P. 1
LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

3.0

|Views: 9,523|Likes:
Published by yusuffirdausaulia

More info:

Published by: yusuffirdausaulia on Apr 02, 2010
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOC, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

02/28/2015

pdf

text

original

BAB I PENDAHULUAN

1. 1

Latar Belakang Ikan Lele (Ciarias batrachus) termasuk kelompok ikan siluroid yang sering

disebut catfish. Kelompok ini mencakup jenis-jenis ikan yang bertulang keras dengan ciri-ciri bagian luar tidak bersisik, berkumis 2-4 pasang disekitar mulut, pada sirip dada terdapat sepasang duri (patil), dan juga pada sirip punggungnya, sedangkan bentuk sirip ekornya bervariasi menurut jenisnya (ada yang meruncing, berlekuk dan bercagak). Lele lokal semula hanya dikenal sebagai ikan curah, tetapi sejak tahun tujuh puluh, jenis ikan ini menarik minat masyarakat untuk dibudidayakan terutama di daerah Jawa Timur. Pada tahun 1975, muncul teknik pemijahan lele sistem Blitar dan benih yang dihasilkan dibudidayakan di kolam dan sawah bersama padi (mina padi). Kepopuleran pemijahan ikan lele di Jawa Timur segera menyebar ke daerahdaerah lain diseluruh Indonesia. Dengan adanya benih-benih ikan lele yang baik maka usaha budidaya ikan lele juga mengalami peningkatan. Sejalan dengan berkembangnya budidaya ikan lele, maka proses isolasi enzim protease tidak hanya berasal dari karet (lateks) saja. Ternyata, enzim-enzim protease (pemecah protein) dapat diisolasi dari pankreas/usus halus ikan lele. Beberapa enzim protease yang terdapat dalam pankreas/usus halus ikan lele, diantaranya:

1

1. Tripsin; memotong protein pada urutan asam amino setelah asam amino basa: Lys dan Arg. 2. Kimotripsin; memotong protein pada urutan asam amino setelah asam amino aromatik: Phe, Tyr, dan Trp. 3. Elastase; memotong protein pada urutan asam amino setelah asam amino nonpolar kecil: Ala dan Ser. 4. Amino peptidase; memotong protein pada asam amino ujung-N. 5. Karboksi peptidase; memotong protein pada asam amino ujung-C. Hal inilah yang menyebabkan kami mencoba untuk mengisolasi enzim protease dari ikan lele.

1. 2

Identifikasi Masalah Masalah-masalah yang timbul dari penelitian yang dilakukan diantaranya : 1. Keberadaan protein yang beraktivitas protelitik dalam usus halus ikan lele 2. Tahapan-tahapan yang secara efektif dan efisien dapat memisahkan dan memurnikan protein tersebut 3. Penentuan aktivitas enzim protease 4. Karakterisasi enzim protease tersebut yang meliputi penentuan pH optimum dan penentuen kadar protein

2

1. 3

Maksud dan Tujuan 1. Mengisolasi enzim proteolitik dari usus halus ikan lele. 2. Memurnikan enzim proteolitik dari usus halus ikan lele. 3. Menentukan aktivitas enzim proteolitik dari usus halus ikan lele. 4. Menentukan kadar protein dari usus halus ikan lele dengan metode Lowry.

1. 4

Kegunaan Percobaan Hasil praktikum ini diharapkan dapat berguna untuk : 1. Memberikan informasi tentang enzim protease yang berasal dan usus halus ikan lele. 2. Perkembangan ilmu pengetahuan khususnya di bidang ilmu Biokimia.

1. 5

Metodologi Percobaan Secara ringkas metode yang dilakukan sesuai dengan empat tujan utama

percobaan yaitu :  Isolasi enzim dilakukan dengan cara : 1. Ekstraksi Enzim 2. Pengendapan protein dengan aseton dingin 3. Sentrifugasi  Pemurnian protein dengan kromatografi kolom penukar kation

3

 Penentuan aktivitas enzim protease dengan penambahan kasein sebagai substrat dan kemudian diukur serapannya pada panjang gelombang 280 nm dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis.  Penentuan kadar protein dengan metode Lowry.

1. 6

Tempat dan Waktu Percobaan Percobaan ini bertempat di laboratorium Biokimia jurusan Kimia FMIPA

UNPAD, jalan Raya Sumedang km 21 Jatinangor, pada tanggal 10 dan 17 November 2009.

