METODE POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Oleh :
Hary Krettiawan
C15109201

I.1Latar Belakang
Penyakit merupakan faktor pembatas dalam kegiatan budidaya perikanan.
Kerugian yang ditimbulkan kerapkali sangat besar. Penyakit dapat menyebabkan
kematian, kekerdilan, periode pemeliharaan lebih lama, tingginya konversi pakan,
padat penebaran rendah dan turunnya tingkat produksi. Penyakit dapat disebabkan
oleh organisme patogen seperti protozoa, bakteri, jamur dan virus.
Adanya hama di dalam tambak sangat merugikan bagi para pembudi daya
dan spesies itu sendiri. Untuk itu para pembudi daya juga perlu memahami lebih
dalam jenis – jenis hama yang dapat mengganggu, merusak bahkan memangsa
spesies yang di budi dayakan. Dengan di ketahuinya jenis – jenis hama tersebut
maka pembudi daya dapat mencegahnya atau memberantasnya dengan memberi
obat sesuai dengan jenis hama yang di ketahui. Begitu pula dengan penyakit, yang
sangat merugikan sekali bagi pembudi daya karena adanya suatu penyakit dapat
menyebabkan ikan / udang mati secara mendadak dalam jangka waktu yang
singkat.
penyebab penyakit bakterial di dalam industri udang, didominasi oleh bakteri
golongan Vibrio. Penyakit udang berpendar atau lebih dikenal vibriosis
merupakan penyakit yang umumnya menyerang hewan laut seperti ikan, udang,
dan kerang-kerangan. Pada udang bakteri Vibrio menyerang secara sekunder
yaitu pada saat dalam keadaan stress dan lemah, oleh karena itu sering
dikatakan bahwa bakteri ini termasuk jenis opportunistic patogen.
Pengujian keberadaan bakteri patogen sangat diperlukan sebelum mewabah
dan menyebabkan kerugian yang makin besar. Metoda pendeteksian bakteri
patogen biasanya menggunakan metode penumbuhan mikroba yang kemudian
diamati keberadaan bakteri penyebab penyakitnya. Namun lamanya waktu
pengerjaan menjadi masalah tersendiri, sehingga perlu penggunaan metode
deteksi yang lebih cepat dan akurat.
Metode pendektesian cepat dengan menggunakan teknik PCR mampu
menghasilkan analisa keberadaan bakteri patogen lebih cepat dibandingkan
dengan metode cawan . Hasil yang diperoleh pun lebih akurat karena level
deteksinya adalah DNA spesifik dari bakteri patogen tersebut.
PCR merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA
secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, orang dapat
menghasilkan DNA dalam jumlah besar dalam waktu singkat sehingga
memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis
oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun
1994 berkat temuannya tersebut.

II. METODOLOGI

II.1 Alat dan Bahan

Peralatan yang digunakan adalah sentrifuse, mesin thermo cycle,
elektroforesis set, mikro pipet ukuran 1000µ, 200µ dan 10µ beserta tipnya,
effendrof, . Sedangkan bahan uji yang digunakan adalah udang stadia PL3,
uropoda, insang, hepatopankreas, kaki renang dan genom bakteri vibrio asal
Sulawesi.
Bahan-bahan yang digunakan adalah regent-reagent yang digunakan untuk
proses ekstraksi DNA antara lain EDTA, SDS, Proteinase-K, NaCl 5 M, CTAB,
phenol-chlorofom-isoamilalkohol, chloroform-isosmilslkohol dan isopropanol.
Sedangkan bahan yang digunakan pada proses PCR adalah master mix, primer,
kontrol positif, kontrol negatif dan mix kontrol.

II.2 Prosedur Kerja

Tahapan yang dilakukan untuk mendeteksi penyakit vibriosis dengan metode
PCR terdiri dari tiga tahapan. Tahapan pertama yaitu ekstraksi DNA, perbanyakan
genom yang telah diekstraksi dengan mesin thermo cycle. Selanjutnya tahapan
terakhir yaitu pembacaan hasil dari ekspresi genom yang telah teramplifikasi
dengan metode elektroforesis dan difoto secara digital. Tahapan tersebut
dijelaskan sebagai berikut.

