BAB I

PENDAHULUAN

1. 1 Latar Belakang

Ikan Lele (Ciarias batrachus) termasuk kelompok ikan siluroid yang sering

disebut catfish. Kelompok ini mencakup jenis-jenis ikan yang bertulang keras dengan

ciri-ciri bagian luar tidak bersisik, berkumis 2-4 pasang disekitar mulut, pada sirip

dada terdapat sepasang duri (patil), dan juga pada sirip punggungnya, sedangkan

bentuk sirip ekornya bervariasi menurut jenisnya (ada yang meruncing, berlekuk dan

bercagak).

Lele lokal semula hanya dikenal sebagai ikan curah, tetapi sejak tahun tujuh

puluh, jenis ikan ini menarik minat masyarakat untuk dibudidayakan terutama di

daerah Jawa Timur. Pada tahun 1975, muncul teknik pemijahan lele sistem Blitar dan

benih yang dihasilkan dibudidayakan di kolam dan sawah bersama padi (mina padi).

Kepopuleran pemijahan ikan lele di Jawa Timur segera menyebar ke daerah-

daerah lain diseluruh Indonesia. Dengan adanya benih-benih ikan lele yang baik

maka usaha budidaya ikan lele juga mengalami peningkatan.

Sejalan dengan berkembangnya budidaya ikan lele, maka proses isolasi enzim

protease tidak hanya berasal dari karet (lateks) saja. Ternyata, enzim-enzim protease

(pemecah protein) dapat diisolasi dari pankreas/usus halus ikan lele. Beberapa enzim

protease yang terdapat dalam pankreas/usus halus ikan lele, diantaranya:

1
 1. Tripsin; memotong protein pada urutan asam amino setelah asam amino basa:

Lys dan Arg.

2. Kimotripsin; memotong protein pada urutan asam amino setelah asam amino

aromatik: Phe, Tyr, dan Trp.

3. Elastase; memotong protein pada urutan asam amino setelah asam amino non-

polar kecil: Ala dan Ser.

4. Amino peptidase; memotong protein pada asam amino ujung-N.

5. Karboksi peptidase; memotong protein pada asam amino ujung-C.

Hal inilah yang menyebabkan kami mencoba untuk mengisolasi enzim

protease dari ikan lele.

1. 2 Identifikasi Masalah

Masalah-masalah yang timbul dari penelitian yang dilakukan diantaranya :

1. Keberadaan protein yang beraktivitas protelitik dalam usus halus ikan lele

2. Tahapan-tahapan yang secara efektif dan efisien dapat memisahkan dan

memurnikan protein tersebut

3. Penentuan aktivitas enzim protease

4. Karakterisasi enzim protease tersebut yang meliputi penentuan pH optimum

dan penentuen kadar protein

2
1. 3 Maksud dan Tujuan

1. Mengisolasi enzim proteolitik dari usus halus ikan lele.

2. Memurnikan enzim proteolitik dari usus halus ikan lele.

3. Menentukan aktivitas enzim proteolitik dari usus halus ikan lele.

4. Menentukan kadar protein dari usus halus ikan lele dengan metode Lowry.

1. 4 Kegunaan Percobaan

Hasil praktikum ini diharapkan dapat berguna untuk :

1. Memberikan informasi tentang enzim protease yang berasal dan usus halus

ikan lele.

2. Perkembangan ilmu pengetahuan khususnya di bidang ilmu Biokimia.

1. 5 Metodologi Percobaan

Secara ringkas metode yang dilakukan sesuai dengan empat tujan utama

percobaan yaitu :

 Isolasi enzim dilakukan dengan cara :

1. Ekstraksi Enzim

2. Pengendapan protein dengan aseton dingin

3. Sentrifugasi

 Pemurnian protein dengan kromatografi kolom penukar kation

3
  Penentuan aktivitas enzim protease dengan penambahan kasein sebagai

substrat dan kemudian diukur serapannya pada panjang gelombang 280 nm

dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis.

 Penentuan kadar protein dengan metode Lowry.

1. 6 Tempat dan Waktu Percobaan

Percobaan ini bertempat di laboratorium Biokimia jurusan Kimia FMIPA

UNPAD, jalan Raya Sumedang km 21 Jatinangor, pada tanggal 10 dan 17 November

2009.

