1. Kemurnian RNA sendiri dikatakan tertinggi jika nilai perbandingan absorbansi 260 nm/280 nm mendekati 2. dikatakan bahwa sampel asam nukleat yang diukur murni.

sedangkan dalam kalorimetri perbedaan panjang gelombang dapat lebih besar (Hardjadi. maka sinar tersebut termasuk ke dalam . Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. entah itu putih. sinar yang digunakan merupakan satu berkas yang panjangnya tidak berbeda banyak antara satu dengan yang lainnya. Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombang dan dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda. Kebetulan spektrofotometer dibandingkan dengan fotometer adalah panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih terseleksi dan ini diperoleh dengan alat pengurai seperti prisma. Sedangkan pengukuran menggunakan spektrofotometer ini. monokromator. biru. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum tampak yang kontinyu. panjang gelombang yang benar-benar terseleksi dapat diperoleh dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma. Spektrofotometer menghasilkan sinar dan spectrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi. Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. 2002). apapun. sel pengabsorbsi untuk larutan sampel blanko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan absorbsi antara sampel dan blanko ataupun pembanding (Khopkar. Pada fotometer filter tidak mungkin diperoleh panjang gelombang 30-40 nm. Sedangkan pada spektrofotometer. Pada spektrofotometri visible yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri (Riyadi 2009).. hijau. selama ia dapat dilihat oleh mata. 1990). grating. Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia.kualitatif dengan mengukur transmitan atau absorbansi dari suatu cuplikan sebagai fungsi dari konsentrasi. atau celah optis. Pada fotometer filter dari berbagai warna yang mempunyai spesifikasi melewatkan trayek panjang gelombang tertentu. Pada titrasi spektrofotometri. merah. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita.

6 kemungkinan mengandung kontaminan seperti protein serta senyawa-senyawa organik lainnya (Faatih.82. sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu.sinar tampak (visible) (Riyadi 2009).. 2009). Sambrook et al.0 jika ditemukan kontaminasi dari protein atau fenol. DNA dinyatakan murni jika memiliki nilai rasio OD260/OD280 (optical density) berkisar antara 1. Sejalan dengan berkembangnya teknik ekstraksi DNA.8-2. Bening dan transparan. (1989) menjelaskan bahwa rasio OD akan lebih besar atau lebih kecil dari nilai 1.8. pada spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV.8-2. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium. Hal ini memang telah diperkirakan sebelumnya.8 kemungkinan mengandung asam nukleat dan nilai A260:A280 <1. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna. Hal ini menunjukkan masih besarnya kontaminasi RNA dalam sampel. Tingkat kemurnian DNA berkorelasi dengan kualitas DNA. karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita. lipid dan lain-lain merupakan ekstraksi DNA. karena tidak ada perlakuan dengan RNAse dalam isolasi DNA kromosom ini. Proses pemisahan DNA dari materi-materi di dalam sel seperti protein. secara umum dilakukan melalui beberapa tahap yaitu isoloasi dari jaringan. 2007). Nilai perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 dan 280 nm dapat digunakan sebagai indikator kemurnian DNA. 2002). Berbeda dengan spektrofotometri visible. DNA kromosom dengan nilai A260:A280 >1. Prosedur analisis DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Kualitas DNA dapat ditentukan dengan cara menghitung rasio antara nilai OD260 dan nilai OD280 pada sampel DNA yang diukur melalui spektrofotometer. Oleh karena itu. proses pelisisan dinding . sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau sentrifugasi. DNA dinyatakan murni apabila memiliki nilai perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 dan 280 nm berkisar 1. Namun perlu diingat. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Hasil pengamatan kualitas DNA dengan spektrofotometer menunjukkan bahwa rata-rata isolat menghasilkan DNA plas-id dengan nilai perbandingan serapan < 1. DNA dikatakan terkontaminasi RNA jika memiliki rasio OD260/OD280 lebih dari dua (Khosravinia et al. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi (Riyadi 2009).0 (Muladno. maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. RNA. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi.

dan membran sel. Metode fenol kloroform yang diperkenalkan Sambrook dan Russel dalam Toha (2001) adalah metode ekstraksi yang umum dan konvensional. Ekstraksi DNA memiliki beberapa variasi metode dalam pengerjaannya yaitu dengan metode fenol-kloroform. metode membran dialisis. dan metode boom. dan RNA. ekstraksi dalam larutan. .1997). metode chilex. Kontaminan tersebut dapat berupa bahan biologis individu lain seperti protein. Kualitas dan kuantitas hasil ekstraksi DNA dipengaruhi oleh beberapa faktor salah satunya adalah bahan yang digunakan sebagai sumber DNA. Bahan yang digunakan harus bebas kontaminan dan proses saat ekstraksi DNA . lemak. Keberhasilan analisis DNA sangat ditentukan oleh kualitas dan kuantitas hasil ekstraksi DNA. Kontaminan lain yaitu bahan abiotik tempat bahan diambil contohnya tanah (Krings et all . purifikasi dan kemudian presipitasi atau pemadatan.

Supaya praktikan dapat lebih menguasai teknik dalam menggunakan spektrofotometri. . sedangkan DNA buah hasil isolasi menunjukkan adanya kontaminasi dari kemikalia/karbohidrat serta terkontaminasi oleh RNA.III. Kualitas DNA E. coli terkontaminasi kemikalia/karbohidrat selain itu juga DNA E. Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan. Saran Sebaiknya mahasiswa atau praktikan mencoba menggunakan spektrofotometer. B. coli dan DNA buah hasil isolasi setelah diuji secara kuantitatif dengan menggunakan spektrofotometer E. dapat diambil kesimpulan sebagai berikut: 1. KESIMPULAN DAN SARAN A. 2. coli terkontaminasi oleh protein. Jumlah dan kualitas DNA dapat diketahui dengan menggunakan alat spektrofotometer.

African J. Optimalisasi Teknik Ekstraksi dan Isolasi DNA Tanaman Suren (Toona Sureni Merr. Diakses tanggal 8 Juni 2013. Vol.. 1990. W. Parasad. and Pääbo S. Dana. Sambrook. Maniatis. 90:19-30. Pavel Kopel. Hardjadi. Optimizing factors influencing DNA extraction from fresh whole avian blood. No. Macam Spektrofotometri dan Perbedaannya (Vis.. Riyadi. UV dan IR). Pengaruh Perbandingan Volume Darah Dan Lisis Buffer Serta Kecepatan Sentrifugasi Terhadap Kualitas Produk Dna Pada Sapi Friesian Holstein (Fh). 1996. Krainitzki H. W. Kokom.. http://wahyuriyadi. International Journal of Electrochemical Science. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. T. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika.) untuk Analisis Keragaman Genetik berdasarkanRandom Amplified PolymorphicDNA (RAPD). J. J. Pirany. Isolasi Dan Digesti DNA Kromosom. Alfabeta. H. 2012. 2009: 61 – 67. F. 2002. . Biokimia : Metabolisme Biomolekul. N. A. [Skripsi]. Muladno. Stoneking M.W. Restu. Intstitut Pertanian Bogor: Bogor. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2009. com.A. Prinsip Dasar Spektrofotometer Visible. Februari 2012: 138-142 ISSN 1410-9379. Tomas Eckschlager. Jaromir Hubalek and Rene Kizek. A. Day. 2009. Stone A. David Hynek. Mukrimin dan Gusmiaty. Mukhlissul.DAFTAR REFERENSI Dospivova. and N. 6 (4): 481-486. Krings M. 1. Vol. Analisis Kimia Kuantitatif edisi Kelima. 10... Komalasari.com. D. and T. Bandung. R. H. 2012. New York. Toha. 2001. Muh. Underwood. Riyadi. 7 (2012) 3072 – 3088. http://wahyuriyadi. of Biotech.blogspot. Schmitz R. A. Marketa Ryvolova. Universitas Indonesia: Jakarta. Pustaka Wirausaha Muda: Bogor.blogspot. H. 1989. Kristyna Smerkova. Konsep Dasar Kimia Analitik. Catalytic Electrochemical Analysis of Platinum in Pt-DNA Adducts.. 2nd edition. 2009. Vojtech Adam. Diakses tanggal 7 Juni 2013. L dan R. Jurnal Penelitian Sains & Teknologi. (1997): Neandertal DNA sequences and the origin of modern humans. 2002. E. Cell. Jurnal Natur Indonesia 14(2). Penerbit Erlangga: Jakarta. Marie Stiborova.. Khopkar. Narasimha Murthy. 2009. Fritsch. Khosravinia. Faatih.. PT Gramedia: Jakarta. 2007. Ilmu Kima Analitik Dasar.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->