Laporan Praktikum Laboratorium Biokimia

Hari, Tanggal : Jumat, 16 Maret 2012 Kelompok :8 PJP : Prof. Dr. Maggy T. Suhartono Yanti, Ph.D. Asisten : Bernadetta Meika Dysa Irina Elissa Tjahjono Fidelia Isabel Yuliani Wijaya Katharina Jessica Matheus Alvin Prawira Sabar Budiman Stephanus Aditya Listian Stevanny Wong Steven Clement Wendy Andryan

PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN SPEKTROFOTOMETRI Debora Jessen Vania Gavrila Wikasa Melinda Ika Sari Michael Edbert Suryanto 2011-080-020 2011-080-026 2011-080-052 2011-080-089 2011-080-101

FAKULTAS TEKNOBIOLOGI UNIVERSITAS KATOLIK INDONESIA ATMA JAYA 2012

PENDAHULUAN Protein merupakan senyawa biomolekul yang penting, karena perannya dalam berbagai proses di dalam tubuh. Protein terdapat dalam jumlah yang banyak di dalam sel dan menyusun lebih dari setengah berat kering pada hampir semua organisme ([UAD] 2011). Untuk memenuhi kebutuhan protein dalam tubuh, seseorang harus mengonsumsi makanan yang mengandung protein. Banyak makanan yang merupakan sumber protein bagi tubuh, namun kadar protein di dalam setiap makanan berbedabeda. Oleh karena itu, pada percobaan ini akan dilakuan penentuan kadar protein dalam sampel dengan menggunakan metode spektrofotometri. Selain itu, percobaan ini juga dilakukan untuk menentukan efektivitas metode yang digunakan (metode Lowry dan metode Bradford), serta untuk membuat kurva standar dari pewarna Lowry dan Bradford. Pengukuran kadar protein dapat dilakukan dengan berbagai metode. Metode spektrofotometri merupakan metode yang menggunakan prinsip absorbansi dan transmisi cahaya dalam mengukur konsentrasi suatu senyawa (Lestari 2010). Dasar penggunaan metode spektrofotometri adalah dengan menggunakan metode Lowry dan Bradford. Prinsip metode Lowry adalah terbentuknya warna biru akibat penambahan pereaksi Folin Ciocalteau dan Biuret. Terbentuknya warna biru tersebut disebabkan oleh reaksi ion Cu2+ dengan ikatan peptida dalam larutan alkalis pada saat penambahan pereaksi biuret serta terjadinya reaksi reduksi pereaksi Folin Ciocalteau dengan asam amino dalam protein (Kolakowski 2012). Sedangkan, prinsip metode Bradford adalah adanya ikatan antara protein dengan CBB-G250 (Coomassie Brilliant Blue-G250) dalam keadaan asam. CBB yang awalnya berwarna merah akan berubah warna menjadi biru pada saat berikatan dengan protein sehingga terjadi perubahan panjang gelombang pewarna dari 465 nm menjadi 595 nm (Walker 2002).

BAHAN DAN METODE Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah spektrofotometer VIS, kuvet plastik, rak tabung reaksi, tabung reaksi, pompa bulp, vorteks, pipet mikro, tip, magnetic stirrer, gelas piala, labu takar, gelas ukur, dan kertas saring. Bahan yang digunakan adalah Bovine Serum Albumin (BSA) 1 mg/ml, NaOH 0,1 M, CuSO4.5H2O 1%, Na K-tartarat 2%, Na2CO3 2%, Coomassie Brilliant Blue G-250, Etanol 95%, Asam fosfat 85%, pereaksi Folin-Ciocalteau, pereaksi Biuret, pereaksi Bradford, alumunium foil dan sampel protein (putih telur 5%v/v, putih telur 5% v/v 2 kali pengenceran, tepung cacing 2 % b/v, tepung cacing 2% b/v 2 kali pengenceran, susu 2% b/v, susu 2% b/v 2 kali pengenceran). Metode yang digunakan dalam praktikum ini terbagi menjadi 2 bagian, yaitu metode Lowry dan metode Bradford. Untuk masing-masing metode dilakukan pembuatan kurva standard dan pengukuran kuantitatif larutan protein. Prosedur kerja pada metode Lowry adalah sebagai berikut. Perrtama, 6 tabung reaksi disiapkan untuk mengencerkan larutan BSA standar (1 mg/ml) dengan keterangan sebagai berikut. Tabung 1 2 3 4 5 6 [BSA] akhir (mg/ml) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,1 Volume BSA 1 mg/ml (ml) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,25 Volume akuades (ml) 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,25

Kemudian, 8 tabung reaksi baru disiapkan dan dilapisi alumunium foil untuk menghindari paparan terhadap cahaya. Selanjutnya, kedelapan tabung reaksi diisi dengan larutan BSA (tabung1-6), sampel (tabung 7), dan akuades (tabung 8) untuk blanko sebagai berikut.