4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2. 1

Ikan Lele ( Clarias bathracus) Lele merupakan ikan konsumsi air tawar dengan bentuk tubuh yang licin,

bertentakel, dan panjang. Di Indonesia ikan Lele tidak hanya dikembangbiakan di tambak–tambak, tetapi juga banyak hidup di alam bebas seperti, sungai, rawa, danau, kanal dan daerah-daerah bersuhu sedang serta berair tawar tidak asin. Sehingga tersebar hampir di seluruh daerah di Indonesia seperti Jawa, Kalimantan, Sulawesi, Aceh, Sumatera, Bali, NTT, NTB, Irian Jaya dan daerah-daerah lainnya. Bahkan di luar negeri pun ada tentunya dengan sebutan yang berbeda, misalnya Mali (Afrika), Plamond (Thailand), Keli (Malaysia), Catretrang (Jepang). Ikan lele bersifat nocturnal, yaitu aktif bergerak mencari makanan pada malam hari, sedangkan pada siang hari berdiam diri berlindung di tempat-tempat gelap. Ikan lele banyak ditemukan di Benua Asia dan Afrika, serta dibudidayakan di Afrika Selatan, Philipina, Indonesia, Thailand, dan lain sebagainya (Arifin, 1991). Ikan Lele memiliki taksonomi sebgai berikut (Simanjuntak, 1996) : Kingdom : Animalia Metozoa Chordata Vertebrata

Subkingdom : Phylum Subphylum : :

5

Class Subclass Ordo Subordo Familia Genus Species

: : : : : : :

Pisces Toleostei Ostariophsysi Siluroidea Clariadae Clarias Clarias bathracus

Manfaat Ikan lele dalam skala industri dan perumahan diantaranya :  Sebagai bahan makanan.  Sebagai ikan hias.  Jika dipelihara di sawah dapat memberantas hama padi berupa serangga air yang merupakan makan alami dari ikan ini jika hidup di alam.  Ikan ini juga dapat diolah dengan berbagai bahan obatl ain untuk mengobati penyakit asma, menstruasi, datang bulan yang tidak teratur, mimisan (hidung berdarah), dan lain-lain.

2. 2

Enzim Enzim adalah katalis untuk reaksi-reaksi dalam sistem biologi (biokatalisator),

semua enzim adalah protein, kecuali ada sekelompok kecil molekul RNA yang juga berperan sebagai enzim (riboenzim). Enzim utuh (holoenzim), terdiri atas (Lehninger, 1982) :

6

 Bagian protein (apoenzim)  Bagian non-Protein (kofator-kofaktor ion anorganik, seperti Fe2+, Mg 2+, Mn2+, Zn2+, dan in-anorganik kompleks)  Koenzim tidak terikat kuat pada apoenzim, seperti NADH  Gugus prostetik terikat kuat dalam apoenzim seperti NADH, misalnya FADH2 Enzim adalah protein globular yang umumnya berfungsi sebagai biokatalis pada semua proses kimia dalam makhluk hidup, sehingga disebut life is enzyme. Enzim mampu meningkatkan reaksi kimia tetapi tidak diubah oleh reaksi yang dikatalisnya serta tidak mengubah kedudukan normal dari kesetimbangan kimia. Enzim mempunyai daya katalisis spesifik yang lebih besar dari katalisator lainnya (Toha,2005). Beberapa enzim seperti tripsin, pepsin, dan ribonuklease merupakan protein sederhana yang hanya terdiri dari rantai asam amino. Enzim lain mengandung komponen non-protein yang penting untuk fungsi khusus dari enzim yang dikenal sebagai kofaktor yang terbagi menjadi (Mckee & Mckee, 1999) :  Gugus prostetik merupakan komponen yang terikat pada enzim dan tidak mudah lepas dari enzim, con tohnya FAD  Ion anorganik merupakan ion-ion logam yang terikat satu mudah dilepas dari enzim, contohnya Fe2+, Mg 2+, Mn2+, Zn2+

7

 Koenzim merupakn molekul organik kecil yang mudah terdisosiasi dan dapat dipisahkan dari enzimnya, contohnya ATP, NADH, dan Koenzim A. Sebagai katalis, enzim sangat luar biasa (Nelson & Michael, 2008) :  Mempunyai daya katalitik yang sangat baik; jauh.  Lebih baik dari katalis anorganik atau sintetik (kecepatan reaksi dapat meningkat sampai sejuta kali).  Mempunyai spesifisitas tinggi terhadap substrat dan reaksi.  Dapat berfungsi baik dalam larutan pada pH dan suhu sedang (mild condition).  Hasil samping jarang terbentuk.  Karena strukturnya yang kompleks, enzim dapat diregulasi. Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim, diantaranya (Lehninger, 1982) : 1.  Pengaruh pH Enzim mempunyai pH optimum (rentang pH) dimana enzim mempunyai aktivitas maksimal; di atas atau di bawah pH optimum aktivitas enzim berkurang.  Konsentrasi ion hidrogen (pH) dapat mempengaruhi enzim dalam beberapa cara:

8

o Perubahan pH dapat mempengaruhi ionisasi pada sisi aktif enzim. o Perubahan pH dapat mempengaruhi struktur tersier dari apoenzim; o Perubahan pH yang drastis dapat menyebabkan denaturasi protein. 2.  Pengaruh suhu Semua reaksi kimia dipengaruhi suhu; makin tinggi suhu makin tinggi kecepatan reaksi.  Pada reaksi enzimatik, suhu tinggi dapat menyebakan denaturasi enzim; aktivitas enzim akan berkurang. Suhu dimana enzim mempunyai aktivitas maksimal dinamakan suhu optimum.

