Laporan Praktikum Laboratorium Biokimia

Hari, Tanggal : Jumat, 16 Maret 2012 Kelompok :8 PJP : Prof. Dr. Maggy T. Suhartono Yanti, Ph.D. Asisten : Bernadetta Meika Dysa Irina Elissa Tjahjono Fidelia Isabel Yuliani Wijaya Katharina Jessica Matheus Alvin Prawira Sabar Budiman Stephanus Aditya Listian Stevanny Wong Steven Clement Wendy Andryan

PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN SPEKTROFOTOMETRI Debora Jessen Vania Gavrila Wikasa Melinda Ika Sari Michael Edbert Suryanto 2011-080-020 2011-080-026 2011-080-052 2011-080-089 2011-080-101

FAKULTAS TEKNOBIOLOGI UNIVERSITAS KATOLIK INDONESIA ATMA JAYA 2012

PENDAHULUAN Protein merupakan senyawa biomolekul yang penting, karena perannya dalam berbagai proses di dalam tubuh. Protein terdapat dalam jumlah yang banyak di dalam sel dan menyusun lebih dari setengah berat kering pada hampir semua organisme ([UAD] 2011). Untuk memenuhi kebutuhan protein dalam tubuh, seseorang harus mengonsumsi makanan yang mengandung protein. Banyak makanan yang merupakan sumber protein bagi tubuh, namun kadar protein di dalam setiap makanan berbedabeda. Oleh karena itu, pada percobaan ini akan dilakuan penentuan kadar protein dalam sampel dengan menggunakan metode spektrofotometri. Selain itu, percobaan ini juga dilakukan untuk menentukan efektivitas metode yang digunakan (metode Lowry dan metode Bradford), serta untuk membuat kurva standar dari pewarna Lowry dan Bradford. Pengukuran kadar protein dapat dilakukan dengan berbagai metode. Metode spektrofotometri merupakan metode yang menggunakan prinsip absorbansi dan transmisi cahaya dalam mengukur konsentrasi suatu senyawa (Lestari 2010). Dasar penggunaan metode spektrofotometri adalah dengan menggunakan metode Lowry dan Bradford. Prinsip metode Lowry adalah terbentuknya warna biru akibat penambahan pereaksi Folin Ciocalteau dan Biuret. Terbentuknya warna biru tersebut disebabkan oleh reaksi ion Cu2+ dengan ikatan peptida dalam larutan alkalis pada saat penambahan pereaksi biuret serta terjadinya reaksi reduksi pereaksi Folin Ciocalteau dengan asam amino dalam protein (Kolakowski 2012). Sedangkan, prinsip metode Bradford adalah adanya ikatan antara protein dengan CBB-G250 (Coomassie Brilliant Blue-G250) dalam keadaan asam. CBB yang awalnya berwarna merah akan berubah warna menjadi biru pada saat berikatan dengan protein sehingga terjadi perubahan panjang gelombang pewarna dari 465 nm menjadi 595 nm (Walker 2002).

BAHAN DAN METODE Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah spektrofotometer VIS, kuvet plastik, rak tabung reaksi, tabung reaksi, pompa bulp, vorteks, pipet mikro, tip, magnetic stirrer, gelas piala, labu takar, gelas ukur, dan kertas saring. Bahan yang digunakan adalah Bovine Serum Albumin (BSA) 1 mg/ml, NaOH 0,1 M, CuSO4.5H2O 1%, Na K-tartarat 2%, Na2CO3 2%, Coomassie Brilliant Blue G-250, Etanol 95%, Asam fosfat 85%, pereaksi Folin-Ciocalteau, pereaksi Biuret, pereaksi Bradford, alumunium foil dan sampel protein (putih telur 5%v/v, putih telur 5% v/v 2 kali pengenceran, tepung cacing 2 % b/v, tepung cacing 2% b/v 2 kali pengenceran, susu 2% b/v, susu 2% b/v 2 kali pengenceran). Metode yang digunakan dalam praktikum ini terbagi menjadi 2 bagian, yaitu metode Lowry dan metode Bradford. Untuk masing-masing metode dilakukan pembuatan kurva standard dan pengukuran kuantitatif larutan protein. Prosedur kerja pada metode Lowry adalah sebagai berikut. Perrtama, 6 tabung reaksi disiapkan untuk mengencerkan larutan BSA standar (1 mg/ml) dengan keterangan sebagai berikut. Tabung 1 2 3 4 5 6 [BSA] akhir (mg/ml) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,1 Volume BSA 1 mg/ml (ml) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,25 Volume akuades (ml) 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,25

Kemudian, 8 tabung reaksi baru disiapkan dan dilapisi alumunium foil untuk menghindari paparan terhadap cahaya. Selanjutnya, kedelapan tabung reaksi diisi dengan larutan BSA (tabung1-6), sampel (tabung 7), dan akuades (tabung 8) untuk blanko sebagai berikut.

