P. 1
Laporan Pembahasan Jurnal KROMATOGRAFI

Laporan Pembahasan Jurnal KROMATOGRAFI

|Views: 2,282|Likes:

More info:

Published by: Natalia Debora Panggabean on May 26, 2010
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

06/10/2013

pdf

text

original

Laporan Pembahasan Jurnal Kromatografi II

Nama : Addy Prasetyo Ainaro Claudia Gilang Pramana Natalia Debora P PJP Kelas Dewi Anggraeni, S.Si KIM B – P2 – Kel.1

SENSITIFITAS PERBANDINGAN ANALISIS KOLESTEROL DENGAN KROMATOGRAFI GAS, KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI DAN METODE SPEKTROFOTOMETRI

Pendahuluan Kolesterol merupakan steroid hewani yang terdapat paling meluas dan dijumpai dalam hampir semua jaringan hewan. Kolesterol merupakan zat antara yang diperlukan dalam biosintesis hormon storoid namun tak merpakan keharusan dalam makanan (Fessenden 1986). Kolesterol memiliki struktur kimia yang mengandung 27 atom

karbon, sering ditemukan sebagai komponen dalam membran sel. Kolesterol, dalam jumlah tertentu dibutuhkan oleh tubuh manusia terutama sebagai prekursor pembentukan hormon steroid dan asam empedu. Namun demikian dalam jumlah berlebih dapat memberikan pengaruh yang kurang menguntungkan untuk kesehatan, antara lain dikatakan sebagai penanggung jawab arteroskeloris (penyempitan pembuluh darah), penyakit jantung koroner maupun darah tinggi. Sedangkan kelompok sterol lain sampai saat ini masih belum jelas pengaruhnya terhadap kesehatan. Penentuan kolesterol dianggap penting karena korelasi yang erat terhadap terjadinya koroner penyakit jantung. Metode analisis kolesterol sebelumnya sangat bergantung pada metode spektroskopi dan gravimetri1. Metode yang didasarkan pada enzimatik, ditambah dengan spektrofotometri untuk analisis kolesterol dari darah yang tidak cocok untuk diaplikasikan pada makanan2,3. Metode kromatografi lebih handal, selektif, dan akurat4,5 karena gangguan dari sterol lainnya dapat dengan mudah diselesaikan. Namun, data dari berbagai teknik kromatografi sangat tergantung pada ekstraksi prosedur dan intensitas langkah-langkah saponifikasi8,9,10,11,12. Selanjutnya, para peneliti sebelumnya batas mereka investigasi ke salah perbandingan metode ekstraksi atau pada jenis peralatan analisis yang digunakan13,14,15.

JURNAL KROMATOGRAFI II – Kel.1 KIM B P2

Hal 1

Tujuan Penelitian ini dilakukan untuk membandingkan efisiensi dari tiga prosedur ekstraksi yang dipublikasikan (yaitu kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi dan metode spektrofotometri) dan kontribusi mereka dalam mempengaruhi sensitivitas analisis kolesterol.

Bahan-bahan dan Metode a. Standar kolesterol Standar kolesterol (5-α-cholestan-3-β-ol, grade kromatografi; Sigma Chemical Inc, USA), larutan dibuat dengan pengenceran dari larutan stok (3 mg / mL). Larutan stok digunakan untuk menyiapkan larutan standar yang mengandung 0,03, 0,15, 0,30 dan 0,60 mg/mL kolesterol. Larutan standar tersebut diekstraksi untuk menentukan batas deteksi (Limit Of Detection-LOD), batas kuantisasi (Limit Of Quantitation-LOQ) dan linieritas dari setiap metode. Pengujian setiap prosedur ekstraksi diuji dengan melarutkan standar diencerkan dengan minyak matriks (murni kelapa sawit) b. Analisis menurut Bohac13 Standar kolesterol tersebut disaponifikasikan dengan menggunakan 10 ml ethanolic 2% KOH dan 0.3mL larutan pirogalol. Campuran tersebut diinkubasi pada 80oC selama 15 menit. Setelah pendinginan, 5 mL air suling ditambahkan ke dalam campuran sedangkan bagian yang tidak tersaponifikasi diekstraksi dengan heksana 2x10mL. Ekstrak heksana yang dihasilkan dipanaskan sampai kering dalam penangas air (45oC) c. Analisis menurut Beyer & Jensen5 Larutan standar yang telah disaponifikasi menggunakan 2% KOH beralkohol dan selama 1 jam, fraksi yang tidak tersaponofikasi diekstraksi dengan heksana 2x10mL. Ekstrak digabungkan dan dicuci dengan 5 ml air suling lalu ekstrak dipanaskan sampai kering dalam penangas air (45 oC) d. Analisis menurut bagian Ilmu Kesehatan Queensland Institut16 Larutan standar yang telah disaponifikasi menggunakan 2% KOH beralkohol, fraksi yang tidak tersaponifikasi diekstraksi dengan petroleum eter 4x10mL dan semua ekstrak kemudian digabungkan. Ekstrak dicuci dengan 0.5N NaOH dan

JURNAL KROMATOGRAFI II – Kel.1 KIM B P2

Hal 2

berulang kali dan dengan air suling sampai larutan menjadi netral (pH netral). Sisa air yang masih terikat dihilangkan dengan penambahan natrium sulfat anhidrat secukupnya, kemudian ekstrak dipanaskan dalam penangas air menghilangkan petroleum eter. e. Analisis spektrofotometri Persiapan reagen pewarna: Larutan stok dibuat dengan melarutkan 10g FeCl3.6H2O dalam asam asetat glasial menggunakan labu takar 100 ml, sebelum digunakan, 1.0mL dari larutan stok dipindahkan ke dalam labu 100 ml dan ditambahkan H2SO4 pekat ke dalam larutan. Warna Reaksi: Ekstrak kering dari (a), (b) dan (c) disuspensikan dalam 3ml asam asetat glasial, 2mL pereaksi pewarna FeCl3, larutan berwarna yang dihasilkan itu dibaca serapannya pada panjang gelombang 565nm. Besarnya serapan yang dihasilkan pan ini dibandingkan dengan standar kolesterol eksternal dan

kadar kolesterol dihitung menggunakan persamaan berikut :

Dimana: c = konsentrasi kolesterol (dari kurva standar); DF = faktor pengenceran; W = berat sampel f. Metode kromatografi gas Sebelum analisis, semua kering ekstrak dari (a), (b) dan (c) disuspensikan dalam 0.8ml petroleum eter. Analisis dilakukan dengan HP 5890 Series II Plus Gas Chromatograph (dilengkapi dengan split/splitless injektor dan kontrol tekanan elektronik, EPC); detektor yang digunakan adalah FID (Flame Ionization Detector atau Detektor Ionisasi Nyala); menggunakan kolom kapiler (0.25mm x 25m panjang) dilapisi dengan fasa temperatur tinggi 007-65HT (Alltech, USA). Kondisi GC adalah sebagai berikut: Injeksi volume Suhu injektor Temperatur detektor : 1.0μl : 300oC : 350oC

JURNAL KROMATOGRAFI II – Kel.1 KIM B P2

Hal 3

Suhu pemrograman

: 65oC - 200oC (dengan laju 40oC/min) - 280oC (dengan laju 10o C/min)

Laju aliran gas pembawa (He) g. Metode KCKT Ekstrak kering dari (a),

: 1.6mL/min

(b)

dan

(c)

disuspensikan

dalam

0.8ml

isopropanol. Analisis isokratik (50% asetonitril: 50% isopropanol) dilakukan dengan menggunakan kolom C18 Waters Symmetry (4.6mm x 250mm) pada sistem HPLC, yang terdiri dari 980 Jasco PU-HPLC Pump, Waters 480 UV-VIS Detector, dan data pengolahan dari perangkat lunak. h. Ketepatan instrumen pengukur Presisi tersebut didasarkan pada keakuratan konsentrasi kolesterol diukur terhadap konsentrasi kolesterol yang diketahui17. Berdasarkan empat kali pengulangan yang dilakukan, pengukuran koefisien variasi (CV) dihitung. i. Penentuan LOD dan LOQ Perkiraan didasarkan pada metode yang diusulkan oleh peneliti17,18, sebelumnya di mana LOD dicapai ketika sinyal/noise (S/N) rasionya adalah 3, sedangkan batas kuantisasi didefinisikan sebagai titik di mana S/N = 10.

Hasil dan Pembahasan Kepekaan yang dihasilkan jika spektrofotometer, kromatografi gas dan kromatografi cair kinerja tinggi digunakan dalam analisis larutan standar

kolesterol, hasilnya ditunjukkan dalam Tabel 1. Presisi atau ketepatan setiap alat pengukur didefinisikan oleh Dyson17 sebagai pengukuran yang ditentukan dengan CV kurang dari 5%; jika CV yang dihasilkan 10%, maka presisi atau ketepatan dari instrumen dianggap baik. Tabel 1 Sensitifitas Instrumen untuk Analisis Kolesterol
Jumlah Instrumen Sebenarnya (mg) Spektrofotometer KCKT Kromatografi Gas 0,27 0,27 0,27 Presisi (n=8) Pengukuran (mg) 0,203 ± 0,032 0,263 ± 0,013 0,202 ± 0,048 CV (%) 5,76 4,94 23,76 LOD (µg/mL) 14,00 0,08 4,00 LOQ (µg/mL) 15,00 0,60 13,00

JURNAL KROMATOGRAFI II – Kel.1 KIM B P2

Hal 4

Peralatan yang paling konsisten bedasarkan percobaan adalah KCKT yang memberikan nilai LOD dan LOQ terendah. Bahkan pada LOD yang rendah, respon yang dihasilkan jelas berbeda (Gambar 1).

Gambar 1 Kromatogram Analisis Kolesterol dengan KCKT Sebaliknya, LOD kromatografi gas lebih tinggi dan kurang reprodusibel, yang ditunjukkan oleh CV yang lebih tinggi. Kolesterol telah dianalisis tanpa derivatisasi terlebih dulu dan puncak yang dihasilkan lebih tajam. TMS-derivatised cholesterol akan mengganggu linieritas karena adanya pengendapan silikondioksida pada detektor (FID)22,23. Kinerja spektrofotometer, lebih baik daripada GC dalam hal reproduktibilitas, tetapi kepekaannya kurang (LOD = 14 µg/mL) dibandingkan dengan metode KCKT. Tidak seperti yang telah dikemukakan oleh Bachman dkk24, KCKT juga kembali menunjukkan nilai kolesterol yang paling dekat (0,263 mg/mL), relatif terhadap nilai sebenarnya dari standar uji (0,270 mg/mL). Berdasarkan data ini, KCKT adalah metode yang dianggap sebagai metode pilihan untuk penentuan kolesterol.

Gambar 2 Kromatogram Analisis Kolesterol Dengan Kromatografi Gas
Hal 5

JURNAL KROMATOGRAFI II – Kel.1 KIM B P2

Pada konsentrasi yang lebih tinggi (Gambar 2) respon yang diperoleh sangat tepat dan reprodusibel. Kisaran konsentrasi dipilih untuk seri pengenceran yang sesuai dengan kisaran normal kolesterol yang ditemukan dalam matriks makanan, Tanggapan deteksi dan linieritas standar diekstraksi dari minyak matriks sangat bagus untuk analisis dengan KCKT. Relatif baik terhadap standar (Gambar 3).

Gambar 3 Kurva Standar Analisis Kolesterol dengan berbagai metode preparasi

Tabel 2 Kolesterol yang di dapatkan dari Matriks Minyak
Metode 1. Spektrofotometri Bohac B&J QSE 2. KCKT Bohac B&J QSE 3. Kromatografi Gas Bohac B&J QSE 0,30 0,30 0,30 0,25 0,18 0,44 28,57 51,23 34,38 83,33 60,00 146,67 0,30 0,30 0,30 0,29 0,22 0,33 7,50 9,10 9,56 96,67 73,33 110 0,30 0,30 0,30 0,26 0,11 0,38 6,66 18,17 18,42 86,67 36,67 126,67 Konsentrasi sebenarnya (mg/mL) Ekstrak Kolesterol* (mg/mL) CV (%) Perolehan kembali (%)

Perolehan kembali kolesterol standar menggunakan semua tiga metode diperlihatkan pada Tabel 2. Berdasarkan hasil dari Gambar. 3 dan Tabel 2, jelas bahwa

JURNAL KROMATOGRAFI II – Kel.1 KIM B P2

Hal 6

metode ekstraksi yang diusulkan oleh Bohac et al.,13 lebih unggul daripada dua metode lainnya. Kolesterol yang di dapatkan kembali jumlahnya sangat dekat dengan jumlah kolesterol ditambahkan. Metode Queensland16 selalu menghasilkan nilai-nilai yang lebih tinggi (terlalu tinggi), seperti yang diperhatikan sebelumnya oleh peneliti, kadar kolesterol dapat dipengaruhi oleh metode ekstraksi dan analisis5,6.

Referensi 1 Sweeney, J. & Weihrauch, J. 1976. Summary of available data for cholesterol in food and methods for its determination. CRC Crit. Rev. Food Nutr. 8, 131 – 159. 2 Touchstone, J.C. 1986. CRC Handbook of Chromatography. CRC Press Inc., Florida, USA. pp 21-218. 3 Jiang, Z., Fenton, M. & Sim, J.S. 1991. Comparison of four different methods for egg cholesterol determination. Poult. Sci. 70(4), 1015 – 1018 4 Maxwell, R.J. & Schwartz, D.P. 1979. A rapid quantitative procedure for measuring the unsaponified matter from animal, marine and plant oil. J.Am. Oil Chem. Soc. 56(6), 636 – 635 5 Beyer, R.S. & Jensen, L.S. 1989. Overestimation of cholesterol content of eggs. J.Agric.Food Chem. 37, 917 – 920 6 Kritchevsky, D. & Dehoff, J.L. 1978. Sterol content of seafood as a function of analytical method. J.Food Sci. 43(6), 1786 – 1789 7 Folch, J.,Lees, M. & Sloane, G.H. 1956. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol.Chem. 226, 497 - 509 8 Hubbard, W.D., Sheppard, A.J., Newkirk, D.R. & Osgood, T.J. 1977. Gas liquid chromatographic determination of cholesterol and other sterols in foods. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 60(6), 1302 – 1305 9 Punwar, J.K. 1976. Gas liquid chromatographic determination of total cholesterol in multi-component foods. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 58(4), 804-809 10 Sheppard, A.J., Newkirk, D.R., Hubbard, W.D. & Osgood, T. 1977. Gas liquid chromatographic determination of cholesterol and other sterols in foods. J.Assoc.Off. Anal. Chem. 60(6), 1302 - 1306 11 Oles, P., Gates, G. Kensinger, S., Patchell, J., Schumacher, T. & Silcox, A. 1990. Optimization of the determination of cholesterol in various food matrices. J.Assoc. Off. Anal. Chem. 73(3), 724 - 727

JURNAL KROMATOGRAFI II – Kel.1 KIM B P2

Hal 7

12 Bitman, J. & Wood, D.L. 1980. Comparison of two extraction of cholesterol in egg yolk. Poult.Sci. 59(7), 2014 – 2017 13 Bohac, C.E., Rhee, K.S., Cross, H.R. & Ono, K. 1984. Assessment of methodologies for colorimetric cholesterol assay of meat. J.Food Sci. 53(6), 1642 – 1693. 14 Elswyk, R.D., Schake, L.S. & Hargis, P.S. 1991. Research Note: Evaluation of two extraction methods for the determination of egg yolk cholesterol. Poult. Sci. 70(4), 1528 15 Guiochon, C.G. & Siouffi, A. 1979. Comparison of various systems for separation of free sterols by HPLC. J.Anal.Chem. 51(11), 1661 – 166 16 Queensland Health Science Institute (1995) Method QSE-CAM-004. 17 Dyson, N. 1992. Chromatographic Integration Methods. The Royal Society of Chemistry, Cambridge, United Kingdom. 1-67, 87-156. 18 Smith, J.S. 1994. Evaluation of analytical data. In: Nielsen, S.S. 1994. Introduction to the chemical analysis of food. Jones & Bartlett Publ., London. pp 53-59. 19 Fenton, M. & Sim, J.S. 1991. Determination of egg yolk content by on-column capillary gas chromatography. J.Chromatogr. 540, 323 – 329 20 Duncan, I.W., Culbreth, P.H. & Burtis, C.A. 1979. Determination of free, total and esterified cholesterol by HPLC. J.Chromatogr. 162, 281-292 21 Ballesteros, E., Gallego, M. & Valcarcel, M. 1996. Gas chromatographic determination of cholesterol and tocopherol in oils and fats with automatic removal of interfering triglyderides. J.Chromatogr. 719, 221- 227 22 Kovacs, M.I.P., Anderson, W.E. & Ackman, R.G. 1979. A simple method for the determination of cholesterol and some plant sterols in fishery-based food products. J.Food Sc. 44 , 1299 – 1300 23 Al-Hasani, S.M., Shabany, H. & Hlavac, J. 1993. Rapid determination of cholesterol in selected frozen foods. J.Assoc. Off. .Anal.Chem. 73(5), 817 – 820 24 Bachman, K.C., Lin, J.H. 7 Wilcox, C.J. 1976. Sensitive colorimetric determination cholesterol in dairy products. J.Assoc. off.Anal.Chem. 59(5), 1146-1149

JURNAL KROMATOGRAFI II – Kel.1 KIM B P2

Hal 8

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->