Effect of temperature on Enzyme Activity 3.  Pengaruh inhibitor

Effect of pH on Two Enzymes

Inhibitor enzim : senyawa yang bersifat menghambat katalisis; memperlambat atau menahan reaksi enzimatik.

9

Inhibisi aktivitas enzim dapat bersifat irreversibel (biasanya terikat secara kovalen pada enzim) atau reversibel (dapat terdisosiasi dari enzim).

Inhibitor reversibel yang umum adalah inhibitor kompetitif dan inhibitor nonkompetitif.

2. 3

Protein Protein merupakan segolongan besar senyawa organik yang dijumpai dalam

semua makhluk hidup. Protein terdiri dari karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen, dan kebanyakan juga mengandung sulfur. Bobot molekulnya berkisar antara 6.000 sampai beberapa juta. Molekul protein terdiri dari satu atau beberapa rantai panjang polipeptida dari asam- asam amino yang terikat dengan urutan yang khas. Urutan ini dinamakan struktur primer dari protein. Polipeptida ini dapat melipat atau menggulung, peptida yang menggulung atau melipat ini dinamakan struktur tersier. Struktur kuarterner muncul dari hubungan structural beberapa polipeptida yang terlihat (Page, 1997). Salah satu tahap yang banyak digunakan untuk pemurnian protein adalah pengendapan protein. Pengendapan ini dapat dilakukan dengan mengubah kekuatan ionik, pH, penambahan pelarut organik, polimer dan penambahan garam. Garam– garam yang efektif digunakan pada proses pengendapan protein adalah garam yang multi anonik seperti sulfat, fosfat, dan sitrat (Scopes, 1994).

10

Enzim protease merupakan biokatalisator untuk reaksi pemecahan protein. Enzim ini akan mengkatalisis reaksi hidrolisis, yaitu reaksi yang melibatkan unsur air pada ikatan spesifik substrat. Karena itu, enzim ini termasuk dalam kelas utama enzim golongan hidrolase (Winarno, 1983). Protease ialah enzim yang sangat kompleks, mempunyai sifat fisiko kimia dan sifat katalitik yang sangat bervariasi. Prote-ase dapat dihasilkan secara ekstraseluler dan intraseluler dan mempunyai peranan penting dalam metabolisme sel dan keteraturan proses dalam sel (Ward, 1983). Protease merupakan enzim yang sangat penting dalam industri pangan maupun non pangan. Pemanfaatan protease dalam industri pangan diantaranya adalah untuk mengurangi kekeruhan dalam industri bir, mengurangi gluten pada industri roti, dan untuk menggumpalkan susu pada industri keju. Enzim protease dapat diperoleh dari jaringan tanaman, hewan, maupun mikroba. Keterbatasan kemampuan hewan dan tumbuhan dalam memenuhi permintaan protease, telah mendorong

berkembangnya protease mikroba (Hame & Hooper, 2000).

2. 4

Metode-Metode Pemisahan Sentrifugasi merupakan salah satu teknik yang penting dalam biokimia.

Sentrifugasi dilakukan dengan menempatkan partikel dan medium suspensinya dalam suatu medan gaya sentrifugasi. Medan sentrifugasi menyebabkan partikel bermigrasi lebih cepat ke arah luar dari sumbu rotasi (Mathews & Van Holde, 1990).

11

Sentrifugasi digunakan untuk preparasi contoh biologis dan pengukuran analitik sifat-sifat hidrodinamik makromolekul yang telah dimurnikan atau organel sel. Pada sentrifugasi suatu contoh biologis diberi suatu gaya besar dengan memutar contoh tersebut pada kecepatan yang tinggi, maka timbul suatu gaya sentrifugal. Gaya sentrifugal (F) dinyatakan dengan persamaan : F = m ω2r dengan, F = kekuatan gaya sentrifugal m = massa efektif partikel yang diendapkan ω = kecepatan sudut perputaran / rad sr = jarak perpindahan partikel dari pusat sumbu perputaran (Boyer,1986) Kromatografi penukar ion sangat cocok untuk pemisahan ion-ion anorganik, baik itu kation ataupun anion. Pemisahan terjadi karena pertukaran ion-ion dalam fase diam. Kromatografi penukar ion berguna untuk pemisahan asam-asam amino. Fase diam pada kromatografi penukar ion berupa matriks-matriks terbuat dari polimer triena yang berhubungan silang dengan senyawa divenil benzene (Day & Underwood, 1986). Bila cahaya (monokromatik maupun campuran) jatuh pada suatu medan homogen sebagian sinar yang masuk akan dipantulkan, sebagian diserap dalam medium itu dan sisanya diteruskan (Voet &Voet, 1995).