II.2.1Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA diambil dari sampel dengan berat 50-150 mg yang direndam
dengan 250µl Buffer TE. Selnjutnya sampel diinkubasi selama 1-3 jam dengan
suhu 55˚C pada larutan yang terdiri dari 500µl Buffer lysis, 20µl proteinase-K dan
40µl SDS 10%. Setelah inkubasi ditambahkan 12.5µl RNAase dan selanjutnya
diinkubasi pada suhu ruang selama 15-30 menit. Setelah diinkubasi ditambahkan
PCIA dengan perbandingan larutan 25:24:1 kemudian divorteks secara manual
sampai homogen dan dinkubasikan kembali pada suhu ruang selama 10 menit.
Selanjutnya disentrifuse pada kecepatan13.000 rpm selama 8 menit. Supernatant
yang terbentuk kemudian diambil dan dipindahkan ke tabung effendrof yang baru
kemudian dicampur dengan 300µl larutan CIA dengan perbandingan 24:1
kemudian disentrifuse lagi pada kecepatan 13.000 rpm selama 4 menit.
Supernatant teratas diambil dan dipindahkan ke effendrof baru sebanyak 200µl
kemudian dicampur dengan 400µl ethanol absolute dingin dan dihomogenkan.
Selanjutnya disentrifuse dengan kecepatan 6000 rpm selama 30 menit.
Supernatant yang terbentuk dibuang dan pellet dibilas dengan 1ml etanol 70%
kemudian disentrifuse kembali pada kecepatan 6000 rpm selama 15 menit. Pellet
yang terbentuk dikeringanginkan selanjutnya disimpan pada suhu -20˚C setelah
dilarutkan dengan 100µl Buffer TE.

II.2.2Amplifikasi Genom
Persiapan awal sebelum mengamplifikasi genom adalah pembuatan master
mix (MM). Volume MM yang dibuat disesuaikan dengan jumlah sampel
ditambah dengan kontrol. Karena jumlah sampel dan kontrol ada 9 maka tiap-tiap
bahan penyusun MM dikalikan 9. Akan tetapi pada praktikum ini jumlah total
MM merupakan hasil kali dari 9 sampel + 1 cadangan sehingga faktor pengkali
MM adalah 10. Hal ini bertujuan untuk menghindari kekurangan MM pada saat
proses pipetting. Setelah MM siap, masukkan template sebanyak 0,5µl ke dalam
tabung PCR yang telah diberi kode dan diisi dengan MM masing-masing 24,3
µl/tabung. Setelah semuanya siap, masing-masing tabung dimasukkan pada mesin
PCR yang telah diatur suhunya sesuai dengan primer yang digunakan.

II.2.3 Pembacaan Hasil PCR dengan Elektroforesis Gel Agarosa

Setelah proses PCR selesai selanjutnya dilakukan pembacaan hasil dengan
eletroforesis gel agarosa. Sebelum melakukan elektroforesis tahapan awal yang
dilakukan adalah membuat gel agarosa itu sendiri. Pembuatannya dilakukan
dengan cara melarutkan agarosa dalam larutan TBE (Tris base, Boric acid,
EDTA) atau TAE (Tris base, Glacial acetic acid, EDTA) yang dipanaskan sampai
mendidih selama 1.5 menit dan larutan hasil menjadi bening. Setelah suhu agar
turun (50-60˚C) kemudian dicetak dengan cetakan khusus yang dilengkapi sisir
sebagai cetakan sumur elektroforesis. Selanjutnya gel dibiarkan beku, kemudian
dimasukkan ke dalam bak elektroforesis yang telah berisi larutan buffer
elektroforesis. Tahapan kedua pada persiapan awal elektroforesis adalah membuat
pemberat atau loading dye (LD). Bahan pemberat ini terdiri dari bahan pemberat
DNA dan pewarna (bromphenol blue, xylene cyanol, gliserol dan EDTA).
Selanjutnya sampel DNA uji dicampur dengan 2-5µl LD kemudian
dihomogenkan dan dimasukkan pada sumur elektroforesis. Setelah sumur terisi
dengan sampel dan kontrol, marker DNA disisipkan pada sumur pertama.
Kemudian bak elektroforesis dialirkan dengan listrik yang bertegangan 250 volt
dengan kuat arus antara 80-100 mA. Proses elektroforesis dihentikan apabila ¾
bagian dari panjang gel DNA bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif.
Setelah itu gel diangkat dan diamati dengan menggunakan ultraviolet
transluminator dengan panjang gelombang pendek yaitu 280nm. Dokumentasi
dilakukan dengan kamera yang telah terhubung komputer.
 Menurut Chainulfiffah. A, D. S. Retnoningrum. (2003), Teknik sintesis dan
amplifikasi fragmen DNA secara in vitro yang dikenal dengan Polymerase chain
reaction (PCR) merupakan salah satu metode untuk mengidentifikasi penyakit
infeksi yang baru-baru ini banyak dikembangkan. Metode ini digunakan untuk
mengatasi kelemahan metode diagnosis konvensional seperti imunologi dan
mikrobiologi.
Teknik PCR didasarkan pada amplifikasi fragmen DNA spesifik dimana
terjadi penggandaan jumlah molekul DNA pada setiap siklusnya secara
eksponensial dalam waktu yang relatif singkat. Teknik ini sangat ideal untuk
mengidentifikasi patogen dengan cepat dan akurat. Secara umum proses ini dapat
dikelompokkan dalam tiga tahap yang berurutan yaitu denaturasi templat,
annealing (penempelan) pasangan primer pada untai tunggal DNA target dan
extension (pemanjangan atau polimerisasi), sehingga diperoleh amplifikasi DNA
antara 106-109 kali (Retnoningrum 1997).