dan akuades (tabung 8) untuk blanko sebagai berikut. pada metode Bradford. Selain itu.3 0.2 Standar: 1. lalu didiamkan selama 10 menit pada suhu ruang. maka larutan akan menjadi jenuh sehingga hasil yang diperoleh tidak maksimal.2 0.2 Akuades: 1. 6 tabung reaksi disiapkan untuk mengencerkan larutan BSA standar (1 mg/ml) dengan keterangan sebagai berikut.3 ml pereaksi Folin Ciocalteau.25 1.7 0.0 2. juga ditentukan konsentrasi protein dalam sampel (mg/ml). larutan diaduk dengan vorteks hingga homogen. Langkah terakhir.0 1. Selanjutnya.1 Volume BSA 1 mg/ml (ml) 2.2 Standar: 1. Setelah itu. Hal tersebut bertujuan agar reaksi dapat berjalan optimal.2 Standar: 1. dan dibiarkan selama 30 menit dalam suhu ruang. Sedangkan.5 0. Perrtama. ditambahkan 0.75 1. kurva larutan standar BSA dibuat dengan absorbansi (A) pada ordinat dan konsentrasi protein pada absis.5 0.2 Volume pereaksi Biuret (ml) 6 6 6 6 6 6 6 6 Langkah selanjutnya.25 Volume akuades (ml) 0. 8 tabung reaksi baru disiapkan dan dilapisi alumunium foil untuk menghindari paparan terhadap cahaya.2 Standar: 1. Tabung 1 2 3 4 5 6 [BSA] akhir (mg/ml) 0.75 1.2 Standar: 1. absorbansi larutan sampel diukur menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 650 nm.25 0.Tabung 1 2 3 4 5 6 7 8 Volume protein (ml) Standar: 1. prosedur kerjanya sebagai berikut. .75 0. sampel (tabung 7). Bila waktu pembiaran lebih dari waktu tersebut.8 0.25 Kemudian. divorteks. kedelapan tabung reaksi diisi dengan larutan BSA (tabung1-6).75 2.2 Sampel protein: 1.5 0. Setelah reaksi terjadi.

4 Sampel protein: 0.4 Standar: 0.4 Akuades: 0. lalu didiamkan selama 2 menit pada suhu ruang sehingga reaksi dapat berlangsung optimal Setelah itu. larutan diaduk dengan vorteks hingga homogen.4 Standar: 0. Selain itu. .4 Standar: 0.Tabung 1 2 3 4 5 6 7 8 Volume protein (ml) Standar: 0. juga ditentukan konsentrasi protein dalam sampel (mg/ml). kurva larutan standar BSA dibuat dengan absorbansi (A) pada ordinat dan konsentrasi protein pada absis.4 Standar: 0. Langkah terakhir.4 Standar: 0. larutan sampel diukur menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 595 nm.4 Volume pereaksi Bradford (ml) 8 8 8 8 8 8 8 8 Langkah selanjutnya.

4 0.743 0.2 0.077 0. Tabel 2 Kurva standar Bradford [BSA] (M) 0 0.35 absorbansi 0.25 0.009 R² = 0.889 0.1 0.255 0.2 0.45 0.05 0 0 0.286 0.6 [protein] Gambar 1 Kurva standar metode Lowry.HASIL Tabel 1 Kurva standar Lowry [BSA] (M) 0 0.3 0.8 1 Absorbansi (A) 0 0.8 1 1.171 0.4 0.1 0.4 0.1 0.433 0.123 0.016 0.396x .15 0.919 0.984 .0.373 y = 0.6 0.2 0.2 0.6 0.318 0.4 0.8 1 0.2 Absorbansi (A) 0 0.

3018 1.6 0.693 1.929 0.5530 0.8232 1.714 0.2 0.467 0.605 1.1905 0.772 0.2 1 absorbansi 0.8220 [Protein] 3.571 0.1.7250 2.975 0.8 1 .102 0.1704 1.6415 1.227 1.535 0.3788 5.8505 0.4160 1.9773 2.6 [protein] Gambar 2 Kurva standar metode Bradford Tabel 3 Pengukuran konsentrasi protein dengan metode Lowry Sampel A B C D E F Kelompok 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Abs1 (A) 1.844 Abs2 (A) 1.0370 1.546 0.5013 1.770 0.7130 0.5855 0.574 0.052 R² = 0.5985 4.199 0.181x + 0.7740 0.547 0.0290 1.996 1.712 0.8 0.078 1.4 y = 1.778 0.800 Abs ratarata (A) 1.6427 4.6237 0.794 2.5065 0.4192 1.1667 3.656 1.590 1.4 0.2 0 0 0.

0290 M 2.8163 0.7710 1.009 1.9905 1.009 y = 1.7947 0.907 1.908 1.1905 [Protein] (M) 0.8548 0.512 2.5520 1.072 0.009 .396x .7250 0.396x 1.029 1.9075 1.9640 Contoh Perhitungan Konsentrasi Protein dengan metode Lowry y = bx+a Keterangan: y = absorbansi (A) x = [Protein] (M) a.0.051 1.1905 + 0.179 1.183 Abs ratarata (A) 1.116 0.593 2.2367 2.9265 1.0160 0.716 0.734 0.396x .7244 0.925 1.7904 0.1168 0.9855 0.979 1.513 2.5860 2.002 1.1905 = 0.009 = 0.b = konstanta dari grafik standar 1.198 Abs2 (A) 1.001 0.003 0.970 0.396x – 0. Sampel A(Kelompok 1) Diketahui: y = 0.934 1.100 0.0615 0.1456 2.1080 0.579 2.1995 = 0.5125 2.919 1.396x x = 3.8942 0.5699 0. Sampel A(Kelompok 2) Diketahui: y = 0.1905 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.0.Tabel 4 Pengukuran konsentrasi protein dengan metode Bradford Sampel A B C D E F Kelompok 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Abs1 (A) 1.

396x x = 1.396x – 0. Sampel B (Kelompok 4) Diketahui: y = 0.009 = 0.009 .5945 = 0.396x x = 1.7130 = 0.5855 = 0.7130 + 0.396x – 0.396x 0.5013 M 4.8232 M 5.396x 0.3018 M 3.009 0.5065 = 0.396x 0. Sampel B (Kelompok 3) Diketahui: y = 0.396x .5855 + 0. Sampel C (Kelompok 5) Diketahui: y = 0.009 = 0.7130 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.396x – 0.0.009 0.009 = 0.5065 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.396x x = 1.5855 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.396x .0.009 y = 0.396x .y = 0.722 = 0.009 0.0.009 y = 0.5065 + 0.5155 = 0.