4
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2. 1 Ikan Lele ( Clarias bathracus)

Lele merupakan ikan konsumsi air tawar dengan bentuk tubuh yang licin,

bertentakel, dan panjang. Di Indonesia ikan Lele tidak hanya dikembangbiakan di

tambak–tambak, tetapi juga banyak hidup di alam bebas seperti, sungai, rawa, danau,

kanal dan daerah-daerah bersuhu sedang serta berair tawar tidak asin. Sehingga

tersebar hampir di seluruh daerah di Indonesia seperti Jawa, Kalimantan, Sulawesi,

Aceh, Sumatera, Bali, NTT, NTB, Irian Jaya dan daerah-daerah lainnya. Bahkan di

luar negeri pun ada tentunya dengan sebutan yang berbeda, misalnya Mali (Afrika),

Plamond (Thailand), Keli (Malaysia), Catretrang (Jepang). Ikan lele bersifat

nocturnal, yaitu aktif bergerak mencari makanan pada malam hari, sedangkan pada

siang hari berdiam diri berlindung di tempat-tempat gelap. Ikan lele banyak

ditemukan di Benua Asia dan Afrika, serta dibudidayakan di Afrika Selatan,

Philipina, Indonesia, Thailand, dan lain sebagainya (Arifin, 1991).

Ikan Lele memiliki taksonomi sebgai berikut (Simanjuntak, 1996) :

Kingdom : Animalia

Subkingdom : Metozoa

Phylum : Chordata

Subphylum : Vertebrata

5
 Class : Pisces

Subclass : Toleostei

Ordo : Ostariophsysi

Subordo : Siluroidea

Familia : Clariadae

Genus : Clarias

Species : Clarias bathracus

Manfaat Ikan lele dalam skala industri dan perumahan diantaranya :

 Sebagai bahan makanan.

 Sebagai ikan hias.

 Jika dipelihara di sawah dapat memberantas hama padi berupa serangga air

yang merupakan makan alami dari ikan ini jika hidup di alam.

 Ikan ini juga dapat diolah dengan berbagai bahan obatl ain untuk mengobati

penyakit asma, menstruasi, datang bulan yang tidak teratur, mimisan (hidung

berdarah), dan lain-lain.

2. 2 Enzim

Enzim adalah katalis untuk reaksi-reaksi dalam sistem biologi (biokatalisator),

semua enzim adalah protein, kecuali ada sekelompok kecil molekul RNA yang juga

berperan sebagai enzim (riboenzim). Enzim utuh (holoenzim), terdiri atas

(Lehninger, 1982) :

6
  Bagian protein (apoenzim)

 Bagian non-Protein (kofator-kofaktor ion anorganik, seperti Fe 2+, Mg 2+,

Mn2+, Zn2+, dan in-anorganik kompleks)

 Koenzim tidak terikat kuat pada apoenzim, seperti NADH

 Gugus prostetik terikat kuat dalam apoenzim seperti NADH, misalnya

FADH2

Enzim adalah protein globular yang umumnya berfungsi sebagai biokatalis

pada semua proses kimia dalam makhluk hidup, sehingga disebut life is enzyme.

Enzim mampu meningkatkan reaksi kimia tetapi tidak diubah oleh reaksi yang

dikatalisnya serta tidak mengubah kedudukan normal dari kesetimbangan kimia.

Enzim mempunyai daya katalisis spesifik yang lebih besar dari katalisator lainnya

(Toha,2005).

Beberapa enzim seperti tripsin, pepsin, dan ribonuklease merupakan protein

sederhana yang hanya terdiri dari rantai asam amino. Enzim lain mengandung

komponen non-protein yang penting untuk fungsi khusus dari enzim yang dikenal

sebagai kofaktor yang terbagi menjadi (Mckee & Mckee, 1999) :


Gugus prostetik merupakan komponen yang terikat pada enzim dan

tidak mudah lepas dari enzim, con tohnya FAD


Ion anorganik merupakan ion-ion logam yang terikat satu mudah dilepas

dari enzim, contohnya Fe2+, Mg 2+, Mn2+, Zn2+

7
 
Koenzim merupakn molekul organik kecil yang mudah terdisosiasi dan

dapat dipisahkan dari enzimnya, contohnya ATP, NADH, dan Koenzim

A.

Sebagai katalis, enzim sangat luar biasa (Nelson & Michael, 2008) :

 Mempunyai daya katalitik yang sangat baik; jauh.

 Lebih baik dari katalis anorganik atau sintetik (kecepatan reaksi dapat

meningkat sampai sejuta kali).

 Mempunyai spesifisitas tinggi terhadap substrat dan reaksi.

 Dapat berfungsi baik dalam larutan pada pH dan suhu sedang (mild

condition).

 Hasil samping jarang terbentuk.

 Karena strukturnya yang kompleks, enzim dapat diregulasi.

Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim, diantaranya (Lehninger,

1982) :

1. Pengaruh pH

 Enzim mempunyai pH optimum (rentang pH) dimana enzim mempunyai

aktivitas maksimal; di atas atau di bawah pH optimum aktivitas enzim

berkurang.

 Konsentrasi ion hidrogen (pH) dapat mempengaruhi enzim dalam

beberapa cara:

8
 o Perubahan pH dapat mempengaruhi ionisasi pada sisi aktif enzim.

o Perubahan pH dapat mempengaruhi struktur tersier dari apoenzim;

o Perubahan pH yang drastis dapat menyebabkan denaturasi protein.

