P. 1
praktikum MIKROBIOLOGI

praktikum MIKROBIOLOGI

4.5

|Views: 10,616|Likes:
Published by L:
email : lant_chan@yahoo.co.id
email : lant_chan@yahoo.co.id

More info:

Published by: L: on Jan 08, 2010
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOC, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

07/15/2013

pdf

text

original

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

PRAKTIKUM I MENGAMATI MORFOLOGI BAKTERI DENGAN PENGECATAN TUNGGAL DAN GRAM

Pendahuluan Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri merupakan organisme mikroskopis yang mempunyai ciri-ciri : tubuh uniseluler, tidak berklorofil, bereproduksi dengan membelah diri, habitatnya dimana-mana (tanah, air, udara, dan makhluk hidup), dan aktif bergerak pada kondisi lembab. Beberapa bentuk bakteri yaitu basil, kokus, dan spirilum. Bentuk-bentuk tersebut dapat menunjukkan karakteristik spesies bakteri, tetapi bergantung pada kondisi pertumbuhannya. Hal ini dipengaruhi oleh keadaan lingkungan, medium, dan bakteri (Edukasi, 2008). Bakteri bersifat transparan dan berukuran sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata telanjang. Salah satu cara untuk mengetahui struktur, morfologi, dan sifat kimia bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Zat warna yang biasa dijadikan untuk mengecat bakteri adalah methylene blue, basic fuchsin, dan crystal violet. Zat warna ini menghasilkan in warna (chromophore) yang bermuatan positif sehingga bakteri yang bermuatan negatif menarik chromophore kationik. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewarna negatif. Contoh pewarna asam misalnya : tinta cina, larutan Nigrosin, asam pikrat, eosin dan lain-lain. Pewarnaan basa bisa terjadi pada

1

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

senyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna basa misalnya methylene blue, kristal violet, safranin dan lain-lain. Beberapa pengecatan yang kita kenal ialah pengecatan tunggal atau sederhana dan pengecatan majemuk. Pengecatan tunggal ialah pengecatan yang hanya digunakan satu macam zat warna saja, misalnya fuchsin, crystal violet atau methylene blue(Gupte, 1990). Sedangkan pengecatan majemuk ialah pengecatan yang menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Dalam pengecatan majemuk kita kenal pengecatan Gram, Ziehl-Nielsen, klein, Burn Gins, dll. Pengecatan tunggal hanya bertujuan untuk melihat bentuk sel, sedangkan pengecatan majemuk dapat membedakan karakteristik suatu morfologi tertentu. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Sebelum melakukan pengecatan bakteri, dibuat dahulu film di atas gelas objek dari suspensi bakteri. Tujuan pembuatan film adalah mematikan sel bakteri dengan cepat tanpa merusak morfologinya dan melekatkan sel bakteri ke permukaan gelas objek. Tujuan Umum • Mengetahui prosedur pengecatan tunggal dan gram • Pengecatan tunggal dilakukan untuk melihat bentuk sel dan pengecatan majemuk dilakukan untuk membedakan karakteristik suatu morfologi tertentu (seperti gram positif atau gram negatif) Teori Umum Bakteri bersifat transparan dan berukuran sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata telanjang. Untuk mengetahui struktur, morfologi, dan sifat kimia bakteri harus dilakukan pengecatan sel bakteri. Zat warna yang dapat digunakan untuk mengecat sel bakteri antara lain methylene blue, basic fuchsin, dan crystal violet. Zat warna ini menghasilkan ion warna (chromophore) yang
2

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

bermuatan

positif, sehingga bakteri yang bermuatan

negative menarik

chromophore kationik. Terdapat dua jenis zat warna yaitu zat warna basa dan asam. Zat warna basa (methylene blue) dan zat warna asam yang mempunyai chromophore anionic (eosin). Zat warna ini tidak dapat dipakai untuk pengecatan bakteri. Waktu pengecatan antara 30 detik – 2 menit tergantung pada afinitas zat warna. Beberapa pengecatan yang kita kenal ialah pengecatan tunggal atau sederhana dan pengecatan majemuk. Pengecatan tunggal ialah pengecatan yang menggunakan satu macam zat warna saja sedangkan pengecatan majemuk ialah pengecatan yang menggunakan lebih dari satu zat warna. Dalam pengecatan majemuk kita kenal pengecatan Gram, Ziehl-Nielsen, Klein, Buri Gins, dan lainlain. Pengecatan tunggal hanya bertujuan untuk melihat bentuk sel sedangkan pengecatan majemuk dapat membedakan karakteristik suatu morfologi tertentu. Sebelum melakukan pengecatan bakteri, dibuat dahulu film di atas gelas objek dari suspensi bakteri. Tujuan pembuatan film adalah mematikan sel bakteri dengan cepat tanpa merusak morfologinya dan meletakan.

1.1.

Pengecatan Tunggal

Tujuan : Melihat morfologi (bentuk susunan) bakteri dengan menggunakan satu macam zat warna Teori Dasar Bakteri bersifat transparan dan berukuran sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata telajang. Untuk mengetahui struktur, morfologi, dan sifat kimia bakteri, kita perlu melakukan pengecatan terhadap bakteri tersebut.

3

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Zat warna yang biasa dijadikan utnuk mengecat bakteri adalah methylene blue, basic fuschin, dan crystal violet. Semua zat warna ini bekerja baik terhadap bakteri karena mengahsilkan ion warna (chromophore) yang mempunyai muatan positif. Bakteri mempunyai muatan negatif sehingga menarik hromophore kationik Zat warna digolongkan ke dalam zat warna basa contohnya methylene-blue (methylene+ chloride-) sedangkan zat warna asam yang mempunyai chromophore anionik cotohnya eosin (sodium+ eosinate-). Chromophore anionik, eosinate- tidak dapat dipakai mengecat bakteri. Waktu pengecatan antara 30 detik - 2 menit tergantung pada afinitas zat warna. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994). Kebanyakan bakteri dapat diwarnai dengan pengecatan sederhana atau pengecatan gram, tetapi beberapa genus anggota dari genus Mycobakterium, bersifat resisten dan hanya dapat dilihat dengan metode tahan asam. Karena M. taberculosis dan M. leprae bakteri yang patogenik bagi manusia, maka pengecatan itu bernilai diagnosa dalam mengidentifikasi mikroorganisme tersebut. Perbedaan sifat antara mycobacterium dengan mikroorganisme lainnya adalah dengan adanya suatu dinding tebal yang berlilin (lipoidal)

4

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

yang menyebabkan penetrasi oleh zat warna menjadi sulit. Akan tetapi, apabila zat warna sudah dapat masuk, zat warna terssebut jadi tidak mudah dibuang meskipun dengan penggunaan asam alcohol yang kuat sebagai zat pelarutnya. Dengan sifat yang demikian, mikroorganisme yang demikian disebut mikroorganisme tahan-asam dan mokroorganisme lainnya yaitu yang mudah dilarutkan dengan asam alcohol disebut mikroorganisme tidak tahan asam. Metode ini mengunakan tiga macam zat kimia yang berbeda. 1) zat warna primer, yaitu karbon Fuchin, 2) zat peluntur warna, 3) counterstain, yaitu metilen biru (Subandu, 2009). Teknik pewarnaan Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Disebut demikian karena hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme. Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofil (suka akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromofornya bersifat positif). Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coccus, vibrio, basillus, dsb) dari bahanbahan lainnya yang ada pasa olesan yang diwarnai (Hadiotomo, 1990).

Prosedur Kerja Bahan dan Alat:
1. Biakan bakteri Azotobacter chroococum dan Bacillus subtilis 2. Zat warna carbol fuchsin/carbol gentian violet/methylene blue

3. Gelas objek, ose, lampu spirtus, dan botol semprot 4. Kertas saring 5. Minyak imersi 6. Mikroskop

5

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Cara Kerja Pelaksanaan praktikum ini meliputi dua langkah, yaitu pembuatan film dan pengecatan.

A. Pembuatan Film Pembuatan film berperan penting dalam pengamatan morfologi. Bakteri yang terlalu bertumpuk atau terlalu tipis di atas gelas objek akan menghasilkan gambaran yang kurang jelas di bawah mikroskop. Cara membuat film :
1. Bersihkan

gelas

objek

dengan

kapas

beralkohol

untuk

menghilangkan lemak dan mikroba yang menempel, lalu keringkan di udara 2. Buat lingkaran kecil di bagian bawah gelas objek untuk membatasi film dengan pensil gelas
3. Ambil satu ose suspensi bekteri secara aseptik, yaitu dengan cara

membakar ose di atas lampu spirtus sampai memijar, kemudian dinginkan sebentar, lalu tempelkan pada bagian dalam tabung biakan sebelum mengambil suspensi bakteri 4. Buat film setipis mungkin di atas gelas objek di dalam batas lingkaran yang telah dibuat
5. Lakukan fiksasi dengan cara melakukan film langsung di atas api

secara cepat dua sampai tiga kali. Maksudnya untuk membunuh

6

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

bakteri secara cepat sehingga tidak mengalami perubahan bentuk. Di samping itu, fiksaki dapat meletakkan bakteri pada gelas objek Langkah-langkah pembuatan film di atas senantiasa dilakukan sebelum kita melakukan pengecatan.

B. Pengecatan
1. Tambahkan salah satu zat warna di atas film dengan waktu yang

sesuai, yaitu carbol fuchsin 15-20” (detik), carbol gentian violet 3045”, dan methylene blue 3-5’ (menit) 2. Buang zat warna tersebut lalu cuci dengan mengalirkan air menggunakan botol semprot untuk menghilangkan zat warna yang tidak terpakai 3. Keringkan dengan kertas saring dengan cara ditempelken perlahan ke atas film yang telah diwarnai. Jangan menggosok film dengan kerts saring 4. Tambahkan satu tetes minyak imersi 5. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat (lensa objektif 100x) 6. Catat dan gambar morfologi bakteri

Hasil dan Pengamatan Azotobacter sp.
Susunan : Tunggal dan koloni

7

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008 Bentuk Warna : Bulat (Coccus) : keunguan

Perbesaran : 100 X Menggunakan gentian violet

Bacillus subtilis

Susunan Bentuk Warna

: Tunggal dan koloni : Batang (Basil) : merah

Perbesaran : 100 X Menggunakan carbol fuchsin

Pembahasan Pewarnaan tunggal bakteri yang menggunakan methylene-blue dapat menyebabkan beberapa granula, pada beberapa jenis bakteri, yang berada di dalamnya tampak terwarnai lebih gelap dibandingkan pada bagian luarnya. Dengan demikian, terlihat pada Azotobacter sp. morfologi yang terlihat adalah berbentuk coccus atau bulat yang berkoloni dengan warna merah. Sedangkan pada Bacillus substilis berbentuk batang atau basil yang berwarna merah. Dan warna yang terlihat pada kedua bakteri tersebut adalah merah karena pewarnaan menggunakan carbol fuchsin.

8

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Kesimpulan

Pada pewarnaan tunggal, Bacillus subtilis berwarna biru keunguan karena diberi warna gentian violet. Berbentuk streptobasil. Susunannya ada yang tunggal dan ada yang berkoloni.

Pada Azotobacter chroococum berwarna kemerahan karena diberi warna fuchsin. Berbentuk streptococcus. Susunannya ada yang tunggal dan ada yang berkoloni.

1.2.

Pengecatan Gram

Tujuan : Membedakan bakteri yang bersifat gram positif dan gram negatif

Teori : Christian Gram (1884) merupakan penemu prosedur pengecatan gram. Pengecatan ini merupakan salah satu prosedur yang amat penting dan paling banyak digunakan dalam klasifikasi bakteri. Dengan metode ini, bakteri dapat dipisahkan secara umum menjadi dua kelompok besar, yaitu :
1. Organisme yang dapat menahan kompleks pewarna primer gentian

violet sampai pada akhir prosedur (sel-sel tampak biru gelap atau ungu), disebut Gram Positif
2. Organisme yang kehilangan kompleks warana ungu kristal pada waktu

pembilasan dengan alkohol (sehingga bila diperiksa ternyata kosong), namun kemudian terwarnai oleh pewarna tandingan, fuchsin/safranin sel tampak merah muda, disebut Gram Negatif.