PCR terdiri atas beberapa siklus yang berulang-ulang, biasanya 20 sampai 40

siklus. Pada setiap siklus DNA polymerase akan menggandakan DNA sebanyak 2
kali, maka secara matematis salinan utas ganda DNA yang akan dihasilkan setelah
30 siklus adalah 2 pangkat 30 yaitu 1.073.741.824 kali, seperti terlihat pada
gambar 2.

Gambar 2. Siklus berulang pada proses PCR (Sumber:

http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrcopies.gif)
 Setiap siklus terdiri dari tiga tahap seperti tersaji pada gambar 3, yaitu :
Pertama, tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Berlangsung pada suhu tinggi,
94–96°C yang menyebabkan ikatan hidrogen DNA terputus atau denaturasi dan
DNA menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini
dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA
terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi templat
("patokan") bagi primer. Durasi tahap ini 1–2 menit. Tahap Kedua, penempelan
atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA templat yang komplementer
urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 45–60°C. Penempelan ini bersifat
spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau
primer menempel di sembarang tempat. Sedangkan tahap ketiga yaitu tahap
pemanjangan atau elongasi. Enzim yang berperan adalah Taq-polimerase, proses
ini biasanya dilakukan pada suhu 76°C selama 1 menit. Setelah tahap 3, siklus
diulang kembali mulai tahap 1.

Gambar 3. Proses denaturasi, anneling dan ekstensi atau elongasi

 Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah-
langkah kerja analisis DNA sequencing. Metode ekstraksi yang digunakan adalah
metode fenol/khloroform/isoamilalkohol. Metode tersebut mampu menghasilkan
lapisan air yang mengandung asam nukleat dan lapisan antara fenol sedangkan air
yang berisi protein penghambat dan polimer (termasuk karbohidrat), dan lapisan
khloroform-isoamilalkohol yang mengikat lemak. mengalami presipitasi
Kemungkinan-kemungkinan yang menyebabkan hasil tidak memuaskan
adalah :
1. Penempelan primer pada temperatur rendah.
Penempelan primer yang terjadi pada temperature rendah tidak spesifik
sehingga akan menghasilkan amplifikasi dengan spesifisitas rendah.
Spesifisitas rendah juga menurunkan sensitifitas karena adanya kompetisi
antara produk spesifik dan nonspesifik (Retnoningrum 1997).

2. Konsentrasi primer yang terlalu tinggi dapat terjadi mispriming yang

mengakibatkan meningkatnya jumlah produk non spesifik. Jika
konsentrasi primer terlalu rendah, hasil dari produk PCR akan rendah.
3. DNA templat yang dipersiapkan pada percobaan mengandung SDS yang
mampu menghambat kinerja enzim Taq DNA polimerase sehingga dapat
menurunkan efisiensi PCR. Untuk itu perlu presipitasi dengan etanol
sekaligus untuk pemekatan kromosom perlu dilakukan dengan seksama
baik waktu maupun konsentrasinya..

Menurut Arheim dan Erlich (1992), Analisis molekuler merupakan analisis

yang dilakukan pada tingkat gen maupun ekspresinya yang bertujuan untuk
mengkonfirmasi keberadaan gen melalui metode molekuler seperti PCR Teknik
PCR memiliki kelebihan diantaranya sangat praktis, akan tetapi dapat terjadi
positif semu jika reaksi yang dipergunakan mengandung kontaminan. Analisis
PCR perlu menggunakan beberapa kontrol untuk menghindari terjadinya positif
maupun negatif semu.