2. Pengaruh suhu

 Semua reaksi kimia dipengaruhi suhu; makin tinggi suhu makin tinggi

kecepatan reaksi.

 Pada reaksi enzimatik, suhu tinggi dapat menyebakan denaturasi enzim;

aktivitas enzim akan berkurang.

Suhu dimana enzim mempunyai aktivitas maksimal dinamakan suhu optimum.

Effect of temperature on Enzyme Activity Effect of pH on Two Enzymes

3. Pengaruh inhibitor

 Inhibitor enzim : senyawa yang bersifat menghambat katalisis;

memperlambat atau menahan reaksi enzimatik.

9
  Inhibisi aktivitas enzim dapat bersifat irreversibel (biasanya terikat

secara kovalen pada enzim) atau reversibel (dapat terdisosiasi dari

enzim).

 Inhibitor reversibel yang umum adalah inhibitor kompetitif dan inhibitor

nonkompetitif.

2. 3 Protein

Protein merupakan segolongan besar senyawa organik yang dijumpai dalam

semua makhluk hidup. Protein terdiri dari karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen, dan

kebanyakan juga mengandung sulfur. Bobot molekulnya berkisar antara 6.000 sampai

beberapa juta. Molekul protein terdiri dari satu atau beberapa rantai panjang

polipeptida dari asam- asam amino yang terikat dengan urutan yang khas. Urutan ini

dinamakan struktur primer dari protein. Polipeptida ini dapat melipat atau

menggulung, peptida yang menggulung atau melipat ini dinamakan struktur tersier.

Struktur kuarterner muncul dari hubungan structural beberapa polipeptida yang

terlihat (Page, 1997).

Salah satu tahap yang banyak digunakan untuk pemurnian protein adalah

pengendapan protein. Pengendapan ini dapat dilakukan dengan mengubah kekuatan

ionik, pH, penambahan pelarut organik, polimer dan penambahan garam. Garam–

garam yang efektif digunakan pada proses pengendapan protein adalah garam yang

multi anonik seperti sulfat, fosfat, dan sitrat (Scopes, 1994).

10
 Enzim protease merupakan biokatalisator untuk reaksi pemecahan protein.

Enzim ini akan mengkatalisis reaksi hidrolisis, yaitu reaksi yang melibatkan unsur air

pada ikatan spesifik substrat. Karena itu, enzim ini termasuk dalam kelas utama

enzim golongan hidrolase (Winarno, 1983).

Protease ialah enzim yang sangat kompleks, mempunyai sifat fisiko kimia dan

sifat katalitik yang sangat bervariasi. Prote-ase dapat dihasilkan secara ekstraseluler

dan intraseluler dan mempunyai peranan penting dalam metabolisme sel dan

keteraturan proses dalam sel (Ward, 1983).

Protease merupakan enzim yang sangat penting dalam industri pangan

maupun non pangan. Pemanfaatan protease dalam industri pangan diantaranya adalah

untuk mengurangi kekeruhan dalam industri bir, mengurangi gluten pada industri roti,

dan untuk menggumpalkan susu pada industri keju. Enzim protease dapat diperoleh

dari jaringan tanaman, hewan, maupun mikroba. Keterbatasan kemampuan hewan

dan tumbuhan dalam memenuhi permintaan protease, telah mendorong

berkembangnya protease mikroba (Hame & Hooper, 2000).

2. 4 Metode-Metode Pemisahan

Sentrifugasi merupakan salah satu teknik yang penting dalam biokimia.

Sentrifugasi dilakukan dengan menempatkan partikel dan medium suspensinya dalam

suatu medan gaya sentrifugasi. Medan sentrifugasi menyebabkan partikel bermigrasi

lebih cepat ke arah luar dari sumbu rotasi (Mathews & Van Holde, 1990).

11
 Sentrifugasi digunakan untuk preparasi contoh biologis dan pengukuran analitik

sifat-sifat hidrodinamik makromolekul yang telah dimurnikan atau organel sel. Pada

sentrifugasi suatu contoh biologis diberi suatu gaya besar dengan memutar contoh

tersebut pada kecepatan yang tinggi, maka timbul suatu gaya sentrifugal. Gaya

sentrifugal (F) dinyatakan dengan persamaan :

F = m ω2r

dengan, F = kekuatan gaya sentrifugal

m = massa efektif partikel yang diendapkan

ω = kecepatan sudut perputaran / rad s-

r = jarak perpindahan partikel dari pusat sumbu perputaran

(Boyer,1986)

Kromatografi penukar ion sangat cocok untuk pemisahan ion-ion anorganik,

baik itu kation ataupun anion. Pemisahan terjadi karena pertukaran ion-ion dalam fase

diam. Kromatografi penukar ion berguna untuk pemisahan asam-asam amino. Fase

diam pada kromatografi penukar ion berupa matriks-matriks terbuat dari polimer

triena yang berhubungan silang dengan senyawa divenil benzene (Day &

Underwood, 1986).

Bila cahaya (monokromatik maupun campuran) jatuh pada suatu medan

homogen sebagian sinar yang masuk akan dipantulkan, sebagian diserap dalam

medium itu dan sisanya diteruskan (Voet &Voet, 1995).

12
 Ada dua hukum yang menyusun persamaan absorbansi:

1. Hukum Baugness (Lambert)

Hukum Lambert menyatakan bila cahaya monokromatik melewati medium

tembus cahaya, laju berkurangnya intensitas oleh bertambahnya ketebalan,

berbanding lurus dengan intensitas cahaya. Ini setara dengan menyatakan

bahwa intensitas cahaya yang dipancarkan berkurang secara eksponensial

dengan bertambahnya ketebalan medium yang menyerap (Basset et al., 1994).

2. Hukum Beer

Hubungan antara konsentrasi spesies menyerap dan tingkat adsorpsi

dirumuskan oleh Beer. Hukum itu dapat ditetapkan benar-benar hanya untuk

radiasi monokromatik dan dimana sifat dasar spesies penyerap berubah

sepanjang jangka konsentrasi yang diselidiki. Hukum Lambert dan Beer

digunakan menjadi rumus yang dikenal dengan persamaan Lambert-Beer :

A = a.b.c

Keterangan : A : absorbansi

a : koefsian absorbansivitas

b : panjang medium

c : konsentrasi spesi

(Schenk, 1981)

13
 BAB III

BAHAN DAN METODE PERCOBAAN

3.1 Bahan-Bahan Percobaan

Pada percobaan ini digunakan berbagai macam reagen dan sampel yang telah

tersedia di laboratorium Biokimia, yaitu diantaranya :

1. Aseton dingin

2. Bovine serum albumin dalam air

3. Buffer fosfat pH 6,5 ; 7,4 ; dan 7,6

4. N,N-dimetil kasein

5. Pereaksi A (natrium karbonat 25 mL dalam natrium hidroksida 0,1 N)

6. Pereaksi B (kuprisulfat pentahidrat 0,5% dalam Na-K tartrat 1%)

7. Pereaksi C ( 50 mL pereaksi A dan 1 mL pereaksi B)

8. Pereaksi D (larutan follin ciocalteu terdiri dari fosfomolibdat dan

fosfowolframat)

9. Sampel usus halus ikan lele

10. Trikloroasetat 8%

14
3.2 Metode Percobaan

Metode-metode yang digunakan untuk isolasi, pemurnian, pengujian aktivitas

serta penentuan kadar protein enzim protease dari usus halus ikan lele dapat diuraikan

sebagai berikut :

1. Ekstraksi Enzim

Isolasi enzim protease yang berasal dari usus ikan lele yang melibatkan proses

homogenasi. Pada proses homogenasi, sampel (usus ikan lele) ditambahkan

larutan buffer kemudian dihomogenasi dengan bantuan alat Potter Elvehjem.

Penambahan larutan buffer bertujuan untuk meningkatkan kelarutan enzim

(salting in).

2. Pengendapan protein dengan aseton dingin

Aseton merupakan suatu pelarut organic, banyak digunakan untuk

pengendapan protein pada skala industri terutama untuk pemisahan protein plasma.

Pada prinsipnya, dengan adanya pelarut organic yang larut dalam air, akan

menyebabkan kekuatan solvasi pada daerah permukaan protein yang hidrofobik

berkurang. Susunan molekul air pada permukaan protein yang hidrofobik diganti

oleh molekul organic, sehingga kelarutan protein meninggkat. Sebaliknya untuk

protein yang dalam air kelarutannya berkurang.

Aseton dapat membuat protein terdenaturasi, oleh karena itu penambahan

harus dilakukan di bawah -20º C atau aseton sebelumnya telah didinginkan.

Pengaruh pelarut organic terhadap kelarutan protein, diantaranya :

15
 o Aseton reduksi konstanta dielektrik dari air

o Penggantian dari molekul air

o Mobilitas partikel dari molekul air melalui filtrasi

3. Sentrifugasi

Sentrifugasi digunakan untuk pemisahan material yang berdasarkan pada

perbedaan kecepatan sedimentasi dari masing-masing partikel yang disebabkan

oleh medan sentrifugal. Pada sentrifugasi, pertikel dan medium pensuspensinya

ditempatkan dalam suatu medan gaya sentrifugal. Medan inilah yang

menyebabkan partikel bermigrasi lebih cepat ke arah luar dari sumbu rotasi.

Perpindahan partikel atau solut dalam suatu medan sentrifugal dinamakan

sedimentasi dan kecepatan pergerakannya dinamakan kecepatan sedimentasi.

Materi yang tersedimentasi pada dasar tabung dinamakan pelet atau residu dan

cairan diatasnya dinamakan supernatan

4. Pemurnian protein dengan kromatografi kolom penukar ion

Kromatografi adalah suatu cara pemisahan berdasarkan perbedaan kecepatan

migrasi. Berdasarkan kecepatan migrasi kromatografi dapat dibagi menjadi

adsorpsi, partisi, filtrasi gel (penyaringan molekul), dan penukar ion. Prinsip kerja

kromatografi kolom penukar ion adalah adsorpsi molekul yang bermuatan pada

kolom penukar ion, kemudian dilepaskan lagi dengan mengubah lingkungan

ioniknya. Sampel protein dielusi dengan buffer awal yang diatur pH nya, sehingga

protein yang akan dianalisis (diisolasi) terikat pada kolom, sedangkan protein lain

16
 dibiarkan keluar dari kolom. Protein yang terikat dalam kolom, dilepas lagi dengan

cara mengubah kondisi ioniknya (gradien pH atau kekuatan ion yang bias

menyebabkan adanya persaingan antara komponen eluen dengan protein yang

terikat. Material penukar ion merupakan suatu padatan yang mengandung gugus-

gugus bermuatan dan terikat secara kimia, yang dapat mengikat ion secara

reversibel atau secara elektrostatik. Gugus-gugus yang bermuatan tersebut

biasanya terikat pada suatu resin. Fasa diam atau matriks yang digunakan dalam

percobaan ini adalah CMC (Carboxyl Methyl Cellullose) sedangkan fase geraknya

adalah buffer fosfat pH 6,5 dan 7,4.

5. Penentuan aktivitas enzim protease

Penentuan aktivitas enzim biasanya dilakukan pada pH dan suhu optimum

serta konsentrasi substrat dan kofaktor yang berlebih, sehingga laju reaksi yang

terjadi merupakan reaksi tingkat ke nol (zero order reaction) terhadap substrat.

Dalam hal ini, laju reaksi permulaan berbanding lurus konsentrasi enzim sehingga

faktor pembatas laju reaksi (rate limitting factor) yang sebenarnya adalah

konsentrasi enzim.

Menurut perjanjian internasional, satu unit aktivitas enzim adalah jumlah

enzim yang menyebabkan transformasi satu mikromol (10-6 mol) substrat per menit

pada suhu 250C dalam keadaan optimum sistem tersebut.

serapan sampel - serapan blanko

unit aktivitas 
0,001 x waktu hidrolisis

17
 Aktivitas spesifik (specific activity) adalah jumlah unit aktivitas enzim per

miligram protein.

unit aktivitas
aktivitas spesifik enzim protease =
mg protein

6. Penentuan kadar protein dengan metode Lowry

Prinsip dari penentuan kadar protein dengan metode Lowry, yaitu:

a. Reaksi biuret dimana Cu2+ tereduksi menjadi Cu+

b. Cu+ mereduksi reagen follin cioceltau menghasilkan warna biru yang

intensitasnya sebanding dengan kadar protein .

Metode Lowry ini memiliki beberapa keuntungan, yaitu :

 Sensitif pada rentang yang besar

 Bisa dilakukan pada suhu kamar

 10-20 kali lebih sensitif daripada deteksi UV

Sedangkan kerugian metode Lowry :

 Banyak senyawa yang bisa menghasilkan positif palsu

 Reagen harus dibuat segar karena adanya peningkatan jumlah karbonat akibat

dari pengaruh cahaya

 Memerlukan waktu yang cukup lama

 Uji sensitif terhadap cahaya sehingga iluminasi selama uji harus dijaga

konstan untuk seluruh sampel.

18
 BAB IV

PEMBAHASAN

Percobaan ini bertujuan untuk mengisolasi enzim proteolitik dari usus halus

ikan lele, memurnikannya, menentukan aktivitas enzim serta menentukan kadar

protein dari enzim tersebut dengan menggunakan metode Lowry.

Hal pertama yang dilakukan adalah enzim proteolitik diisolasi dari usus ikan

lele. Usus halus ikan lele yang digunakan dicuci bersih terlebih dahulu untuk

mencegah terjadinya kontaminasi mikroba. Pengambilan usus halus ikan lele harus

dilakukan secepat mungkin, dikarenakan ekstrak usus halus ikan lele kaya akan

nutrien sehingga berpotensi menunjang perkembangan mikroba kontaminan.

Pencucian usus ikan lele ini dilakukan menggunakan air dingin. Hal ini dilakukan

dengan tujuan untuk pengkodisiaan awal agar selama proses penghancuran usus ikan

lele masih dalam keadaan dingin. Hal ini juga untuk mencegah kontaminasi mikroba

karena pada temperatur rendah mikroba akan sulit tumbuh. Selain itu hal ini

dilakukan untuk mencegah denaturasi protein (enzim) yang terdapat didalamnya

(enzim stabil) atau juga dapat menyebabkan enzim-enzim tersebut kehilangan

aktivitasnya (enzim tidak aktif pada suhu rendah).

Setelah itu, usus halus ikan lele ini dihomogenasi dengan menggunakan buffer

fosfat pH 6,5. Penambahan buffer pH 6,5 bertujuan untuk menjaga agar enzim

protease pada usus halus ikan lele ini tetap stabil. Jika pH terlalu rendah maka akan

19
mendenaturasi protein. Enzim mempunyai pH optimum dimana enzim ini akan

bekerja maksimum, di bawah atau di atas pH maksimum enzim akan mengalami

denaturasi dan akan berkurang kereaktifannya. Perubahan konsentarsi ion hidrogen

(H+) akan mempengaruhi ionisasi sisi aktif enzim. Jika substrat juga mengandung

gugus yang dapat terionisasi, maka perubahan pH dapat mengubah kapasitasnya

untuk berikatan dengan sisi aktif. Perubahan gugus ionik pada enzim juga dapat

mengubah struktur tersier dari enzim sehingga kebanyakan enzim aktif pada rentang

pH kecil. Oleh karena itulah ditambah larutan buffer yang tidak mengalami

perubahan pH yang berarti pada penambahan sedikit asam maupun basa. Larutan

buffer dibuat dari asal lemah dan garamnya, dimana buffer fosfat dibuat dari asam

lemahnya yaitu asam fosfat dan garamnya.

Usus halus ikan lele ini dihancurkan dengan menggunakan alat waring

blender yang bertujuan untuk memecah dinding sel dari usus halus. Jumlah buffer

fosfat pH 7,4 yang ditambahkan sebanyak 2 mL. Selama proses tersebut berlangsung,

akan timbul efek panas sehingga untuk meredam efek panas tersebut suhu harus

dijaga agar tetap berada di bawah 00C (suhu rendah), hal ini dilakukan dengan

menggunakan penangas es agar enzim tidak terdenaturasi akibat perubahan struktur

enzim yang tadinya folding menjadi unfolding.

Setelah usus halus ikan lele dihancurkan (dengan adanya penambahan 2 mL

buffer fosfat ph 7,4) ekstrak kasar tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm

untuk memisahkan enzim protease dengan komponen-komponen lainnya.

20
Sentrifugasi ini dilakukan dengan menempatkan partikel dan medium suspensinya

dalam medan sentrifugal. Medan sentrifugal menyebabkan partikel bermigrasi lebih

cepat ke arah luar dari sumber rotasi. Dalam operasinya, sentrifugasi dijalankan

dengan menaruh partikel dan medium suspensinya pada ujung dari alat yang berputar,

yaitu rotor. Prinsip dari pemisahan ini adalah perbedaan kecepatan sedimentasi

partikel atau molekul yang disebabkan oleh medan sentrifugal. Kecepatan

sentrifugasi enzim dengan kecepatan sedimentasi komponen lainnya berbeda

sehingga pada saat disentrifugasi dalam medan sentrifugasi terjadi pemisahan.

Setelah disentrifugasi, enzim berada pada supernatan sedangkan endapannya

merupakan organel lisis (pemecahan sel). Enzim berada pada supernatan karena

memiliki densitas lebih kecil dibandingkan densitas pelarutnya dan enzim lebih larut

pada air karena kepolarannya relatif sama dengan air (sesuai dengan prinsip ‘like

dissolved like’). Partikel yang memiliki kecepatan sedimentasi lebih besar

diendapkan terlebih dahulu, dimana kecepatan sedimentasi dipengaruhi oleh

kecepatan perputaran rotor dan jarak partikel dari sumber rotasi. Semakin besar

partikel maka semakin cepat partikel itu mengendap. Selain itu juga dipengaruhi oleh

perbedaan kerapatan partikel dengan medium suspensinya dan viskositas medium

suspensinya.

Supernatan yang diperoleh sebagian diuji ekstrak kasarnya, dan sebagian

lainnya dipipet sebanyak 8 ml dan ditambahkan aseton dingin sebanyak 80 ml.

Tujuannya adalah untuk mengendapkan enzim protease yang ada dalam supernatan

21
tersebut. Penambahan pelarut organik (aseton) dapat menyebabkan reduksi dari sifat

aktifitas air. Kekuatan solvasi air terhadap molekul enzim atau protein hidrofil akan

berkurang dengan meningkatnya keonsentrasi aseton. Hal ini disebabkan oleh reduksi

konstanta dielektrik dari air, penggantian molekul dari air, serta mobilisasi partikel

dari molekul air tersebut melalui vibrasi dan pelarut organik. Air akan lebih tertarik

pada pelarut organik karena kepolaran keduanya relatif sama. Selain tiu aseton

bersifat semipolar.

Untuk pengujian aktivitas enzim, sampel sebanyak 0,1 ml ditambahkan N,N-

dimetilkasein yang berperan sebagai sustrat kemudian ditambahkan buffer fosfat ph

7,6 yang bertujuan untuk mempertahankan pH karena enzim bekerja pada pH

optimum (tertentu). Jika pH asam atau basa maka enzim akan rusak. Kemudian

larutan diinkubasi selama 30 menit. Tujuan dari inkubasi untuk mempercepat reaksi,

karena enzim akan bekerja optimal pada suhu optimum. Setelah diinkubasi, kemudian

ditambahkan larutan TCA (trikloroasetat) 8 % yang berfungsi untuk mengendapkan

protein yang telah terpotong-potong karena adanya akifitas enzim protease. Dengan

adanya TCA 8% maka protein akan terdenaturasi sehingga terbentuk endapan.

Endapan yang terbentuk disaring untuk memisahkan endapan dan filtratnya.

Filtratnya di ukur serapannya pada panjang gelombang 280 nm karena protein

memilki asam-asam amino yang spesifik yang memilki gugus aromatik terkonjugasi

yang dapat menyerap spektra pada panjang gelombang 280 nm, yaitu fenilalanin,

tyrosin, dan tryptophan.

22
 Untuk menentukan kadar protein digunakan metoda Lowry. Penentuan kadar

protein dengan metoda Lowry adalah untuk menentukan kadar protein terlarut

berdasarkan warna yang timbul karena adanya reaksi biuret disamping warna yang

disebabkan oleh reduksi fosfomolibdat-fosfowolframat karena adanya reduksi asam

amino tyrosin dan triptophan dalam molekul protein. Dengan adanya Cu 2+ dalam

suasana basa, biuret akan membentuk kompleks berwarna ungu.

Absorpsi warna dari reaksi biuret dalam penentuan kadar protein diukur pada

panjang gelombang maksimum 750 nm maka absorbansinya diketahui.

Pada penentuan aktivitas enzim hasil kromatogafi penukar ion, sampel dipipet

kemudian ditambahkan dengan N,N-dimetil kasein, buffer fosfat pH 7,6 dan

diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Setelah itu ditambahkan TCA, disaring

dan diukur serapannya, sehingga didapat absorbansi pada panjang gelombang 280

nm. N,N-dimetil kasein ini berfungsi sebagai substrat yang akan terikat pada sisi aktif

enzim sehingga pengukuran aktivitas enzim dapat dilakukan. Inkubasi dilakukan pada

suhu 37 oC untuk meningkatkan aktivitas enzim (dicapai aktivitas yang maksimum)

karena masing-masing enzim memiliki aktivitas berbeda-beda dan aktivitas enzim

akan maksimum pada suhu tersebut. Waktu inkubasi adalah 30 menit karena

merupakan waktu optimum untuk enzim. TCA (Tri Chloroacetat Acid) berfungsi

sebagai inhibitor yang menghentikan reaksi antara enzim dan substrat (enzim

protease dan N,N-dimetil kasein). Penentuan aktivitas enzim dilakukan terhadap

23
ekstrak kasar dan hasil pengendapan. Dari hasil pengukuran serapannya, didapat

ekstrak kasar A= 0,442 dan untuk hasil ekstrak fraksionasi A=0,173.

Pada penentuan kadar protein dengan metode Lowry, fraksi hasil penukar ion

yang membentuk puncak, ekstrak kasar dan hasil pengendapan pereaksi C, dikocok

dan didiamkan selama 10 menit, lalu ditambahkan pereaksi D. hasil pencampuran

diukur serapannya pada panjang gelombang 750 nm, didapat absorbansi untuk hasil

penukar ion yang membentuk puncak A= 0,055 , untuk ekstrak kasar A= 1,293 dan

untuk ekstrak sebelum dimurnikan sebesar A=1,334.

Metode Lowry bekerja melalui dua tahapan. Tahap pertama adalah reaksi

biuret yang merupakan suatu reduksi Cu2+ menjadi Cu+ yang selanjutnya akan

mereduksi pereaksi D yang merupakan reagen follin ciocalteu (fosfomolibdat dan

fosfowolframat). Pada tahapan ini terdeteksi pada range 500-750 nm karena pada

panjang gelombang 750 nm terjadi serapan maksimum.

Penentuan kadar protein ini dilakukan dengan melakukan metode

spektrofotometri dimana untuk metode ini sampel terlebih dahulu dibuat dalam

larutan berwarna karena spektrofotometri dapat mengabsorpsi sinar tampak pada

larutan yang berwarna. Oleh karena itu, protein direaksikan dengan pereaksi D

(pereaksi folin ciocalteu) yang mengandung senyawa fosfomolibdat dan

fosfowolframat yang akan membentuk senyawa kompleks biru bila bereaksi dengan

protein dan warna biru yang timbul mempunyai panjang gelombang maksimum pada

750 nm.

24
 Dari hasil percobaan didapat bahwa enzim protease dapat diisolasi dari usus

halus ikan lele dan diperoleh perolehan kembali protein pada estrak kasar sebesar

100%, fraksionasi hasil pengendapan sebesar 81,36% dan hasil kromatografi penukar

ion sebesar 98%.

Unit aktivitas enzim merupakan jumlah enzim yang menyebabkan kenaikan 0,001

A unit/menit. Unit aktivitas untuk estrak kasar, fraksionasi, dan hasil kromatografi

penukar ion ditentukan dengan persamaan:

serapan sampel - serapan blanko

unit aktivitas 
0,001 x waktu hidrolisis

Dan diperoleh besarnya untuk ekstrak kasar, fraksionasi, dan hasil kromatografi

penukar ion masing-masing sebesar 3,75 ; 0,885 ; dan 0,153.

Sedangkan untuk menentukan kadar protein, diperoleh dengan persamaan

kurva baku dari kadar protein standar. Dari percobaan diperoleh persamaan y=

(2,0895 x 10-3) x + 0.3077. Data dalam bentuk tabel terdapat pada lampiran dan data

menunjukkan bahwa enzim protease terdapat dalam fraksi ke 12,13, dan 14 dimana

pada fraksi ini diperoleh nilai absorbansi tertinggi.

25
 BAB V

KESIMPULAN

Kesimpulan yang dapat diambil dari percobaan yang telah dilakukan, yaitu :

1. Enzim proteolitik dapat diisolasi dari usus halus ikan lele.

2. Kemurnian enzim proteolitik dari usus halus ikan lele dapat ditentukan

dengan kromatografi penukar ion, yaitu sebesar : 1 (ekstrak kasar), 0,2125

(fraksionasi), dan 0,1625 (hasil kromatografi).

3. Aktivitas enzim yang diperoleh sebesar : 7,125 (ekstrak kasar), 5,797

(fraksionasi), dan 7,02 (hasil kromatografi).

4. Kadar protein yang diperoleh sebesar : 471,55 (ekstrak kasar), 491,17

(fraksionasi), dan 120,94 (hasil kromatografi).

26
 DAFTAR PUSTAKA

Arifin, M.Z. 1991. Budidaya Lele. Dohara prize. Semarang.

Basset, J., J. Mendham, R.C. Denney, & G.H. Jeffery. 1994. Buku Ajar Vogel
Analisis Kimia Kuantitatif, diterjemahkan oleh A.H. Pudjaatmaka. EGC.
Jakarta.
Boyer, R.F. 1986. Modern Experimental Biochemistry. The Benjamin Cummings
Publishing Company. California.

Hames, B.D. & N. M. Hooper. 2000. Biochemistry the Instant Notes. Second Edition.
Spinger-Verlag. Hongkong .
Holme, D.J. & H. Peck. 1993. Analytical Biochemistry. Longman Scientific &
Technical. Singapore.
Lehninger, A.L. 1982. Dasar-Dasar Biokimia, diterjemahkan oleh M. Theniwidjaja.
Erlangga. Jakarta.
Mathews, C.K. & M.E. Van Holde. 1990. Biochemistry. The Benjamin Cummings
Publishing Company. California.
Mckee,T. & J.K. Mckee. 1999. Biochemistry an Introduction. Mc Graw Hill
Company, Inc. Boston.
Nelson, D.L. & M.C. Michael. 2008. Principle of Biochemistry. Fifth edition. W.H.
Fremann and Company. New York.
Page, D.J. 1997. Prinsip-Prinsip Biokimia, diterjemahkan oleh R.Soedono. Erlangga.
Jakarta.
Schenk, G.H. 1981. Quantitative Analytical Chemistry. Prentice Hall. New Jersey.
Scopes, R.K. 1994. Protein Purification : Principles & Practice. Springer-Verlag.
New York.
Simanjutak, R.H. 1996. Pembudidayaan Ikan Lele Lokal dan Dumbo. Bhratara.
Jakarta.
Toha, A.H.A. 2001. Deoxyribosa Nucleac Acid. Alfabeta. Bandung.
Voet, O. & J.B. Voet. 1995. Biochemistry. John Willey & Sons. New Jersey.
Winarno, F.G. 1983. Enzim Pangan. P.T. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
Ward, O.P. 1983. Proteinases In Fogatory Microbial Enzymes and Biotechnology.
Applied Science Publisher. New York.

27