12

Ada dua hukum yang menyusun persamaan absorbansi: 1. Hukum Baugness (Lambert) Hukum Lambert menyatakan bila cahaya monokromatik melewati medium tembus cahaya, laju berkurangnya intensitas oleh bertambahnya ketebalan, berbanding lurus dengan intensitas cahaya. Ini setara dengan menyatakan bahwa intensitas cahaya yang dipancarkan berkurang secara eksponensial dengan bertambahnya ketebalan medium yang menyerap (Basset et al., 1994). 2. Hukum Beer Hubungan antara konsentrasi spesies menyerap dan tingkat adsorpsi dirumuskan oleh Beer. Hukum itu dapat ditetapkan benar-benar hanya untuk radiasi monokromatik dan dimana sifat dasar spesies penyerap berubah sepanjang jangka konsentrasi yang diselidiki. Hukum Lambert dan Beer digunakan menjadi rumus yang dikenal dengan persamaan Lambert-Beer : A = a.b.c Keterangan : A : absorbansi a : koefsian absorbansivitas b : panjang medium c : konsentrasi spesi (Schenk, 1981)

13

BAB III BAHAN DAN METODE PERCOBAAN

3.1

Bahan-Bahan Percobaan Pada percobaan ini digunakan berbagai macam reagen dan sampel yang telah

tersedia di laboratorium Biokimia, yaitu diantaranya : 1. Aseton dingin 2. Bovine serum albumin dalam air 3. Buffer fosfat pH 6,5 ; 7,4 ; dan 7,6 4. N,N-dimetil kasein 5. Pereaksi A (natrium karbonat 25 mL dalam natrium hidroksida 0,1 N) 6. Pereaksi B (kuprisulfat pentahidrat 0,5% dalam Na-K tartrat 1%) 7. Pereaksi C ( 50 mL pereaksi A dan 1 mL pereaksi B) 8. Pereaksi D (larutan follin ciocalteu terdiri dari fosfomolibdat dan fosfowolframat) 9. Sampel usus halus ikan lele 10. Trikloroasetat 8%

14

3.2

Metode Percobaan Metode-metode yang digunakan untuk isolasi, pemurnian, pengujian aktivitas

serta penentuan kadar protein enzim protease dari usus halus ikan lele dapat diuraikan sebagai berikut : 1. Ekstraksi Enzim Isolasi enzim protease yang berasal dari usus ikan lele yang melibatkan proses homogenasi. Pada proses homogenasi, sampel (usus ikan lele) ditambahkan larutan buffer kemudian dihomogenasi dengan bantuan alat Potter Elvehjem. Penambahan larutan buffer bertujuan untuk meningkatkan kelarutan enzim (salting in). 2. Pengendapan protein dengan aseton dingin

Aseton merupakan suatu pelarut organic, banyak digunakan untuk pengendapan protein pada skala industri terutama untuk pemisahan protein plasma. Pada prinsipnya, dengan adanya pelarut organic yang larut dalam air, akan menyebabkan kekuatan solvasi pada daerah permukaan protein yang hidrofobik berkurang. Susunan molekul air pada permukaan protein yang hidrofobik diganti oleh molekul organic, sehingga kelarutan protein meninggkat. Sebaliknya untuk protein yang dalam air kelarutannya berkurang. Aseton dapat membuat protein terdenaturasi, oleh karena itu penambahan harus dilakukan di bawah -20º C atau aseton sebelumnya telah didinginkan. Pengaruh pelarut organic terhadap kelarutan protein, diantaranya :

15

o Aseton reduksi konstanta dielektrik dari air o Penggantian dari molekul air o Mobilitas partikel dari molekul air melalui filtrasi 3. Sentrifugasi

Sentrifugasi digunakan untuk pemisahan material yang berdasarkan pada perbedaan kecepatan sedimentasi dari masing-masing partikel yang disebabkan oleh medan sentrifugal. Pada sentrifugasi, pertikel dan medium pensuspensinya ditempatkan dalam suatu medan gaya sentrifugal. Medan inilah yang menyebabkan partikel bermigrasi lebih cepat ke arah luar dari sumbu rotasi. Perpindahan partikel atau solut dalam suatu medan sentrifugal dinamakan sedimentasi dan kecepatan pergerakannya dinamakan kecepatan sedimentasi. Materi yang tersedimentasi pada dasar tabung dinamakan pelet atau residu dan cairan diatasnya dinamakan supernatan 4. Pemurnian protein dengan kromatografi kolom penukar ion

Kromatografi adalah suatu cara pemisahan berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi. Berdasarkan kecepatan migrasi kromatografi dapat dibagi menjadi adsorpsi, partisi, filtrasi gel (penyaringan molekul), dan penukar ion. Prinsip kerja kromatografi kolom penukar ion adalah adsorpsi molekul yang bermuatan pada kolom penukar ion, kemudian dilepaskan lagi dengan mengubah lingkungan ioniknya. Sampel protein dielusi dengan buffer awal yang diatur pH nya, sehingga protein yang akan dianalisis (diisolasi) terikat pada kolom, sedangkan protein lain

16

dibiarkan keluar dari kolom. Protein yang terikat dalam kolom, dilepas lagi dengan cara mengubah kondisi ioniknya (gradien pH atau kekuatan ion yang bias menyebabkan adanya persaingan antara komponen eluen dengan protein yang terikat. Material penukar ion merupakan suatu padatan yang mengandung gugusgugus bermuatan dan terikat secara kimia, yang dapat mengikat ion secara reversibel atau secara elektrostatik. Gugus-gugus yang bermuatan tersebut biasanya terikat pada suatu resin. Fasa diam atau matriks yang digunakan dalam percobaan ini adalah CMC (Carboxyl Methyl Cellullose) sedangkan fase geraknya adalah buffer fosfat pH 6,5 dan 7,4. 5. Penentuan aktivitas enzim protease

Penentuan aktivitas enzim biasanya dilakukan pada pH dan suhu optimum serta konsentrasi substrat dan kofaktor yang berlebih, sehingga laju reaksi yang terjadi merupakan reaksi tingkat ke nol (zero order reaction) terhadap substrat. Dalam hal ini, laju reaksi permulaan berbanding lurus konsentrasi enzim sehingga faktor pembatas laju reaksi (rate limitting factor) yang sebenarnya adalah konsentrasi enzim. Menurut perjanjian internasional, satu unit aktivitas enzim adalah jumlah enzim yang menyebabkan transformasi satu mikromol (10-6 mol) substrat per menit pada suhu 250C dalam keadaan optimum sistem tersebut. unit aktivitas = serapan sampel - serapan blanko 0,001 x waktu hidrolisis

17

Aktivitas spesifik (specific activity) adalah jumlah unit aktivitas enzim per miligram protein. aktivitas spesifik enzim protease = unit aktivitas mg protein

6.

Penentuan kadar protein dengan metode Lowry

Prinsip dari penentuan kadar protein dengan metode Lowry, yaitu: a. b. Reaksi biuret dimana Cu2+ tereduksi menjadi Cu+ Cu+ mereduksi reagen follin cioceltau menghasilkan

warna biru yang intensitasnya sebanding dengan kadar protein . Metode Lowry ini memiliki beberapa keuntungan, yaitu : • Sensitif pada rentang yang besar • Bisa dilakukan pada suhu kamar • 10-20 kali lebih sensitif daripada deteksi UV Sedangkan kerugian metode Lowry : • Banyak senyawa yang bisa menghasilkan positif palsu • Reagen harus dibuat segar karena adanya peningkatan jumlah karbonat akibat dari pengaruh cahaya • Memerlukan waktu yang cukup lama

18

Uji sensitif terhadap cahaya sehingga iluminasi selama uji harus dijaga konstan untuk seluruh sampel. BAB IV PEMBAHASAN

Percobaan ini bertujuan untuk mengisolasi enzim proteolitik dari usus halus ikan lele, memurnikannya, menentukan aktivitas enzim serta menentukan kadar protein dari enzim tersebut dengan menggunakan metode Lowry. Hal pertama yang dilakukan adalah enzim proteolitik diisolasi dari usus ikan lele. Usus halus ikan lele yang digunakan dicuci bersih terlebih dahulu untuk

mencegah terjadinya kontaminasi mikroba. Pengambilan usus halus ikan lele harus dilakukan secepat mungkin, dikarenakan ekstrak usus halus ikan lele kaya akan nutrien sehingga berpotensi menunjang perkembangan mikroba kontaminan. Pencucian usus ikan lele ini dilakukan menggunakan air dingin. Hal ini dilakukan dengan tujuan untuk pengkodisiaan awal agar selama proses penghancuran usus ikan lele masih dalam keadaan dingin. Hal ini juga untuk mencegah kontaminasi mikroba karena pada temperatur rendah mikroba akan sulit tumbuh. Selain itu hal ini dilakukan untuk mencegah denaturasi protein (enzim) yang terdapat didalamnya (enzim stabil) atau juga dapat menyebabkan enzim-enzim tersebut kehilangan aktivitasnya (enzim tidak aktif pada suhu rendah).

19

Setelah itu, usus halus ikan lele ini dihomogenasi dengan menggunakan buffer fosfat pH 6,5. Penambahan buffer pH 6,5 bertujuan untuk menjaga agar enzim protease pada usus halus ikan lele ini tetap stabil. Jika pH terlalu rendah maka akan mendenaturasi protein. Enzim mempunyai pH optimum dimana enzim ini akan bekerja maksimum, di bawah atau di atas pH maksimum enzim akan mengalami denaturasi dan akan berkurang kereaktifannya. Perubahan konsentarsi ion hidrogen (H+) akan mempengaruhi ionisasi sisi aktif enzim. Jika substrat juga mengandung gugus yang dapat terionisasi, maka perubahan pH dapat mengubah kapasitasnya untuk berikatan dengan sisi aktif. Perubahan gugus ionik pada enzim juga dapat mengubah struktur tersier dari enzim sehingga kebanyakan enzim aktif pada rentang pH kecil. Oleh karena itulah ditambah larutan buffer yang tidak mengalami perubahan pH yang berarti pada penambahan sedikit asam maupun basa. Larutan buffer dibuat dari asal lemah dan garamnya, dimana buffer fosfat dibuat dari asam lemahnya yaitu asam fosfat dan garamnya. Usus halus ikan lele ini dihancurkan dengan menggunakan alat waring blender yang bertujuan untuk memecah dinding sel dari usus halus. Jumlah buffer fosfat pH 7,4 yang ditambahkan sebanyak 2 mL. Selama proses tersebut berlangsung, akan timbul efek panas sehingga untuk meredam efek panas tersebut suhu harus dijaga agar tetap berada di bawah 00C (suhu rendah), hal ini dilakukan dengan menggunakan penangas es agar enzim tidak terdenaturasi akibat perubahan struktur enzim yang tadinya folding menjadi unfolding.

20

Setelah usus halus ikan lele dihancurkan (dengan adanya penambahan 2 mL buffer fosfat ph 7,4) ekstrak kasar tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm untuk memisahkan enzim protease dengan komponen-komponen lainnya.

Sentrifugasi ini dilakukan dengan menempatkan partikel dan medium suspensinya dalam medan sentrifugal. Medan sentrifugal menyebabkan partikel bermigrasi lebih cepat ke arah luar dari sumber rotasi. Dalam operasinya, sentrifugasi dijalankan dengan menaruh partikel dan medium suspensinya pada ujung dari alat yang berputar, yaitu rotor. Prinsip dari pemisahan ini adalah perbedaan kecepatan sedimentasi partikel atau molekul yang disebabkan oleh medan sentrifugal. Kecepatan sentrifugasi enzim dengan kecepatan sedimentasi komponen lainnya berbeda sehingga pada saat disentrifugasi dalam medan sentrifugasi terjadi pemisahan. Setelah disentrifugasi, enzim berada pada supernatan sedangkan endapannya merupakan organel lisis (pemecahan sel). Enzim berada pada supernatan karena memiliki densitas lebih kecil dibandingkan densitas pelarutnya dan enzim lebih larut pada air karena kepolarannya relatif sama dengan air (sesuai dengan prinsip ‘like dissolved like’). Partikel yang memiliki kecepatan sedimentasi lebih besar diendapkan terlebih dahulu, dimana kecepatan sedimentasi dipengaruhi oleh kecepatan perputaran rotor dan jarak partikel dari sumber rotasi. Semakin besar partikel maka semakin cepat partikel itu mengendap. Selain itu juga dipengaruhi oleh perbedaan kerapatan partikel dengan medium suspensinya dan viskositas medium suspensinya.

21

Supernatan yang diperoleh sebagian diuji ekstrak kasarnya, dan sebagian lainnya dipipet sebanyak 8 ml dan ditambahkan aseton dingin sebanyak 80 ml. Tujuannya adalah untuk mengendapkan enzim protease yang ada dalam supernatan tersebut. Penambahan pelarut organik (aseton) dapat menyebabkan reduksi dari sifat aktifitas air. Kekuatan solvasi air terhadap molekul enzim atau protein hidrofil akan berkurang dengan meningkatnya keonsentrasi aseton. Hal ini disebabkan oleh reduksi konstanta dielektrik dari air, penggantian molekul dari air, serta mobilisasi partikel dari molekul air tersebut melalui vibrasi dan pelarut organik. Air akan lebih tertarik pada pelarut organik karena kepolaran keduanya relatif sama. Selain tiu aseton bersifat semipolar. Untuk pengujian aktivitas enzim, sampel sebanyak 0,1 ml ditambahkan N,Ndimetilkasein yang berperan sebagai sustrat kemudian ditambahkan buffer fosfat ph 7,6 yang bertujuan untuk mempertahankan pH karena enzim bekerja pada pH optimum (tertentu). Jika pH asam atau basa maka enzim akan rusak. Kemudian larutan diinkubasi selama 30 menit. Tujuan dari inkubasi untuk mempercepat reaksi, karena enzim akan bekerja optimal pada suhu optimum. Setelah diinkubasi, kemudian ditambahkan larutan TCA (trikloroasetat) 8 % yang berfungsi untuk mengendapkan protein yang telah terpotong-potong karena adanya akifitas enzim protease. Dengan adanya TCA 8% maka protein akan terdenaturasi sehingga terbentuk endapan. Endapan yang terbentuk disaring untuk memisahkan endapan dan filtratnya. Filtratnya di ukur serapannya pada panjang gelombang 280 nm karena protein

22

memilki asam-asam amino yang spesifik yang memilki gugus aromatik terkonjugasi yang dapat menyerap spektra pada panjang gelombang 280 nm, yaitu fenilalanin, tyrosin, dan tryptophan. Untuk menentukan kadar protein digunakan metoda Lowry. Penentuan kadar protein dengan metoda Lowry adalah untuk menentukan kadar protein terlarut berdasarkan warna yang timbul karena adanya reaksi biuret disamping warna yang disebabkan oleh reduksi fosfomolibdat-fosfowolframat karena adanya reduksi asam amino tyrosin dan triptophan dalam molekul protein. Dengan adanya Cu2+ dalam suasana basa, biuret akan membentuk kompleks berwarna ungu. Absorpsi warna dari reaksi biuret dalam penentuan kadar protein diukur pada panjang gelombang maksimum 750 nm maka absorbansinya diketahui. Pada penentuan aktivitas enzim hasil kromatogafi penukar ion, sampel dipipet kemudian ditambahkan dengan N,N-dimetil kasein, buffer fosfat pH 7,6 dan

diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Setelah itu ditambahkan TCA, disaring dan diukur serapannya, sehingga didapat absorbansi pada panjang gelombang 280 nm. N,N-dimetil kasein ini berfungsi sebagai substrat yang akan terikat pada sisi aktif enzim sehingga pengukuran aktivitas enzim dapat dilakukan. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 oC untuk meningkatkan aktivitas enzim (dicapai aktivitas yang maksimum) karena masing-masing enzim memiliki aktivitas berbeda-beda dan aktivitas enzim akan maksimum pada suhu tersebut. Waktu inkubasi adalah 30 menit karena merupakan waktu optimum untuk enzim. TCA (Tri Chloroacetat Acid) berfungsi

23

sebagai inhibitor yang menghentikan reaksi antara enzim dan substrat (enzim protease dan N,N-dimetil kasein). Penentuan aktivitas enzim dilakukan terhadap ekstrak kasar dan hasil pengendapan. Dari hasil pengukuran serapannya, didapat ekstrak kasar A= 0,442 dan untuk hasil ekstrak fraksionasi A=0,173. Pada penentuan kadar protein dengan metode Lowry, fraksi hasil penukar ion yang membentuk puncak, ekstrak kasar dan hasil pengendapan pereaksi C, dikocok dan didiamkan selama 10 menit, lalu ditambahkan pereaksi D. hasil pencampuran diukur serapannya pada panjang gelombang 750 nm, didapat absorbansi untuk hasil penukar ion yang membentuk puncak A= 0,055 , untuk ekstrak kasar A= 1,293 dan untuk ekstrak sebelum dimurnikan sebesar A=1,334. Metode Lowry bekerja melalui dua tahapan. Tahap pertama adalah reaksi biuret yang merupakan suatu reduksi Cu2+ menjadi Cu+ yang selanjutnya akan mereduksi pereaksi D yang merupakan reagen follin ciocalteu (fosfomolibdat dan fosfowolframat). Pada tahapan ini terdeteksi pada range 500-750 nm karena pada panjang gelombang 750 nm terjadi serapan maksimum. Penentuan kadar protein ini dilakukan dengan melakukan metode

spektrofotometri dimana untuk metode ini sampel terlebih dahulu dibuat dalam larutan berwarna karena spektrofotometri dapat mengabsorpsi sinar tampak pada larutan yang berwarna. Oleh karena itu, protein direaksikan dengan pereaksi D (pereaksi folin ciocalteu) yang mengandung senyawa fosfomolibdat dan

fosfowolframat yang akan membentuk senyawa kompleks biru bila bereaksi dengan

24

protein dan warna biru yang timbul mempunyai panjang gelombang maksimum pada 750 nm. Dari hasil percobaan didapat bahwa enzim protease dapat diisolasi dari usus halus ikan lele dan diperoleh perolehan kembali protein pada estrak kasar sebesar 100%, fraksionasi hasil pengendapan sebesar 81,36% dan hasil kromatografi penukar ion sebesar 98%. Unit aktivitas enzim merupakan jumlah enzim yang menyebabkan kenaikan 0,001 A unit/menit. Unit aktivitas untuk estrak kasar, fraksionasi, dan hasil kromatografi penukar ion ditentukan dengan persamaan: unit aktivitas = serapan sampel - serapan blanko 0,001 x waktu hidrolisis

Dan diperoleh besarnya untuk ekstrak kasar, fraksionasi, dan hasil kromatografi penukar ion masing-masing sebesar 3,75 ; 0,885 ; dan 0,153. Sedangkan untuk menentukan kadar protein, diperoleh dengan persamaan kurva baku dari kadar protein standar. Dari percobaan diperoleh persamaan y= (2,0895 x 10-3) x + 0.3077. Data dalam bentuk tabel terdapat pada lampiran dan data menunjukkan bahwa enzim protease terdapat dalam fraksi ke 12,13, dan 14 dimana pada fraksi ini diperoleh nilai absorbansi tertinggi.

25

BAB V KESIMPULAN

Kesimpulan yang dapat diambil dari percobaan yang telah dilakukan, yaitu : 1. 2. Enzim proteolitik dapat diisolasi dari usus halus ikan lele. Kemurnian enzim proteolitik dari usus halus ikan lele dapat

ditentukan dengan kromatografi penukar ion, yaitu sebesar : 1 (ekstrak kasar), 0,2125 (fraksionasi), dan 0,1625 (hasil kromatografi). 3. Aktivitas enzim yang diperoleh sebesar : 7,125 (ekstrak kasar),

5,797 (fraksionasi), dan 7,02 (hasil kromatografi). 4. Kadar protein yang diperoleh sebesar : 471,55 (ekstrak kasar),

491,17 (fraksionasi), dan 120,94 (hasil kromatografi).

26

DAFTAR PUSTAKA Arifin, M.Z. 1991. Budidaya Lele. Dohara prize. Semarang. Basset, J., J. Mendham, R.C. Denney, & G.H. Jeffery. 1994. Buku Ajar Vogel Analisis Kimia Kuantitatif, diterjemahkan oleh A.H. Pudjaatmaka. EGC. Jakarta. Boyer, R.F. 1986. Modern Experimental Biochemistry. The Benjamin Cummings Publishing Company. California. Hames, B.D. & N. M. Hooper. 2000. Biochemistry the Instant Notes. Second Edition. Spinger-Verlag. Hongkong . Holme, D.J. & H. Peck. 1993. Analytical Biochemistry. Longman Scientific & Technical. Singapore. Lehninger, A.L. 1982. Dasar-Dasar Biokimia, diterjemahkan oleh M. Theniwidjaja. Erlangga. Jakarta. Mathews, C.K. & M.E. Van Holde. 1990. Biochemistry. The Benjamin Cummings Publishing Company. California. Mckee,T. & J.K. Mckee. 1999. Biochemistry an Introduction. Mc Graw Hill Company, Inc. Boston. Nelson, D.L. & M.C. Michael. 2008. Principle of Biochemistry. Fifth edition. W.H. Fremann and Company. New York. Page, D.J. 1997. Prinsip-Prinsip Biokimia, diterjemahkan oleh R.Soedono. Erlangga. Jakarta. Schenk, G.H. 1981. Quantitative Analytical Chemistry. Prentice Hall. New Jersey. Scopes, R.K. 1994. Protein Purification : Principles & Practice. Springer-Verlag. New York. Simanjutak, R.H. 1996. Pembudidayaan Ikan Lele Lokal dan Dumbo. Bhratara. Jakarta. Toha, A.H.A. 2001. Deoxyribosa Nucleac Acid. Alfabeta. Bandung. Voet, O. & J.B. Voet. 1995. Biochemistry. John Willey & Sons. New Jersey. Winarno, F.G. 1983. Enzim Pangan. P.T. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta. Ward, O.P. 1983. Proteinases In Fogatory Microbial Enzymes and Biotechnology. Applied Science Publisher. New York.

27

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->