9

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Diketahui bahwa komposisi dinding sel bakteri gram positif berbeda dari bakteri gram negatif. Dinding sel yang lebih tebal pada bakteri gram positif menyusut oleh perlakuan alkohol karena terjadi dehidrasi, menyebabkan poripori dinding sel menutup sehingga mencegah larutnya kompleks gentian violet pada langkah penucatan. Di lain pihak, sel-sel gram negatif mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi pada dinding selnya dan lipid umumnya larut dalam alkohol dan aseton. Larutnya lipid oleh pemucat yang digunakan dalam pewarnaan gram diduga memperbesar pori-pori dinding sel sehingga proses pemucatan pada sel-sel gram negatif berlangsung cepat. Contoh bakteri gram positif antara lain Bacillus subtilis, Streptococcus lactis, dan Staphylococcus aureus. Sedangkan bakteri gram negatif antara lain Corynebacterium diphteri, Escherichia coli, dan Salmonella typhosa.

Prosedur Kerja Bahan dan Alat :
1. Biakan murni B. subtilis

2. Zat warna carbol gentian violet, fuchsin/safranin 3. Larutan lugol (I+KI+air), alkohol 95%, minyak imersi 4. Gelas objek, ose, lampu spiritus, dan kertas saring 5. Mikroskop

Cara Kerja 1. Buat film (seperti pada praktikum I) 2. Tambahkan carbol gentian violet selama 3 menit
3. Cuci dengan air yang dialirkan dari botol semprot

10

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

4. Tambahkan larutan lugol selama 1 menit 5. Tambahkan 2-3 tetes alkohol biarkan selama 30 detik sampai tidak ada warna yang larut 6. Cuci dengan air, tambahkan fuchsin/safranin salama 1-2 menit 7. Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring (tidak digosok) 8. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran lensa objek 100x
9. Catat dan gambar morfologi dan warna sel (bakteri gram positif

berwarna ungu dan gram negatif berwana merah) Hasil dan Pengamatan
Azotobacter chroococum

Perbesaran kuat: 100 X Zat warna : Carbol Gentian Violet&Safranin. Bentuk : Bulat (coccus) Susunan : tunggal, Koloni (bergerombol) Warna : Merah Gram : ( - ) / negatif

Bacillus subtilis

Perbesaran kuat : 100 X

11

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008 Zat warna : Carbol Gentian Violet&Safranin. Bentuk Susunan Warna Gram : Batang (Bacilus) : Tunggal : Ungu : ( + ) / Positif.

Pembahasan Pada percobaan yang menggunakan Azotobacter chroococum dapat dilihat bahwa setelah diberikan carbol gentien violet yang merupakan pengecatan awal dan selanjutnya diberikan lagi larutan lugol, prosesnya disebut dengan mordanisasi, selanjutnya pengecatan terakhir dengan penambahan safranin yang merupakan warna tandingan, yang menyebabkan sel-sel pada bakteri tampak berwarna merah muda. Sel-sel pada bakteri ini berbentuk bulat dengan susunan ada yang tunggal dan koloni (bergerombol), hasilnya berwarna merah, menandakan bahwa hasil percobaan ini negatif, karena warna yang dihasilkan tidak sesuai dengan teori, bahwa setelah penambahan warna sel bakteri ini merah sehingga disebut gram negatif (-). Sedangkan pada percobaan pengamatan bakteri Bacillus subtilis, dapat dilihat bahwa setelah pemberian pemberian gentien violet, lugol serta safranin yang merupakan warna tandingan, meghasilkan sel bakteri tampak berwarna ungu, meandakan bahwa sel pada bakteri ini merupakan gram positif (+). Dengan bentuk bakteri seperti batang, dan susunannya tunggal. Proses perwarnaan dilakukan dengan membersihkan gelas objek dan gelas penutup dengan alkohol untuk sterilisasi agar tidak kontaminasi. Gram A mengandung kristal violet yang berwarna ungu merupakan cat primer yang akan

12

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

mewarnai bakteri, pewarnaan dilakukan 1 menit agar cat ini dapat melekat sempurna pada dinding bakteri. Gram D mengandung safranin sehingga bewarna merah yang merupakan cat sekunder atau kontras berfungsi untuk memberikan warna bakteri non target, dilakukan selama 30 detik agar bakteri yang catnya telah luntur dapat terwarnai (Heritage, 2000). Pencucian dengan air mengalir dimaksudkan agar cat dapat hilang secara sempurna dan tidak tersisa, dikeringanginkan bertujuan agar warna melekat pada bakteri dan segera kering sehingga bila diwarnai lagi warna sebelumnya tidak tercampur dengan warna yang baru. Kemudian dilihat di bawah mikroskop agar dapat mengamati bentuk dan warna sel bakteri. Bakteri gram positif akan berwarna ungu, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah. Pewarnaaan dengan safrani (1-2 menit) bertujuan sebagai counterstain yang digunakan untuk melumuri bagian warna dari sel yang lain daripada endospora (Prescot, 2002). Kemudian dicuci dengan air mengalir agar warna safranin luntur dan dikeringanginkan agar warna cepat kering. Pada pengamatan dengan menggunakan mikroskop nampak Bacillus subtilis berbentuk basil (batang) dan merupakan bakteri gram positif. Jenis ini memiliki endospora yang letaknya di tengah. Bacillus subtilis merupakan bakteri yang berbentuk batang yang Gram-positif (Perez 2000). Bakteri ini tersusun atas peptidoglycan, yang merupakan polimer dari sugars dan asam amino. Peptidoglycan yang yang ditemukan di bakteri yang dikenal sebagai murein. Sel membentuk tembok penghalang antara lingkungan dan bakteri sel yang berguna untuk mempertahankan bentuk sel dan withstanding sel yang tinggi internal tekanan turgor (Schaechter 2006). Habitat endospora bakteri ini adalah tanah. Mikroba tersebut dalam bentuk spora yang kekurangan nutrisi. Organisme ini dapat menghasilkan antibiotik selama sporulation. Contohnya polymyxin, difficidin, subtilin, dan mycobacillin. Banyak dari mikroba Bacillus dapat menurunkan Polymers seperti protein, pati, dan pektin, sehingga bakteri ini merupakan penyumbang penting kepada siklus karbon dan nitrogen. Akan tetapi apabila terkontaminasi, dapat menyebabkan

13

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

pembusukan. Berdasarkan pewarnaan sel vegetatif didapatkan warna kemerahan dan warna endosporanya adalah hijau (Schaechter 2006). Penjelasan lainnya yaitu pada pewarnaan gram, komposisi dinding sel bakteri gram negatif mengandung lipid, lemak atau substansi seperti lemak lebih tinggi daripada yang terkandung pada bakteri gram positif. Selain itu, dinding sel bakteri gram negatif cenderung lebih tipis terbukti dalam percobaan pewarnaan gram pada bakteri gram negatif penggunaan alkohol (etanol) menyebabkan terekstraksinya lipid sehingga memperbesar daya rembes atau permeabilitas dinding sel gram negatif. Hal itu menyebabkan kompleks zat warna ungu (gentian violet) yang telah memasuki dinding sel selama langkah awal dalam proses pewarnaan dapat diekstraksi. Karena itu bakteri gram negatif (dalam percobaan ini adalah Basillus subtilis) kehilangan warna tersebut. Berbeda dengan bakteri gram positif yang memiliki kandungan lipid lebih sedikit, dinding selnya menjadi terdehidrasi selama perlakuan dengan etanol. Ukuran pori-pori mengecil, permeabilitas berkurang, dan kompleks gentian violet tidak dapat terekstraksi.

Kesimpulan

Pada pewarnaan gram, didapatkan hasil Bacillus subtilis merupakan gram positif. Warna yang terlihat adalah warna ungu.

Sedangkan

pada

Azotobacter

chroococum

terlihat

warna merah.

Diidentifikasikan merupakan bakteri gram negatif.

14

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

PRAKTIKUM II MENGAMATI MORFOLOGI BAKTERI DENGAN PENGECATAN SPORA DAN KAPSUL

Pendahuluan Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri. Endospora merupakan organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008). Karena kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan dengan sel vegetatifnya, maka endospora berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop. Struktur endospora mungkin bervariasi untuk setiap jenis spesies, tapi umumnya hampir sama. Endospora bakteri merupakan struktur yang tahan terhadap keadaan lingkungan yang ekstrim misalnya kering, pemanasan, dan keadaan asam. Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya, sehingga harus digunakan pewarna spesifik, tetapi sekali diwarnai zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode

15

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

pengecatan spora secara umum. Bakteri yang tidak berspora cenderung tidak tahan pengecatan karena hanya memiliki sel vegetatif. Beberapa endospora mempunyai diameter lebih besar daripada sel, dimana sel tersebut akan nampak menggembang pada letak endosporanya (Ncbi, 2008). Letak endospora yang berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi. Tipe utama diantara terminal, subterminal dan sentral. Tipe sentral atau tengah merupakan lokasi dari sel vegetatif yang letaknya tepat di tengah. Tipe terminal memiliki pengertian letak sel vegetatif diantara ujung dan pinggir dari sel vegetatif. Tipe subterminal berarti lokasi endosporanya diantara tengah dan pinggir dari sel vegetatif. Endospora dapat berukuran lebih besar ataupun kecil dari sel vegetatif yang terdiri dari lapisan protein yang terbuat dari keratin. Spora ini memiliki resistensi yang tinggi terhadap pewarnaan.

2.1. Tujuan :

Pengecatan Spora Bakteri (Metode Klein dan Wirtz)

Melihat bentuk spora di dalam sel bakteri. Teori : Bakteri dapat mengubah dirinya dari bentuk vegetative menjadi spora bila keadaan memburuk. Pada bentuk spora kegiatan bakteri akan berhenti ( dorman atau tidak melakukan metabolisme dan tidak bereproduksi). Dalam bentuk ini bakteri sangat resisten dan dapat bertahan hidup dalam waktu yang lama meskipun lingkungan dalam keadaan yang kurang baik. Sifat spora yang demikian menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Berdasarkan letak sporanya dikenal tiga macam letak, yaitu: sentral, subterminal dan terminal. Berdasarkan posisinya bakteri dibedakan atas: 1. Endospora, dibentuk didalam sel itu sendiri.
a. Ditengah sel (sentral). Contoh Bacillus Cereus.

16

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008 b. Di ujung sel (terminal). Contohnya Clostridium thuringensis. c. Didekat ujung (sub terminal). Contohnya Clostridium subterminale.

Endospora adalah tubuh kecil yang tahan lama terbentuk didalam sel dan mampu tumbuh menjadi organisme vegetatif yang baru.
2. Eksospora, dibentuk diluar sel. Contoh Streptomyces. Beberapa spesies bakteri

menghasilkan spora eksternal, seperti konidia, yang disangga diujung hifa, suatu filamen vegetatif, pada streptomyces. Proses ini serupa dengan proses pembentukan spora pada cendawan. Prosedur Kerja Bahan dan Alat :
1. 2.

Biakan murni Bacillus subtilis Zat kimia / warna carbol fuchsin, methylene blue, malachite green, Asam sulfat dan alkohol. Gelas objek, Ose, dan Tabung reaksi Penangas air, Termometer Mikroskop

safranin. 3. 4. 5. 6. Cara Kerja : A. 1.
2.