Setelah itu.25 Volume akuades (ml) 0.2 Volume pereaksi Biuret (ml) 6 6 6 6 6 6 6 6 Langkah selanjutnya. Perrtama. Selain itu.5 0.75 1. Sedangkan. maka larutan akan menjadi jenuh sehingga hasil yang diperoleh tidak maksimal. .3 0.2 0.0 2.2 Standar: 1.2 Standar: 1. Langkah terakhir. Hal tersebut bertujuan agar reaksi dapat berjalan optimal.7 0.2 Standar: 1.75 1. dan akuades (tabung 8) untuk blanko sebagai berikut. dan dibiarkan selama 30 menit dalam suhu ruang. kurva larutan standar BSA dibuat dengan absorbansi (A) pada ordinat dan konsentrasi protein pada absis. Selanjutnya. ditambahkan 0. Setelah reaksi terjadi.8 0.25 Kemudian.0 1.25 1. juga ditentukan konsentrasi protein dalam sampel (mg/ml). 8 tabung reaksi baru disiapkan dan dilapisi alumunium foil untuk menghindari paparan terhadap cahaya. prosedur kerjanya sebagai berikut.2 Standar: 1. kedelapan tabung reaksi diisi dengan larutan BSA (tabung1-6). 6 tabung reaksi disiapkan untuk mengencerkan larutan BSA standar (1 mg/ml) dengan keterangan sebagai berikut. Bila waktu pembiaran lebih dari waktu tersebut.3 ml pereaksi Folin Ciocalteau.5 0. lalu didiamkan selama 10 menit pada suhu ruang.25 0.75 2.2 Akuades: 1. Tabung 1 2 3 4 5 6 [BSA] akhir (mg/ml) 0.Tabung 1 2 3 4 5 6 7 8 Volume protein (ml) Standar: 1.2 Standar: 1.2 Sampel protein: 1. larutan diaduk dengan vorteks hingga homogen. pada metode Bradford. absorbansi larutan sampel diukur menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 650 nm.5 0.75 0. sampel (tabung 7). divorteks.1 Volume BSA 1 mg/ml (ml) 2.

4 Standar: 0. kurva larutan standar BSA dibuat dengan absorbansi (A) pada ordinat dan konsentrasi protein pada absis.4 Standar: 0.4 Volume pereaksi Bradford (ml) 8 8 8 8 8 8 8 8 Langkah selanjutnya.4 Standar: 0.Tabung 1 2 3 4 5 6 7 8 Volume protein (ml) Standar: 0.4 Standar: 0. Langkah terakhir.4 Standar: 0. Selain itu.4 Sampel protein: 0. juga ditentukan konsentrasi protein dalam sampel (mg/ml).4 Akuades: 0. larutan sampel diukur menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 595 nm. lalu didiamkan selama 2 menit pada suhu ruang sehingga reaksi dapat berlangsung optimal Setelah itu. larutan diaduk dengan vorteks hingga homogen. .

8 1 Absorbansi (A) 0 0.4 0.25 0.8 1 1.255 0.373 y = 0.1 0.009 R² = 0. Tabel 2 Kurva standar Bradford [BSA] (M) 0 0.2 Absorbansi (A) 0 0.0.2 0.318 0.4 0.05 0 0 0.171 0.016 0.123 0.396x .3 0.45 0.6 [protein] Gambar 1 Kurva standar metode Lowry.4 0.286 0.889 0.1 0.433 0.2 0.15 0.4 0.743 0.6 0.984 .8 1 0.35 absorbansi 0.HASIL Tabel 1 Kurva standar Lowry [BSA] (M) 0 0.2 0.1 0.2 0.919 0.6 0.077 0.

9773 2.778 0.8 0.4160 1.6 0.6415 1.0290 1.5065 0.7130 0.3018 1.546 0.5985 4.7250 2.227 1.6427 4.199 0.656 1.3788 5.5013 1.8232 1.714 0.052 R² = 0.770 0.535 0.8 1 .5855 0.2 1 absorbansi 0.5530 0.467 0.8505 0.800 Abs ratarata (A) 1.772 0.794 2.547 0.102 0.4 0.571 0.1667 3.1704 1.6 [protein] Gambar 2 Kurva standar metode Bradford Tabel 3 Pengukuran konsentrasi protein dengan metode Lowry Sampel A B C D E F Kelompok 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Abs1 (A) 1.844 Abs2 (A) 1.605 1.8220 [Protein] 3.4 y = 1.996 1.1905 0.574 0.1.712 0.693 1.929 0.2 0 0 0.7740 0.181x + 0.078 1.975 0.6237 0.590 1.0370 1.4192 1.2 0.

029 1.970 0.7710 1.7947 0.396x – 0.925 1.907 1.1168 0.9640 Contoh Perhitungan Konsentrasi Protein dengan metode Lowry y = bx+a Keterangan: y = absorbansi (A) x = [Protein] (M) a.396x 1.5860 2.1995 = 0.396x .009 y = 1. Sampel A(Kelompok 2) Diketahui: y = 0.1456 2.1080 0.396x .7244 0.183 Abs ratarata (A) 1.8548 0.9905 1.934 1.5520 1.b = konstanta dari grafik standar 1.009 1.7250 0.051 1.1905 = 0.979 1.198 Abs2 (A) 1.9265 1.5699 0.179 1.5125 2.2367 2.8163 0.001 0.0.116 0.003 0.0615 0.Tabel 4 Pengukuran konsentrasi protein dengan metode Bradford Sampel A B C D E F Kelompok 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Abs1 (A) 1.579 2.396x x = 3.734 0.009 = 0.8942 0.1905 + 0.0.9855 0.593 2.512 2.716 0.002 1.919 1.1905 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.908 1.1905 [Protein] (M) 0.0160 0.072 0.100 0.9075 1.513 2. Sampel A(Kelompok 1) Diketahui: y = 0.0290 M 2.009 .7904 0.

0. Sampel C (Kelompok 5) Diketahui: y = 0.009 = 0.7130 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.5855 + 0.5855 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.5065 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.7130 = 0.396x x = 1.396x x = 1.396x .009 .396x – 0.396x 0.009 0.396x – 0.396x .5945 = 0.396x – 0.5065 + 0.396x x = 1.009 = 0.y = 0.009 0.3018 M 3.0.009 = 0.009 0.396x .5013 M 4.7130 + 0.722 = 0.396x 0.5065 = 0.396x 0.8232 M 5. Sampel B (Kelompok 3) Diketahui: y = 0.009 y = 0. Sampel B (Kelompok 4) Diketahui: y = 0.0.5155 = 0.009 y = 0.5855 = 0.

396x x = 2.396x x = 1.396x x = 1. Sampel C (Kelompok 6) Diketahui: y = 0.396x .783 = 0.009 = 0.009 0.0.0.1704 M 7.9773 M 6.8595 = 0.396x – 0.0.396x 0.009 = 0.8505 = 0.5530 + 0.009 y = 0.009 y = 0.8505 + 0.009 0.396x 0.009 .8505 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.009 = 0.009 0. Sampel D (Kelompok 7) Diketahui: y = 0.7740 + 0.396x .7740 = 0.7740 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.396x .y = 0.396x – 0.396x 0.4192 M 8.562 = 0.5530 = 0. Sampel D (Kelompok 8) Diketahui: y = 0.396x – 0.5530 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.

3788 M 10.009 y = 1.0370 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 2.396x x = 4.396x .009 .0.6427 M 9.7250 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.y = 0.396x 1.7250 = 0.396x 2.396x – 0.009 0.6415 + 0.396x x = 5.009 y = 2.396x – 0.396x .1667 M 11.009 = 0.009 = 0. Sampel E (Kelompok 10) Diketahui: y = 0.734 = 0.0.6415 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.0.396x 0.396x – 0.6505 = 0.0370 = 0.009 2.7250 + 0.396x x = 1. Sampel F (Kelompok 11) Diketahui: y = 0.009 1.0370 + 0.6415 = 0. Sampel E (Kelompok 9) Diketahui: y = 0.009 = 0.046 = 0.396x .

396x x = 3.396x – 0.0160 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.009 = 0.8220 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.4160 = 0.181x + 0.5985 M 12.4160 + 0.y = 1.396x – 0.396x x = 4.009 1.009 y = 1. Sampel A(Kelompok 1) Diketahui: y = 1.396x .052 y = 1.6237 M Contoh Perhitungan Konsentrasi Protein dengan metode Bradford y = bx+a Keterangan: y = absorbansi (A) x = [Protein] (M) a.396x 1.0.009 = 0.009 1.425 = 0.8220 = 0.831 = 0. Sampel F (Kelompok 12) Diketahui: y = 0.181x + 0.0160 = 1.052 .b = konstanta dari grafik standar 1.8220 + 0.4160 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.396x 1.

1080 = 1.964 = 1. Sampel A(Kelompok 2) Diketahui: y = 1.9075 = 1.9385 = 1.181x + 0.181x x = 0.0160 .052 1.056 = 1.9905 . Sampel B (Kelompok 3) Diketahui: y = 1.052 = 1.181x + 0.0.0.1. Sampel B (Kelompok 4) Diketahui: y = 1.052 = 1.9905 = 1.9905 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.052 .181x + 0.052 y = 0.1080 .052 = 1.8942 M 4.0.9075 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.7947 M 3.052 y = 0.181x + 0.181x x = 0.052 y = 0.181x + 0.181x 0.8163 M 2.181x 0.181x + 0.052 0.181x 1.9905 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.181x x = 0.

181x + 0.052 = 1.8555 = 1.0.0615 .181x + 0.052 = 1.8548 M 6. Sampel D (Kelompok 7) Diketahui y = 1.7244 M 5.181x x = 0.052 .052 y = 0.0095 = 1.052 1.052 y = 1.052 0.0.181x 0.181x + 0.7250 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.9855 .181x x = 0.0.7904 M 7.9075 .181x 1.0615 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.052 = 1.181x + 0.9335 = 1.181x + 0.9855 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.7250 = 1. Sampel C (Kelompok 5) Diketahui y = 1.181x + 0.0615 = 1.181x x = 0.052 y = 0.9855 = 1.181x 0.0. Sampel C (Kelompok 6) Diketahui y = 1.

0.5860 = 1.181x 0.052 y = 1.0.5125 = 1.181x + 0.052 1.9265 .052 = 1.181x + 0.052 = 1.9265 = 1.9265 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.4605 = 1.181x x = 0.181x x = 1.7710 M 9.052 = 1.673 = 1.181x 1.181x + 0. Sampel E (Kelompok 10) Diketahui y = 1.7250 .052 0.5699 M 8.5125 .181x + 0.5125 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.181x + 0.181x x = 0. Sampel D (Kelompok 8) Diketahui y = 1.052 y = 0.181x 0.9105 = 1.181x + 0.052 .0.2367 M 10. Sampel E (Kelompok 9) Diketahui y = 1.5860 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 2.0.052 y = 2.

181x 1.1456 M 11.181x x = 2.052 = 1.5860 .0.0.052 = 1.5520 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 2.5520 = 1.0.1905 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.2.1385 = 1.052 = 1.1905 = 1.5 = 1.052 2.534 = 1.9640 M Contoh Perhitungan Konsentrasi Sampel Hasil Pengenceran M1V1=M2V2 Keterangan: F = Banyaknya pengenceran M1 = Konsentrasi sampel awal (%v/v) .5520 .181x 2.181x x = 2. Sampel F (Kelompok 12) Diketahui y = 1.181x x = 0.181x + 0.1168 M 12. Sampel F (Kelompok 11) Diketahui y = 1.052 y = 2.181x + 0.181x + 0.052 1.181x 2.181x + 0.052 y = 1.1905 .

Sampel D Diketahui: Sampel A= 2%b/v ⁄ Volume Sampel = 100 ml Ditanya: Berapa konsentrasi sampel hasil pengukuran? Jawab: Vtotal = 200 ml 2% x 100 ml = M2 x 200 ml M2 = 1%b/v 3.5%v/v 2.M2 = Konsentrasi hasil pengenceran (%v/v) V1 = Volume sampel (ml) V2 = Volume total (ml) 1. Sampel B Diketahui: Sampel A= 5%v/v ⁄ Volume Sampel = 100 ml Ditanya: Berapa konsentrasi sampel hasil pengukuran? Jawab: Vtotal = 200 ml 5% x 100 ml = M2 x 200 ml M2 = 2. Sampel F Diketahui: .

Sampel A= 2%b/v ⁄ Volume Sampel = 100 ml Ditanya: Berapa konsentrasi sampel hasil pengukuran? Jawab: Vtotal = 200 ml 2% x 100 ml = M2 x 200 ml M2 = 1%b/v PEMBAHASAN .

Hal ini sesuai dengan hukum Lambert-Beer yang menyatakan bahwa semakin besar absorbansi larutan. Dari kurva standar.984 (Lowry) dan 0. dibuat kurva standar untuk masingmasing metode. semakin besar konsentrasi zat terlarut. Hal ini sesuai dengan literatur yang menyatakan bahwa pengenceran akan menurunkan konsentrasi larutan tanpa mengubah jumlah mol zat yang terlarut di dalamnya (Chang 2006). Persamaan garis tersebut kemudian digunakan untuk menentukan konsentrasi protein dalam larutan sampel untuk masing-masing metode. Semakin besar nilai regresi. Sesuai hasil perhitungan. Berdasarkan percobaan dengan metode Lowry.0290 M dan 1. Sampel A kemudian diencerkan sebanyak 2x menjadi sampel B yang memiliki absorbansi sebesar 0.0. dapat dilihat korelasi absorbansi dengan konsentrasi protein dalam larutan.5013 M dan 1. data pada sampel B juga memperlihatkan relasi absorbansi dengan konsentrasi protein dalam larutan. Dari data di atas.5065 A dengan konsentrasi 3. Persamaan garis metode Lowry adalah y = 0. persamaan garis metode Bradford adalah y = 1. .396x .3018 M.009. Konsentrasi sampel B dari hasil perhitungan berdasarkan persamaan garis kurva standar adalah 1. Sedangkan. Namun. Demikian pula sebaliknya.8232 M. dapat diketahui bahwa terjadi penurunan konsentrasi larutan sampel.5855 A dan 0. Sampel pertama adalah putih telur dengan konsentrasi 5%v/v. semakin kecil absorbansi.1505 A dan 0. semakin baik model kurva yang dibuat ([UI] 2009). yaitu keduanya berbanding lurus. juga diperoleh persamaan garis untuk kedua metode.713 A dalam metode Lowry.181x + 0. Nilai regresi yang diperoleh dari masing-masing kurva standar yang dibuat yaitu 0. semakin kecil pula konsentrasi zat terlarut (Effendi 2003).Pada praktikum penentuan kadar protein.975 (Bradford). penurunan konsentrasi protein dalam percobaan ini tidak sesuai dengan data hasil perhitungan.052. Seperti pada sampel A. seharusnya didapatkan konsentrasi akhir protein dalam sampel B setengah kali konsentrasi protein dalam sampel A. yang berbanding lurus (Effendi 2003). Bila data sampel A dengan sampel B dibandingkan. didapatkan absorbansi sampel A 1.

Seperti pada sampel C. semakin besar konsentrasi zat terlarut (Effendi 2003). Hal ini sesuai dengan hukum Lambert-Beer yang menyatakan bahwa semakin besar absorbansi larutan. Data ini tidak sesuai dengan literatur bahwa pengenceran menyebabkan penurunan konsentrasi larutan (Chang 2006).6415 A.9905 dengan konsentrasi protein 0.704 M. Sampel C kemudian diencerkan sebanyak 2x menjadi sampel D yang memiliki absorbansi metode Lowry 0. Namun. Berdasarkan percobaan dengan metode Lowry. Sedangkan.8163 M dan 0. yaitu keduanya berbanding lurus. Bahkan bila dibandingkan.9075 A dengan konsentrasi protein 0. . dapat diamati bahwa terjadi penurunan konsentrasi larutan sampel. sampel A memiliki absorbansi 1.8505 A dengan konsentrasi 1. tidak terdapat perbedaan yang terlalu signifikan antara konsentrasi protein sebelum dan setelah larutan putih telur diencerkan.016 A dan 0. data sampel D juga memperlihatkan relasi absorbansi dengan konsentrasi protein dalam larutan yang berbanding lurus (Effendi 2003).Berdasarkan percobaan dengan metode Bradford. dengan konsentrasi protein hasil perhitungan sebesar 1. terlihat relasi absorbansi dengan konsentrasi protein dalam larutan. Hal ini sesuai dengan literatur yang menyatakan bahwa pengenceran akan menurunkan konsentrasi larutan tanpa mengubah jumlah mol zat yang terlarut di dalamnya (Chang 2006).7244 M. penurunan konsentrasi protein dalam percobaan ini tidak sesuai dengan data hasil perhitungan. data kedua konsentrasi protein setelah pengenceran lebih besar daripada sebelum pengenceran. konsentrasi akhir protein dalam sampel D seharusnya setengah kali konsentrasi protein dalam sampel C. Dari data ini terlihat bahwa absorbansi larutan berbanding lurus dengan konsentrasi zat terlarutnya (Effendi 2003).553 A dan 0.6427 M. Bila data kedua sampel dibandingkan.108 A dan 0. Dari data di atas.7947 M.774 A dan 0. dapat pula diamati bahwa dalam pengukuran dengan metode Bradford. Selain itu.9773 M dan 2.4191 M dan 1. didapatkan absorbansi sampel C adalah 0. Sampel kedua dalam praktikum ini adalah tepung cacing dengan konsentrasi 2%b/v. Berdasarkan hasil perhitungan. sampel B memiliki absorbansi 1.8942 M dan 0.

seharusnya konsentrasi protein dalam sampel F setengah kali konsentrasi protein dalam sampel E. didapatkan absorbansi sampel E sebesar 1.7250 A dan 2.3788 M dan 5. Namun.9855 A dengan konsentrasi protein 0.5860 A dengan konsentrasi protein 1.6237 M. Hal ini sesuai dengan teori yang menyatakan bahwa pengenceran akan menyebabkan penurunan konsentrasi larutan tanpa mengubah jumlah mol zat yang terlarut di dalamnya (Chang 2006). diketahui sampel C memiliki absorbansi 1. bila data kedua sampel di atas dibandingkan.5985 M dan 4. Berdasarkan percobaan dengan metode Lowry. Dari data di atas.8548 M dan 0. dapat juga diketahui bahwa terjadi penurunan konsentrasi protein dalam larutan sampel setelah pengenceran.7250 A dan 0.0370 A dengan konsentrasi 4. semakin besar konsentrasi zat terlarut (Effendi 2003). Sampel E kemudian diencerkan sebanyak 2x menjadi sampel F yang memiliki absorbansi metode Lowry sebesar 1.5699 M dan 0.2367 M dan 2. yaitu keduanya berbanding lurus. Sedangkan.552 A . dapat diketahui relasi antara absorbansi dengan konsentrasi protein dalam larutan.9265 A dengan konsentrasi protein 0.7904 M. Berdasarkan percobaan dengan metode Bradford. Seperti pada sampel E.1667 M. data pada sampel F juga memperlihatkan relasi absorbansi dengan konsentrasi protein dalam larutan yang berbanding lurus (Effendi 2003). diketahui sampel E memiliki absorbansi sebesar 1.5125 A dan 2. sampel F memiliki absorbansi sebesar 2. dapat diamati bahwa terjadi penurunan konsentrasi larutan sampel. Hal ini sesuai literatur yang menyatakan bahwa semakin besar absorbansi larutan. Sedangkan.0615 A dan 0. Data ini sesuai dengan literatur bahwa konsentrasi larutan akan menurun jika dilakukan pengenceran (Chang 2006). Sesuai hasil perhitungan.Dalam percobaan dengan metode Bradford. Data kedua sampel tersebut menunjukkan bahwa absorbansi larutan berbanding lurus dengan konsentrasi zat terlarutnya (Effendi 2003).1456 M. penurunan konsentrasi protein dalam percobaan ini tidak sesuai dengan data hasi perhitungan. Sampel ketiga adalah tepung cacing dengan konsentrasi 2%b/v.4160 A dan 1. dengan konsentrasi protein hasil perhitungan sebesar 3.822 A. Bila data sampel E dan sampel F dibandingkan.7710 M. sampel D memiliki absorbansi sebesar 0. Selain itu.

Selain itu. glisin. Dari data kedua sampel. Hal ini dapat disebabkan oleh perbedaan sensitivitas dan senyawa pengganggu pada kedua metode (Nielsen 2010). Contoh senyawa tersebut diantaranya ammonium sulfat. dapat diamati bahwa kedua metode memberikan hasil absorbansi dan konsentrasi protein yang berbeda pada masing-masing sampel yang sama. Data ini sesuai dengan literatur bahwa konsentrasi larutan akan menurun jika dilakukan pengenceran (Chang 2006). Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan. lubrol. sedangkan pereaksi Biuret dibuat dengan mencampurkan 50 mL reagen A (2 % Na2CO3. Reagen yang digunakan pada metode Lowry adalah pereaksi Folin-Ciocalteau dan peraksi Biuret.9640 M. cesium bikarbonat. Ammonium sulfat. Triton X-100. triptofan. sorbitol. dapat diketahui bahwa absorbansi larutan berbanding lurus dengan konsentrasi zat terlarutnya (Effendi 2003). NaCl. sistein) yang ada dalam larutan protein. glukosa. maupun konsentrasi protein dalam sampel. chaps.1168 M dan 0. 1% Na-K tartrat) (Owusu 2002). octyl glucoside. Ion Cu+ bersama dengan fosfotungstat dan fosfolibdat dalam pereaksi Folin-Ciocalteau akan membentuk warna biru yang dapat menyerap cahaya (Purwoko 2007).4% NaOH) dengan 1 mL reagen B (0. . Warna biru yang muncul akan dideteksi pada panjang gelombang 750 nm (sensitivitas yang tinggi untuk konsentrasi protein yang kecil) atau 500 nm (sensitivitas yang rendah untuk konsentrasi protein yang tinggi). tris. absorbansi. EDTA. chapso.5% CuSO4. 0. dapat juga diketahui terjadi penurunan konsentrasi protein dalam larutan sampel setelah pengenceran. Dalam percobaan ini. bila data kedua sampel dibandingkan. Pada metode Lowry terdapat banyak senyawa pengganggu yang dapat bereaksi dan mempengaruhi hasil pengukuran. Pereaksi Folin Ciocalteau dibuat dengan cara mengencerkan reagen Folin Ciocalteau. Metode Lowry mampu mengukur kadar protein sampai dengan 5 μg (Nielsen 2010). dll. sukrosa. Hal tersebut diakibatkan Metode Lowry merupakan metode pengukuran konsentrasi protein dengan prinsip reduksi Cu2+ menjadi Cu+ oleh asam amino (tirosin. terdapat beberapa kesalahan baik pada pembuatan kurva standar.dan 1.1905 A dengan konsentrasi protein 2.

Gambar 3 Struktur Coomassie Brilliant Blue G-250 ([UA] 2009). Metode Bradford sendiri merupakan metode yang sederhana karena hanya menggunakan 1 reagen dan reaksi berlangsung cepat karena inkubasi hanya berlangsung selama 5 menit dalam suhu ruang ([UA] 2009). yaitu pewarna CBB dapat membekas pada alat-alat berbahan kaca dan dapat terganggu dengan adanya detergen seperti SDS ([UA] 2009). SDS akan mengganggu ikatan hidrogen dan berikatan dengan . metode ini juga sensitif dan tepat karena mampu mendeteksi protein sampai dengan 1-20 µg (Li 2005). chaps.5%) dan EDTA adalah contoh senyawa pengganggu yang menyebabkan tidak terbentuknya warna biru pada reaksi (Walker 2002). Namun. pengukuran kadar protein juga dapat dilakukan dengan metode Bradford. cesium bikarbonat merupakan contoh senyawa pengganggu yang dapat mengendapkan protein. Glisin (lebih besar dari 0. Dengan demikian. Selain itu juga ada merkaptan (2-mercaptoethanol) dan Ditiotreitol (DTT) yang merupakan senyawa pengganggu yang mereduksi protein untuk bereaksi dengan pewarna (Owusu 2002). absorbansinya protein dapat diukur menggunakan spektrofotometri pada panjang gelombang 465-595 nm (Caprette 2005).lubrol. CBB akan berikatan dengan protein pada sampel larutan dalam suasana asam. chapso. metode ini memiliki kelemahan. Selain menggunakan metode Lowry. Selain itu. Metode Bradford merupakan metode pengukuran konsentrasi protein total yang melibatkan pewarna Coomassie Brilliant Blue (CBB).

Spektrofotometri berbeda dengan kolorimetri. Melalui nilai absorbansi. dalam susu terdapat protein yang disebut kasein. tetapi dapat juga menggunakan sinar UV maupun sinar infra merah (Natalia 2010). Albumin dan lysozyme yang mempunyai aktivitas antimikroba dapat digunakan sebagai bahan pengganti antibiotik dalam mengobati penyakit yang disebabkan oleh mikroorganisme. Penggunaan albumin dan lysozyme dalam putih telur ini sebagai pengganti antibiotik sangat penting karena penggunaan antibiotik secara kontinu dapat menimbulkan resistensi (Chairul et al. Kolorimetri sendiri. Prinsip spektrofotometri yaitu pengukudan absorbsi cahaya yang melalui suatu larutan pada panjang gelombang tertentu. 2006). pada percobaan penentuan kadar protein dengan spektrofotometri. 2006). metode spektrofotometri tidak terbatas pada penggunaan sinar daerah tampak. terutama albumin dan lysozyme yang termasuk protein kualitas tinggi (Chairul et al. Berbeda dengan putih telur. Sedangkan. digunakan 3 sampel. Seperti yang telah disebutkan sebelumnya. susu. Jadi. Hal ini menyebabkan larutan bersifat basa dan tidak dapat bereaksi dengan pewarna CBB (Saraswati 2008). dapat ditentukan konsentrasi zat terlarut dalam sampel. Protein ini dapat dimodifikasi menjadi produk bernama CPP-APP (casein . yaitu putih telur. dan tepung cacing. Ketiga sampel memiliki kandungan protein yang berbeda-beda dengan manfaat yang juga beragam. Putih telur ini kaya akan protein. Metode ini berdasar pada penyerapan cahaya tampak dan energi radiasi lainnya oleh suatu larutan (Amanda 2011).bagian hidrofobik pada protein sehingga protein terurai menjadi ikatan polipeptida yang panjang dan mempunyai muatan negatif yang besar sehingga akan saling tolakmenolak dengan molekul CBB yang bermuatan negatif. Putih telur merupakan bagian yang berwarna bening dan mengelilingi kuninng telur. kolorimetri merupakan pengukuran warna. Jumlah cahaya yang diabsorbsi oleh larutan sebanding dengan konsentrasi zat terlaut (Lestari 2007). khususnya bakteri patogen. merupakan metode analisa kimia yang didasarkan pada kesamaan besaran warna antara larutan sampel dengan sumber cahaya polikromatis dan detektor mata. yang berarti sinar yang digunakan adalah sinar daerah tampak.

dalam tepung cacing terdapat protein berupa enzim yang disebut lumbrokinase.000 Dal (Harper 2003). BSA ada protein lain yang dapat dijadikan sebagai standar. Pada praktikum ini. Selain. yaitu enzim amilase yang dalam bidang kedokteran digunakan untuk mengetahui kerusakan pada pankreas dan menentukan kondisi utama dalam plasma (Neryceka 2004). Namun dalam kenyataannya. Produk kasein tersebut dapat digunakan untuk menguatkan email gigi dan mehambat caries pada gigi. Hal tersebut berkaitan dengan fakta bahwa penggunaan antibiotik dalam jangka lama dapat menyebabkan resistensi terhadap bakteri patogen (Sofyan 2008). lumbrokinase digunakan untuk mencegah dan mengobati ischemic stroke. 2005). digunakan larutan BSA dalam pembuatan kurva standar metode Bradford dan Lowry. Selain lumbricin. Selain itu. tepung cacing dapat digunakan sebagai pengganti antiobiotik yang merupakan pakan imbuhan (pemacu pertumbuhan) pada ternak unggas. Tepung cacing juga mengandung enzim lain. Pemilihan protein standar merupakan hal yang penting dalam suatu tes protein. dan thrombosis disease. BSA dijadikan sebagai protein standar karena mudah didapat dalam keadaan murni dan relatif murah (Wrolstad et al. Protein ini merupakan turunan dari darah sapi sehat (Wise & Watters 2010). seharusnya dalam pembuatan kurva standar digunakan bentuk murni protein yang akan diuji. Biasanya. 2006). Protein ini mampu menghambat pertumbuhan bakteri-bakteri patogen. Sedangkan. BSA atau Bovine Serum Albumin adalah protein globular besar yang berukuran kurang lebih 66. yaitu BGG (Bovine Gamma Globulin). Oleh karena itu. pada tepung cacing terdapat komponen bioaktif bernama lumbricin yang merupakan senyawa peptida dengan susunan asam amino lengkap terutama prolin. Secara ideal. BSA juga bersifat sangat stabil (Estey et al. jika sampel yang .phosphopeptide–amorphous calcium phosphate). hypercoagulanility. BGG menjadi pilihan yang baik. Oleh karena itu. BSA dijadikan sebagai standar relatif protein di samping pengembangan warnanya yang lebih baik dibanding protein lain (Kirschner 2007). Enzim ini memiliki aktivitas fibrinolitik dan antitrombotik (Cooper & Yamaguchi 2004). hal tersebut sulit dilakukan. CPP-APP sendiri sudah lazim digunakan dalam permen karet bebas gula (Reynolds 2009).

. Warna yang dihasilkan oleh BSA lebih baik daripada BSA.diuji memiliki kandungan immunoglobulin. 2005). uji Bradford lebih sensitif terhadap BSA dibandingkan dengan BGG (Caprette 2006). BGG memiliki beberapa kelemahan dibandingkan dengan BSA. Hal itu disebabkan oleh respon warna BGG yang sangat mirip dengan immunoglobulin G (Wrolstad et al. Akan tetapi. Selain itu. BSA merupakan protein standar yang lebih baik jika sampel yang diuji memberikan respon warna yang sejenis atau sampel memiliki kandungan utama berupa albumin (Kirschner 2007).

2 M. semakin besar nilai absorbansinya maka semakin besar pula jumlah konsentrasi protein yang terkandung dalam larutan. ada tidaknya senyawa pengganggu. banyaknya jumlah cahaya yang diserap berbanding lurus dengan konsentrasi senyawa di dalam larutan. 0. dari data tersebut terbentuk dan terhubung menjadi kurva standar. Untuk metode Lowry mempunyai kelebihan yaitu sensitivitas yang tinggi. Kelemahannya adalah variasi warna tidak proporsional dengan konsentrasi protein. dan 1 M. Pengukuran dan analisis konsentrasi kadar protein dalam larutan dilakukan dengan menggunakan prinsip absorbansi dan transmisi cahaya yang merupakan dasar dalam penentuan sifat dan analisis biomolekul seperti protein.4 M. Sedangkan. dan waktu yang tersedia.SIMPULAN Untuk membuat kurva standar dari pewarna Lowry dan Bradford digunakan larutan BSA. . Kedua metode yang digunakan pada percobaan kali ini. absorbansi diperoleh dari pengukuran. Kurva standar dibuat dengan menghubungkan absorbansi pada ordinat (sumbu Y) dan konsentrasi protein sebagai absis (sumbu X).1 M. reagen yang digunakan tidak sederhana dan mudah bereaksi dengan senyawa lain. 0. pewarna protein bisa menempel pada kuvet kuarsa. dan mengalami intervensi deterjen. 0. Untuk Bradford mempunyai kelebihan yaitu reaksinya cepat dan bersifat reprodusibel.6 M. 0. dan turbiditas sampel tidak berpengaruh dalam metode ini. Penentuan kadar protein dalam sampel pada percobaan dilakukan dengan metode spektrofotometri. lebih spesifik. Dengan demikian. Jadi. Efektivitas metode tersebut tergantung dari sensitivitas dan akurasi. Dalam pengukuran ini. Sedangkan kelemahannya sama seperti Lowry yaitu variasi warna tidak proporsional dengan konsentrasi protein. yaitu metode Lowry dan metode Bradford masing-masing mempunyai kelebihan dan kelemahannya sendiri. sifat-sifat protein yang diukur.8 M. Konsetrasi BSA yang digunakan adalah 0.

Jelaskan tentang kelebihan dan kelemahan metode Lowry dan Bradford dalam mengukur kadar protein! .MENJAWAB PERTANYAAN 1.

Untuk itu. dalam menentukan kadar protein. sehingga kurang efisien dari segi waktu (Simpson 2004). metode ini juga memiliki beberapa kekurangan. lipid. Metode ini juga sangat sensitif. Selain itu.Jawab: Kelebihan metode Lowry adalah metode ini sensitif. warna yang terbentuk pada metode Lowry bervariasi bergantung jenis protein (Nielsen 2010). 50-100 kali lebih sensitive daripada metode Biuret dan 10-20 kali lebih sensitive daripada metode UV-280 nm absorption. juga dapat digunakan metode Bradford. Konsentrasi tinggi ammonium sulfat dan senyawa sulfidril juga dapat mengintervensi reaksi pada metode Lowry (Nielsen 2010). Selain itu. Selain itu. lebih baik digunakan kuvet kaca atau kuvet plastik. dan hexoamine hingga mencapai derajat tertentu. Namun. antara lain variasi warna yang tidak terlalu proporsional dengan konsentrasi protein. yaitu variasi warna yang luas sesuai dengan jenis proteinnya mengakibatkan seleksi protein menjadi lebih sulit sehingga harus dilakukan dengan hati-hati. sama seperti metode Lowry. Selain itu. metode ini dapat mengukur protein atau peptida dengan massa molekul sama dengan atau lebih besar dari 4000 Da (Nielsen 2010).5 jam. yaitu sekitar 2 menit dan data yang dihasilkan dalam metode ini berulang atau dengan kata lain bersifat reprodusibel. sekitar 1-1. baik yang ionik maupun anionik seperti Triton X-100 dan Sodium . buffer fosfat. Turbiditas sampel tidak berpengaruh dalam metode ini (Nielsen 2010). Selain itu. bahkan lebih sensitif daripada metode Lowry. Kelemahan lain adalah metode ini dapat mengalami intervensi deterjen. reaksi ini dapat mengalami intervensi senyawa-senyawa tertentu seperti sukrosa. Selain metode Lowry. Kelebihan metode ini adalah reaksinya berlangsung sangat cepat. Kelemahan lain adalah reagen metode Lowry tidak stabil dan membutuhkam preparasi harian dengan prosedur cukup rumit. metode Lowry memiliki beberapa kelemahan. kompleks protein-pewarna hasil reaksinya dapat berikatan dengan kuvet kuartz. monosakarida. metode Lowry lebih spesifik daripada metode lain dan relatif sederhana dalam eksekusinya sehingga tidak membutuhkan waktu terlalu lama. Namun.

Metode BCA (Bicinchoninic Acid). 6. Sebutkan metode pengukuran kadar protein lain yang ada! Jawab: Beberapa metode pengukuran kadar protein lain yaitu sebagai berikut (Nielsen 2010). Namun. dan titrasi. Metode Biuret. yang dapat menghitung konsentrasi asam amino triptofan dan tirosin menggunakan hukum Beer. Metode Kjeldahl. kesalahan akibat kandungan deterjen kurang dari 0. yang meliputi tahapan pencernaan. tepung gandum. yang banyak digunakan untuk menentukan protein pada sereal atau kacang kedelai. 5. 2. yang biasa digunakan untuk menghitung kadar protein dalam susu. netralisasi. Metode Dumas (Nitrogen Combustion) . dan daging. 2. Metode anionic dye-binding. yang banyak digunakan dalam proses isolasi dan purifikasi protein. 3. 1. Metode UV-280 nm absorption.Dodesil Sulfat (SDS). 4.1% masih dapat diperbaiki melalui control yang tepat (Nielsen 2010).

Poeloengan M. Estey T. Caprette DR. Maheswari RRA. Effendi H. Carpenter JF.DAFTAR PUSTAKA Amanda M.htm [10 Mar 2012]. [11 Mar Cooper EL. Complementary and Alternative Approach to Biomedicine. Medan: Universitas Sumatera Utara. 2003.edu/files/protocols/BioRad_proteinassay. Aktivitas antimikroba pada putih telur dari beberapa jenis unggas terhadap bakteri gram positif dan gram negatif. Penetapan kadar kromium pada air reservoir secara kolorimetri di PDAM Tirtanadi instalasi pengolahan air sunggal [skripsi]. Methods of Analysis of Food Components and Additives. berkala]. http://kirschner. 2006. Bovine serum albumin [terhubung berkala].fst. 2004. Kolakowski E. 2011. [skripsi].edu/people/harper/functionalfoods/milk%20components/bovine%20serum%20albumin. Harper JW. Kang J.html 2012]. Florida: CRC. 2007.rice. 2010. 2003. Yamaguchi N. Protein assay [terhubung http://www.Yogyakarta: Kanisius.ruf.edu/~bioslabs/methods/protein/protein. . Biorad protein assay [terhubung berkala].ohiostate. BSA degradation under acidic solution: a model for protein instability during release from PLGA delivery systems. J Pharm Sci 7(95):1626-1639. 2006. New York: Kluwer Academic.harvard. Schwendeman SP. Kirschner MW. http://www. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Telaah Kualitas Air Bagi Pengelolaan Sumber Daya dan Lingkungan Perairan. Chairul.pdf [10 Mar 2012]. 2006.med.

Jakarta: Erlangga. 2010.pdf [10 Mar 2012]. Raymond C. Casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate: the scientific evidence. berkala]. Efek tegdma terhadap protein total dan profil protein sel-sel pulpa gigi (in vitro) [skripsi]. Bahaya Purifying Proteins for Proteomics: A Laboratory Manual.edu/protocols/CEP_38. Purwoko T. 2006. 2004.uga.biochem. Protein determination assays [terhubung rscott. Penentuan kadar klorin air baku produksi di PT. Owusu RK.edu/classes/bioc463a/Info/lecture_notes/colorimetric.Lestari F. Depok: Penebar Swadaya. Natalia S. Food Analysis. 2008. 2004. 2007. Damayanti E. 2010.ppt [11 Mar 2012]. Aktivitas antibakteri dan retensi protein tepung cacing tanah (Lumbricus rubellus) sebagai pakan imbuhan dengan taraf penambahan kitosan. Li X. New York: Cold Spring Harbor. Bahaya Kimia Sampling & Pengukuran Kontaminan Kimia di Udara.myweb. Depok: Universitas Indonesia. Food Protein Analysis: Quantitative Effects on Processing. . Reynolds EC. New York: Springer. Saraswati T. Colorimetric [terhubung berkala]. New York: Marcel Dekker. JITV 13(3): 182-188. http://www. Sofyan A. 2008. oligosporus. Cola-Cola bottling Indonesia Medan dengan metode kolorimetri [skripsi]. Jakarta: Universitas Katolik Indonesia Atma Jaya. 2002. Kandungan protein kecap manis tanpa fermentasi moromi hasil fermentasi Rhizopus oryzae dan R. 2009. 2010. Jakarta: EGC. Nielsen SS. 2005. 2009. Julendra H. Deteksi keberadaan berbagai enzim hidrolase pada cacing tanah (Lumbricus rubellus) [skripsi]. Biodiversitas 2(8):223-227. Neryceka CK. Kimia Dasar. 2010 Usaha Ternak Cacing Tanah. Simpson RJ. [UA] University of Arizona. Medan: Universitas Sumatera Utara. Palungkun R. ADR 21:25-29.arizona.

uad. Totowa: Humana. http://staff. blog.[UAD] Universitas Ahmad Dahlan. Proteins. 2011. Schwatz SJ 2005.ui. Walker JM. Decker EA. 2010. Regresi majemuk [terhubung berkala]. The Protein Protocols Handbook. https://wwws.ac.docx [10 Mar 2012].gov/srmors/certificates/927d. Bovine serum albumin (7%) [terhubung berkala]. Wrolstad RE. .pdf?CFID=11628267&CFTOKEN=f682f8 8a759516bc-B4D66BFA-E23D-27B47C85AA1E5BC84277&jsessionid=b430384deb613141a202 [10 Mar 2012]. Handbook of Food Analytical Chemistry: Water. Enzymes.ac. and Carbohydrates. 2002.id/internal/131998622/material/Multipleregression. New Jersey: John Wiley & Sons. Sifat protein [terhubung berkala]. Lipids.nist. Wise SA. Watters RL. 2009.id/primamitha/files/2011/12/SIFAT-PROTEIN. [UI] Universitas Indonesia.pdf [10 Mar 2012].