Laporan Praktikum Biokimia I

LAPORAN TETAP PRAKTIKUM BIOKIMIA

I. II.

NOMOR PERCOBAAN NAMA PERCOBAAN :

: IX (SEMBILAN)

PENENTUAN DALAM KASEIN III. TUJUAN :

KADAR

TIROSIN

Menentukan kadar tirosin dalam kasein serta dapat membuat kurva kalibrasinya. IV. DASAR TEORI Kadar protein yang terkandung dalam setiap bahan berbeda-beda. Karena itu, pengukuran kadar protein suatu bahan sangat diperlukan. Untuk dapat menghitung kadar protein, maka diperlukan spektrofotometer dengan cara penembakan sampel. Untuk itulah maka pada praktikum ini dilakukan percobaan untuk menentukan kadar protein. Sifat protein jika dilarutkan dengan asam klorida dan enzim protease akan mengahasilkan asam amino karboksilat. Di sisi lain protein dapat mengalami denaturasi yaitu perubahan struktur protein yang menimbulkan perubahan sifat fisika, kimia dan biologi. Metode Spektrofotokopi dengan ultraviolet yang diserap bukan cahaya tampak ultra ungu (ultraviolet). Dalam spektrofotokopi ultra ungu energii cahaya tampak terserap digunakan untuk transfuse elektron. Karena energi cahaya ultraviolet dapat menyebabkan transfuse elektron (Hendayana, 1997). Protein juga memiliki molekul besar dengan bobot molekul bervariasi antara 5000 sampai jutaan. Dengan cara hidrolisis oleh asam atau oleh enzim, protein akan menghasilkan asam-asam amino. Protein mempunyai sifat yang sangat dipengaruhi oleh suhu tinggi, pH, dan pelarut organik. Jenis asam amino yang kita gunakan adalah Tirosin dengan rumus :
O OH HO NH2

Riska Ria Lestari (06101410016)

Laporan Praktikum Biokimia I

Tirosin adalah salah satu jenis asam amino dalam protein. Tirosin ini mempunyai gugus fenol dan bersifat asam lemah. Tirosin dapat diperoleh dari kasein, yaitu protein dalam keju atau susu. Pada percobaan ini kita akan melakukan pemurnian tirosin dari kaseinnya dengan melarutkan tirosin ke dalam berbagai larutan yang bersifat asam, alcohol, maupun senyawa yang mengandung logam berat. Dengan demikian, kita harus memperhatikan sifat-sifat protein antara lain : 1. ionisasi seperti asam amino, protein juga larut dalam air akan membentuk ion yang mempunyai muatan positif dan negative. Dalam suasanan asam molekul protein akan membentuk ion positif, sedangkan dalam suasana basa akan membentuk ion negative. Pada titik isolistriknya protein mempunyai muatan positif dan negative yang sama, sehingga tidak bergerak kea rah elektroda positif maupun negative apabila ditempatkan diantara kedua electrode tersebut. Ionisasi protein dapat digambarkan sebagai berikut : protein+ kation H+ + +proteinion zwitter

Protein memiliki titik isolistrik yang berbeda-beda sebagaimana yang tertera dalam table berikut : Tabel Titik Isolistrik Berbagai Protein : Protein Albumin telur Insulin Albumin serum Kasein Gelatine Globulin serum Fibroin Gliadin Sumber Telur Pancreas Darah Susu sapi Kulit sapi Darah Sutera Terigu pH isolistrik 4,55 4,90 5,3 5,35 4,88 4,6 4,8 4,85 5,4 5,5 2,0 2,4 6,5

Titik isolistrik protein mempunyai arti penting karena pada umunya sifat fisika, dan kimia erat hubungannya dengan pH isolistrik. Riska Ria Lestari (06101410016) 2

Laporan Praktikum Biokimia I

Pada pH diatas titik isolistrik protein bermuatan negative, sedangkan di bawah titik isolistrik protein bermuatan negative. Oleh karena itu untuk megendapkan protein dengan ion logam, diperlukan pH larutan diatas titik isolistrik, sedangkan pengendapan oleh ion negative memerlukan pH dibawah titik isolistrik. Ion-ion posisitf yang mengendapkan protein antara lain ialah Ag+, Ca++, Zn++, Hg++, Fe++, CU++, dan Pb++, sedangkan ion negative yang dapat mengendapkan protein adalah ion salisilat, triklorasetat, pikrat, tanat dan sulfosalisilat. Berdasarkan sifat tersebut putih teluratau susu dapat digunakan sebagai antidotum atau penawar racun apabila orang keracunan logam berat. 2. Denaturasi Protein akan mengalami koalgulasi apabila dipanaskan pada suhu 50oC atau lebih. Koagulasi ini hanya terjadi apabila larutan protein berada pada titik isolistriknya. Protein yang terdenaturasi pada titik isolistriknya masih dapat alrut pada pH di luar titik isolistrik tersebut. Air ternyata diperlukan untuk proses denaturasi oleh panas. Disamping pH, sushu tinggi dan ion logam berat, denaturasi dapat pula terjadi oleh adanya gerakan mekanik, alcohol aseton, eter dan detergen. 3. Viskositas. Viskositas adalah tahanan yang timbul karena adanya gesekan antara molekul-molekul di dalam zat cair yang mengalir. Suatu larutan protein dalam air mempunyai viskositas atau kekentalan yang relative besar daripada viskositas air sebagai pelarutnya. 4. Kristalisasi Banyak protein yang telah diperoleh dalam bentuk kristal. Meskipun demikian proses kristalisasi untuk berbagai jenis protein tidak selalu sama, artinya ada yang dengan mudah dapat terkristalisasi, tetapi ada pula ynag sukar. 5. Sistem Koloid Molekul protein apabila dilarutkan dalam air mempunyai sifat koloid, yang tidak dapat menembus membrane atau kertas perkamen.

Riska Ria Lestari (06101410016)

Laporan Praktikum Biokimia I

Pemurnian Protein Langkah awal yang dalam pemurnian protein ini ialah menentukan bahan alam yang akan diproses. Penentuan ini didasarkan pada kadar protein yang terkandung didalamnya. Tentu saja dipilih bahan alam yang mempunyai kadar protein tinggi dan mudah diperoleh. Analisis terhadap kadar protein dalam bahan alam tersebut perlu dilakukan untuk memperoleh data tentang kadar protein yang akan dimurnikan. Setelah itu protein akan dilarutkan ke dalam air atau pelarut lainnya. Namun, disini juga harus diperhatikan sushu dan pH larutan agar tidak merusak protein. Dalam percobaan ini untuk menentukan kadar atau konsentrasi protein ini kita menggunakan spectrometer yang berfunsgi untuk menentukan transmittan maupun adsorbannya. Tyrosin dapat diubah menjadi asam P-hidroksi fenil piruvat dengan cara transaminasi. Reaksi ini berlangsung dengan bantuan enzim tyrosin ketoglutarat. Selanjutnya melalui beberapa tahap reaksi asam P- hidroksi fenil piruvat diubah menjadi asam fumarat dan asam astoasetat. Tyrosin dapat dibentuk dari fenil alanin hidroksilasi sebagai katalis.Dalam proses ini aada dua tahap, yaitu : 1. Tahap 1 Reduksi hidrobiopterin oleh NADPH menjadi tetra biobpterindan 2. Tahap 2 Reduksi O2 menjadi H2O dan pengubahan fenil alanin menjadi tyrosin kemudian menjadi hidrobiopterin kembali.

Riska Ria Lestari (06101410016)

Laporan Praktikum Biokimia I

V.

ALAT DAN BAHAN

1. ALAT 1. beker gelas 2. gelas ukur 3. pipet tetes 4. penangas air 5. refluks kondensor 6. pipet tetes 7. corong pemisah 8. pengaduk kaca 9. porselen 10. statif dan klem 11. erlenmeyer 12. spektometer 13. kuvet 14. neraca analitik 15. kaca arloji 16. labu bundar 17. penjepit kayu

2. BAHAN: 1. Kasein 2. Tirosin 3. NaOH 6 N 20 ml 4. H2SO4 7 N 30 ml 5. Larutan Tirosina standard 1 ml 6. HgSO4 (5%) 3 ml 7. H2SO4 5 N 8. H2SO4 7 N 2 ml 9. NaNO2 (0,2%) 2 ml 10. 12 ml air

VI.

PROSEDUR PERCOBAAN Hidrolisa 1,0 gr Kaseina dengan 20, 0 ml NaOH 6 N pada refluks

kondensor dalam penangas air selama 4 jam. Tambahkan hati-hati 30 ml H2SO4 7 N. campur. Tempatkan 1,0 ml hidrolisat ke dalam tabung yang bersih dan kering. Pada tabung-tabung lain pipet masing-masing 1,0 ml larutan tirosina standard dengan lima macam kadar yang berbeda. Tambahkan 3 ml HgSO4 5 % dalam H2SO4 5 N pada semua tabung. Panaskan dalam penangas air yang mendidih selama 10 menit. Dinginkan dan tambahkan ke dalam masing-masing tabung 2 ml H2SO4 7 N dan 2 ml NaNO2 0,2 %. Campur dan tambahkan 12 ml air ke dalam masing-masing tabung. Baca ekstingsinya pada spectrometer dengan maks = 470 nm.

Riska Ria Lestari (06101410016)

Laporan Praktikum Biokimia I

VII.

HASIL PENGAMATAN

Pengukuran % Transmittan larutan Tirosina Standar : Kadar tyrosin (%) 1 2 3 4 5 0.007 0.013 0.017 0.021 0.055 absorban

VIII. Analisa Data Perhitungan regresi linier konsentrasi terhadap adsorbannya : X = konsentrasi Y = Adsorban X 1 2 3 4 5 Y 0.007 0.013 0.017 0.021 0.055 0,113 XY 0,007 0,026 0,051 0,084 0,275 0,443 X2 1 4 9 16 25 55

15

N . XY - X . Y Slope = N . X2 (X)2 5 . 0,443 15 . 0,113 = 5 . 55 (15)2 2,215 1,695 = 275 225 = 0,0104

Riska Ria Lestari (06101410016)

Laporan Praktikum Biokimia I

Y . X2 - X . XY Intersep = N . X2 (X)2 0,113 . 55 15 . 0,443 = 5 . 55 (15)2 6,215 6,645 = 275 225 Maka diperoleh persamaan regresi linier : Y = AX + B Y = 0,0104 X + (-0,0086) = - 0,0086

X Y

0 -0,0086

1 0,0018

2 0,0122

3 0,0226

4 0,033

5 0,0434

Riska Ria Lestari (06101410016)

Laporan Praktikum Biokimia I

Tabel Hasil Persamaan Regresi

Riska Ria Lestari (06101410016)

Laporan Praktikum Biokimia I

IX.

REAKSI
O O O

HO

NH 3

NaOH
HO NH2

Na

H2O

O
O

2 HO NH 3
+

H2SO 4 2
HO
+ NH 3

OH

SO 4

O OH HO NH2

HgSO 4

O C O Hg CH 2 CH NH 2
++

O O C

+
CH CH 2 OH

SO 4

HO

NH 2

Riska Ria Lestari (06101410016)

Laporan Praktikum Biokimia I

X.

PEMBAHASAN Percobaan ini merupakan penentuan kadar tyrosein dalam kasein, dengan

cara membandingkan hidrolisat kasein dengan larutan standar yang telah dibuat dan diukur mengunakan spektrometer UV/Vis. Hidrolisat yang dimaksud adalah larutan yang terdiri dari 1 mg kasein yang direfluks dengan 20 ml NaOH 6 N yang kemudian ditambah sedikit demi sedikit H2SO4 7 N. Setelah 4 jam di refluks, hidrolisat diambil sebanyak 1 ml dan dicampur dengan larutan Tyrosin standar yng berbeda konsentrasi. Larutan tyrosin staandar yang berbeda konsentrasi tersebut bertujuan untuk mendapatkan adsorbansi yang berbeda-beda sehingga dapat memprediksi absorbansi sampel kasein. Kasein yang digunakan dalam percobaan ini merupakan hasil yang didapatkan dari hasil percobaan sebelumnya yang kemudian diteruskan untuk dilakukan pengujian terhadap kadar tirosinnya. Proses refluks menggunakan suhu konstan yang berkisar 40 oC. Hal ini dikarenakan protein mengalami denaturasi pada suhu 40 oC, dimana protein atau asam nukleat kehilangan struktur tersier dan struktur sekunder dengan penerapan beberapa tekanan eksternal atau senyawa, jika protein dalam sel protein sel hidup didenaturasi menyebabkan gangguan terhadap aktivitas sel dan kemungkinan kematian sel. Pada proses ini diharapkan kandungan tirosin dalam kasein mengalami pemisahan sehingga dapat ditentukan kadarnya. Saat kasein dihidrolisa dengan NaOH, kasein akan tercampur dan terikat secara sempurna dalam suhu yang stabil sehingga larutan bersifat basa. Hal seperti ini dapat terjadi karena konsentrasi (HO-) yang tinggi mampu mengikat ion-ion H+ yang terdapat pada gugus NH3+ . Dan ketika larutan ditambahkan dengan asam sulfat, maka akan terjadi pengikatan asam oleh basa dalam larutan kasein itu. Refluks dilakukan selama 4 jam, dari hasil refluks didapatkan larutan yang bening tak berwarna. Kemudian larutan standar tirosin ditambahkan dengan HgSO4 5 % dalam H2SO4 5 N dengan kadar konsentrasi yang berbeda pada 5 tabung. Hal ini bertujuan untuk mengendapkan protein dengan ion logam positif yaitu Hg++. Penambahan H2SO4 pada larutan protein akan menyebabkan struktur molekul

Riska Ria Lestari (06101410016)

10

Laporan Praktikum Biokimia I

asam amino. Hal ini terjadi karena konsentrasi H+ yang tinggi mampu berikatan dengan ion COO-, sehingga membentuk gugus COOH. Setelah itu larutan yang telah dicampurkan dengan kadar yang berbeda dipanaskan menggunakan penangas air yang mendidih selama 10 menit dan untuk selanjutnya dinginkan lalu tambahkan ke dalam masing-masing tabung tadi H2SO4 dan NaNO2. Penambahan NaNO2 pada larutan tirosin bertujuan untuk memberikan warna. Warna yang terjadi akibat penambahan NaNO2 yaitu terjadinya warna merah pada larutan protein. Adanya warna merah pada larutan protein ini karena kita akan menghitung adsorban pada larutan protein dengan menggunakan spektrofotometer. Karena alat spektrofotometer ini menggunakan cahaya UV-Vis yang menggunakan warna dalam penganalisisannya. Dari hasil pengukuran diperoleh harga absorbansi yang sebanding lurus dengan konsentrasi larutan. Semakin besar konsentrasi larutan maka harga absorbansinya semakin besar. Pengukuran absorbansi larutan ini harus dilakukan dengan cepat karena jika larutan dibiarkan terlalu lama hal ini akan mengubah warna larutan karena adanya reaksi dengan lingkungan.

Riska Ria Lestari (06101410016)

11

Laporan Praktikum Biokimia I

XI.

Kesimpulan 1. Berdasarkan hasil pengamatan,semakin besar konsentrasi larutan asam amino maka semakin besar pula nilai adsorbannya. 2. Semakin besar konsentrasi larutan tirosin yang digunakan, maka warna yang ditimbulkan akan semakin pekat, sesuai dengan semakin besarnya kuantitas analit yang ada dalam larutan. 3. Proses kondensasi menggunakan suhu konstan yakni 40oC 4. Alat spektrofotometer ini menggunakan cahaya UV-Vis yang

menggunakan warna dalam penganalisisannya. 5. Pengukuran absorbansi larutan dengan menggunakan spektrometri ini harus dilakukan dengan cepat karena jika didiamkan terlalu lama akan mempengaruhi hasil pengamatan yang didapat karena warna larutan akan berubah seiring dengan bereaksinya dengan udara luar. 6. Penambahan NaNO2 bertujuan untuk mengubah larutan yang awalnya bening pada saat penambahan dengan H2SO4 menjadi kemerahan saat penambahan NaNO2. 7. Dari hasil pengukuran diperoleh harga absorbansi yang sebanding lurus dengan konsentrasi larutan. Semakin besar konsentrasi larutan maka harga absorbansinya semakin besar. 8. Kondensor merupakan tempat terjadinya proses kondensasi dimana pada saat larutan menguap menjadi cair uapnya tidak keluar atau pun habis.

Riska Ria Lestari (06101410016)

12

Laporan Praktikum Biokimia I

XII.

DAFTAR PUSTAKA

Arbianto, Purwo. 1993. Biokimia Konsep-Konsep Dasar. Bandung:ITB Khopkar, S.M, 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta :UI Press Martoharsono, Soeharsono. 1998. Biokimia Jilid 1. Yogyakarta :Gajah Mada University Press . Pudjiadi, Anna. Indonesia 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta:Universitas

Sukaryawan, Made. 2011. Petunjuk Praktikum Biokimia. Universitas Sriwijaya:Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan.

Riska Ria Lestari (06101410016)

13

Laporan Praktikum Biokimia I

XIII. GAMBAR ALAT 1. beker gelas

2. gelas ukur 6. corong pemisah

3. pipet tetes

7. pengaduk kaca 4. penangas air

8. porselen

5. kondensor

Riska Ria Lestari (06101410016)

14

Laporan Praktikum Biokimia I

9. statif dan klem 13. neraca analitik

10. erlenmeyer

14. kaca arloji

11. spektometer 15. pembakar bunsen

12. kuvet 16. kaki tiga penyangga

Riska Ria Lestari (06101410016)

15

Laporan Praktikum Biokimia I

17. kawat kasa

19. penjepit tabung

18. labu bundar

Riska Ria Lestari (06101410016)

16