Metode Klein I Campurkan suspensi bakteri dengan carbol fuschin dalam tabung Panaskan dalam penangas air selama10 menit pada temperatur 80 0 Buat film dari campuran suspensi diatas. Celupkan ke dalam asam sulfat selama 1-2 detik. Cuci dengan air, lalu tambahkan methylene blue selama 3 menit. Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring. Amati dengan perbesaran kuat. Catat dan gambar apa yang terlihat. Spora berwarna merah reaksi dengan perbandingan 1:1. C. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

sedangkan bentuk vegetatif berwarna biru.

17

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

B. 1.
2.

Metode Klein II Buat film dari suspensi bakteri Tambahkan carbol fuschin, panaskan sampai keluar uap . (80 0 C Langkah-langkah selanjutnya sama dengan metode klein I. Metode Wirtz 1. 2. 3. 4. 5. 6. Buat film dari suspensi bakteri. Tambahkan malachite green, panaskan sampai menguap kurang Cuci dengan air, tambahkan safranin selama 30 detik. Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring. Amati dengan perbesaran kuat. Catat dan amati apa yang terlihat. Spora berwarna hijau dan badan

selam 10 menit ).. 3. C.

lebih selama 2 menit.

bakteri berwarna merah muda.

Hasil dan Pembahasan
Metode Klein II Bacillus subtilis

Badan vegetative: warna biru Spora : warna merah muda sel vegetatif: bentuk batang

Metode Wirtz Bacillus subtilis

Badan vegetative: merah muda

18

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Spora : warna hijau sel vegetatif: bentuk batang

Pembahasan Pada percobaan metode klein II ini, dapat dilihat bahwa setelah pemberian asam sulfat dan methylene blue di atas, dan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100 X, bakteri Bacillus subtilus memiliki sel vegetatifnya berbentuk batang dan berwarna biru. Dengan latar sporanya di luar sel vegetatif, dan warna sporanya itu sendiri adalah merah. Sel spora bakteri memiliki RNA yang mampu mengikat warna sehingga tetap mempertahankan warna merah yang diberikan carbol fuchsin. Sedangkan sel vegetatif tidak mampu mengikat warna merah sehingga sel vegetatif tidak berwarna. Sel-sel vegetatif baru berwarna biru setelah di beri zat warna methylene blue. Sedangkan pada percobaan yang kedua yaitu menggunakan metode Wirtz juga sama, pada perobaan bakteri yang digunakan adalah Bacillus subtilis tetapi zat warna yang digunakan adalah malachite green, dan pada percobaan ini menggunakan zat warna tandingan yaitu safranin. Sehingga setelah diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100 X, menghasilkan sel vegetatifnya berbentuk seperti batang, dan berwarna merah muda. Latar sporanya berada di luar sel vegetatif, dengan warna sporanya itu sendiri adalah hijau. Malachite green merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada
19

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya. Saat diwarnai oleh malachite, sel vegetatif dapat mengikat warna tetapi dapat luntur setelah dilunturkan karena ikatannya tidak kuat. Setelah pewarnaan selanjutnya dengan safranin, sel vegetatif mudah mengikat warna kembali. Oleh karena itu, hasil pewarnaan akhir adalah merah muda dari safranin. B. Subtilis akan berwarna hijau setelah pengecatan. Bacillus pada umumnya bersifat aerobic. Hal ini berarti B. Subtilis memiliki endospora. Endospora lebih tahan lama meski dalam keadaan linghkungan ekstrim seperti kering, panas, atau bahan kimia yang beracun. Selain itu, endospora juga lebih tahan terhadap pewarnaan. Sekali berhasil diwarnai, spora sangat sukar untuk melepaskan zat warna sehingga saat diberi warna dari safranin tetap berwarna hijau karena spora sudah mengikat malachite dan sulit mengikat warna yang diberikan kemudian. Bacillus subtilis memiliki endospora yang terletak di subterminal (Ncbi, 2008).

Kesimpulan

Pada bakteri Bacillus subtilis dengan menggunakan metode klein II spora berwarna merah karena diberikan fuchsin, sedangkan sel vegatatif berwarna biru karena diberikan methylene blue.

Pada percobaan yang menggunakan metode Wirtz sel spora berwarna hijau karena terwarnai oleh malachite green, sedangkan sel vegetatif berwarna merah muda karena terwarnai oleh safranin.

2.2. Tujuan :

Pengecatan Kapsul Bakteri (Metode Buri-Gins dan Maneval)

Melihat keberadaan kapsul bakteri. Teori : Pada bagian sebelah luar dari dinding sel beberapa jenis bakteri terdapat suatu zat semacam lendir atau gum. Karena zat tersebut mengelilingi bakteri dan menyerupai kapsul, maka struktur demikian disebut dengan kapsul bakteri.

20

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Struktur kapsul dapat tipis atau tebal tergantung pada jenis bakteri itu sendiri dan jenis bahan makanan yang terkandung dalam media atau substrat. Kapsul merupakan ekskresi dari dinding sel bakteri itu sendiri dan berfungsi untuk melindungi dirinya.. Adanya kapsul pada bakteri pathogen mempunyai hubungan erat dengan virulensi bakteri itu sendiri. Bakteri dengan kapsul yang tebal mempunyai virulensi yang lebih tinggi dari pada bakteri dengan kapsul yang tipis atau dengan bakteri yang tidak berkapsul sama sekali. Pengecatan kapsul disebut juga pengecatan negatif, karena disini yang diwarnai adalah latar belakangnya, sedangkan objeknya sendiri (kapsul) tidak diwarnai. Pada metode Burri-Gins dipakai tinta cina untuk mewarnai latar belakangnya, sedangkan untuk mewarnai badan sel bakteri digunakan Fuchsin, sehingga badan bakteri menjadi berwarna merah dan kapsulnya didak berwarna (transparan) pada latar belakang yang hitam. Pada metode Maneval bakteri diwarnai dengan menggunakan Congo red, sedangkan untuk mewarnai latar belakangnya diberi cat Maneval. Badan bakteri akan berwarna merah sedangkan kapsul tidak berwarna pada latar belakang berwarna hijau. Bahan dan Alat :
1. Biakan murni Azotobacter chroococum atau Bacillus subtilis 2. Zat kimia/warna larutan fuchsin, Congo red, tinta cina, cat maneval, dan

media cair. 3. Gelas objek, Ose, Lampu spirtus, dan Mikroskop Cara Kerja : A. Metode Buri-Gins 1. Bersihkan gelas objek. 2. Teteskan satu ose suspensi bakteri di atas gelas objek pada bagian ujungnya. 3. Teteskan 1-2 ose tinta cina di dekatnya, lalu campurkan.

21

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

4. Buat preparat hapus dengan cara mendorong ke depan dengan menggunakan gelas objek lain. 5. Keringkan di udara. 6. Tambahkan carbol fuchsin selama 1-2 menit. 7. Keringkan dengan kertas saring. 8. Amati dengan perbesaran kuat. 9. Catat dan amati apa yang terlihat. Kapsul tidak berwarna sedangkan badan bakteri berwarna merah dengan latar belakang berwarna hitam. B. Metode Maneval
1. Teteskan 2 ose Congo red pada gelas objek.

2. Ambil 2 ose suspensi bakteri, lalu mencampurkan dengan congo red tadi. Membuat film setipis mungkin. 3. Keringkan di udara. 4. Tambahkan cat Maneval , diamkan selama 1 menit. 5. Keringkan dengan kertas saring. 6. Amati preparat dengan perbesaran kuat. 7. Catat dan gambar apa yang terlihat. Kapsul tidak berwarna sedangkan badan bakteri berwarna merah dengan latar belakang biru. Hasil Pengamatan Metode Maneval Bacillus subtilis Badan bakteri: warna merah Kapsul: tidak berwarna Latar belakang: hijau.

22

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Pembahasan Umumnya tidak semua bakteri itu memiliki kapsul, sedangkan fungsi kapsul itu sendiri adalah untuk mendekatkan pada media. Pada percobaan ini, bakteri diberikan setetes sampai 2 tetes tinta cina, setelah itu diberikan karbol fuchsin, dan diamati, sehingga dihasilkan warna kapsul transparan, sedangkan warna pada badan bakteri tersebut merah, dengan warna latarnya adalah hitam. Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat (Hadiotomo, 1990). Sedangkan pada percobaan dengan meggunakan metode maneval didapat bahwa bakteri setelah dicampurkan dengan congo red dan diberikan cat maneval. Menyebabkan warna kapsul transparan, warna badan bakteri merah dengan bentuk bakteri seperti batang, dan warna latarnya hijau. Kesimpulan • Pada metode Burri-Gins, tinta cina digunakan sebagai latar belakangnya, sedangkan untuk mewarnai badan bakteri digunakan fuchsin, sehingga badan bakteri berwarna merah dan kapsul tidak berwarna (transparan) pada latar belakang yang hitam. • Pada metode Maneval, untuk mewarnai badan bakteri digunakan Congo red, sedangkan cat Maneval digunakan sebagai latar belakangnya. Badan bakteri akan berwarna merah, sedangkan kapsul tidak berwarna pada latar belakang hijau.

23

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

PRAKTIKUM III PENGENALAN STRUKTUR MIKROSKOPIS JAMUR

Pendahuluan Penyakit pada tumbuhan dapat disebabkan karena faktor abiotik (anorganik) dan penyebab-penyebab nabati (jamur dan bakteri), virus, dan nematoda. Jamur itu sendiri memiliki pengertian yaitu mikroorganisme yang selselnya berinti sejati (eukariotik) dengan bentuknya berupa benang, bercabangcabang, tidak berklorofil, dan dinding sel mengandung kitin, selulosa atau keduanya. Jamur merupakan organisme heterotrof yang mendapatkan nutrisi dengan cara absorbsi dan bereproduksi secara seksual atau aseksual dengan spora. Jamur merupakan organisme yang sangat penting karena peranannya yang sangat vital dalam ekosistem dan pengaruhnya terhadap manusia serta berbagai aktifitas yang berhubungan dengan manusia. Jamur memiliki jenis yang beraneka ragam. Di dunia ada sekitar 1.5 juta jenis jamur, namun hanya sekitar 74.00024

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

120.000 yang telah teridentifikasi. Sementara itu, Scmidt dan Muller menduga bahwa terdapat sedikitnya 600.000 spesies jamur. Tujuan : Mengamati struktur jamur, yaitu bentuk hifa dan spora jamur. Teori : Jamur adalah organisme yang sel-selnya berinti sejati (eukariotik), berbentuk benang (hifa), bercabang, tidak berklorofil, dinding selnya mengandung kitin atau selulosa atau keduanya, heterotrof, absortif, dan sebagian besar tubuhnya terdiri dari bagian vegetatif berupa hifa dan generatif berupa spora. Bagian vegetatif jamur (hifa) berupa benang-benang dan ada yang bersekat ada pula yang tidak bersekat. Kumpulan benang hifa disebut miselium. Umumnya hifa memiliki tebal 0,5 - 100 µm. Hifa dikelompokkan menjadi dua macam, yaitu : 1. Hifa seluler Adalah hifa yang mempunyai sekat dan tiap sel mengandung satu atau dua inti. 2. Hifa senositik Adalah hifa yang mengandung banyak inti dan keseluruhan miselium berupa satu sel multi inti yang berkesinambungan, tubular, bercabang ada pula yang tidak bercabang. Dengan kata lain, miselium yang dibagi menjadi beberapa dinding melintang (septa) dengan setiap segmen menjadi hifa multi inti. Jamur dapat berkembang biak dengan menggunakan dan menghasilkan spora. Spora merupakan bagian reproduksi atau pembiakan terspesialisasi yang terdiri atas satu atau beberapa sel. Spora ada yang memiliki flgel (zoospore) dan ada pula yang tidak berflagel (aplonasora). Bentuk dari spora jamur bermacam-macam diantaranya adalah bulat, lonjong, bulat telur, bulan sabit, dan gada. Warna spora diantaranya hialin, coklat, oranye, dan hitam.

25

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Bahan dan Alat : 1. Beberapa spesies jamur yang ditumbuhkan di media Potato Dextrose Agar (PDA) dan jamur-jamur konsumsi 2. Jarum preparat 3. Object glass dan cover glass 4. Mikroskop Cara Kerja : 1. Ambil potongan kecil biakan murni dan letakkan pada object glass yang telah diberi satu tetes lactophenol cotton blue atau lactophenol 2. Untuk melihat bentuk/susunan spora maka potongan biakan dapat langsung diamati di bawah stereoscopic microscope (hati-hati dalam mengatur jarak lensa jangan sampai lensa object terkena biakan) 3. Untuk melihat secara detail bentuk sporangiofor/konidiofor dan peletakannya pada sporangium/konidia, maka biakan harus ditutup dengan gelas penutup. Tekan gelas penutup pada potongan biakan yang ada sehingga memudahkan pengamatan 4. Atur jarak lensa object, agar tidak terkena gelas penutup, agardiperoleh focus yang paling baik. Gunakan perbesaran sampai 10x, tetapi untuk memperjelas detail maka digunakan perbesaran 40x 5. Amati secara mikroskopis karakteristik spora/konidia, ujung konidiofor, dan peletakan antara konidia dengan konidiofor 6. Berdasarkan karakteristik koloni tentukan genus jamur-jamur tersebut 7. Jelaskan klasifikasi dari genus tersebut 8. Jelaskan peranan jamur-jamur tersebut Hasil Pengamatan

26

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Makroskopis Trichoderma sp.

Mikroskopis

Makroskopis Fusarium sp

Mikroskopis

Metharizium sp

27

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Rhizopus sp

Sclerotium sp

Makroskopis Rhizoctonia sp

Mikroskopis

Paecilomyces sp

28

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Jamur Merang (Volvariella volvacea)

Jamur Kuping (Auricularuia auricula)

Makroskopis Jamur Tiram (Pleurotus ostreatus)

Mikroskopis

Jamur Oncom (Neurospora sitophyla)

29

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Pembahasan Salah satu cara mengidentifikasi jamur adalah dengan memngamati spora jamur tersebut. Berdasarkan hasil pengamatan diketahui bahwa bentuk spora dari Fusarium sp yang mirip seperti bulan sabit, Metharizium sp bulat lonjong, Trichoderma sp memiliki cabang tiga, dan lainnya seperti yang dapat terlihat pada hasil pengamatan tersebut. Kesimpulan • Bentuk mikroskopis dan makroskopis jamur memiliki perbedaan yang nantinya dapat digunakan untuk menentukan klasifikasi dari jamur tersebut.

PRAKTIKUM IV REKAYASA GENETIKA BAKTERI Pendahuluan Rekayasa genetika (Ing. genetic engineering) dalam arti paling luas adalah penerapan genetika untuk kepentingan manusia. Dengan pengertian ini kegiatan pemuliaaan hewan atau tanaman melalui seleksi dalam populasi dapat dimasukkan. Demikian pula penerapan mutasi buatan tanpa target dapat pula dimasukkan. Masyarakat ilmiah sekarang lebih bersepakat dengan batasan yang lebih sempit, yaitu penerapan teknik-teknik genetika molekular untuk mengubah susunan genetik dalam kromosom atau mengubah sistem ekspresi genetik yang diarahkan pada kemanfaatan tertentu. Obyek rekayasa genetika mencakup hampir semua golongan organisme, mulai dari bakteri, fungi, hewan tingkat rendah, hewan tingkat tinggi, hingga tumbuh-tumbuhan.

30

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Tujuan Praktikum ini bertujuan untuk memperbanyak bakteri dengan cara buatan dan mentransfer plasmid maupun gen yang bermanfaat pada tanaman. Teori Umum Polymerase Chain reaction merupakann reaksi berantai enzimatis untuk memperbanyak sekuen nukleotida melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu secara invitro. Metode ini pertama kali dikembangkan pada tahun 985 oleh Kary B.Mulllis. Seorang Peneliti di perusahaan CETUS Corporation. Metode ini sekarang telah banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan analitik genetic. Pada awal perkembangnnya metode ini hanya digunakan untuk melipatgandakan molekul DNA, tetapi kemudian dikembangkan lebih lanjut sehingga dapat digunakan pula untuk melipatgandakan dan melakukuan kuantitasi molekul mRNA. Metode PCR tersebut sangat sensitive. Sensitivitas tersebut membuatnya dapat digunakan untuk melipatgandakan satu molekul DNA. Metode ini juga sering digunakan untuk memisahkan gen berkopi tunggal dari dekelompok sekuen genom. Hal ini menunjukkan bahwa pelipatgandaan suatu fragmen DNA dapat dilakukan secara cepat. Kelebihan lain metode PCR adalah bahwa reaksi ini dapat dilakukan dengan menggunakan komponen dalam jumlah yang sangat sedikit, misalnya DNA cetakan yang diperlukan hanya sekitar 5ug. DNA cetakan yang digunakan juga tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu sehingga metode PCr dapat digunakan untuk melipatgandakan sutu sekuen DNA genom bakteri hanya dengan mencampurkan kultur bakteri di dalam tabung PCR. Konsep asli teknologi PCr mensyaratkan bahwa baguan tertentu sekuaen DNA yang akan dilipatgandakan harus diketahui terlabih dahulu sebelum proses pelipatgandaan tersebut dapat dilakukan. Sekuen yang diketahui tersebut penting untuk menyediakan primer, yaitu sekuen oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA dalam reaksi berantai polymerase. Perkembangan lebih lanjut metode PCR memungkinkan dilakuakn pelipatgandaan suatu fragmen DNA yang belum diketahuisekuennya.

31

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

1. Prinsip Dasar PCR Empat komponen utama proses PCR adalah; 1. DNA cetakan yaitufragmen DNA yang akan dilipatgandakan 2. Oligonukleotida primer yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek yang digunakan untuk mengawalisintesis rantai DNA. 3. Deoksiribinukleotida trifosfat (dNTP), terdiri atas dATP, dCIP, dGTP, dTTP 4. Enzim DNA polymerase, yaituenzim yang melakukan katalis reaksi sintesis rantai DNA. Reaksi pelipatgandaan suatu fragmen DNA dimulai dengan melakukan denaturasi DNA cetakan sehingga rantai DNA yang berantai ganda (double srtanded ) akan terpisah menjadi rantai tunggal (single stranded). Denaturasi DNA dilakuakn dengan menghuankan panas 95 0c selama 1-2 menit, kemudian suhu diturunkan menjadi 55 derajat celcius sehingga primer akan “menempel” pada cetakan yang telah terpisahmenjadi rantai tunggal. Primer akan membentuk jemabtanhidrogen degan cetakan pada daerah sekuaen yang komplementer dengan sekuen primer. Amplifikasi akan lebih efisien jika dilakukan pada suhub yang lebih rendah (37 derajat celcius) tetapi biasanya akan terjadi mispriming yaitu penempelan promer pada tempata yang salah. Pada suhu yang lebih tinggi, spesifisitas reaksi amplifikasi akan meningkat, tetapi secara keseluruhan efisiennya akan menurun. Reaksi tersebut diulang lagi sampai 25- 30 kali sehingga pada akhir siklus akan didapatkan molekul DNA rantai ganda yang baru hasil polimersi dalam jumlah yang jauh lebiuh banyak dibandingkan dengan jmlah DNA cetakan yang digunakan. BAnyaknya siklus implifikasi tergantung pda konsentrasi DNA target di dalam campuran reaksi. Paling tidak, diperlukan 25 siklus untuk mrlipatgandakan satu kopi DNA sekuen targr di dalam DNA genom mamalia agar hasilnya dapat dilihat secara langsung, misalnya dengaan elektroforesis terbatas Faq menjadi terbatas setelah 25 – 30 siklus amplifikasi. gel agarose Akan tetapi, pada umumnya konsentarsi DNA polymerase taq menjadi

32

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Tabung reaksi yang digunakan untuk PCR diinkubasi sesuai suhu dan lama inkubasi. Akan tetapi proses yang dilakukan secara manual tersebut mempunyai kelemahan antar lain ketepatan waktu inkjubasi yang cenderung rendah sehingga sekarang telah dikembangkan alat yang dapat deprogram secara jauh lebih tepat untuk melakukan inkubasi pada suhu yang berbeda dengan waktu yang berbeda pula. 1. DNA polymerase yang Digunakan dalam PCR Pada awal perkembangannya DNA polymerase yang digunakan dalam PCR adalah frahemn Klenow DNA polymerase IYang berasal dari E.coli (Mullis dan Faloona, 1989) Fragmen Klenow adalah DNA polymerase yang telah dihilangkan aktivitas eksonuklease (5’-3’)- nya. Beberapa kelemahan fragmen tersebut antara lain adalah bahwa enzim ini tidak tahan panas, laju polimerasinya sedang, dan posesivitasnay rendah. 1. TAq DNA Polimerase Oleh karena salah satu tahapan PCR adalah denaturasi DNA cetakan dengan menggunakan suhu tinggi, maka diperlukan suatu enzim DNA polymerase yang tetap aktif meskipun mengalami inkubasi pada suhu tunggi. Alternatif Klenow yang kemudian digunakan dalam PCR adalah DNA polymerase yang berasal dari mikroba termofilik, yaitu DNA polymerase yang berasal dari bakteri Thermus aquaticus BM, yaitu suatu starin yang tidak mempunyai endonuklease restriksi Taql. Taq DNA polymerase tersusun atas satu rantai polipeptida dengan berat molekul kurang lebih 95 kD. Enzi mini mempunyai kemampuan polimerisasi DAN yang sangat tinggi, tetapi tidak mempunyai aktivitas eksonuklease 3’-‘. Enzi mini paling aktif pada pH 9 dan suhu aktivitas optimumnya 75-80 derajat celcius. Aktivitas spesifiknya dalam manggabungkan nukleotida mencapai 150 nukleotida per detik per molekul enzim. Waktu paruh Taq DNA polymerase adalah 40 menit ( Gelfrand dan white,1990). Detergen non- ionic Tween 20 (0,51%) adapt digunakan untuk meningkatkan efisiensi polymerase Taq DNA polymerase. Senyawa tambahan lain yang jug adapt meningkatkan efisiensi polimersi Taq DNA polymerase adalah DMSO, gelati, gliserol, dan ammonium sulfat..

33

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Salah satu kelemahan enzim Taq DNA polymerase adalah bahwa enzim tersebut mempunyai potensi untuk melakukan kesalahan dalam menggabungkan nukleotida sehingga ada kemungjinan terjadi mutasi pada fragmen gen hasil amplifikasi. Meskupun demikian dengan kondisi yang tepat, kesalahan penggabungan nukleotida semacam itu tidak terjadi seperti misalnya hasil amplifikasi fragman gen HIV-1 (5400 nukleotida) dengan siklus amplifikasi 30 kali. Dengan demikian rata-rat frekuensi kesalahan pwngabungan nukleotida sekitar 5x10 6 kesalalahan per nukleotida yang digabungkan per siklus, dengan menggunakan 25 siklus. 2. Tth DNA Polimerase Enzim DNA polimerse lain yang juga dapat digunakan adalah Tth DNA polymerase. Enzi mini diisolasi dan eubakteri thermofilik. Tth DNA polymerase mempunyai posesivitas yang tinggi dan tidak mempunyai aktivitas eksonuklease 3’-5’. Enzi mini menunjukkan aktiivitas tertinggi pada ph 9. Selain aktivitas polymerase, enzim ini juga mempunyai aktivitas transcriptase balik ontronsik yang sangat efisien dengan adanya ion mangan. Aktivitas transkriptasi balik tersebut jauh lebih tinggi disbanding dengan aktivitas serupa yang dimiliki oleh DNA polymerase 1. Tth DNA polymerase juga dapat menggunakan substrat yang dinodifikasi sehingga juga dapat digunakan untuk melabel fragmen DNA dengan radionukleotida, digoxigenon, maupun biotin. Oleh karena enzim Tth DNa polymerase mempunyai aktivitas transcriptase balik pada suhu tinggi maka enzim ini dapat digunakan untuk mengatasi masalah yang timbul akibat adanya struktur sekunder pada molekul RNA. 3. Pwo DNA Polimerase Enzim Pwo DNa polymerase diisolasi dari archaebacteria hiperthermofilik Pyrococcus woesei. Enzim pwo DNA polymerase mempunyai berat molekul sekitar 90 kD. Enzim ini mempunyai prosesivitas polimerasi 5’-3’ yang tinggi, mempunayi aktivitas eksonuklease 3’-5’, dan tidak menunjukkan aktivitas eksonuklease 5’-3’.

34

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Pwo DNA polymerase stabilitas thermal yang lebih tinggi disbanding dengan Taq DNA polymerase. Waktu paruh enzim ini lebih dari 2 jam pada suhu 100 derajat celcius., sedangakan taq Taq DNA polymerase sedangkan Taq DNA hanya mempunyai waktu paruh 5 menit pada suhu ini. Aktivitas eksonukleses 3’ – 5’ yang dimilki oleh Pwo DNA polymerase meningkatkan ketepatan proses sintesis DNA 10 kali lebih tinggi disbanding dengan ketepatan yang dimiliki oleh Taq DNA polymerase. Hasil amplifikasi menggunakan Pwo DNA polymerase adalah molekul DNA dengan ujung tumpul sehingga dapat digunakan dalam proses ligasi ujung tumpul secara langsung tanpa harus dilakuakn modifikasi terhadap ujung molekul DNA. Oleh karena sifat ketepatannya yang tinggi maka enzim ini sangat berguna untuk aplikasi: a. b. c. d. e. Cloning produk PCR Studi polimorfisme alel dalam transkrip RNA individual Karakterisasi mutasi yang jarang di dalam suatu jaringan Karakterisasi status alel suatu sel tunggal atau DNA molekul Karakterisasi populasi sel dalam suatu kultur

tunggal 4. Pfu dan Ti DNA Polimerase DNA polymerase lain yang dapat digunakan untuk PCR adalah Pfu DNA polymerase dan Tliu DNA plomerase. Pfu SDNA pplimerase diisolasi mempunyai berat molekul 92 kd, aktif pada suhu 74 derajat celcius dan mempunyai aktivitas eksonuklese 3’-5’. Enzim ini memepunyai laju kesalahan yanhg paling kecil disbanding dengan enzim DNA polymerase yang lain. Produk amplifikasi dengan menggunakan enzim ini adalah molekul DNA dengan ujung tumpul. 2. Pengembangan Teknik PCR Sejak pertama kali diperkenankan, teknik PCR berkembang pesat.dan diaplikasiakn untuk bermacam-macam tujuan, baik untuk riset dasar maupun aplikasi praktis. Pada aspek metodologinya, teknik PCR yang pertama kali diperkenalkan keberhasilannya. 1. Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR) memerlukan banyak kondisi khusus untuk menjamin

35

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Teknik ini dikembangkan untuk melakukan analisis terhadap molekul RNA hasil transkripsi yang terdapat dalam jumlah sedikit dalam sel. Sebelu teknik ini dikembangkan, analisis terhadap molekul mRNA biasanya dilakikan dengan metode hibridisasi in situ, northen blot, dot blot atau slot blot, analisis menggunakan si nuclease, atau dengan metode pengujian RNse protection Assay. Metode hibridisasi in situ bersifat sangat sensitive hingga dapat digunakan untuk analisis molekul m RNA yang terdapat dalam jumlah sangat sedikit, tetapi teknik ini cukup sulit untuk dilakukan. Metode yang lain, meskipun lebih mudah dilakukan tidak cukup sensitive. Oleh karena itu, kemudian dikembangkan teknik RT-PCR untuk mengatasi kelemahan metode yang lain tersebut. Oleh karena PCR tidak dapat dilakukan dengan mengguankan RNA sebagai cetakan maka terlebih dahulu dilakukan proses transkripsi balik terhadap molekul mRNA sehingga diperoleh molekul cDNA (complementary DNA). 2. PCR In Situ Analisis DNA atau mRNA hasil transkripsi dapat dilakukan dengan beberapa macam cara, misalnya hibridisasi mRNA : RNA atau DNA : DNA, dengan system dot blot atau slot blot. Analisis dapat dilakukan terlebih dahulu dengan isolasi DNA atau mRNA dan sel atau jaringan atau dengan metode yang lebih maju. Teknik semacam ini dikenal sebagai hibridisasi in situ. Teknik ini memerlukan molekul RNA atau DNA target dalam jumlah paling tidak 20 copy dalam satu sel agar dapat terdeteksi. Oleh karena itu, teknik hibridisasi in situ paling sering digunakan untuk analisis mRNA. Jumlah genom virus laten yang menginfeksi satu sel sering kali hanya terdiri dari atas beberapa copy. Demikian pula mutasi gen, translokasi kromosom dan perubahan patologis awal sering kali hanya melibatkan coy sequen nukleotida. Oleh karena itu, untuk analisis molekul DNA yang jumlah copynya sedikit didalam sel, harus dilakukan amplifikasi terlebih dahulu secara in situ. Sebelum dilakukan PCR in sit, sampel jaringan harus di fiksasi dan dipermeabilisasi terlebih dahulu. Fiksasi dilakukan untuk mempetahankan DNA atau RNA dan morfologi sel atau jaringan. Biasanya yang digunakan untuk fiksasi adalah formalin. Jaringan yang masih segar merupakan sampel yang ideal, walaupun sampel jaringan yang telah difiksasi dengan formalin juga dapat digunakan untuk PCR in situ. Permeabilisasi dapat dilakukan

36

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

dengan menggunakan enzim sehingga primer, enzim DNA polymerase dan nukleotida dapat masuk ke dalam inti sel. Setelah permeabilisasi enzim protease yang digunakan harus dinon aktifkan. SEtelah dilakukan fiksasi dan permeabilisasi kemudian dilakuikan amplifikasi in situ yaitu dengan menambahkan komponen yang diperlukan untuk PCR. Setelah dilakikan PCR selanjutnya sela atau jaringann yang digunakan diambil lagi dan didekatkan pada gelas objek. Sebagian sel dianalisis dengan elektroforesis gel. Produk PCR hasil amplifikasi in situ yang ada di dalam sel kemudian dianalisis dengan teknik hibridisasi ataub dengan imunohistokimia. Secara umum teknik PCR in situi dfapat dibedakan menjadi 2 yaitu : 1. 2. PCR in situ tidak langsung ( indirect in situ PCR) PCR in situ langsung (direct in situ PCR).

Pada teknik PCr in situ tidak langsung dilakukan amplifikasi in situ dan hibridisasi in situ, tetapi pelacak disiapkan tersendiri. Sebaliknya pada teknin PCr in situ langsung dilakuiakn amplifikasi in situ dfengan menggunakan nukleotida yang sudah dilabel sehingga deteksi atas produk PCR dapat dilakukan secara langsung tanpa menggunakan pelacak. Teknik PCR langsung dianggap merupakan teknik yang lebih tepat dbanding dengan teknik PCR tidak langsung. Meskipun demikian, teknik PCR in situ langsung memberikan hasil yang kuramg meyakinkan disbanding teknok PCr in situ tidak langsung jika dilakukan untuk sampel berupa potongan jaringan. Dalam penerapan teknik PCR in situ ini ada beberapa variable penting yang yang harus diperhatikan antara lain: 1. 2. 3. 4. 5. Tipe bahan awal yang digunakan Tipe dan jumlah kopi urutan nukleotida yang menjadi target Metode amplifikasi cDNA yang digunakan System deteksi Penggunaan control dalam eksperimen. Aplikasi metode PCR in situ secara umum dapat disariakn sebagai berikut: 1. PCR in situ dengan target dapat digunakan untuk deteksi gen asing dan deteksi perubahan gen. Gen asing yang dideteksi dapat berupa hasil infeksi olehsuatu jasad misalnya bakteri, jamur, virus atau gen asing yang merupakan
37

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

hasil introduksi melalui proses transgenic, terapi gen, atau hasil transplantasi. Perubahan gen yang dapat dideteksi dengan metode PCR in situ antara lain mutasi gen, translokasi, maupun perubahan gen yang lain. 2. RT-PCR in situ dapat digunakan untuk mendeteksi ekspresi gen asing atau gen yang aras ekspresinya rendah maupun eksdpresi gen abnormal. Selain itu juga diterapkan untuk deteksi virus yang bahan genetiknya berupa RNA. Pembahasan Keberhasilan PCR sangat ditentukan oleh beberapa factor, yaitu: 1. Deoxiribonukleotida triphosphat (dNTP) 2. Oligonukleotida Primer 3. DNA template 4. Komposisi larutan buffer 5. Jumlah siklus reaksi 6. Enzim yang digunakan 7. Faktor teknis dan nonteknis lainnya, misalnya kontaminasi. Keunggulan metode PCR adalah kemampuannya dalam melipatgandakan suatu fragmen DNA sehingga dapat mencapai 109 kali lipat. 1. Jelaskan bagaimana memperbanyak vektor plasmid yang sekuen DNAnya sudah disisipi gen yang berasal dari organisme lain ?
a. Plasmid dipotong dengan enzim restriksi. Sekuen DNA yang dipotong

GAATTC
b. Bagian-bagian

plasmid yaitu replication arigin, multiple kloning,

impicilin-resistance.
c. Sekuen DNA asing disambung dengan enzim ligase

d. Bakteri E.coli ditambahkan ke dalam larutan yang berisi plasmid
e. Setelah plsamid masuk dalam bakteri E.coli, larutan ini dituangkan dalam

media pertumbuhan bakteri yang mengandung ampicilin, diinkubasi pada suhu 37oC.

38

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

f. Bakteri yang tidak mengandung plasmid dengan gen ampicilin resisten akan mati, sehingga hanya bakteri yang mengandung plasmid saja yang terus hidup. g. Bakteri memperbanyak diri, termasuk Plasmid kemudian membentuk koloni. 2. Transfer Dana dari Plasmid Agrobacerium ke Sel Tanaman (salah satu teknik untuk membuat tanaman transgenik) Agrobacterium yang mengandung plasmid yang telah disisipkan gen tertentu yang bermanfaat (misalnya tahan terhadap herbisida dsb) ditransformasikan ke sel daun dengan cara mengerat daun dengan scalpel yang telah dicelupkan ke Agrobacterium yang mengandung plasmid rekombinan. Penggunaan teknologi kultur jaringan menjadikan daun ditumbuhkan pada media yang mengandung zat pengatur tumbuh untuk merangsang tunas menjadi tanaman baru. Jika sekuen DNA rekombinan akan hidup dan menjadi tanaman transgenik, sedangkan tanaman yang tidak mengandung DNA rekombinan akan mati. Mengapa tanaman yang disemprot herbisida dapat hidup ? Pada tanaman yang hidup disimpan gen tahan terhadap herbisida melalui agrobacterium yang disisipkan Ti-Plasmid yang resisten terhadap herbisida sehingga saat agrobacterium dioles pada daun, maka gen yang resisten terhadap herbisida akan ditransfer ke daun.

39

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

PRAKTIKUM V ISOLASI DAN PENENTUAN POPULASI BAKTERI DAN JAMUR DARI RIZOSFER, FILOSFER, DAN SPERMOSFER

Pendahuluan Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran berbagai macam sel. Populasi mikroba di alam sekitar kita sangat besar dan komplek. Beratus-ratus spesies berbagai mikroba biasanya menghuni bermacam-macam bagian tubuh kita, termasuk mulut, saluran

40

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

pencernaan, dan kulit. Sebagai contoh, sekali bersin dapat menyebarkan beriburibu mikroorganisme. Satu tinja dapat mengandung jutaan bakteri (Pelczar, 1986). Bakteri tersebar sangat luas baik ditanah, air dan udara, bila hendak mengisolasi bakteri dari tanah/ benda padat yang mudah tersuspensi atau terlarut, atau zat cair lain, maka dilakukan serangkaian pengenceran (dilution series) terhadap zat tersebut. Sumber isolat dari bakteri benda yang liat atau padat, misatnya daging maka zat tersebut dihancurkan terlebih dahulu. Tehadap bakteri yang hanya terdapat dipermukaan maka pengenceran dilakukan terhadap air tempat zat tersebut dicelupkan/ direndam. Dan jika bakteri hendak diisolasi dari udara, cukup dengan membuka cawan petri yang berisi media agar steril beberapa saat. Di dalam laboratorium mikrobiologi, populasi bakteri ini dapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya. Tujuan Umum : 1. Memisahkan bakteri dan jamur yang berasal dari alam seperti air, udara, tanah, rizosfer, filosfer atau spermosfer, ataupun dari suspensi yang mengandung beberapa jenis mikroba. 2. Mengisolasi suatu isolat (genus/spesies) bakteri dan jamur. 3. Mendapatkan biakan murni, yaitu suatu kultur murni yang hanya terdiri atas satu jenis/isolat bakteri dan jamur. Teori Umum: Tanaman mikroorganisme. dan bagian tanaman Bagian tanaman tertentu merupakan habitat bagi dengan

yang

berasosiasi

spesifik

mikroorganisme tersebut antara lain filosfir, rizosfir, dan spermosfir. Definisi secara umum menurut Hiltner (1904) , rizosfir sebagai suatu volume tanah yang mengelilingi akar, dimana dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme. Rhizosfir berasal dari kata rhizo dan sphere., Rhizo adalah akar, sedangkan sphere diartikan suatu zona yang mengelilingi suatu “sentral point”

41

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

dimana menjadi tempat

aktivitas

komunitas (”sociaty”) dari beragam jenis

mikroorganisme. Definisi lain dari Rhizosphere adalah zona kontak tanah (beberapa mm) dengan akar tanaman sebagai “sentral point”, dimana antara mikroorganisme dan akar terjadi interaksi dan interelasi, artinya aktivitas mikroorganisme di dalam zona tersebut akan dipengaruhi oleh eksudat akar yang diproduksi, sebaliknya metabolisme tanaman akan dipengaruhi aktivitas mikroorganisme yang berada dalam zona tersebut. Hubungan interaksi yang menguntungkan di dalam rizosfir merupakan salah satu fenomena yang dapat dikembangkan dan dimanfaatkan untuk meningkatkan produktivitas tanaman ataupun kesuburan tanah untuk pertanian. Filosfer adalah daerah permukaan tanaman yang berhubungan langsung dengan udara atmosfer, yang meliputi daun, pucuk daun, helai bunga, dan kuntum bunga. Pengetahuan tentang komposisi kualitatif mikroflora di permukaan daun masih terbatas, jika dibandingkan dengan mikroba di rizosfer. Sejumlah hasil penelitian berhasil menjelaskan keberadaan mikroba di permukaan daun, tetapi banyak mikroba filosfer yang tidak berhasil diidentifikasi. Mikroba yang paling banyak ditemui adalah
a. bakteri:

Achromobacter,

Azorobacter,

Bacillus,

Mycobacterium,

Beijerinckia, Aerobacter dan Mycoplasma
b. Ragi: Rhodotorula, Cryptococcus, Torulopsis c. Jamur: Aureobasidium pullulans, Cladosporium herbarum, Epicoccum

nigrum. Penelitian mengenai mikroba filosfer umumnya lebih ditujukan pada mikroba patogen yang menyebabkan nekrosis di permukaan daun. Sebenarnya, filosfer banyak dihuni oleh mikroba menguntungkan seperti bakteri pemfiksasi N yang mensuplai N tersedia untuk tanaman melalui daun. Spermosfer adalah daerah yang melingkupi permukaan biji (benih) yang sedang bergerminasi. Spermosfer dikolonisasi oleh mikroba, biasanya di ujung embrio. Tergantung dari jenis tanaman, kolonisasi mikroba oleh mikroorganisme udara (airborne microorganism) dapat terjadi selama pembentukan benih. Media yang digunakan dalam perbanyakan mikroba antara lain :

42

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

 Berdasarkan “kepadatannya”, media dibagi atas: 1. 2. 3. Media cair, yaitu media yang mempunyai komposisi bahan dan nutrisi yang diperlukan tanpa bahan pemadat. Media setengah padat (semi solid), media yang diberi bahan padat 1,5% Media padat (media solid), ditambah 3%  Berdasarkan fungsinya dikenal 3 media : a. Media agar plat, yaitu media agar padat dalam petridish, digunakan untuk isolasi bakteri dan inumersi(perhitungan) jumlah/populasi bakteri. b. Media agar tegak, yaitu media agar setengah padat dalam tabung reaksi, digunakan untuk menguji gerak bakteri secara makrokopis. c. Media agar miring, yaitu media agar padat dalam tabung reaksi yang diletakan miring sehingga mempunyai permukaan media yang lebih luas dari permukaan agar tegak, digunakan untuk menumbuhkan dan menyimpan biakan murni sebagai stok biakan murni. Sedangkan isolasi bakteri dan jamur dapat dilakukan dengan tiga cara, yaitu : a. Metode Gores (streak plate method) Setelah masa inkubasi satu atau dua hari, plate agar akan ditumbuhi berbagai jenis koloni dengan pola pertumbuhan koloni sesuai alur goresan kultur. Setelah kita beda-bedakan koloni yang tumbuh berdasarkan sifatsifat koloninya, selanjutnya kita ambil koloni yang terpisah lalu pindahkan pada media nutrisi agar miring. Bila dalam plate agar terdapat tiga jenis koloni yang berbeda maka kita peroleh tiga biakan murni. b. Metode tuang (pour method) Pada cara ini kita tuangkan media nutrisi agar steril yang belum membeku (temperatur tidak lebih dari 450C, pada suhu ini agar tidak membeku dan bakteri tidak mati) kedalam petridis steril yang telah diisi suspensi bakteri yang akan diisolasi, petridish yang berisi suspensi bakteri dan nutrisi agar gerakan ke-kiri ke-kanan dan putar beberapa kali agar suspensi bakteri tersebar merata dalam media biakan membeku, kemudian inkubasi selama 24 jam dengan cara petridish diletakan terbalik.

43

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

c. Metode replika bahan tanaman Pada metode ini kita menempelkan bahan tanaman seperti daun, batang, atau benih ke atas plat agar selama 5 menit. Kemudian plat agar diinkubasi selama 1-3 hari. Setelah masa inkubasi akan terlihat tumbuh beberapa jenis koloni bakteri yang tersebar. Ambil koloni yang terpisah, tanamkan pada media nutrisi agar miring inkubasi maka akan diperoleh biakan murni.

1. Isolasi Dan Penentuan Populasi Bakteri Dan Jamur Dari Rizosfer
Dengan Metode Tuang

Tujuan Mengisolasi dan menentukan bakteri dan jamur dari rizosfer beberapa tanaman.

Teori Metode penghitungan yang digunakan pada praktikum ini adalah metode tidak langsung yang banyak digunakan untuk menentukan populasi mikroba di dalam tanah. Langkahnya diawali dengan pengenceran suspensi tanah, lalu menumbuhkan mikroba yang ada di dalam suspensi tanah di dalam plat agar. Jumlah koloni yang tumbuh menggambarkan jumlah mikroba yang terdapat di dalam suspensi sehingga satuan dalam perhitungan ini adalah CFU (Colony Forming Unit) dengan asumsi satu koloni berasal dari satu sel mikroba. Jumlah mikroba dalam gram tanah contoh (CFU/gr) dihitung dengan membagi jumlah koloni yang tumbuh dengan faktor pengenceran. Metode ini hanya menghitung bakteri hidup dan tidak selamanya satu koloni berasal dari satu sel bakteri. Selain itu, tidak semua mikroba tanah dapat tumbuh pada media yang dipakai.

44

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Prosedur Kerja Bahan dan Alat : 1. Tanah rizosfer tanaman pangan/sayur 2. Akuades steril 3. Pipet steril ukuran 1,0 dan 10 ml, tabung reaksi 18 ml, cawan petri, dan kuas 4. Media agar nutrisi (3 g beef extact, 5 g pepton, 15 g agar, dan 1 L akuades) 5. Media potato dextrose agar (PDA) (200 g kentang, 10 g dekstrosa, 15 g agar, 0,2 g CaCo3, 0,2 g Mg SO4.7H2O, dan 1 L akuades) Cara Kerja : 1. Koleksi tanah rizosfer dengan cara mengambil tanah yang menempel di perakaran dengan bantuan kuas. 2. Suspensikan 1 gram tanah ke dalam 9 mL akuades sehingga didapat suspense tanah dengan pengenceran 10ˉ1. Kocok selama lima menit dan biarkan selama 15 menit. 3. Kemudian ambil sebanyak 1 mL suspense tanah dari pengenceran pertama 10ˉ1 dan pidahkan ke dalam tabung yang berisi 9 mL akuades. Kocok sampai merata. 4. Lanjutkan pengenceran sampai 10ˉ7. 5. Dari pengenceran 10ˉ6 dan 10ˉ7 ambil masing-masing 0,5 mL suspensi kemudian masukan ke dalam cawan petri. Tuangkan 15 mL media agar nutrisi. Goyangkan cawan petri agar suspensi dan media tercampur homogen.

45

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

6. Dari pengenceran 10ˉ3 dan 10ˉ4 ambil masing-masing 0,5 mL suspensi kemudian masukan ke dalam cawan petri. Tuangkan 15 mL media PDA untuk penghitungan jamur. Goyangkan cawan petri agar suspensi dan media tercampur homogen. 7. Inkubasi selama 24 jam. Amati koloni yang tumbuh dan ambil koloni yang terpisah, tanamkan pada nutrisi agar miring 8. Tentukan isolat bakteri/jamur yang tumbuh berdasarkan karakteristik koloni. 9. Hitung koloni tersebut di permukaan atau sedikit di bawah permukaan media. Jumlah yang memenuhi syarat adalah 30-300 CFU/plat agar.

Hasil dan Pengamatan

Koloni Bakteri

Perhitungan : Jumlah bakteri/gram tanah = rata-rata koloni Pengenceran = 5
46

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

10ˉ6 = 5 x 106 CFU/gram Jumlah jamur/gram tanah = rata-rata koloni Pengenceran = 18 10ˉ3 = 18 x 103CFU/gram

Pembahasan Teknik metode tuang memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak begitu banyak mengandung oksigen. Sehingga hasilnya berbeda dengan metode gores. Kesimpulan • Perbanyakan bakteri pada metode tuang memiliki nilai CFU per gram lebih besar daripada perbanyakan jamur

2. Isolasi Bakteri Dan Jamur Dari Suspensi Campuran Dengan Metode
Gores Tujuan Mengisolasi dan memperoleh biakan murni bakteri dan jamur dari rizosfer beberapa jenis tanaman.

47

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Prosedur Kerja Alat dan Bahan :

1. Suspensi tanaha dengan pengenceran 10ˉ2 2. Media NA dan PDA 3. Ose, petridish, lampu spiritus 4. Media agar miring NA dan PDA
Cara Kerja : 1. Tuangkan 10 mL media NA yang masih mencair ke dalam petridish (lakukan secara aseptik) biarkan membeku 2. Lakukan prosedur yang sama dengan media PDA 3. Ambil satu ose suspensi tanah, buatlah goresan-goresan pada pemukaan plat agar NA dan PDA dengan simple sreak 4. Inkubasikan selam 24-48 jam sampai koloni bakteri dan jamur tumbuh. Amati koloni yang tumbuh dengan asumsi setiap koloni yang terpisah adalah satu isolat. 5. Ambil isolat menenggunakan ose kemudian tanamkan pada agar miring NA untuk bakteri dan PDA untuk jamur. Penanaman dilakukan dengan membuat goresan sebanyak mungkin di permukaan agar miring. 6. Inkubasikan selama 24 jam.

Hasil dan Pengamatan :

48

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Koloni Bakteri

Perhitungan : Jumlah bakteri/gram tanah = rata-rata koloni Pengenceran = 45 10ˉ6 = 45 x 106 CFU/gram Jumlah jamur/gram tanah = rata-rata koloni Pengenceran = 6 10ˉ3 = 6 x 103CFU/gram

49

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Pembahasan Perbanyakan mikroba dengan menggunakan metode gores bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru. Metode ini berbeda dengan metode tuang karena tidak menghomogenkan mikroba dengan media perbanyakannya. Namun, berdasarkan hasil praktikum didapatkan bahwa perbanyakan bakteri menghasilkan isolate lebih banyak daripada perbanyakan jamur. Hal pertama yang mungkin terjadi yaitu kemampuan perkembangbiakan dari bakteri itu sendiri yang lebih cepat daripada jamur.

Kesimpulan • Perbanyakan bakteri pada metode gores menghasilkan lebih banyak isolat daripada perbanyakan jamur • Eksudat akar dianalisis merupakan salah satu faktor yang menyebabkan daerah rhizosfer lebih banyak dihuni mikroba daripada daerah yang lain

3. Isolasi Bakteri Dan Jamur Dari Filosfer Dan Spermosfer Dengan Metode
Replika Tujuan Memperoleh atau membuat biakan murni bakteri dan jamur dari filosfer dan spermosfer beberapa jenis tanaman

Prosedur Kerja Alat dan Bahan : 1. Daun dan biji tanaman yang masih segar

50

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

2. Media NA dan PDA 3. Pinset, petridish, ose, dan lampu spiritus Cara Kerja : 1. Tuangkan 10 mL media NA untuk bakteri dan PDA untuk jamur yang masih cair ke dalam petridish (lakukan secara aseptik). Biarkan membeku. 2. Ambil selembar daun atau potongan daun dan satu biji benih, letakkan berdampingan di permukaan agar. 3. Tekan permukaan daun dan biji, tutup kembali petridish dan diamkan selama 5 menit. 4. Angkat daun dan biji kemudian tutup kembali petridish. 5. Inkubasikan selama 1-2 hari dengan posisi tutup petridish berada di bagian bawah. 6. Amati pertumbuhan bakteri di permukaan agar, isolate bakteri diisolasikan dari koloni yang terpisah.

Hasil dan Pengamatan : Perhitungan : Pada Daun Jumlah bakteri/gram tanah = rata-rata koloni Pengenceran = 2 10ˉ6 = 2 x 106 CFU/gram Jumlah jamur/gram tanah = rata-rata koloni
51

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Pengenceran = 5 10ˉ3 = 5 x 103CFU/gram

Pada Biji Jumlah bakteri/gram tanah = rata-rata koloni Pengenceran = 7 10ˉ6 = 7 x 106 CFU/gram Jumlah jamur/gram tanah = rata-rata koloni Pengenceran = 6 10ˉ3 = 6 x 103CFU/gram Pembahasan Substansi di rizosfer berasal dari sel akar mati (sloughing off cells) dan senyawa eksudat akar yang disebut musilas (mucilage). Musilase dapat dihasilkan dari mikroorganisme dan tanaman. Musilase tanaman diproduksi di tudung akar umumnya berupa polisakarida, adanya mucilage menyebabkan dinding sel epidermis menjadi seperti gelatin. Musilase merupakan sisi dimana terjadi pelekatan mikroorganisme dan terbentuk agregat tanah. Komposisi jenis

52

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

karbohidart musilase berbeda untuk setiap jenis tanaman, demikian juga komposisi eksudat akar beragam untuk setiap kondisi dan jenis tanaman. Eksudat tersebut mengandung sejumlah bahan terlarut di dalam air. Pertumbuhan mikroba yang cepat di rizosfer menunjukkan bahwa daerah ini kaya akan substrat untuk pertumbuhan mikroba dan bahwa substrat yang dihasilkan akar tanaman selalu berada dalam keseimbangan untuk tetap menjaga suplai makanan yang diperlukan mikroba.

Kesimpulan • Jumlah mikroba yang terdapat pada rizosfir lebih banyak daripada mikroba yang terdapat di spermosfer dan filosfer • Ada beberapa faktor yang mempengaruhi perbedaan jumlah mikroba yang terdapat pada zona tersebut seperti eksudat akar (baik tipe ataupun jumlahnya), spesies tanaman, kondisi fisiologis tanaman (umur, status nutrisi) dan kondisi abiotik (suhu, struktur tanah, aerasi, kadar air). PRAKTIKUM VI UJI METABOLISME BAKTERI FOTOSINTETIK PADA KONDISI GELAP DAN TERANG

Pendahuluan Mikroorganisme merupakan salah satu makhluk hidup yang hanya dapat dilihat dengan bantuan mikroskop. Karena ukurannya yang sangat kecil, maka sukar sekali untuk menghitung mikroorganisme. Oleh sebab itu, praktikan harus mengetahui cara-cara untuk melakukan perhitungan mikroorganisme dengan metode-metode tertentu, yaitu metode ALT (Angka Lempeng Total), MPN (Most Probable Number), dan metode Turbidimetri.

53

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Langkah pertama yang harus dilakukan adalah melakukan pengenceran dan setelah itu ditambahkan dengan medium yang sesuai dan kemudian diinkubasikan. Setelah jangka waktu tertentu, diamati hasil pertumbuhan mikroba dan kemudian dihitung jumlah mikroorganisme dengan menggunakan metodemetode yang telah ditentukan.

Tujuan : 1. Membandingkan populasi cyanobakteri (bakteri fotosintesis) yang ditumbuhkan pada kondisi tanpa dan dengan sinar matahari. 2. Membandingkan morfologi mikroskopis cyanobakteri yang tumbuh pada kondisi gelap dan terang.

Teori Dasar: Tipe metabolism fotoautotrof terdapat pada cyanobakteri yang memiliki pigmen klorofil untuk menangkap energi cahaya dalam bentuk foton. Pada tipe metabolisme ini, bakteri memfiksasi CO2 menjadi C6H12O6 melalui proses fotosintesis. Berbeda dengan tanaman tinggi, fotosintesis bakteri hijau hanya berlangsung dalam satu tahap fotosistem. Di daerah tropis beberapa cyanobakteri hidup di permukaan tanah yang lembab dan di tanah sawah dengan itensitas cahaya tinggi. Populasi terbanyak terdapat di lapisan tanah dekat permukaan tanah lembab. Cyanobakteri dianggap penting karena dianggap sebagai produsen makanan melalui fotosintesis dan beberapa spesies dapat memfiksasi nitrogen di udara. Metode untuk menentukan kemampuan proliferasi bakteri hijau adalah penghitungan tidak langsung untuk menduga populasi cyanobakteri adalah metode Most Probable Number. Pada metode ini suspense tanah diencerkan dan ditumbuhkan pada media cair yang selektif sehingga hanya alga yang bersifat fotosintetik yang dapat tumbuh selama inkubasi di tempat yang mendapat cahaya.

54

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Prosedur Kerja Bahan dan Alat : 1. Contoh tanah sawah segar dari lapisan aerob (0-5 cm dari permukaan tanah) 2. Akuades 3. Pipet 1 mL dan 10 mL, 30 tabung reaksi 100 mL, gelas objek dan cover glass
4. Medium gerlof dengan N untuk menghitung cyanobakteri total

Cara Kerja :
1. Buat pengenceran tanah sampai 10ˉ6 2. Pindahkan dari pengenceran 10ˉ1, 10ˉ2, dan 10ˉ3 masing-masing 0,5 mL ke

dalam 5 buah tabung reaksi yang berisi 5 mL media cair gerlof 3. Susun ke 15 tabung di rak sesuai dengan pengencerannya
4. Buat dua seri kultur inkubasikan satu seri di tempat gelap dan lainnya di

tempat terang selama 2 minggu 5. Amati pertumbuhan cyanobakteri dengan mengidentifikasi warna hijau di dalam larutan atau di dasar dan di permukaan larutan
6. Catat jumlah tabung pertumbuhan positif dari setiap derat pengenceran

10ˉ1, 10ˉ2, dan 10ˉ3. Ambil beberapa tetes larutan dari tabung yang menunjukan pertumbuhan, pindahkan ke gelas objek dan amati morfologi cyanobakteri Metode MPN :
1. Hitung dan catat jumlah tabung pada setiap pengenceran yang menunjukan

terjadinya pertumbuhan alga

55

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008 2. Bandingkan dengan tabel probabilitas. Catat bahwa daftar kolom sebagai

kode yang terdiri atas 3 buah angka. Angka tersebut menunjukan jumlah nilai positif (tabung yang menunjukan pertumbuhan cyanobakteri) pada setiap pengenceran 3x berturut-turut. Misalnya terdapat 4 tabung positif pada pengenceran 10ˉ1, 4 pada 10ˉ2, dan 1 tabung pada 10ˉ3, maka kodenya adalah 4-4-1
3. Kode berhubungan dengan nilai 40 pada tabel probabilatas. Nilai ini

merupakan nilai MPN untuk mikroba pada pengenceran kedua (dalam contoh ini adalah 10ˉ2) yang ditentukan menurut teori probabilitas tertentu
4. Berdasarkan tabel tersebut maka MPN untuk alga dalam satu mL

pengenceran 10ˉ2 adalah 40 sehingga MPN cyanobakteri/gram tanah asal adalah : 100 x 40 = 400 MPN/gram

Hasil dan Pengamatan :

Bakteri yang ditempatkan di daerah terang setelah satu minggu

56

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

bakteri yang ditempatkan ditempat gelap setelah satu minggu

Setelah praktikum dilaksanakan dan ditunggu selama satu minggu terlihat perbedaan yang cukup jelas antara tabung yang ditempatkan pada daerah terang dan tabung yang ditempatkan didaerah gelap. Dalam satu minggu tabung yang ditempatkan ditempatkan di daerah terang terutama pada pengenceran 10-1 telah menunjukkan adanya pertumbuhan cyanobakteri pada seluruh tabung, begitu pula pada pengenceran 10-2. Sedangkan tabung pada pengenceran 10-3 belum menunjukkan perubahan warna. Seluruh tabung yang ditempatkan di daerah gelap tidak menunjukkan adanya perubahan baik pada pengenceran 10-1, 10-2, ataupun 10-3. Setelah dua minggu, tabung yang ditempatkan di daerah terang seluruhnya telah berubah warna menjadi kehijauan baik pada pengenceran 10-1, 10-2, dan 10-3. Sedangkan seluruh tabung yang ditempatkan di daerah gelap seluruhnya tidak mengalami kehijauan. Jumlah tabung positif pada setiap pengenceran

57

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Cahaya Terang Gelap

Tabung positif pada pengenceran 10-1 10-2 10-3 5 5 5 0 0 0

MPN pada minggu kedua : • Kondisi Terang 5-5-5 = 1600 MPN cyanobakteri/gram tanah asal adalah : 100 x 1600 = 16 x 104 MPN/gram • Kondisi Gelap 0-0-0= 1,8 MPN cyanobakteri/gram tanah asal adalah : 100 x 1,8 = 1,8 x 102 MPN/gram
Morfologi sianobakteri di tempat terang Morfologi sianobakteri di tempat gelap

Tidak tumbuh sianobakteri karena pigmen bakteri ini bersifat fotoautotrof fotosintetik klorofil a, karotenoid, sehingga apabila tidak ada cahaya dan fikobiliprotein dan dapat maka bakteri tidak akan tumbuh. Sianobakteri memiliki melakukan fotosintesis oksigenik. Secara morfologi, sianobakter dapat dikelompokkan ke dalam spesiesspesies uniselular.

58

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Pembahasan Kloroplas dan cyanobakteri telah menggabungkan beberapa reaksi cahaya dari bakteri fotosintesis berwarna ungu dan bakteri fotosintesis hijau, yang terjadi secara berangkai, sehingga kedua reaksi cahaya itu menghasilkan energi bagi suatu elektron tunggal yang memberi energi bagi sintetis ATP, dan mengubah NADP+. Konsentrasi juga mempengaruhi perubahan warna yang terjadi. Kemungkinan hal ini disebabkan perbedaan kuantitas bakteri (dalam hal ini cyanobakteri) pada tiap tabung. Perubahan warna yang terjadi pada cyanobakteri membutuhkan hijau yang saat energi berfungsi praktikum sehingga untuk dilaksanakan terjadi karena bakteri menghasilkan suatu zat berwarna fotosintesis. Zat tersebut dihasilkan oleh selaput-selaput fotosintetis. Selaput-selaput fotosintetis pada sianobakteri sesungguhnya merupakan selaput intraselular, yang membatasi sac (kantung), disebut tilakoid, yang memiliki pusat-pusat reaksi maupun kompleks pemanen cahaya yang disebut phycobilisome. Phycobilisome ini merupakan granula yang banyak, menutupi tilakoid dan menempel di PS II. Phycobilisome ini terdiri dari protein-protein yang disebut phycobiliprotein, yang menyerap cahaya pada kisaran 450-660 nm, bergantung pada bukaan-rantai tetrapyrrole (phycobilin) yang secara bersamaan terikat pada protein melalui jalinan thioether ke residu sistein di phyco-biliprotein. Penelitian tentang fotosintesis yang dilakukan dengan alga (ganggang) oleh Emerson, mengamati bahwa efisiensi fotosintesis yang diukur sebagai mol oksigen yang dikembangkan per einstein yang diserap (yakni quantum yield/hasil quantum) cukup tinggi, melebihi panjang gelombang yang diserap oleh klorofil dan pigmen pemanen cahaya, namun jatuh secara drastis pada 685 nm; meskipun

59

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

pada faktanya, klorofil itu dapat terus menyerap cahaya antara 680-700 nm. Hal ini kemudian diketahui sebagai efek dari “red-drop” karena cahaya 700 nm itu adalah red (berwarna merah). Terdapat dua pusat reaksi, pertama yang memperoleh energi dengan cahaya pada panjang gelombang sekitar 700 nm yang disebut Pusat Reaksi I; dan kedua yang memperoleh energi dengan panjang gelombang cahaya yang lebih pendek, disebut Pusat Reaksi II. Kedua hal itu juga disebut fotosistem I dan II.

Kesimpulan • Bakteri fotosintetik seperti cyanobakteri dapat tumbuh baik di lingkungan terang daripada dilingkungan gelap.
• Konsentrasi mempengaruhi perubahan warna pada tiap tabung akibat

perbedaan kuantitas bakteri (dalam hal ini cyanobakteri). • Cyanobakteri fotosintetik melakukan fotosintesis untuk menghasilkan energi. Hal ini terlihat dengan adanya perubahan warna pada tabung percobaan menjadi kehijauan.

60

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

PRAKTIKUM VII PERBANYAKAN BAKTERI DAN JAMUR

Pendahuluan Produk-produk berbasis mikroba seperti biofertilizer, biokontrol,

biopestisida, biodekomposer, ataupun produk biomassa mikroba memerlukan fermentor untuk memproduksinya. Fermentor untuk memproduksi mikroba ini tidak harus berteknologi tinggi. Fermentor dapat dibuat dengan peralatan sederhana, namun fungsional. Bahkan bisa dibuat sendiri dengan biaya yang terjangkau. Sedangkan untuk perhitungan biasanya menggunakan plate count / viable count yang didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang
61

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

tumbuh

dihitung

dan

merupakan

perkiraan

atau

dugaan

dari

jumlah

mikroorganisme dalam suspensi tersebut. Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel mikroorganisme karena beberapa mikroorganisme tertentu cenderung membentuk kelompok atau berantai. Berdasarkan hal tersebut digunakan istilah Coloni Forming Units (CFU’s) per ml. koloni yang tumbuh berasal dari suspensi yang diperoleh menggunakan pengenceran bertingkat dari sebuah sampel yang ingin diketahui jumlah bakterinya. Tujuan Praktikum ini bertujuan untuk memproduksi inokulan bakteri dan jamur. Teori Umum Untuk dapat digunakan sebagai pupuk hayati ataupun sebagai bahan penelitian, bakteri dan jamur harus dioerbanyak dalam volume yang relatif besar. Penggunaan fermentor sudah lazim dilakukan untuk perbayakan sel bakteri dan jamur dengan tujuan untuk produksi inokulan. Pada prinsipnya perbanyakan bakteri dan jamur adalah menumbuhkan mikroba tersebut di dalam media zat cair selektif. Untuk memperbanyak bakteri heterotrof umumnya digunakan media nutrisi Azotobacter chrococcum digunakan untuk media Ashby bebas N karena bakteri ini dapat memfiksasi N2 dari udara. Jumlah biakan murni yang ditambahkan, komposisi media, kondisi fisik, dan lama inkubasi akan berpengaruh terhadap pertumbuhan sel dan akhirnya konsentrasi bakteri/jamur di dalam inokulan cair. Kualitas inokulan selain ditentukan oleh metabolit sekunder di dalamnya, juga sangat ditentukan oleh populasi bakteri/jamurnya. Populasi bakteri diukur berdasarkan jumlah Colony Forming Unit (CFU) per mL inokulan sedangkan jamur diukur berdasarkan jumlah spora per mL inokulan.

7.1 Tujuan

Perbanyakan Bakteri

62

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

1. 2.

Meproduksi inokulamn bakteri pada fermentor Menentukan populasi bakteri di dalam inokulan

Prosedur Kerja Alat dan Bahan :
1. Biakan murni Sarcina lutea berumur 72 jam

2. 3. 4. 5. 6. 7.

Media cair Nutrisi steril sebanyak 500 mL Alkohol 70% Ose Lampu spiritus Tabung reaksi untuk pengenceran Fermentor 2,5 L dilengkapi dengan pengaduk pada suhu kamar.

c. Cara kerja 1. Masing-masing sebanyak 10 Ml akuades steril ditambahkan ke dalam 2 agar miring biakan murni bakteri. Keruk dengan ose permukaan koloni dan kocok dengan vortex sehingga didapatkan suspensi jamur. 2. 3. Sterilkan fermentor dengan alkohol 70%. Masukkan 1L media nutrisi cair steril ke dalam tabung fermentor yang telah disterilkan (sterilkan memakai alkohol), tambahkan suspensi bakteri sehingga didapatkan konsentrasi inokulan sebesar 5% (mL). Pasang tutup fermentor dengan pengaduk. Set kecepatan pengaduk (kecepatan pengaduk 120 Rpm selama 10 menit).

63

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

4. 5.

Inkubasikan selama 72 jam pada suhu kamar. Ambil sampel dari pipa di dasar tabung fermentor.

6. Lakukan pengenceran (menggunakan aquadest 9 mL) sampai 10-8 7. Tuangkan 0.5 mL sampel dengan pengenceran 10-8 ke dalam cawan petri

steril dan tambahkan 15 mL media nutrisi agar (NA) pada suhu 450C. Lakukan duplo (duplo). Inkubasikan kultur di inkubator pada suhu 300C selama 1-2 hari sampai terbentuk koloni bakteri. 8. Hitung jumlah koloni di setiap plat agar.

7. 2 Perbanyakan Jamur Tujuan 1. 2. Memroduksi inokulan jamur pada fermentor Menentukan populasi jamur di dalam inokulan

Prosedur Kerja Alat dan Bahan :
1. Biakan murni Trichoderma sp. berumur 72 jam

2. 3. 4. 5. 6. 7.

Media cari PDA Alkohol 70% Ose Lampu spiritus Tabung reaksi untuk pengenceran Fermentor 2,5 L dilengkapi dengan pengaduk (suhu kamar)

a. Cara kerja

64

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

1.

Masing-masing sebanyak 10 mL aquades steril ditambahkan ke dalam agar miring biakan murni jamur. Keruk dengan ose permukaan koloni dan kocok dengan vortex sehingga didapatkan suspensi jamur.

2. 3.

Masukkan masing-masing 1L media Ashby cair ke dalam dua tabung fermentor yang telah disterilkan dengan alkohol 70%. Ke dalam fermentor tersebut ditambahkan 20 mL suspensi jamur sehingga didapatkan konsentrasi inokulan sebesar 4%. Pasang tutup dengan pengaduk. Atur kecepatan pengaduk (kecepatan pengaduk 120 Rpm selama 10 menit).

4. 5.

Inkubasikan selama 72 jam pada suhu kamar. Ambil sampel dari pipa di dasar tabung fermentor.

6. Lakukan pengenceran dari 1 mL sampel sampai 10-6. 7. Hitung populasi jamur di dalam suspensi pengenceran 10-6 dengan metode

pengenceran plat pada media PDA.
8. Lakukan duplo (dua kali). Inkubasikan kultur di inkubator pada suhu 30 0C

selama 1-2 hari sampai terbentuk koloni jamur. 9. Hitung jumlah koloni di setiap plat agar.

7.3 Hasil Pengamatan dan Pembahasan Genus / Spesies Bakteri : Sarcina sp. Jumlah koloni Plat agar 1 Plat agar 2 Populasi bakteri di dalam inokulan

65

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

X0 : 136 Xt : 84

X0 : Tak terhingga Xt : 92

X0 : dikali 1.000 Xt : dikali 100.000.000

Genus / Spesies Jamur : Trichoderma sp. Jumlah Koloni Plat agar 1 Xo: Tak hingga Xt: 2 Plat agar 2 Xo: Tak hingga Xt: 6 Populasi jamur di dalam inokulan Xo: Tak hingga Xt: (2+6)/2=4

Trichoderma

Sarchina lutea

Pembahasan Pembiakan mikroba dalam laboraturium memerlukan medium yang berisi zat hara serta lingkungan pertumbuhan yang sesuai dengan mikroorganisme. Setelah medium biakan disiapkan, harus disterilkan lebih dahulu sebelum digunakan untuk membiakkan mikroba. Bila medium biakan yang disiapkan tidak disterilkan, mikroba pencemar akan tumbuh menyebabkan kekeruhan medium.
66

Nama : Wulan Feitriani NPM : 150110080191 Agroteknologi-E 2008

Adanya mikroba pencemar menyebabkan kita tidak dapat mengetahui apakah perubahan yang terjadi dalam medium disebabkan mikroba yang tumbuh ataukah oleh mikroba pencemar. Perbedaan sifat – sifat mikroba terhadap induk semangnya akan berpengaruh terhadap medium apa yang akan dipakai. Populasi jamur diukur berdasarkan jumlah spora per ml inokulan.

Kesimpulan • • Perbanyakan bakteri dapat dilakukan dengan waktu yang lebih singkat apabila di bandingkan dengan perbanyakan jamur Dalam perbanyakan mikroba medium mempengaruhi perkembangan mikroba

67

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->