396x – 0.4192 M 8.396x 0.5530 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.y = 0.009 = 0.562 = 0.396x 0.7740 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.8505 + 0.009 y = 0.009 .0.396x x = 1.396x x = 1.7740 = 0.0. Sampel D (Kelompok 8) Diketahui: y = 0.396x 0.5530 = 0.396x .396x .0. Sampel D (Kelompok 7) Diketahui: y = 0.009 = 0.009 0.8505 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.8505 = 0.396x . Sampel C (Kelompok 6) Diketahui: y = 0.009 y = 0.8595 = 0.1704 M 7.396x – 0.009 = 0.783 = 0.5530 + 0.7740 + 0.396x – 0.9773 M 6.009 0.396x x = 2.009 0.

7250 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.009 .396x 0.0.396x – 0.396x .0370 = 0.009 = 0.7250 + 0.7250 = 0.6505 = 0.0370 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 2.396x 1.396x . Sampel E (Kelompok 9) Diketahui: y = 0.009 0.009 = 0.0.396x – 0.1667 M 11.396x x = 4.396x x = 1.009 y = 1. Sampel E (Kelompok 10) Diketahui: y = 0.y = 0.6415 + 0.009 = 0.396x – 0.009 y = 2.3788 M 10.0.396x . Sampel F (Kelompok 11) Diketahui: y = 0.6415 = 0.009 2.396x 2.046 = 0.734 = 0.009 1.0370 + 0.6427 M 9.6415 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.396x x = 5.

8220 + 0.425 = 0.0160 = 1.009 1.396x .052 .y = 1.6237 M Contoh Perhitungan Konsentrasi Protein dengan metode Bradford y = bx+a Keterangan: y = absorbansi (A) x = [Protein] (M) a.4160 = 0.0160 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.009 = 0.396x x = 3.009 1.b = konstanta dari grafik standar 1.396x – 0.181x + 0.052 y = 1.8220 = 0.4160 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.396x – 0.5985 M 12.009 = 0.4160 + 0. Sampel F (Kelompok 12) Diketahui: y = 0.396x 1.0.181x + 0.396x x = 4. Sampel A(Kelompok 1) Diketahui: y = 1.009 y = 1.396x 1.8220 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.831 = 0.

9905 = 1.1080 .052 = 1.181x 0.181x + 0.052 0. Sampel B (Kelompok 4) Diketahui: y = 1.9075 = 1.181x + 0.181x + 0.7947 M 3.8942 M 4.0.9075 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0. Sampel B (Kelompok 3) Diketahui: y = 1.0.964 = 1.9385 = 1.9905 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.052 y = 0.8163 M 2.9905 .052 = 1.052 = 1.181x + 0.181x + 0.181x x = 0.1080 = 1.052 .181x x = 0.052 y = 0.056 = 1.1.052 1.181x 1.181x 0. Sampel A(Kelompok 2) Diketahui: y = 1.181x x = 0.0160 .9905 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.052 y = 0.181x + 0.0.

052 y = 0.8548 M 6.0.9335 = 1.052 = 1.9855 = 1.7244 M 5.052 1. Sampel C (Kelompok 5) Diketahui y = 1.0.052 = 1.181x + 0.052 = 1.9075 .181x x = 0.181x + 0.9855 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.7904 M 7.9855 .052 y = 1. Sampel C (Kelompok 6) Diketahui y = 1.181x 0.7250 = 1.0.181x x = 0.8555 = 1.0.052 y = 0.0615 = 1.052 .181x + 0.7250 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.181x 1.0095 = 1. Sampel D (Kelompok 7) Diketahui y = 1.181x + 0.181x + 0.0615 .181x + 0.052 0.0615 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.181x 0.181x x = 0.

181x + 0.5860 = 1. Sampel E (Kelompok 9) Diketahui y = 1.052 y = 0.052 = 1.181x x = 1.9265 = 1. Sampel D (Kelompok 8) Diketahui y = 1.181x x = 0.181x 1.181x + 0.181x + 0.052 y = 2.181x + 0.9105 = 1.4605 = 1.052 = 1.673 = 1.181x + 0.2367 M 10.5125 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.0.181x 0.9265 .5125 = 1.0.052 = 1.181x x = 0.5860 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 2.052 y = 1.7250 .052 .0.052 0.181x + 0.052 1.7710 M 9.5125 .5699 M 8.9265 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 0.181x 0.0. Sampel E (Kelompok 10) Diketahui y = 1.

181x 2.181x x = 2.181x + 0.181x x = 0.1456 M 11.181x + 0.5860 .1905 = 1.181x x = 2.181x 1.0.052 1.1385 = 1.5 = 1.052 = 1.1168 M 12. Sampel F (Kelompok 11) Diketahui y = 1.9640 M Contoh Perhitungan Konsentrasi Sampel Hasil Pengenceran M1V1=M2V2 Keterangan: F = Banyaknya pengenceran M1 = Konsentrasi sampel awal (%v/v) .5520 = 1.5520 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 2.181x + 0. Sampel F (Kelompok 12) Diketahui y = 1.052 = 1.2.0.1905 Ditanya: Berapa konsentrasi protein (x)? Jawab: 1.052 2.5520 .052 y = 1.1905 .181x + 0.052 y = 2.0.052 = 1.181x 2.534 = 1.

Sampel D Diketahui: Sampel A= 2%b/v ⁄ Volume Sampel = 100 ml Ditanya: Berapa konsentrasi sampel hasil pengukuran? Jawab: Vtotal = 200 ml 2% x 100 ml = M2 x 200 ml M2 = 1%b/v 3. Sampel B Diketahui: Sampel A= 5%v/v ⁄ Volume Sampel = 100 ml Ditanya: Berapa konsentrasi sampel hasil pengukuran? Jawab: Vtotal = 200 ml 5% x 100 ml = M2 x 200 ml M2 = 2.5%v/v 2. Sampel F Diketahui: .M2 = Konsentrasi hasil pengenceran (%v/v) V1 = Volume sampel (ml) V2 = Volume total (ml) 1.

Sampel A= 2%b/v ⁄ Volume Sampel = 100 ml Ditanya: Berapa konsentrasi sampel hasil pengukuran? Jawab: Vtotal = 200 ml 2% x 100 ml = M2 x 200 ml M2 = 1%b/v PEMBAHASAN .

dapat dilihat korelasi absorbansi dengan konsentrasi protein dalam larutan. dapat diketahui bahwa terjadi penurunan konsentrasi larutan sampel. Persamaan garis metode Lowry adalah y = 0. Demikian pula sebaliknya. didapatkan absorbansi sampel A 1. penurunan konsentrasi protein dalam percobaan ini tidak sesuai dengan data hasil perhitungan. Seperti pada sampel A. Konsentrasi sampel B dari hasil perhitungan berdasarkan persamaan garis kurva standar adalah 1.181x + 0. seharusnya didapatkan konsentrasi akhir protein dalam sampel B setengah kali konsentrasi protein dalam sampel A.0290 M dan 1. dibuat kurva standar untuk masingmasing metode.984 (Lowry) dan 0. Sampel pertama adalah putih telur dengan konsentrasi 5%v/v. Dari data di atas. Persamaan garis tersebut kemudian digunakan untuk menentukan konsentrasi protein dalam larutan sampel untuk masing-masing metode. Sampel A kemudian diencerkan sebanyak 2x menjadi sampel B yang memiliki absorbansi sebesar 0. Bila data sampel A dengan sampel B dibandingkan. Hal ini sesuai dengan hukum Lambert-Beer yang menyatakan bahwa semakin besar absorbansi larutan. Nilai regresi yang diperoleh dari masing-masing kurva standar yang dibuat yaitu 0. Namun.Pada praktikum penentuan kadar protein. persamaan garis metode Bradford adalah y = 1. Sesuai hasil perhitungan.3018 M. Berdasarkan percobaan dengan metode Lowry.009.713 A dalam metode Lowry. Sedangkan.8232 M.052. yang berbanding lurus (Effendi 2003). Dari kurva standar.975 (Bradford). juga diperoleh persamaan garis untuk kedua metode. data pada sampel B juga memperlihatkan relasi absorbansi dengan konsentrasi protein dalam larutan.1505 A dan 0. semakin besar konsentrasi zat terlarut.0. Semakin besar nilai regresi. semakin kecil pula konsentrasi zat terlarut (Effendi 2003). Hal ini sesuai dengan literatur yang menyatakan bahwa pengenceran akan menurunkan konsentrasi larutan tanpa mengubah jumlah mol zat yang terlarut di dalamnya (Chang 2006). semakin kecil absorbansi.396x .5855 A dan 0.5065 A dengan konsentrasi 3. .5013 M dan 1. semakin baik model kurva yang dibuat ([UI] 2009). yaitu keduanya berbanding lurus.

Hal ini sesuai dengan literatur yang menyatakan bahwa pengenceran akan menurunkan konsentrasi larutan tanpa mengubah jumlah mol zat yang terlarut di dalamnya (Chang 2006). Sedangkan.7947 M. Sampel C kemudian diencerkan sebanyak 2x menjadi sampel D yang memiliki absorbansi metode Lowry 0. penurunan konsentrasi protein dalam percobaan ini tidak sesuai dengan data hasil perhitungan. tidak terdapat perbedaan yang terlalu signifikan antara konsentrasi protein sebelum dan setelah larutan putih telur diencerkan. didapatkan absorbansi sampel C adalah 0.8163 M dan 0. sampel A memiliki absorbansi 1.9905 dengan konsentrasi protein 0. Berdasarkan hasil perhitungan. Seperti pada sampel C. terlihat relasi absorbansi dengan konsentrasi protein dalam larutan.Berdasarkan percobaan dengan metode Bradford. Sampel kedua dalam praktikum ini adalah tepung cacing dengan konsentrasi 2%b/v.4191 M dan 1.553 A dan 0. . semakin besar konsentrasi zat terlarut (Effendi 2003). data kedua konsentrasi protein setelah pengenceran lebih besar daripada sebelum pengenceran. konsentrasi akhir protein dalam sampel D seharusnya setengah kali konsentrasi protein dalam sampel C. data sampel D juga memperlihatkan relasi absorbansi dengan konsentrasi protein dalam larutan yang berbanding lurus (Effendi 2003). yaitu keduanya berbanding lurus.8942 M dan 0.8505 A dengan konsentrasi 1. sampel B memiliki absorbansi 1. dapat diamati bahwa terjadi penurunan konsentrasi larutan sampel. Hal ini sesuai dengan hukum Lambert-Beer yang menyatakan bahwa semakin besar absorbansi larutan. Selain itu.774 A dan 0.016 A dan 0.704 M. dapat pula diamati bahwa dalam pengukuran dengan metode Bradford. Dari data di atas.108 A dan 0. Data ini tidak sesuai dengan literatur bahwa pengenceran menyebabkan penurunan konsentrasi larutan (Chang 2006).6415 A.9773 M dan 2. Namun.9075 A dengan konsentrasi protein 0.6427 M.7244 M. dengan konsentrasi protein hasil perhitungan sebesar 1. Bahkan bila dibandingkan. Bila data kedua sampel dibandingkan. Dari data ini terlihat bahwa absorbansi larutan berbanding lurus dengan konsentrasi zat terlarutnya (Effendi 2003). Berdasarkan percobaan dengan metode Lowry.

Hal ini sesuai dengan teori yang menyatakan bahwa pengenceran akan menyebabkan penurunan konsentrasi larutan tanpa mengubah jumlah mol zat yang terlarut di dalamnya (Chang 2006).822 A. Berdasarkan percobaan dengan metode Lowry. Dari data di atas.1456 M. Berdasarkan percobaan dengan metode Bradford. dapat diamati bahwa terjadi penurunan konsentrasi larutan sampel. didapatkan absorbansi sampel E sebesar 1. bila data kedua sampel di atas dibandingkan. Seperti pada sampel E.3788 M dan 5. diketahui sampel E memiliki absorbansi sebesar 1. Data ini sesuai dengan literatur bahwa konsentrasi larutan akan menurun jika dilakukan pengenceran (Chang 2006).5985 M dan 4.5125 A dan 2. penurunan konsentrasi protein dalam percobaan ini tidak sesuai dengan data hasi perhitungan. sampel F memiliki absorbansi sebesar 2.6237 M.0615 A dan 0.7250 A dan 0. diketahui sampel C memiliki absorbansi 1. Bila data sampel E dan sampel F dibandingkan. Hal ini sesuai literatur yang menyatakan bahwa semakin besar absorbansi larutan. Namun. Sedangkan.7710 M. Sampel ketiga adalah tepung cacing dengan konsentrasi 2%b/v. dengan konsentrasi protein hasil perhitungan sebesar 3. sampel D memiliki absorbansi sebesar 0.Dalam percobaan dengan metode Bradford. dapat juga diketahui bahwa terjadi penurunan konsentrasi protein dalam larutan sampel setelah pengenceran.9855 A dengan konsentrasi protein 0.4160 A dan 1.5699 M dan 0.1667 M. Sampel E kemudian diencerkan sebanyak 2x menjadi sampel F yang memiliki absorbansi metode Lowry sebesar 1. semakin besar konsentrasi zat terlarut (Effendi 2003).7904 M. yaitu keduanya berbanding lurus.9265 A dengan konsentrasi protein 0. Data kedua sampel tersebut menunjukkan bahwa absorbansi larutan berbanding lurus dengan konsentrasi zat terlarutnya (Effendi 2003).2367 M dan 2. data pada sampel F juga memperlihatkan relasi absorbansi dengan konsentrasi protein dalam larutan yang berbanding lurus (Effendi 2003). Sedangkan. Selain itu. dapat diketahui relasi antara absorbansi dengan konsentrasi protein dalam larutan. seharusnya konsentrasi protein dalam sampel F setengah kali konsentrasi protein dalam sampel E. Sesuai hasil perhitungan.0370 A dengan konsentrasi 4.552 A .8548 M dan 0.7250 A dan 2.5860 A dengan konsentrasi protein 1.

chapso.dan 1. Selain itu. Hal tersebut diakibatkan Metode Lowry merupakan metode pengukuran konsentrasi protein dengan prinsip reduksi Cu2+ menjadi Cu+ oleh asam amino (tirosin. cesium bikarbonat. Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan. dll. dapat diamati bahwa kedua metode memberikan hasil absorbansi dan konsentrasi protein yang berbeda pada masing-masing sampel yang sama. sorbitol. Reagen yang digunakan pada metode Lowry adalah pereaksi Folin-Ciocalteau dan peraksi Biuret. . sedangkan pereaksi Biuret dibuat dengan mencampurkan 50 mL reagen A (2 % Na2CO3. Pereaksi Folin Ciocalteau dibuat dengan cara mengencerkan reagen Folin Ciocalteau. Data ini sesuai dengan literatur bahwa konsentrasi larutan akan menurun jika dilakukan pengenceran (Chang 2006). Pada metode Lowry terdapat banyak senyawa pengganggu yang dapat bereaksi dan mempengaruhi hasil pengukuran. bila data kedua sampel dibandingkan. Triton X-100. dapat juga diketahui terjadi penurunan konsentrasi protein dalam larutan sampel setelah pengenceran.1905 A dengan konsentrasi protein 2. Warna biru yang muncul akan dideteksi pada panjang gelombang 750 nm (sensitivitas yang tinggi untuk konsentrasi protein yang kecil) atau 500 nm (sensitivitas yang rendah untuk konsentrasi protein yang tinggi). dapat diketahui bahwa absorbansi larutan berbanding lurus dengan konsentrasi zat terlarutnya (Effendi 2003). NaCl.4% NaOH) dengan 1 mL reagen B (0. glisin. terdapat beberapa kesalahan baik pada pembuatan kurva standar. chaps. Dari data kedua sampel. Metode Lowry mampu mengukur kadar protein sampai dengan 5 μg (Nielsen 2010). Contoh senyawa tersebut diantaranya ammonium sulfat. maupun konsentrasi protein dalam sampel.1168 M dan 0. 1% Na-K tartrat) (Owusu 2002). Ammonium sulfat. triptofan. sistein) yang ada dalam larutan protein. octyl glucoside. 0. Dalam percobaan ini.5% CuSO4. EDTA. glukosa. sukrosa.9640 M. Ion Cu+ bersama dengan fosfotungstat dan fosfolibdat dalam pereaksi Folin-Ciocalteau akan membentuk warna biru yang dapat menyerap cahaya (Purwoko 2007). lubrol. tris. Hal ini dapat disebabkan oleh perbedaan sensitivitas dan senyawa pengganggu pada kedua metode (Nielsen 2010). absorbansi.

Metode Bradford merupakan metode pengukuran konsentrasi protein total yang melibatkan pewarna Coomassie Brilliant Blue (CBB). metode ini memiliki kelemahan. absorbansinya protein dapat diukur menggunakan spektrofotometri pada panjang gelombang 465-595 nm (Caprette 2005).5%) dan EDTA adalah contoh senyawa pengganggu yang menyebabkan tidak terbentuknya warna biru pada reaksi (Walker 2002). chapso. Metode Bradford sendiri merupakan metode yang sederhana karena hanya menggunakan 1 reagen dan reaksi berlangsung cepat karena inkubasi hanya berlangsung selama 5 menit dalam suhu ruang ([UA] 2009). Selain itu. Glisin (lebih besar dari 0.lubrol. Namun. Selain menggunakan metode Lowry. Dengan demikian. Gambar 3 Struktur Coomassie Brilliant Blue G-250 ([UA] 2009). pengukuran kadar protein juga dapat dilakukan dengan metode Bradford. CBB akan berikatan dengan protein pada sampel larutan dalam suasana asam. chaps. Selain itu juga ada merkaptan (2-mercaptoethanol) dan Ditiotreitol (DTT) yang merupakan senyawa pengganggu yang mereduksi protein untuk bereaksi dengan pewarna (Owusu 2002). SDS akan mengganggu ikatan hidrogen dan berikatan dengan . metode ini juga sensitif dan tepat karena mampu mendeteksi protein sampai dengan 1-20 µg (Li 2005). cesium bikarbonat merupakan contoh senyawa pengganggu yang dapat mengendapkan protein. yaitu pewarna CBB dapat membekas pada alat-alat berbahan kaca dan dapat terganggu dengan adanya detergen seperti SDS ([UA] 2009).

Prinsip spektrofotometri yaitu pengukudan absorbsi cahaya yang melalui suatu larutan pada panjang gelombang tertentu. Kolorimetri sendiri. Metode ini berdasar pada penyerapan cahaya tampak dan energi radiasi lainnya oleh suatu larutan (Amanda 2011). Putih telur merupakan bagian yang berwarna bening dan mengelilingi kuninng telur. Penggunaan albumin dan lysozyme dalam putih telur ini sebagai pengganti antibiotik sangat penting karena penggunaan antibiotik secara kontinu dapat menimbulkan resistensi (Chairul et al. dan tepung cacing. susu. metode spektrofotometri tidak terbatas pada penggunaan sinar daerah tampak. tetapi dapat juga menggunakan sinar UV maupun sinar infra merah (Natalia 2010). Jumlah cahaya yang diabsorbsi oleh larutan sebanding dengan konsentrasi zat terlaut (Lestari 2007). Putih telur ini kaya akan protein. kolorimetri merupakan pengukuran warna. Spektrofotometri berbeda dengan kolorimetri. Ketiga sampel memiliki kandungan protein yang berbeda-beda dengan manfaat yang juga beragam. digunakan 3 sampel. Protein ini dapat dimodifikasi menjadi produk bernama CPP-APP (casein . Sedangkan. yaitu putih telur. terutama albumin dan lysozyme yang termasuk protein kualitas tinggi (Chairul et al. 2006). Jadi. Seperti yang telah disebutkan sebelumnya. merupakan metode analisa kimia yang didasarkan pada kesamaan besaran warna antara larutan sampel dengan sumber cahaya polikromatis dan detektor mata. pada percobaan penentuan kadar protein dengan spektrofotometri. Hal ini menyebabkan larutan bersifat basa dan tidak dapat bereaksi dengan pewarna CBB (Saraswati 2008). Melalui nilai absorbansi. 2006). Berbeda dengan putih telur. Albumin dan lysozyme yang mempunyai aktivitas antimikroba dapat digunakan sebagai bahan pengganti antibiotik dalam mengobati penyakit yang disebabkan oleh mikroorganisme. yang berarti sinar yang digunakan adalah sinar daerah tampak. dalam susu terdapat protein yang disebut kasein. dapat ditentukan konsentrasi zat terlarut dalam sampel. khususnya bakteri patogen.bagian hidrofobik pada protein sehingga protein terurai menjadi ikatan polipeptida yang panjang dan mempunyai muatan negatif yang besar sehingga akan saling tolakmenolak dengan molekul CBB yang bermuatan negatif.

BSA dijadikan sebagai protein standar karena mudah didapat dalam keadaan murni dan relatif murah (Wrolstad et al. seharusnya dalam pembuatan kurva standar digunakan bentuk murni protein yang akan diuji. hypercoagulanility. Hal tersebut berkaitan dengan fakta bahwa penggunaan antibiotik dalam jangka lama dapat menyebabkan resistensi terhadap bakteri patogen (Sofyan 2008). Biasanya. BSA ada protein lain yang dapat dijadikan sebagai standar. Oleh karena itu. 2006). BSA juga bersifat sangat stabil (Estey et al. BGG menjadi pilihan yang baik. Pemilihan protein standar merupakan hal yang penting dalam suatu tes protein. dalam tepung cacing terdapat protein berupa enzim yang disebut lumbrokinase. jika sampel yang . tepung cacing dapat digunakan sebagai pengganti antiobiotik yang merupakan pakan imbuhan (pemacu pertumbuhan) pada ternak unggas. Enzim ini memiliki aktivitas fibrinolitik dan antitrombotik (Cooper & Yamaguchi 2004). yaitu BGG (Bovine Gamma Globulin). Secara ideal. Protein ini mampu menghambat pertumbuhan bakteri-bakteri patogen. BSA atau Bovine Serum Albumin adalah protein globular besar yang berukuran kurang lebih 66. Produk kasein tersebut dapat digunakan untuk menguatkan email gigi dan mehambat caries pada gigi. Namun dalam kenyataannya. lumbrokinase digunakan untuk mencegah dan mengobati ischemic stroke. Selain lumbricin.000 Dal (Harper 2003). Sedangkan. Protein ini merupakan turunan dari darah sapi sehat (Wise & Watters 2010). digunakan larutan BSA dalam pembuatan kurva standar metode Bradford dan Lowry. yaitu enzim amilase yang dalam bidang kedokteran digunakan untuk mengetahui kerusakan pada pankreas dan menentukan kondisi utama dalam plasma (Neryceka 2004). Selain itu. BSA dijadikan sebagai standar relatif protein di samping pengembangan warnanya yang lebih baik dibanding protein lain (Kirschner 2007). Oleh karena itu. Selain. Tepung cacing juga mengandung enzim lain. dan thrombosis disease. CPP-APP sendiri sudah lazim digunakan dalam permen karet bebas gula (Reynolds 2009). hal tersebut sulit dilakukan. 2005). Pada praktikum ini. pada tepung cacing terdapat komponen bioaktif bernama lumbricin yang merupakan senyawa peptida dengan susunan asam amino lengkap terutama prolin.phosphopeptide–amorphous calcium phosphate).

Warna yang dihasilkan oleh BSA lebih baik daripada BSA.diuji memiliki kandungan immunoglobulin. Selain itu. BGG memiliki beberapa kelemahan dibandingkan dengan BSA. . BSA merupakan protein standar yang lebih baik jika sampel yang diuji memberikan respon warna yang sejenis atau sampel memiliki kandungan utama berupa albumin (Kirschner 2007). Hal itu disebabkan oleh respon warna BGG yang sangat mirip dengan immunoglobulin G (Wrolstad et al. 2005). Akan tetapi. uji Bradford lebih sensitif terhadap BSA dibandingkan dengan BGG (Caprette 2006).

reagen yang digunakan tidak sederhana dan mudah bereaksi dengan senyawa lain. Efektivitas metode tersebut tergantung dari sensitivitas dan akurasi. pewarna protein bisa menempel pada kuvet kuarsa. 0. Untuk Bradford mempunyai kelebihan yaitu reaksinya cepat dan bersifat reprodusibel. Kelemahannya adalah variasi warna tidak proporsional dengan konsentrasi protein. Dalam pengukuran ini. sifat-sifat protein yang diukur. Dengan demikian. dan turbiditas sampel tidak berpengaruh dalam metode ini. Kedua metode yang digunakan pada percobaan kali ini. 0. dan 1 M. banyaknya jumlah cahaya yang diserap berbanding lurus dengan konsentrasi senyawa di dalam larutan. yaitu metode Lowry dan metode Bradford masing-masing mempunyai kelebihan dan kelemahannya sendiri. semakin besar nilai absorbansinya maka semakin besar pula jumlah konsentrasi protein yang terkandung dalam larutan. Kurva standar dibuat dengan menghubungkan absorbansi pada ordinat (sumbu Y) dan konsentrasi protein sebagai absis (sumbu X). dan waktu yang tersedia. Sedangkan kelemahannya sama seperti Lowry yaitu variasi warna tidak proporsional dengan konsentrasi protein. 0. dari data tersebut terbentuk dan terhubung menjadi kurva standar. Jadi. lebih spesifik.4 M. 0. absorbansi diperoleh dari pengukuran.1 M. Untuk metode Lowry mempunyai kelebihan yaitu sensitivitas yang tinggi.2 M. dan mengalami intervensi deterjen. . Sedangkan. Penentuan kadar protein dalam sampel pada percobaan dilakukan dengan metode spektrofotometri.SIMPULAN Untuk membuat kurva standar dari pewarna Lowry dan Bradford digunakan larutan BSA.8 M. Konsetrasi BSA yang digunakan adalah 0.6 M. ada tidaknya senyawa pengganggu. Pengukuran dan analisis konsentrasi kadar protein dalam larutan dilakukan dengan menggunakan prinsip absorbansi dan transmisi cahaya yang merupakan dasar dalam penentuan sifat dan analisis biomolekul seperti protein.

Jelaskan tentang kelebihan dan kelemahan metode Lowry dan Bradford dalam mengukur kadar protein! .MENJAWAB PERTANYAAN 1.

Namun. kompleks protein-pewarna hasil reaksinya dapat berikatan dengan kuvet kuartz. sehingga kurang efisien dari segi waktu (Simpson 2004). Selain itu. Selain itu. reaksi ini dapat mengalami intervensi senyawa-senyawa tertentu seperti sukrosa. Kelemahan lain adalah metode ini dapat mengalami intervensi deterjen. baik yang ionik maupun anionik seperti Triton X-100 dan Sodium . antara lain variasi warna yang tidak terlalu proporsional dengan konsentrasi protein. Selain metode Lowry. sama seperti metode Lowry. lebih baik digunakan kuvet kaca atau kuvet plastik. metode ini dapat mengukur protein atau peptida dengan massa molekul sama dengan atau lebih besar dari 4000 Da (Nielsen 2010).Jawab: Kelebihan metode Lowry adalah metode ini sensitif. Kelemahan lain adalah reagen metode Lowry tidak stabil dan membutuhkam preparasi harian dengan prosedur cukup rumit. sekitar 1-1. yaitu variasi warna yang luas sesuai dengan jenis proteinnya mengakibatkan seleksi protein menjadi lebih sulit sehingga harus dilakukan dengan hati-hati. Namun. metode Lowry memiliki beberapa kelemahan. buffer fosfat. juga dapat digunakan metode Bradford. Selain itu. lipid. bahkan lebih sensitif daripada metode Lowry. Konsentrasi tinggi ammonium sulfat dan senyawa sulfidril juga dapat mengintervensi reaksi pada metode Lowry (Nielsen 2010). dan hexoamine hingga mencapai derajat tertentu. warna yang terbentuk pada metode Lowry bervariasi bergantung jenis protein (Nielsen 2010). yaitu sekitar 2 menit dan data yang dihasilkan dalam metode ini berulang atau dengan kata lain bersifat reprodusibel. Selain itu. 50-100 kali lebih sensitive daripada metode Biuret dan 10-20 kali lebih sensitive daripada metode UV-280 nm absorption. Untuk itu. Metode ini juga sangat sensitif. dalam menentukan kadar protein. Turbiditas sampel tidak berpengaruh dalam metode ini (Nielsen 2010). metode ini juga memiliki beberapa kekurangan. monosakarida. metode Lowry lebih spesifik daripada metode lain dan relatif sederhana dalam eksekusinya sehingga tidak membutuhkan waktu terlalu lama.5 jam. Selain itu. Kelebihan metode ini adalah reaksinya berlangsung sangat cepat.

Metode Kjeldahl. 6. 3. Metode Dumas (Nitrogen Combustion) . Metode anionic dye-binding. kesalahan akibat kandungan deterjen kurang dari 0. 2. Metode Biuret. netralisasi.1% masih dapat diperbaiki melalui control yang tepat (Nielsen 2010). yang banyak digunakan untuk menentukan protein pada sereal atau kacang kedelai. yang dapat menghitung konsentrasi asam amino triptofan dan tirosin menggunakan hukum Beer. tepung gandum. Sebutkan metode pengukuran kadar protein lain yang ada! Jawab: Beberapa metode pengukuran kadar protein lain yaitu sebagai berikut (Nielsen 2010). Namun. 4. 1. dan titrasi. yang meliputi tahapan pencernaan.Dodesil Sulfat (SDS). 2. yang biasa digunakan untuk menghitung kadar protein dalam susu. yang banyak digunakan dalam proses isolasi dan purifikasi protein. 5. dan daging. Metode BCA (Bicinchoninic Acid). Metode UV-280 nm absorption.

Telaah Kualitas Air Bagi Pengelolaan Sumber Daya dan Lingkungan Perairan. 2003. [skripsi]. Complementary and Alternative Approach to Biomedicine. Yamaguchi N. 2011.ohiostate.fst. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Methods of Analysis of Food Components and Additives. Schwendeman SP. Chairul. 2007. http://kirschner.med. J Pharm Sci 7(95):1626-1639. 2006. berkala]. BSA degradation under acidic solution: a model for protein instability during release from PLGA delivery systems.html 2012]. Kang J. 2006. 2010.harvard. Medan: Universitas Sumatera Utara. Effendi H. Carpenter JF.rice. Caprette DR. . 2006. Kirschner MW. Maheswari RRA. Penetapan kadar kromium pada air reservoir secara kolorimetri di PDAM Tirtanadi instalasi pengolahan air sunggal [skripsi].edu/~bioslabs/methods/protein/protein.pdf [10 Mar 2012]. Bovine serum albumin [terhubung berkala].DAFTAR PUSTAKA Amanda M. Florida: CRC.htm [10 Mar 2012].ruf. Poeloengan M. Estey T.Yogyakarta: Kanisius. 2003. [11 Mar Cooper EL. 2004. Biorad protein assay [terhubung berkala]. Harper JW.edu/people/harper/functionalfoods/milk%20components/bovine%20serum%20albumin. http://www.edu/files/protocols/BioRad_proteinassay. Kolakowski E. New York: Kluwer Academic. Protein assay [terhubung http://www. Aktivitas antimikroba pada putih telur dari beberapa jenis unggas terhadap bakteri gram positif dan gram negatif.

Cola-Cola bottling Indonesia Medan dengan metode kolorimetri [skripsi]. http://www. Deteksi keberadaan berbagai enzim hidrolase pada cacing tanah (Lumbricus rubellus) [skripsi]. Raymond C.arizona. Bahaya Kimia Sampling & Pengukuran Kontaminan Kimia di Udara. Penentuan kadar klorin air baku produksi di PT. 2005. . Saraswati T. [UA] University of Arizona. 2002. Depok: Universitas Indonesia. JITV 13(3): 182-188. 2010. 2004. 2010. Simpson RJ. Aktivitas antibakteri dan retensi protein tepung cacing tanah (Lumbricus rubellus) sebagai pakan imbuhan dengan taraf penambahan kitosan. Jakarta: Erlangga. Damayanti E. Colorimetric [terhubung berkala].pdf [10 Mar 2012]. 2008. 2009. Kandungan protein kecap manis tanpa fermentasi moromi hasil fermentasi Rhizopus oryzae dan R. 2010. Purwoko T.biochem. Jakarta: Universitas Katolik Indonesia Atma Jaya. New York: Cold Spring Harbor. Jakarta: EGC. Nielsen SS. 2006. Bahaya Purifying Proteins for Proteomics: A Laboratory Manual.edu/classes/bioc463a/Info/lecture_notes/colorimetric. 2007. 2004.ppt [11 Mar 2012]. Biodiversitas 2(8):223-227. Natalia S. 2010 Usaha Ternak Cacing Tanah.myweb. Neryceka CK. Palungkun R. 2008. Depok: Penebar Swadaya.uga. Food Protein Analysis: Quantitative Effects on Processing. Owusu RK. Sofyan A. New York: Marcel Dekker. ADR 21:25-29. Medan: Universitas Sumatera Utara. Kimia Dasar. Reynolds EC.Lestari F. Casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate: the scientific evidence.edu/protocols/CEP_38. 2009. Julendra H. Efek tegdma terhadap protein total dan profil protein sel-sel pulpa gigi (in vitro) [skripsi]. Li X. oligosporus. Protein determination assays [terhubung rscott. New York: Springer. Food Analysis. berkala].

ac.uad. Proteins. Watters RL. http://staff.docx [10 Mar 2012]. https://wwws. Totowa: Humana. Regresi majemuk [terhubung berkala]. blog. Wise SA.[UAD] Universitas Ahmad Dahlan.pdf?CFID=11628267&CFTOKEN=f682f8 8a759516bc-B4D66BFA-E23D-27B47C85AA1E5BC84277&jsessionid=b430384deb613141a202 [10 Mar 2012].id/primamitha/files/2011/12/SIFAT-PROTEIN.pdf [10 Mar 2012]. The Protein Protocols Handbook. [UI] Universitas Indonesia. 2002. Lipids.nist. Schwatz SJ 2005. 2009. Enzymes. Wrolstad RE. Walker JM. . Bovine serum albumin (7%) [terhubung berkala].ac.id/internal/131998622/material/Multipleregression.ui. Decker EA.gov/srmors/certificates/927d. New Jersey: John Wiley & Sons. and Carbohydrates. 2011. 2010. Sifat protein [terhubung berkala]. Handbook of Food Analytical Chemistry: Water.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful