Laporan Praktikum Laboratorium Biokimia

Hari, Tanggal : Jumat, 16 Maret 2012 Kelompok :8 PJP : Prof. Dr. Maggy T. Suhartono Yanti, Ph.D. Asisten : Bernadetta Meika Dysa Irina Elissa Tjahjono Fidelia Isabel Yuliani Wijaya Katharina Jessica Matheus Alvin Prawira Sabar Budiman Stephanus Aditya Listian Stevanny Wong Steven Clement Wendy Andryan

PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN SPEKTROFOTOMETRI Debora Jessen Vania Gavrila Wikasa Melinda Ika Sari Michael Edbert Suryanto 2011-080-020 2011-080-026 2011-080-052 2011-080-089 2011-080-101

FAKULTAS TEKNOBIOLOGI UNIVERSITAS KATOLIK INDONESIA ATMA JAYA 2012

PENDAHULUAN Protein merupakan senyawa biomolekul yang penting, karena perannya dalam berbagai proses di dalam tubuh. Protein terdapat dalam jumlah yang banyak di dalam sel dan menyusun lebih dari setengah berat kering pada hampir semua organisme ([UAD] 2011). Untuk memenuhi kebutuhan protein dalam tubuh, seseorang harus mengonsumsi makanan yang mengandung protein. Banyak makanan yang merupakan sumber protein bagi tubuh, namun kadar protein di dalam setiap makanan berbedabeda. Oleh karena itu, pada percobaan ini akan dilakuan penentuan kadar protein dalam sampel dengan menggunakan metode spektrofotometri. Selain itu, percobaan ini juga dilakukan untuk menentukan efektivitas metode yang digunakan (metode Lowry dan metode Bradford), serta untuk membuat kurva standar dari pewarna Lowry dan Bradford. Pengukuran kadar protein dapat dilakukan dengan berbagai metode. Metode spektrofotometri merupakan metode yang menggunakan prinsip absorbansi dan transmisi cahaya dalam mengukur konsentrasi suatu senyawa (Lestari 2010). Dasar penggunaan metode spektrofotometri adalah dengan menggunakan metode Lowry dan Bradford. Prinsip metode Lowry adalah terbentuknya warna biru akibat penambahan pereaksi Folin Ciocalteau dan Biuret. Terbentuknya warna biru tersebut disebabkan oleh reaksi ion Cu2+ dengan ikatan peptida dalam larutan alkalis pada saat penambahan pereaksi biuret serta terjadinya reaksi reduksi pereaksi Folin Ciocalteau dengan asam amino dalam protein (Kolakowski 2012). Sedangkan, prinsip metode Bradford adalah adanya ikatan antara protein dengan CBB-G250 (Coomassie Brilliant Blue-G250) dalam keadaan asam. CBB yang awalnya berwarna merah akan berubah warna menjadi biru pada saat berikatan dengan protein sehingga terjadi perubahan panjang gelombang pewarna dari 465 nm menjadi 595 nm (Walker 2002).

BAHAN DAN METODE Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah spektrofotometer VIS, kuvet plastik, rak tabung reaksi, tabung reaksi, pompa bulp, vorteks, pipet mikro, tip, magnetic stirrer, gelas piala, labu takar, gelas ukur, dan kertas saring. Bahan yang digunakan adalah Bovine Serum Albumin (BSA) 1 mg/ml, NaOH 0,1 M, CuSO4.5H2O 1%, Na K-tartarat 2%, Na2CO3 2%, Coomassie Brilliant Blue G-250, Etanol 95%, Asam fosfat 85%, pereaksi Folin-Ciocalteau, pereaksi Biuret, pereaksi Bradford, alumunium foil dan sampel protein (putih telur 5%v/v, putih telur 5% v/v 2 kali pengenceran, tepung cacing 2 % b/v, tepung cacing 2% b/v 2 kali pengenceran, susu 2% b/v, susu 2% b/v 2 kali pengenceran). Metode yang digunakan dalam praktikum ini terbagi menjadi 2 bagian, yaitu metode Lowry dan metode Bradford. Untuk masing-masing metode dilakukan pembuatan kurva standard dan pengukuran kuantitatif larutan protein. Prosedur kerja pada metode Lowry adalah sebagai berikut. Perrtama, 6 tabung reaksi disiapkan untuk mengencerkan larutan BSA standar (1 mg/ml) dengan keterangan sebagai berikut. Tabung 1 2 3 4 5 6 [BSA] akhir (mg/ml) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,1 Volume BSA 1 mg/ml (ml) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,25 Volume akuades (ml) 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,25

Kemudian, 8 tabung reaksi baru disiapkan dan dilapisi alumunium foil untuk menghindari paparan terhadap cahaya. Selanjutnya, kedelapan tabung reaksi diisi dengan larutan BSA (tabung1-6), sampel (tabung 7), dan akuades (tabung 8) untuk blanko sebagai berikut.

Tabung 1 2 3 4 5 6 [BSA] akhir (mg/ml) 0.2 Standar: 1.5 0.75 0.25 0.7 0. Langkah terakhir. Selain itu.2 Standar: 1. ditambahkan 0.75 1.5 0. sampel (tabung 7). Bila waktu pembiaran lebih dari waktu tersebut.8 0.0 1. lalu didiamkan selama 10 menit pada suhu ruang. maka larutan akan menjadi jenuh sehingga hasil yang diperoleh tidak maksimal. Setelah itu.3 ml pereaksi Folin Ciocalteau.75 1. prosedur kerjanya sebagai berikut. absorbansi larutan sampel diukur menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 650 nm.5 0. Sedangkan.Tabung 1 2 3 4 5 6 7 8 Volume protein (ml) Standar: 1. Selanjutnya.1 Volume BSA 1 mg/ml (ml) 2. Setelah reaksi terjadi. Hal tersebut bertujuan agar reaksi dapat berjalan optimal.2 Standar: 1.2 Volume pereaksi Biuret (ml) 6 6 6 6 6 6 6 6 Langkah selanjutnya.3 0.25 Kemudian. larutan diaduk dengan vorteks hingga homogen. 6 tabung reaksi disiapkan untuk mengencerkan larutan BSA standar (1 mg/ml) dengan keterangan sebagai berikut.25 Volume akuades (ml) 0. dan dibiarkan selama 30 menit dalam suhu ruang.2 0.2 Standar: 1. kurva larutan standar BSA dibuat dengan absorbansi (A) pada ordinat dan konsentrasi protein pada absis. pada metode Bradford. Perrtama.2 Akuades: 1. kedelapan tabung reaksi diisi dengan larutan BSA (tabung1-6). divorteks. 8 tabung reaksi baru disiapkan dan dilapisi alumunium foil untuk menghindari paparan terhadap cahaya.2 Sampel protein: 1. dan akuades (tabung 8) untuk blanko sebagai berikut.25 1. .2 Standar: 1.75 2.0 2. juga ditentukan konsentrasi protein dalam sampel (mg/ml).

Tabung 1 2 3 4 5 6 7 8 Volume protein (ml) Standar: 0.4 Standar: 0. lalu didiamkan selama 2 menit pada suhu ruang sehingga reaksi dapat berlangsung optimal Setelah itu. larutan sampel diukur menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 595 nm. Langkah terakhir. larutan diaduk dengan vorteks hingga homogen.4 Akuades: 0.4 Volume pereaksi Bradford (ml) 8 8 8 8 8 8 8 8 Langkah selanjutnya.4 Standar: 0. Selain itu.4 Standar: 0. kurva larutan standar BSA dibuat dengan absorbansi (A) pada ordinat dan konsentrasi protein pada absis. juga ditentukan konsentrasi protein dalam sampel (mg/ml). .4 Standar: 0.4 Standar: 0.4 Sampel protein: 0.

05 0 0 0.HASIL Tabel 1 Kurva standar Lowry [BSA] (M) 0 0.286 0.8 1 0.373 y = 0.8 1 Absorbansi (A) 0 0.0.123 0.8 1 1.4 0.25 0.4 0.171 0.3 0.2 Absorbansi (A) 0 0.2 0.45 0.6 0.077 0.4 0.255 0.009 R² = 0.2 0.919 0.1 0.984 .6 [protein] Gambar 1 Kurva standar metode Lowry.743 0.318 0.396x .016 0.15 0.2 0.1 0.4 0.433 0.6 0.1 0.889 0. Tabel 2 Kurva standar Bradford [BSA] (M) 0 0.35 absorbansi 0.2 0.

778 0.5013 1.6427 4.772 0.199 0.2 0 0 0.1704 1.547 0.8232 1.5985 4.7740 0.102 0.6 0.6 [protein] Gambar 2 Kurva standar metode Bradford Tabel 3 Pengukuran konsentrasi protein dengan metode Lowry Sampel A B C D E F Kelompok 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Abs1 (A) 1.2 0.8505 0.4 y = 1.7130 0.3788 5.794 2.656 1.800 Abs ratarata (A) 1.712 0.078 1.8 1 .590 1.546 0.693 1.9773 2.7250 2.770 0.227 1.6415 1.5855 0.574 0.929 0.8220 [Protein] 3.8 0.571 0.5065 0.535 0.0370 1.605 1.4160 1.844 Abs2 (A) 1.714 0.5530 0.975 0.2 1 absorbansi 0.1667 3.6237 0.0290 1.181x + 0.4 0.052 R² = 0.467 0.1905 0.996 1.3018 1.4192 1.1.

029 1.593 2. Sampel A(Kelompok 2) Diketahui: y = 0.1905 [Protein] (M) 0.8548 0.8163 0.925 1.1168 0.716 0.100 0.396x 1.396x x = 3.0.5125 2.1995 = 0.9075 1.9855 0.2367 2.183 Abs ratarata (A) 1.919 1.002 1.5860 2.7710 1.116 0.9905 1.5699 0.1905 + 0.9265 1.1080 0.579 2.970 0.934 1.8942 0.009 = 0.009 .7947 0.009 y = 1.001 0.907 1.0615 0.0.179 1.396x – 0.979 1.396x .b = konstanta dari grafik standar 1.513 2.009 1.7904 0.1456 2.9640 Contoh Perhitungan Konsentrasi Protein dengan metode Lowry y = bx+a Keterangan: y = absorbansi (A) x = [Protein] (M) a.1905 = 0. Sampel A(Kelompok 1) Diketahui: y = 0.734 0.5520 1.198 Abs2 (A) 1.Tabel 4 Pengukuran konsentrasi protein dengan metode Bradford Sampel A B C D E F Kelompok 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Abs1 (A) 1.0290 M 2.1905 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.7250 0.512 2.0160 0.051 1.003 0.908 1.072 0.7244 0.396x .

396x .396x 0.396x x = 1.722 = 0.7130 + 0.009 0.396x x = 1.396x – 0.0.5855 = 0. Sampel B (Kelompok 4) Diketahui: y = 0.009 = 0.009 0.0.396x .009 0.7130 = 0.009 = 0. Sampel C (Kelompok 5) Diketahui: y = 0.009 = 0.5855 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.396x 0.5945 = 0.396x – 0.5065 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.5065 + 0.5013 M 4.y = 0.396x .5855 + 0.396x x = 1.7130 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.009 y = 0.009 y = 0.009 .396x – 0.5155 = 0.5065 = 0.396x 0.3018 M 3.0. Sampel B (Kelompok 3) Diketahui: y = 0.8232 M 5.

009 0.0.7740 + 0.009 = 0.9773 M 6.7740 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.396x x = 1.5530 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.396x 0.8505 + 0.562 = 0.783 = 0.009 0.1704 M 7.396x .396x . Sampel D (Kelompok 7) Diketahui: y = 0.009 = 0.396x – 0.8505 = 0.396x .7740 = 0.4192 M 8.009 = 0.y = 0.009 .0.5530 = 0.009 0.396x 0. Sampel C (Kelompok 6) Diketahui: y = 0.8595 = 0.396x – 0.5530 + 0. Sampel D (Kelompok 8) Diketahui: y = 0.009 y = 0.009 y = 0.396x x = 1.8505 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.396x – 0.396x 0.0.396x x = 2.

009 y = 2.1667 M 11. Sampel E (Kelompok 10) Diketahui: y = 0.009 = 0.396x . Sampel F (Kelompok 11) Diketahui: y = 0.396x – 0.009 2.3788 M 10.7250 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.009 = 0.7250 = 0.009 1.396x x = 5.009 = 0.0370 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 2.009 .396x x = 1.6427 M 9.0370 + 0.734 = 0.009 y = 1.0.0.396x x = 4.6415 = 0.6505 = 0.396x 0.0370 = 0.396x 2.6415 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.396x . Sampel E (Kelompok 9) Diketahui: y = 0.396x – 0.0.046 = 0.6415 + 0.396x .y = 0.396x 1.009 0.396x – 0.7250 + 0.

009 1.396x x = 3.0160 = 1.b = konstanta dari grafik standar 1.052 .181x + 0.009 1.6237 M Contoh Perhitungan Konsentrasi Protein dengan metode Bradford y = bx+a Keterangan: y = absorbansi (A) x = [Protein] (M) a.052 y = 1.8220 = 0.4160 = 0.8220 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.181x + 0.0. Sampel F (Kelompok 12) Diketahui: y = 0.396x – 0. Sampel A(Kelompok 1) Diketahui: y = 1.009 = 0.396x .396x 1.0160 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.396x 1.425 = 0.396x – 0.y = 1.4160 + 0.009 = 0.5985 M 12.396x x = 4.831 = 0.8220 + 0.009 y = 1.4160 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.

181x + 0.052 = 1.181x + 0.052 y = 0.052 .052 = 1.9075 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.0.052 = 1.9905 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.9385 = 1.181x + 0.1080 = 1.052 0.052 y = 0. Sampel B (Kelompok 4) Diketahui: y = 1.0.052 1.181x 1.052 y = 0.056 = 1.1.8942 M 4.7947 M 3. Sampel B (Kelompok 3) Diketahui: y = 1. Sampel A(Kelompok 2) Diketahui: y = 1.0.9905 = 1.9905 .181x + 0.181x 0.8163 M 2.0160 .181x x = 0.181x x = 0.181x + 0.181x + 0.964 = 1.181x x = 0.181x 0.9905 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.9075 = 1.1080 .

8555 = 1.0615 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.9855 = 1.181x 1. Sampel D (Kelompok 7) Diketahui y = 1.0.9075 .052 1.181x + 0.052 = 1.9855 .181x x = 0.7250 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.052 .181x + 0.0615 = 1.0.052 0.7904 M 7.181x + 0.052 = 1.181x + 0.8548 M 6.0.0615 .0.181x 0.181x 0.181x x = 0.7250 = 1.052 y = 0.181x + 0.7244 M 5.9335 = 1.181x x = 0.181x + 0.052 y = 0. Sampel C (Kelompok 6) Diketahui y = 1.9855 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.052 y = 1.052 = 1. Sampel C (Kelompok 5) Diketahui y = 1.0095 = 1.

7710 M 9.7250 .052 = 1.052 y = 0.4605 = 1.181x x = 1.0. Sampel E (Kelompok 9) Diketahui y = 1.181x + 0.052 .5860 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 2.181x 0.0.181x + 0.181x x = 0.052 0.052 y = 2.5125 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.0.181x + 0.052 = 1.181x x = 0.181x + 0.181x 0.052 1.0.9265 .052 = 1.181x + 0.052 y = 1.673 = 1. Sampel D (Kelompok 8) Diketahui y = 1.5125 .5860 = 1.5699 M 8.2367 M 10.9105 = 1.5125 = 1.9265 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.181x + 0. Sampel E (Kelompok 10) Diketahui y = 1.181x 1.9265 = 1.

181x + 0.181x x = 2.052 = 1.0.1456 M 11.181x + 0.0.052 1.1905 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.181x 2.534 = 1.181x + 0.181x 2.5520 = 1.1905 . Sampel F (Kelompok 11) Diketahui y = 1.052 = 1.181x x = 2. Sampel F (Kelompok 12) Diketahui y = 1.181x 1.181x + 0.5520 .5860 .1385 = 1.9640 M Contoh Perhitungan Konsentrasi Sampel Hasil Pengenceran M1V1=M2V2 Keterangan: F = Banyaknya pengenceran M1 = Konsentrasi sampel awal (%v/v) .5520 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 2.5 = 1.0.052 2.052 y = 1.052 y = 2.1905 = 1.052 = 1.181x x = 0.1168 M 12.2.

M2 = Konsentrasi hasil pengenceran (%v/v) V1 = Volume sampel (ml) V2 = Volume total (ml) 1.5%v/v 2. Sampel F Diketahui: . Sampel B Diketahui: Sampel A= 5%v/v ⁄ Volume Sampel = 100 ml Ditanya: Berapa konsentrasi sampel hasil pengukuran? Jawab: Vtotal = 200 ml 5% x 100 ml = M2 x 200 ml M2 = 2. Sampel D Diketahui: Sampel A= 2%b/v ⁄ Volume Sampel = 100 ml Ditanya: Berapa konsentrasi sampel hasil pengukuran? Jawab: Vtotal = 200 ml 2% x 100 ml = M2 x 200 ml M2 = 1%b/v 3.

Sampel A= 2%b/v ⁄ Volume Sampel = 100 ml Ditanya: Berapa konsentrasi sampel hasil pengukuran? Jawab: Vtotal = 200 ml 2% x 100 ml = M2 x 200 ml M2 = 1%b/v PEMBAHASAN .

181x + 0.052. Dari data di atas. Konsentrasi sampel B dari hasil perhitungan berdasarkan persamaan garis kurva standar adalah 1. dapat diketahui bahwa terjadi penurunan konsentrasi larutan sampel. Hal ini sesuai dengan literatur yang menyatakan bahwa pengenceran akan menurunkan konsentrasi larutan tanpa mengubah jumlah mol zat yang terlarut di dalamnya (Chang 2006). Berdasarkan percobaan dengan metode Lowry. yang berbanding lurus (Effendi 2003). persamaan garis metode Bradford adalah y = 1.009. semakin baik model kurva yang dibuat ([UI] 2009). juga diperoleh persamaan garis untuk kedua metode. data pada sampel B juga memperlihatkan relasi absorbansi dengan konsentrasi protein dalam larutan. dibuat kurva standar untuk masingmasing metode. yaitu keduanya berbanding lurus. penurunan konsentrasi protein dalam percobaan ini tidak sesuai dengan data hasil perhitungan.713 A dalam metode Lowry. Sesuai hasil perhitungan.975 (Bradford).0290 M dan 1. Nilai regresi yang diperoleh dari masing-masing kurva standar yang dibuat yaitu 0. Demikian pula sebaliknya.5065 A dengan konsentrasi 3.5855 A dan 0. Sedangkan. dapat dilihat korelasi absorbansi dengan konsentrasi protein dalam larutan. . Sampel pertama adalah putih telur dengan konsentrasi 5%v/v. Bila data sampel A dengan sampel B dibandingkan. Semakin besar nilai regresi.5013 M dan 1. Seperti pada sampel A. Dari kurva standar. Hal ini sesuai dengan hukum Lambert-Beer yang menyatakan bahwa semakin besar absorbansi larutan. didapatkan absorbansi sampel A 1.3018 M. Persamaan garis metode Lowry adalah y = 0. Sampel A kemudian diencerkan sebanyak 2x menjadi sampel B yang memiliki absorbansi sebesar 0.Pada praktikum penentuan kadar protein.984 (Lowry) dan 0. semakin besar konsentrasi zat terlarut. semakin kecil pula konsentrasi zat terlarut (Effendi 2003). seharusnya didapatkan konsentrasi akhir protein dalam sampel B setengah kali konsentrasi protein dalam sampel A. Persamaan garis tersebut kemudian digunakan untuk menentukan konsentrasi protein dalam larutan sampel untuk masing-masing metode.8232 M. Namun. semakin kecil absorbansi.0.396x .1505 A dan 0.

8942 M dan 0. Dari data ini terlihat bahwa absorbansi larutan berbanding lurus dengan konsentrasi zat terlarutnya (Effendi 2003). didapatkan absorbansi sampel C adalah 0.704 M. Data ini tidak sesuai dengan literatur bahwa pengenceran menyebabkan penurunan konsentrasi larutan (Chang 2006). yaitu keduanya berbanding lurus. Sampel C kemudian diencerkan sebanyak 2x menjadi sampel D yang memiliki absorbansi metode Lowry 0. Namun.9773 M dan 2. data sampel D juga memperlihatkan relasi absorbansi dengan konsentrasi protein dalam larutan yang berbanding lurus (Effendi 2003). data kedua konsentrasi protein setelah pengenceran lebih besar daripada sebelum pengenceran.7244 M. sampel B memiliki absorbansi 1. penurunan konsentrasi protein dalam percobaan ini tidak sesuai dengan data hasil perhitungan. dapat pula diamati bahwa dalam pengukuran dengan metode Bradford. konsentrasi akhir protein dalam sampel D seharusnya setengah kali konsentrasi protein dalam sampel C. Sedangkan.4191 M dan 1. terlihat relasi absorbansi dengan konsentrasi protein dalam larutan.6415 A. sampel A memiliki absorbansi 1.8163 M dan 0. Sampel kedua dalam praktikum ini adalah tepung cacing dengan konsentrasi 2%b/v.Berdasarkan percobaan dengan metode Bradford. tidak terdapat perbedaan yang terlalu signifikan antara konsentrasi protein sebelum dan setelah larutan putih telur diencerkan. semakin besar konsentrasi zat terlarut (Effendi 2003). .553 A dan 0.774 A dan 0. dapat diamati bahwa terjadi penurunan konsentrasi larutan sampel.9075 A dengan konsentrasi protein 0. Berdasarkan percobaan dengan metode Lowry.6427 M.9905 dengan konsentrasi protein 0.016 A dan 0. dengan konsentrasi protein hasil perhitungan sebesar 1. Seperti pada sampel C.108 A dan 0. Berdasarkan hasil perhitungan. Bila data kedua sampel dibandingkan. Hal ini sesuai dengan literatur yang menyatakan bahwa pengenceran akan menurunkan konsentrasi larutan tanpa mengubah jumlah mol zat yang terlarut di dalamnya (Chang 2006). Dari data di atas. Hal ini sesuai dengan hukum Lambert-Beer yang menyatakan bahwa semakin besar absorbansi larutan.8505 A dengan konsentrasi 1.7947 M. Bahkan bila dibandingkan. Selain itu.

diketahui sampel C memiliki absorbansi 1. Sampel ketiga adalah tepung cacing dengan konsentrasi 2%b/v.7250 A dan 0.9855 A dengan konsentrasi protein 0. data pada sampel F juga memperlihatkan relasi absorbansi dengan konsentrasi protein dalam larutan yang berbanding lurus (Effendi 2003). Berdasarkan percobaan dengan metode Lowry. semakin besar konsentrasi zat terlarut (Effendi 2003).8548 M dan 0. sampel F memiliki absorbansi sebesar 2.5125 A dan 2.3788 M dan 5. Namun. sampel D memiliki absorbansi sebesar 0. Berdasarkan percobaan dengan metode Bradford.4160 A dan 1. yaitu keduanya berbanding lurus. Data ini sesuai dengan literatur bahwa konsentrasi larutan akan menurun jika dilakukan pengenceran (Chang 2006). penurunan konsentrasi protein dalam percobaan ini tidak sesuai dengan data hasi perhitungan. Sesuai hasil perhitungan.552 A . Data kedua sampel tersebut menunjukkan bahwa absorbansi larutan berbanding lurus dengan konsentrasi zat terlarutnya (Effendi 2003).2367 M dan 2.5985 M dan 4. Seperti pada sampel E. seharusnya konsentrasi protein dalam sampel F setengah kali konsentrasi protein dalam sampel E.5699 M dan 0. Hal ini sesuai dengan teori yang menyatakan bahwa pengenceran akan menyebabkan penurunan konsentrasi larutan tanpa mengubah jumlah mol zat yang terlarut di dalamnya (Chang 2006). Dari data di atas.0370 A dengan konsentrasi 4. dapat diamati bahwa terjadi penurunan konsentrasi larutan sampel. bila data kedua sampel di atas dibandingkan. Sampel E kemudian diencerkan sebanyak 2x menjadi sampel F yang memiliki absorbansi metode Lowry sebesar 1.7904 M.1456 M. Hal ini sesuai literatur yang menyatakan bahwa semakin besar absorbansi larutan. Sedangkan. dapat juga diketahui bahwa terjadi penurunan konsentrasi protein dalam larutan sampel setelah pengenceran.5860 A dengan konsentrasi protein 1. dapat diketahui relasi antara absorbansi dengan konsentrasi protein dalam larutan.7710 M. Bila data sampel E dan sampel F dibandingkan. didapatkan absorbansi sampel E sebesar 1. dengan konsentrasi protein hasil perhitungan sebesar 3.6237 M.Dalam percobaan dengan metode Bradford.9265 A dengan konsentrasi protein 0. Sedangkan.0615 A dan 0.1667 M.822 A. Selain itu.7250 A dan 2. diketahui sampel E memiliki absorbansi sebesar 1.

sistein) yang ada dalam larutan protein. dapat diamati bahwa kedua metode memberikan hasil absorbansi dan konsentrasi protein yang berbeda pada masing-masing sampel yang sama. Selain itu. dapat juga diketahui terjadi penurunan konsentrasi protein dalam larutan sampel setelah pengenceran. NaCl.5% CuSO4.dan 1. terdapat beberapa kesalahan baik pada pembuatan kurva standar. Dari data kedua sampel. 1% Na-K tartrat) (Owusu 2002). 0. Reagen yang digunakan pada metode Lowry adalah pereaksi Folin-Ciocalteau dan peraksi Biuret. Triton X-100. Ammonium sulfat. Hal tersebut diakibatkan Metode Lowry merupakan metode pengukuran konsentrasi protein dengan prinsip reduksi Cu2+ menjadi Cu+ oleh asam amino (tirosin. sukrosa. triptofan. Pada metode Lowry terdapat banyak senyawa pengganggu yang dapat bereaksi dan mempengaruhi hasil pengukuran. EDTA. Pereaksi Folin Ciocalteau dibuat dengan cara mengencerkan reagen Folin Ciocalteau.9640 M. chaps. Contoh senyawa tersebut diantaranya ammonium sulfat. Data ini sesuai dengan literatur bahwa konsentrasi larutan akan menurun jika dilakukan pengenceran (Chang 2006).1905 A dengan konsentrasi protein 2. absorbansi. bila data kedua sampel dibandingkan. lubrol. dll. cesium bikarbonat. glukosa. chapso. Hal ini dapat disebabkan oleh perbedaan sensitivitas dan senyawa pengganggu pada kedua metode (Nielsen 2010).4% NaOH) dengan 1 mL reagen B (0. maupun konsentrasi protein dalam sampel. dapat diketahui bahwa absorbansi larutan berbanding lurus dengan konsentrasi zat terlarutnya (Effendi 2003). glisin. octyl glucoside. Ion Cu+ bersama dengan fosfotungstat dan fosfolibdat dalam pereaksi Folin-Ciocalteau akan membentuk warna biru yang dapat menyerap cahaya (Purwoko 2007). Metode Lowry mampu mengukur kadar protein sampai dengan 5 μg (Nielsen 2010). Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan. sorbitol. sedangkan pereaksi Biuret dibuat dengan mencampurkan 50 mL reagen A (2 % Na2CO3. tris. . Warna biru yang muncul akan dideteksi pada panjang gelombang 750 nm (sensitivitas yang tinggi untuk konsentrasi protein yang kecil) atau 500 nm (sensitivitas yang rendah untuk konsentrasi protein yang tinggi). Dalam percobaan ini.1168 M dan 0.

chapso. metode ini juga sensitif dan tepat karena mampu mendeteksi protein sampai dengan 1-20 µg (Li 2005). Selain itu. Selain menggunakan metode Lowry.lubrol. Dengan demikian. CBB akan berikatan dengan protein pada sampel larutan dalam suasana asam. Metode Bradford merupakan metode pengukuran konsentrasi protein total yang melibatkan pewarna Coomassie Brilliant Blue (CBB).5%) dan EDTA adalah contoh senyawa pengganggu yang menyebabkan tidak terbentuknya warna biru pada reaksi (Walker 2002). chaps. Selain itu juga ada merkaptan (2-mercaptoethanol) dan Ditiotreitol (DTT) yang merupakan senyawa pengganggu yang mereduksi protein untuk bereaksi dengan pewarna (Owusu 2002). Metode Bradford sendiri merupakan metode yang sederhana karena hanya menggunakan 1 reagen dan reaksi berlangsung cepat karena inkubasi hanya berlangsung selama 5 menit dalam suhu ruang ([UA] 2009). yaitu pewarna CBB dapat membekas pada alat-alat berbahan kaca dan dapat terganggu dengan adanya detergen seperti SDS ([UA] 2009). Namun. Glisin (lebih besar dari 0. absorbansinya protein dapat diukur menggunakan spektrofotometri pada panjang gelombang 465-595 nm (Caprette 2005). Gambar 3 Struktur Coomassie Brilliant Blue G-250 ([UA] 2009). pengukuran kadar protein juga dapat dilakukan dengan metode Bradford. metode ini memiliki kelemahan. cesium bikarbonat merupakan contoh senyawa pengganggu yang dapat mengendapkan protein. SDS akan mengganggu ikatan hidrogen dan berikatan dengan .

Berbeda dengan putih telur. Hal ini menyebabkan larutan bersifat basa dan tidak dapat bereaksi dengan pewarna CBB (Saraswati 2008). dapat ditentukan konsentrasi zat terlarut dalam sampel.bagian hidrofobik pada protein sehingga protein terurai menjadi ikatan polipeptida yang panjang dan mempunyai muatan negatif yang besar sehingga akan saling tolakmenolak dengan molekul CBB yang bermuatan negatif. tetapi dapat juga menggunakan sinar UV maupun sinar infra merah (Natalia 2010). Metode ini berdasar pada penyerapan cahaya tampak dan energi radiasi lainnya oleh suatu larutan (Amanda 2011). Seperti yang telah disebutkan sebelumnya. kolorimetri merupakan pengukuran warna. khususnya bakteri patogen. Albumin dan lysozyme yang mempunyai aktivitas antimikroba dapat digunakan sebagai bahan pengganti antibiotik dalam mengobati penyakit yang disebabkan oleh mikroorganisme. metode spektrofotometri tidak terbatas pada penggunaan sinar daerah tampak. terutama albumin dan lysozyme yang termasuk protein kualitas tinggi (Chairul et al. digunakan 3 sampel. Sedangkan. Kolorimetri sendiri. 2006). pada percobaan penentuan kadar protein dengan spektrofotometri. 2006). Prinsip spektrofotometri yaitu pengukudan absorbsi cahaya yang melalui suatu larutan pada panjang gelombang tertentu. Ketiga sampel memiliki kandungan protein yang berbeda-beda dengan manfaat yang juga beragam. yaitu putih telur. Jumlah cahaya yang diabsorbsi oleh larutan sebanding dengan konsentrasi zat terlaut (Lestari 2007). Melalui nilai absorbansi. merupakan metode analisa kimia yang didasarkan pada kesamaan besaran warna antara larutan sampel dengan sumber cahaya polikromatis dan detektor mata. dan tepung cacing. dalam susu terdapat protein yang disebut kasein. Spektrofotometri berbeda dengan kolorimetri. Putih telur ini kaya akan protein. Jadi. Protein ini dapat dimodifikasi menjadi produk bernama CPP-APP (casein . susu. Penggunaan albumin dan lysozyme dalam putih telur ini sebagai pengganti antibiotik sangat penting karena penggunaan antibiotik secara kontinu dapat menimbulkan resistensi (Chairul et al. Putih telur merupakan bagian yang berwarna bening dan mengelilingi kuninng telur. yang berarti sinar yang digunakan adalah sinar daerah tampak.

000 Dal (Harper 2003). dan thrombosis disease. BSA dijadikan sebagai standar relatif protein di samping pengembangan warnanya yang lebih baik dibanding protein lain (Kirschner 2007). 2005). 2006). Oleh karena itu. Sedangkan. pada tepung cacing terdapat komponen bioaktif bernama lumbricin yang merupakan senyawa peptida dengan susunan asam amino lengkap terutama prolin. Namun dalam kenyataannya. Pada praktikum ini. BGG menjadi pilihan yang baik. Secara ideal. Protein ini merupakan turunan dari darah sapi sehat (Wise & Watters 2010). dalam tepung cacing terdapat protein berupa enzim yang disebut lumbrokinase.phosphopeptide–amorphous calcium phosphate). Tepung cacing juga mengandung enzim lain. Selain itu. jika sampel yang . Oleh karena itu. CPP-APP sendiri sudah lazim digunakan dalam permen karet bebas gula (Reynolds 2009). Hal tersebut berkaitan dengan fakta bahwa penggunaan antibiotik dalam jangka lama dapat menyebabkan resistensi terhadap bakteri patogen (Sofyan 2008). lumbrokinase digunakan untuk mencegah dan mengobati ischemic stroke. yaitu enzim amilase yang dalam bidang kedokteran digunakan untuk mengetahui kerusakan pada pankreas dan menentukan kondisi utama dalam plasma (Neryceka 2004). Pemilihan protein standar merupakan hal yang penting dalam suatu tes protein. Selain lumbricin. Selain. BSA juga bersifat sangat stabil (Estey et al. Biasanya. Enzim ini memiliki aktivitas fibrinolitik dan antitrombotik (Cooper & Yamaguchi 2004). BSA atau Bovine Serum Albumin adalah protein globular besar yang berukuran kurang lebih 66. hypercoagulanility. BSA ada protein lain yang dapat dijadikan sebagai standar. digunakan larutan BSA dalam pembuatan kurva standar metode Bradford dan Lowry. yaitu BGG (Bovine Gamma Globulin). seharusnya dalam pembuatan kurva standar digunakan bentuk murni protein yang akan diuji. tepung cacing dapat digunakan sebagai pengganti antiobiotik yang merupakan pakan imbuhan (pemacu pertumbuhan) pada ternak unggas. BSA dijadikan sebagai protein standar karena mudah didapat dalam keadaan murni dan relatif murah (Wrolstad et al. Produk kasein tersebut dapat digunakan untuk menguatkan email gigi dan mehambat caries pada gigi. Protein ini mampu menghambat pertumbuhan bakteri-bakteri patogen. hal tersebut sulit dilakukan.

Warna yang dihasilkan oleh BSA lebih baik daripada BSA. . Akan tetapi.diuji memiliki kandungan immunoglobulin. Hal itu disebabkan oleh respon warna BGG yang sangat mirip dengan immunoglobulin G (Wrolstad et al. uji Bradford lebih sensitif terhadap BSA dibandingkan dengan BGG (Caprette 2006). BGG memiliki beberapa kelemahan dibandingkan dengan BSA. BSA merupakan protein standar yang lebih baik jika sampel yang diuji memberikan respon warna yang sejenis atau sampel memiliki kandungan utama berupa albumin (Kirschner 2007). Selain itu. 2005).

Konsetrasi BSA yang digunakan adalah 0. dan waktu yang tersedia. Kelemahannya adalah variasi warna tidak proporsional dengan konsentrasi protein. Sedangkan kelemahannya sama seperti Lowry yaitu variasi warna tidak proporsional dengan konsentrasi protein. banyaknya jumlah cahaya yang diserap berbanding lurus dengan konsentrasi senyawa di dalam larutan. Pengukuran dan analisis konsentrasi kadar protein dalam larutan dilakukan dengan menggunakan prinsip absorbansi dan transmisi cahaya yang merupakan dasar dalam penentuan sifat dan analisis biomolekul seperti protein. ada tidaknya senyawa pengganggu. Kedua metode yang digunakan pada percobaan kali ini. 0.4 M.6 M. reagen yang digunakan tidak sederhana dan mudah bereaksi dengan senyawa lain. 0. dan turbiditas sampel tidak berpengaruh dalam metode ini. Dengan demikian. Untuk Bradford mempunyai kelebihan yaitu reaksinya cepat dan bersifat reprodusibel.2 M. absorbansi diperoleh dari pengukuran. sifat-sifat protein yang diukur. dan 1 M. Sedangkan.SIMPULAN Untuk membuat kurva standar dari pewarna Lowry dan Bradford digunakan larutan BSA. Jadi. dan mengalami intervensi deterjen. Efektivitas metode tersebut tergantung dari sensitivitas dan akurasi. Penentuan kadar protein dalam sampel pada percobaan dilakukan dengan metode spektrofotometri. yaitu metode Lowry dan metode Bradford masing-masing mempunyai kelebihan dan kelemahannya sendiri. 0. Kurva standar dibuat dengan menghubungkan absorbansi pada ordinat (sumbu Y) dan konsentrasi protein sebagai absis (sumbu X). dari data tersebut terbentuk dan terhubung menjadi kurva standar. lebih spesifik.1 M. pewarna protein bisa menempel pada kuvet kuarsa. Dalam pengukuran ini. Untuk metode Lowry mempunyai kelebihan yaitu sensitivitas yang tinggi. .8 M. semakin besar nilai absorbansinya maka semakin besar pula jumlah konsentrasi protein yang terkandung dalam larutan. 0.

MENJAWAB PERTANYAAN 1. Jelaskan tentang kelebihan dan kelemahan metode Lowry dan Bradford dalam mengukur kadar protein! .

dalam menentukan kadar protein. dan hexoamine hingga mencapai derajat tertentu. Selain itu. Selain metode Lowry. Selain itu. metode ini juga memiliki beberapa kekurangan. Turbiditas sampel tidak berpengaruh dalam metode ini (Nielsen 2010). Selain itu. lebih baik digunakan kuvet kaca atau kuvet plastik. Kelebihan metode ini adalah reaksinya berlangsung sangat cepat. monosakarida. Metode ini juga sangat sensitif. buffer fosfat.5 jam. reaksi ini dapat mengalami intervensi senyawa-senyawa tertentu seperti sukrosa. metode Lowry lebih spesifik daripada metode lain dan relatif sederhana dalam eksekusinya sehingga tidak membutuhkan waktu terlalu lama. metode ini dapat mengukur protein atau peptida dengan massa molekul sama dengan atau lebih besar dari 4000 Da (Nielsen 2010). juga dapat digunakan metode Bradford. sekitar 1-1. yaitu variasi warna yang luas sesuai dengan jenis proteinnya mengakibatkan seleksi protein menjadi lebih sulit sehingga harus dilakukan dengan hati-hati. kompleks protein-pewarna hasil reaksinya dapat berikatan dengan kuvet kuartz. yaitu sekitar 2 menit dan data yang dihasilkan dalam metode ini berulang atau dengan kata lain bersifat reprodusibel. Untuk itu. 50-100 kali lebih sensitive daripada metode Biuret dan 10-20 kali lebih sensitive daripada metode UV-280 nm absorption. baik yang ionik maupun anionik seperti Triton X-100 dan Sodium . Selain itu. antara lain variasi warna yang tidak terlalu proporsional dengan konsentrasi protein. lipid. Namun. Kelemahan lain adalah metode ini dapat mengalami intervensi deterjen. Namun. Konsentrasi tinggi ammonium sulfat dan senyawa sulfidril juga dapat mengintervensi reaksi pada metode Lowry (Nielsen 2010). metode Lowry memiliki beberapa kelemahan. Selain itu. Kelemahan lain adalah reagen metode Lowry tidak stabil dan membutuhkam preparasi harian dengan prosedur cukup rumit.Jawab: Kelebihan metode Lowry adalah metode ini sensitif. sehingga kurang efisien dari segi waktu (Simpson 2004). bahkan lebih sensitif daripada metode Lowry. sama seperti metode Lowry. warna yang terbentuk pada metode Lowry bervariasi bergantung jenis protein (Nielsen 2010).

4. yang biasa digunakan untuk menghitung kadar protein dalam susu. Metode Dumas (Nitrogen Combustion) . dan daging. Metode UV-280 nm absorption. tepung gandum. yang banyak digunakan untuk menentukan protein pada sereal atau kacang kedelai.1% masih dapat diperbaiki melalui control yang tepat (Nielsen 2010). 6. netralisasi. Namun. 5. 2. 2. Metode BCA (Bicinchoninic Acid). kesalahan akibat kandungan deterjen kurang dari 0. yang dapat menghitung konsentrasi asam amino triptofan dan tirosin menggunakan hukum Beer. yang meliputi tahapan pencernaan.Dodesil Sulfat (SDS). 3. Metode Kjeldahl. 1. Metode anionic dye-binding. Metode Biuret. yang banyak digunakan dalam proses isolasi dan purifikasi protein. dan titrasi. Sebutkan metode pengukuran kadar protein lain yang ada! Jawab: Beberapa metode pengukuran kadar protein lain yaitu sebagai berikut (Nielsen 2010).

Schwendeman SP. 2006. [11 Mar Cooper EL. Harper JW. . Biorad protein assay [terhubung berkala].edu/files/protocols/BioRad_proteinassay.harvard.fst. Florida: CRC.edu/people/harper/functionalfoods/milk%20components/bovine%20serum%20albumin. New York: Kluwer Academic. Poeloengan M. Methods of Analysis of Food Components and Additives.Yogyakarta: Kanisius. Bovine serum albumin [terhubung berkala]. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Kirschner MW. Telaah Kualitas Air Bagi Pengelolaan Sumber Daya dan Lingkungan Perairan. Maheswari RRA.med. Kang J. Kolakowski E. 2007. 2006. [skripsi]. Protein assay [terhubung http://www. Yamaguchi N. 2004.html 2012]. 2010. Caprette DR.rice. 2006. Effendi H. berkala]. J Pharm Sci 7(95):1626-1639. Penetapan kadar kromium pada air reservoir secara kolorimetri di PDAM Tirtanadi instalasi pengolahan air sunggal [skripsi].ohiostate. 2003. http://kirschner. 2003. Carpenter JF.pdf [10 Mar 2012]. BSA degradation under acidic solution: a model for protein instability during release from PLGA delivery systems.htm [10 Mar 2012].ruf.edu/~bioslabs/methods/protein/protein.DAFTAR PUSTAKA Amanda M. Estey T. Complementary and Alternative Approach to Biomedicine. Medan: Universitas Sumatera Utara. Aktivitas antimikroba pada putih telur dari beberapa jenis unggas terhadap bakteri gram positif dan gram negatif. http://www. 2011. Chairul.

JITV 13(3): 182-188. Bahaya Kimia Sampling & Pengukuran Kontaminan Kimia di Udara.biochem. 2010. 2004.Lestari F. Penentuan kadar klorin air baku produksi di PT. Food Analysis. Damayanti E. 2005. Raymond C. Reynolds EC. Simpson RJ. Jakarta: Erlangga. 2002. 2006. oligosporus. Nielsen SS. Purwoko T. Kimia Dasar. Medan: Universitas Sumatera Utara.ppt [11 Mar 2012]. Julendra H.arizona. http://www. 2008. Bahaya Purifying Proteins for Proteomics: A Laboratory Manual. 2008. 2010. [UA] University of Arizona. New York: Marcel Dekker. Colorimetric [terhubung berkala]. Depok: Penebar Swadaya. 2007. New York: Springer. ADR 21:25-29. Cola-Cola bottling Indonesia Medan dengan metode kolorimetri [skripsi]. Palungkun R. 2009. Jakarta: EGC. berkala]. . Biodiversitas 2(8):223-227. Neryceka CK.edu/classes/bioc463a/Info/lecture_notes/colorimetric. Casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate: the scientific evidence. 2010 Usaha Ternak Cacing Tanah. Natalia S. Depok: Universitas Indonesia. 2010.myweb.pdf [10 Mar 2012]. Jakarta: Universitas Katolik Indonesia Atma Jaya.uga. Efek tegdma terhadap protein total dan profil protein sel-sel pulpa gigi (in vitro) [skripsi]. Saraswati T. Li X. New York: Cold Spring Harbor. Protein determination assays [terhubung rscott. 2009. Sofyan A. Food Protein Analysis: Quantitative Effects on Processing. Aktivitas antibakteri dan retensi protein tepung cacing tanah (Lumbricus rubellus) sebagai pakan imbuhan dengan taraf penambahan kitosan. Owusu RK.edu/protocols/CEP_38. 2004. Kandungan protein kecap manis tanpa fermentasi moromi hasil fermentasi Rhizopus oryzae dan R. Deteksi keberadaan berbagai enzim hidrolase pada cacing tanah (Lumbricus rubellus) [skripsi].

nist. http://staff. blog. Schwatz SJ 2005.ac. 2002. Wise SA. Regresi majemuk [terhubung berkala].id/internal/131998622/material/Multipleregression. and Carbohydrates. 2011.gov/srmors/certificates/927d. Bovine serum albumin (7%) [terhubung berkala]. [UI] Universitas Indonesia. Handbook of Food Analytical Chemistry: Water. The Protein Protocols Handbook. Lipids. New Jersey: John Wiley & Sons.id/primamitha/files/2011/12/SIFAT-PROTEIN.ac. 2009. 2010. Totowa: Humana.docx [10 Mar 2012].ui. Enzymes. Watters RL.pdf?CFID=11628267&CFTOKEN=f682f8 8a759516bc-B4D66BFA-E23D-27B47C85AA1E5BC84277&jsessionid=b430384deb613141a202 [10 Mar 2012].[UAD] Universitas Ahmad Dahlan. Walker JM.pdf [10 Mar 2012]. https://wwws. . Wrolstad RE. Decker EA. Proteins.uad. Sifat protein [terhubung berkala].

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful