Laporan Pembahasan Jurnal Nama : Addy Prasetyo

Kromatografi II Ainaro Claudia

Gilang Pramana
Natalia Debora P
PJP Dewi Anggraeni, S.Si
Kelas KIM B – P2 – Kel.1

SENSITIFITAS PERBANDINGAN ANALISIS KOLESTEROL DENGAN KROMATOGRAFI GAS,

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI DAN METODE SPEKTROFOTOMETRI

Pendahuluan
Kolesterol merupakan steroid hewani yang terdapat paling meluas dan dijumpai
dalam hampir semua jaringan hewan. Kolesterol merupakan zat antara yang diperlukan
dalam biosintesis hormon storoid namun tak merpakan keharusan dalam makanan
(Fessenden 1986). Kolesterol memiliki struktur kimia yang mengandung 27 atom
karbon, sering ditemukan sebagai komponen dalam membran sel. Kolesterol, dalam
jumlah tertentu dibutuhkan oleh tubuh manusia terutama sebagai prekursor
pembentukan hormon steroid dan asam empedu. Namun demikian dalam jumlah
berlebih dapat memberikan pengaruh yang kurang menguntungkan untuk kesehatan,
antara lain dikatakan sebagai penanggung jawab arteroskeloris (penyempitan pembuluh
darah), penyakit jantung koroner maupun darah tinggi. Sedangkan kelompok sterol lain
sampai saat ini masih belum jelas pengaruhnya terhadap kesehatan.
Penentuan kolesterol dianggap penting karena korelasi yang erat terhadap
terjadinya koroner penyakit jantung. Metode analisis kolesterol sebelumnya sangat
bergantung pada metode spektroskopi dan gravimetri1. Metode yang didasarkan pada
enzimatik, ditambah dengan spektrofotometri untuk analisis kolesterol dari darah yang
tidak cocok untuk diaplikasikan pada makanan2,3.
Metode kromatografi lebih handal, selektif, dan akurat4,5 karena gangguan dari
sterol lainnya dapat dengan mudah diselesaikan. Namun, data dari berbagai teknik
kromatografi sangat tergantung pada ekstraksi prosedur dan intensitas langkah-langkah
saponifikasi8,9,10,11,12. Selanjutnya, para peneliti sebelumnya batas mereka investigasi ke
salah perbandingan metode ekstraksi atau pada jenis peralatan analisis yang
digunakan13,14,15.

JURNAL KROMATOGRAFI II – Kel.1 KIM B P2 Hal 1

Tujuan
Penelitian ini dilakukan untuk membandingkan efisiensi dari tiga prosedur
ekstraksi yang dipublikasikan (yaitu kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi
dan metode spektrofotometri) dan kontribusi mereka dalam mempengaruhi sensitivitas
analisis kolesterol.

Bahan-bahan dan Metode

a. Standar kolesterol
Standar kolesterol (5-α-cholestan-3-β-ol, grade kromatografi; Sigma Chemical
Inc, USA), larutan dibuat dengan pengenceran dari larutan stok (3 mg /
mL). Larutan stok digunakan untuk menyiapkan larutan standar yang
mengandung 0,03, 0,15, 0,30 dan 0,60 mg/mL kolesterol. Larutan standar
tersebut diekstraksi untuk menentukan batas deteksi (Limit Of Detection-LOD),
batas kuantisasi (Limit Of Quantitation-LOQ) dan linieritas dari setiap
metode. Pengujian setiap prosedur ekstraksi diuji dengan melarutkan standar
diencerkan dengan minyak matriks (murni kelapa sawit)
b. Analisis menurut Bohac13
Standar kolesterol tersebut disaponifikasikan dengan menggunakan 10 ml
ethanolic 2% KOH dan 0.3mL larutan pirogalol. Campuran tersebut diinkubasi
pada 80oC selama 15 menit. Setelah pendinginan, 5 mL air suling ditambahkan
ke dalam campuran sedangkan bagian yang tidak tersaponifikasi diekstraksi
dengan heksana 2x10mL. Ekstrak heksana yang dihasilkan dipanaskan sampai
kering dalam penangas air (45oC)
c. Analisis menurut Beyer & Jensen5
Larutan standar yang telah disaponifikasi menggunakan 2% KOH beralkohol dan
selama 1 jam, fraksi yang tidak tersaponofikasi diekstraksi dengan heksana
2x10mL. Ekstrak digabungkan dan dicuci dengan 5 ml air suling lalu ekstrak
dipanaskan sampai kering dalam penangas air (45 oC)
d. Analisis menurut bagian Ilmu Kesehatan Queensland Institut16
Larutan standar yang telah disaponifikasi menggunakan 2% KOH beralkohol,
fraksi yang tidak tersaponifikasi diekstraksi dengan petroleum eter 4x10mL dan
semua ekstrak kemudian digabungkan. Ekstrak dicuci dengan 0.5N NaOH dan

JURNAL KROMATOGRAFI II – Kel.1 KIM B P2 Hal 2

 berulang kali dan dengan air suling sampai larutan menjadi netral (pH
netral). Sisa air yang masih terikat dihilangkan dengan penambahan natrium
sulfat anhidrat secukupnya, kemudian ekstrak dipanaskan dalam penangas air
menghilangkan petroleum eter.
e. Analisis spektrofotometri
Persiapan reagen pewarna:
Larutan stok dibuat dengan melarutkan 10g FeCl3.6H2O dalam asam asetat
glasial menggunakan labu takar 100 ml, sebelum digunakan, 1.0mL dari larutan
stok dipindahkan ke dalam labu 100 ml dan ditambahkan H2SO4 pekat ke dalam
larutan.
Warna Reaksi:
Ekstrak kering dari (a), (b) dan (c) disuspensikan dalam 3ml asam asetat glasial,
2mL pereaksi pewarna FeCl3, larutan berwarna yang dihasilkan itu dibaca
serapannya pada panjang gelombang 565nm. Besarnya serapan yang dihasilkan
pan ini dibandingkan dengan standar kolesterol eksternal dan
kadar kolesterol dihitung menggunakan persamaan berikut :

Dimana:
c = konsentrasi kolesterol (dari kurva standar);
DF = faktor pengenceran;
W = berat sampel
f. Metode kromatografi gas
Sebelum analisis, semua kering ekstrak dari (a), (b) dan (c) disuspensikan dalam
0.8ml petroleum eter. Analisis dilakukan dengan HP 5890 Series II Plus Gas
Chromatograph (dilengkapi dengan split/splitless injektor dan kontrol tekanan
elektronik, EPC); detektor yang digunakan adalah FID (Flame Ionization Detector
atau Detektor Ionisasi Nyala); menggunakan kolom kapiler (0.25mm x 25m
panjang) dilapisi dengan fasa temperatur tinggi 007-65HT (Alltech, USA).
Kondisi GC adalah sebagai berikut:
Injeksi volume : 1.0μl
Suhu injektor : 300oC
Temperatur detektor : 350oC

JURNAL KROMATOGRAFI II – Kel.1 KIM B P2 Hal 3

 Suhu pemrograman : 65oC - 200oC (dengan laju 40oC/min) - 280oC
(dengan laju 10o C/min)
Laju aliran gas pembawa (He) : 1.6mL/min
g. Metode KCKT
Ekstrak kering dari (a), (b) dan (c) disuspensikan dalam 0.8ml
isopropanol. Analisis isokratik (50% asetonitril: 50% isopropanol) dilakukan
dengan menggunakan kolom C18 Waters Symmetry (4.6mm x 250mm) pada
sistem HPLC, yang terdiri dari 980 Jasco PU-HPLC Pump, Waters 480 UV-VIS
Detector, dan data pengolahan dari perangkat lunak.
h. Ketepatan instrumen pengukur
Presisi tersebut didasarkan pada keakuratan konsentrasi kolesterol diukur
terhadap konsentrasi kolesterol yang diketahui17. Berdasarkan empat kali
pengulangan yang dilakukan, pengukuran koefisien variasi (CV) dihitung.
i. Penentuan LOD dan LOQ
Perkiraan didasarkan pada metode yang diusulkan oleh peneliti17,18, sebelumnya
di mana LOD dicapai ketika sinyal/noise (S/N) rasionya adalah 3, sedangkan
batas kuantisasi didefinisikan sebagai titik di mana S/N = 10.

Hasil dan Pembahasan

Kepekaan yang dihasilkan jika spektrofotometer, kromatografi gas dan
kromatografi cair kinerja tinggi digunakan dalam analisis larutan standar
kolesterol, hasilnya ditunjukkan dalam Tabel 1. Presisi atau ketepatan setiap alat
pengukur didefinisikan oleh Dyson17 sebagai pengukuran yang ditentukan dengan CV
kurang dari 5%; jika CV yang dihasilkan 10%, maka presisi atau ketepatan dari instrumen
dianggap baik.
Tabel 1 Sensitifitas Instrumen untuk Analisis Kolesterol
Jumlah Presisi (n=8)
LOD LOQ
Instrumen Sebenarnya
Pengukuran (mg) CV (%) (µg/mL) (µg/mL)
(mg)
Spektrofotometer 0,27 0,203 ± 0,032 5,76 14,00 15,00
KCKT 0,27 0,263 ± 0,013 4,94 0,08 0,60
Kromatografi Gas 0,27 0,202 ± 0,048 23,76 4,00 13,00

JURNAL KROMATOGRAFI II – Kel.1 KIM B P2 Hal 4

 Peralatan yang paling konsisten bedasarkan percobaan adalah KCKT yang
memberikan nilai LOD dan LOQ terendah. Bahkan pada LOD yang rendah, respon yang
dihasilkan jelas berbeda (Gambar 1).

Gambar 1 Kromatogram Analisis Kolesterol dengan KCKT

Sebaliknya, LOD kromatografi gas lebih tinggi dan kurang reprodusibel, yang
ditunjukkan oleh CV yang lebih tinggi. Kolesterol telah dianalisis tanpa derivatisasi
terlebih dulu dan puncak yang dihasilkan lebih tajam. TMS-derivatised cholesterol akan
mengganggu linieritas karena adanya pengendapan silikondioksida pada detektor
(FID)22,23. Kinerja spektrofotometer, lebih baik daripada GC dalam hal reproduktibilitas,
tetapi kepekaannya kurang (LOD = 14 µg/mL) dibandingkan dengan metode KCKT. Tidak
seperti yang telah dikemukakan oleh Bachman dkk24, KCKT juga kembali menunjukkan
nilai kolesterol yang paling dekat (0,263 mg/mL), relatif terhadap nilai sebenarnya dari
standar uji (0,270 mg/mL). Berdasarkan data ini, KCKT adalah metode yang dianggap
sebagai metode pilihan untuk penentuan kolesterol.

Gambar 2 Kromatogram Analisis Kolesterol Dengan Kromatografi Gas

JURNAL KROMATOGRAFI II – Kel.1 KIM B P2 Hal 5

 Pada konsentrasi yang lebih tinggi (Gambar 2) respon yang diperoleh sangat
tepat dan reprodusibel. Kisaran konsentrasi dipilih untuk seri pengenceran yang sesuai
dengan kisaran normal kolesterol yang ditemukan dalam matriks makanan, Tanggapan
deteksi dan linieritas standar diekstraksi dari minyak matriks sangat bagus untuk analisis
dengan KCKT. Relatif baik terhadap standar (Gambar 3).

Gambar 3 Kurva Standar Analisis Kolesterol dengan berbagai metode preparasi

Tabel 2 Kolesterol yang di dapatkan dari Matriks Minyak

Konsentrasi Ekstrak Kolesterol* Perolehan
Metode CV (%)
sebenarnya (mg/mL) (mg/mL) kembali (%)
1. Spektrofotometri
Bohac 0,30 0,26 6,66 86,67
B&J 0,30 0,11 18,17 36,67
QSE 0,30 0,38 18,42 126,67
2. KCKT
Bohac 0,30 0,29 7,50 96,67
B&J 0,30 0,22 9,10 73,33
QSE 0,30 0,33 9,56 110
3. Kromatografi Gas
Bohac 0,30 0,25 28,57 83,33
B&J 0,30 0,18 51,23 60,00
QSE 0,30 0,44 34,38 146,67

Perolehan kembali kolesterol standar menggunakan semua tiga metode

diperlihatkan pada Tabel 2. Berdasarkan hasil dari Gambar. 3 dan Tabel 2, jelas bahwa

JURNAL KROMATOGRAFI II – Kel.1 KIM B P2 Hal 6

metode ekstraksi yang diusulkan oleh Bohac et al.,13 lebih unggul daripada dua metode
lainnya. Kolesterol yang di dapatkan kembali jumlahnya sangat dekat dengan jumlah
kolesterol ditambahkan. Metode Queensland16 selalu menghasilkan nilai-nilai yang lebih
tinggi (terlalu tinggi), seperti yang diperhatikan sebelumnya oleh peneliti, kadar
kolesterol dapat dipengaruhi oleh metode ekstraksi dan analisis5,6.

Referensi
1 Sweeney, J. & Weihrauch, J. 1976. Summary of available data for cholesterol in food
and methods for its determination. CRC Crit. Rev. Food Nutr. 8, 131 – 159.
2 Touchstone, J.C. 1986. CRC Handbook of Chromatography. CRC Press Inc., Florida, USA.
pp 21-218.
3 Jiang, Z., Fenton, M. & Sim, J.S. 1991. Comparison of four different methods for egg
cholesterol determination. Poult. Sci. 70(4), 1015 – 1018
4 Maxwell, R.J. & Schwartz, D.P. 1979. A rapid quantitative procedure for measuring the
unsaponified matter from animal, marine and plant oil. J.Am. Oil Chem. Soc. 56(6),
636 – 635
5 Beyer, R.S. & Jensen, L.S. 1989. Overestimation of cholesterol content of eggs.
J.Agric.Food Chem. 37, 917 – 920
6 Kritchevsky, D. & Dehoff, J.L. 1978. Sterol content of seafood as a function of analytical
method. J.Food Sci. 43(6), 1786 – 1789
7 Folch, J.,Lees, M. & Sloane, G.H. 1956. A simple method for the isolation and
purification of total lipids from animal tissues. J. Biol.Chem. 226, 497 - 509
8 Hubbard, W.D., Sheppard, A.J., Newkirk, D.R. & Osgood, T.J. 1977. Gas liquid
chromatographic determination of cholesterol and other sterols in foods. J. Assoc.
Off. Anal. Chem. 60(6), 1302 – 1305
9 Punwar, J.K. 1976. Gas liquid chromatographic determination of total cholesterol in
multi-component foods. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 58(4), 804-809
10 Sheppard, A.J., Newkirk, D.R., Hubbard, W.D. & Osgood, T. 1977. Gas liquid
chromatographic determination of cholesterol and other sterols in foods.
J.Assoc.Off. Anal. Chem. 60(6), 1302 - 1306
11 Oles, P., Gates, G. Kensinger, S., Patchell, J., Schumacher, T. & Silcox, A. 1990.
Optimization of the determination of cholesterol in various food matrices. J.Assoc.
Off. Anal. Chem. 73(3), 724 - 727

JURNAL KROMATOGRAFI II – Kel.1 KIM B P2 Hal 7

12 Bitman, J. & Wood, D.L. 1980. Comparison of two extraction of cholesterol in egg
yolk. Poult.Sci. 59(7), 2014 – 2017
13 Bohac, C.E., Rhee, K.S., Cross, H.R. & Ono, K. 1984. Assessment of methodologies for
colorimetric cholesterol assay of meat. J.Food Sci. 53(6), 1642 – 1693.
14 Elswyk, R.D., Schake, L.S. & Hargis, P.S. 1991. Research Note: Evaluation of two
extraction methods for the determination of egg yolk cholesterol. Poult. Sci. 70(4),
1528
15 Guiochon, C.G. & Siouffi, A. 1979. Comparison of various systems for separation of
free sterols by HPLC. J.Anal.Chem. 51(11), 1661 – 166
16 Queensland Health Science Institute (1995) Method QSE-CAM-004.
17 Dyson, N. 1992. Chromatographic Integration Methods. The Royal Society of
Chemistry, Cambridge, United Kingdom. 1-67, 87-156.
18 Smith, J.S. 1994. Evaluation of analytical data. In: Nielsen, S.S. 1994. Introduction to
the chemical analysis of food. Jones & Bartlett Publ., London. pp 53-59.
19 Fenton, M. & Sim, J.S. 1991. Determination of egg yolk content by on-column
capillary gas chromatography. J.Chromatogr. 540, 323 – 329
20 Duncan, I.W., Culbreth, P.H. & Burtis, C.A. 1979. Determination of free, total and
esterified cholesterol by HPLC. J.Chromatogr. 162, 281-292
21 Ballesteros, E., Gallego, M. & Valcarcel, M. 1996. Gas chromatographic determination
of cholesterol and tocopherol in oils and fats with automatic removal of
interfering triglyderides. J.Chromatogr. 719, 221- 227
22 Kovacs, M.I.P., Anderson, W.E. & Ackman, R.G. 1979. A simple method for the
determination of cholesterol and some plant sterols in fishery-based food
products. J.Food Sc. 44 , 1299 – 1300
23 Al-Hasani, S.M., Shabany, H. & Hlavac, J. 1993. Rapid determination of cholesterol in
selected frozen foods. J.Assoc. Off. .Anal.Chem. 73(5), 817 – 820
24 Bachman, K.C., Lin, J.H. 7 Wilcox, C.J. 1976. Sensitive colorimetric determination
cholesterol in dairy products. J.Assoc. off.Anal.Chem. 59(5), 1146-1149

JURNAL KROMATOGRAFI II – Kel.1 KIM B P2 Hal 8