Validasi Metode Analisis

Metode validasi adalah proses yang digunakan untuk mengkonfirmasi bahwa

prosedur analitis digunakan untuk tes tertentu cocok untuk digunakan. Hasil dari
validasi metode dapat digunakan untuk menilai kualitas, keandalan dan konsistensi
dari hasil analisis, melainkan merupakan bagian integral dari setiap praktek analitis
yang baik.
metode Analytical perlu divalidasi atau revalidated
a. sebelum diperkenalkan ke dalam penggunaan rutin;
b. setiap kali perubahan kondisi untuk metode mana yang
telah divalidasi (misalnya, instrumen dengan karakteristik yang berbeda atau
sampel yang berbeda dengan matriks)
c. kapan metode ini berubah dan perubahan di luar lingkup
asli metode ini.
Metode validasi telah menerima perhatian yang cukup besar dalam literatur dan
dari komite industri dan badan pengatur.
a. The US FDA cGMP permintaan di bagian metode yang
akan divalidasi: Ketelitian, sensitivitas, spesifisitas, dan reproduksibilitas
metode pengujian yang digunakan oleh perusahaan harus dibuat dan
didokumentasikan. validasi semacam itu dan dokumentasi dapat dicapai sesuai
persyaratan-persyaratan termasuk pernyataan dari setiap metode yang
digunakan dalam pengujian sampel yang tepat untuk memenuhi standar akurasi
dan reliabilitas, sebagaimana yang diterapkan untuk produk diuji. FDA Amerika
juga mengusulkan bimbingan industri untuk Analitik Prosedur dan Metode
Validasi.
b. ISO / IEC 17025 mencakup sebuah bab tentang validasi
metode dengan daftar sembilan parameter validasi. The ICH telah
mengembangkan teks validasi konsensus mengenai prosedur analitis. Dokumen
tersebut mencakup definisi untuk delapan karakteristik validasi. ICH juga
mengembangkan pedoman dengan metodologi rinci .
 c. US EPA dipersiapkan untuk menjadi pedoman
pembangunan dan validasi metode untuk Konservasi Sumber Daya dan
Recovery Act (RCRA). The AOAC, EPA dan organisasi ilmiah lain
memberikan metode yang disahkan melalui studi multi-laboratorium.
USP telah menerbitkan pedoman khusus untuk validasi metode untuk evaluasi
senyawa. USP mendefinisikan delapan langkah untuk validasi:
a. Ketepatan
b. Ketelitian
c. Kekhususan
d. Batas deteksi
e. Batas kuantisasi
f. Linieritas dan jangkauan
g. Kekasaran
h. Kesegaran
FDA juga telah menerbitkan petunjuk untuk validasi metode bioanalytical.
Dokumen paling komprehensif adalah laporan konferensi konferensi Washington
1990: Validasi Metode Analitik: Bioavailabilitas, Bioekuivalensi dan
Farmakokinetika Studi, yang disponsori oleh, antara lain, Asosiasi Amerika untuk
ilmuwan Farmasi (AAPS), yang AOAC dan FDA Amerika Serikat. Laporan ini
menyajikan prinsip untuk memvalidasi studi tentang manusia dan hewan subyek
keduanya. Laporan ini juga telah digunakan sebagai dasar untuk dokumen industri
bimbingan FDA.
Perwakilan dari industri farmasi dan kimia telah menerbitkan makalah di
validasi metode analisis. Hokanson menerapkan pendekatan siklus hidup, yang
dikembangkan untuk sistem komputerisasi, untuk validasi dan revalidation metode.
Green memberikan panduan praktis untuk validasi metode analisis, dengan deskripsi
dari serangkaian persyaratan minimum untuk suatu metode. Renger dan rekan-
rekannya menggambarkan validasi prosedur analitis khusus untuk analisis tablet
teofilin dalam menggunakan performa tinggi kromatografi lapisan tipis
(HPTLC). Prosedur validasi dalam artikel ini khusus didasarkan pada persyaratan
untuk pendaftaran multistate Uni Eropa.
Wegscheider telah menerbitkan prosedur untuk validasi metode dengan fokus
khusus pada kalibrasi, eksperimen pemulihan, metode perbandingan dan penyelidikan
kekasaran.  AOAC telah mengembangkan program-Verified Metode validasi rekan
dengan panduan lengkap tentang hal apa yang parameter harus divalidasi. Winslow
dan Meyer merekomendasikan definisi dan penerapan rencana induk untuk validasi
metode analisis. J. Breaux dan rekan telah menerbitkan sebuah studi pada
pengembangan metode analisis dan validasi. Titik kunci adalah untuk
mengembangkan metode untuk validasi mudah dan revalidation. O. Krause
menerbitkan sebuah panduan untuk transfer metode analitis, komparatif,
pemeliharaan dan kriteria penerimaan untuk pengujian biopharmaceuticals.
Pelajaran ini memberikan review dan strategi untuk validasi metode analisis
untuk kedua metode yang dikembangkan in-house serta metode standar, dan
rekomendasi mengenai dokumentasi yang harus dihasilkan selama, dan pada saat
penyelesaian, validasi metode. Hal ini juga menjelaskan apa yang penting ketika
mentransfer sebuah metode.
Validitas dari metode spesifik harus ditunjukkan dalam percobaan laboratorium
menggunakan contoh atau standar yang mirip dengan sampel yang tidak diketahui
dianalisis secara rutin. Penyusunan dan pelaksanaan harus mengikuti protokol
validasi, sebaiknya ditulis dalam instruksi langkah demi langkah
format.Kemungkinan langkah-langkah untuk validasi metode lengkap yang tercantum
dalam Tabel 1. Prosedur yang diusulkan ini mengasumsikan bahwa instrumen
tersebut telah dipilih dan metode telah dikembangkan. Hal ini memenuhi kriteria
seperti kemudahan penggunaan, kemampuan untuk menjadi otomatis dan
dikendalikan oleh sistem komputer; biaya per analisa; throughput sampel; waktu
penyelesaian, dan lingkungan, kesehatan dan keselamatan.
1. Mengembangkan protokol validasi, sebuah prosedur operasi atau rencana
validasi master untuk validasi
2. Untuk proyek validasi spesifik mendefinisikan dan tanggung jawab pemilik
 3. Mengembangkan rencana proyek validasi
4. Tentukan aplikasi, tujuan dan ruang lingkup metode
5. Tentukan parameter kinerja dan kriteria penerimaan
6. Tentukan validasi eksperimen
7. Verifikasi karakteristik kinerja peralatan yang relevan
8. Kualifikasi bahan, misalnya standar dan reagen untuk kemurnian, jumlah yang
cukup akurat dan stabilitas
9. Melakukan percobaan pra-validasi
10. Sesuaikan parameter metode atau / dan kriteria penerimaan jika perlu
11. Melakukan penuh internal (dan eksternal) eksperimen validasi
12. Mengembangkan SOP untuk melaksanakan metode ini dalam rutinitas
13. Tentukan kriteria untuk revalidation
14. Menetapkan jenis dan frekuensi uji kesesuaian sistem dan / atau pengendalian
mutu analitis (AQC) cek untuk rutin
15. Dokumen validasi eksperimen dan hasil dalam laporan validasi
Keberhasilan penerimaan parameter validasi dan kriteria kinerja, oleh semua
pihak yang terlibat, membutuhkan upaya kerjasama dari beberapa departemen,
termasuk pengembangan analitis, QC, urusan peraturan dan individu yang
membutuhkan data analitis. Prosedur operasi atau Validasi Master Plan (VMP) harus
secara jelas mendefinisikan peran dan tanggung jawab masing-masing departemen
yang terlibat dalam validasi metode analisis.
Ruang lingkup metode dan kriteria validasi yang harus didefinisikan pada awal
proses. Ini termasuk pertanyaan-pertanyaan berikut:
a. Apa analit harus terdeteksi?
b. Apa tingkat konsentrasi yang diharapkan?
c. Apakah matriks sampel?
d. Apakah ada zat campuran yang diharapkan, dan jika
demikian, zat campuran tersebut harus dideteksi dan dihitung?
e. Apakah ada peraturan khusus legislatif atau persyaratan?
f. Secara kualitatif atau kuantitatif?
 g. Apa saja yang diperlukan deteksi dan batas kuantisasi?
h. Berapa kisaran konsentrasi yang diharapkan?
i. Apa yang presisi dan akurasi diharapkan?
j. Bagaimana metode yang sesuai?
k. Jenis peralatan yang harus digunakan? Apakah metode
untuk satu instrumen tertentu, atau seharusnya itu digunakan oleh semua
instrumen dari jenis yang sama?
l. Apakah metode yang digunakan dalam satu laboratorium
khusus atau seharusnya itu bisa diterapkan di semua laboratorium di satu sisi
atau seluruh dunia?
m. Keterampilan apa yang telah diantisipasi pengguna metode
ini?
Karakteristik performa Metode harus didasarkan pada tujuan penggunaan
metode ini. Hal ini tidak selalu diperlukan untuk memvalidasi semua parameter
analitik yang tersedia untuk teknik tertentu. Sebagai contoh, jika metode ini
digunakan untuk melacak tingkat analisis kualitatif, tidak perlu untuk menguji dan
memvalidasi metode yang membatasi kuantisasi, atau linieritas, selama rentang
dinamis penuh peralatan. Parameter awal harus dipilih menurut analis pengalaman
dan penilaian terbaik. Final parameter harus disepakati antara lab atau ahli kimia
analitis melakukan validasi dan laboratorium atau individu menerapkan metode dan
pengguna data yang akan dihasilkan oleh metode ini. Tabel 2 memberikan contoh
yang mungkin parameter diuji untuk tugas analisis tertentu.
Ruang lingkup metode ini juga harus mencakup berbagai jenis peralatan dan
lokasi di mana metode yang akan dijalankan. Sebagai contoh, jika metode ini akan
dijalankan pada instrumen tertentu dalam suatu laboratorium khusus, tidak perlu
menggunakan instrumen dari vendor lain atau untuk memasukkan laboratorium lain
pada percobaan validasi. Dengan cara ini, eksperimen dapat terbatas pada apa yang
benar-benar diperlukan.
 Mayor Mayor senyawa
Jejak Jejak
senyawa dan jejak
kuantitatif kuantitatif kualitatif kualitatif
batas deteksi tidak Tidak Ya tidak
batas tidak Ya Tidak ya
kuantisasi
linieritas ya Ya Tidak ya
jarak ya Ya Tidak tidak
ketelitian ya Ya Tidak ya
ketepatan ya Ya Tidak ya
kekhususan ya Ya Ya ya
kekasaran ya Ya Tidak mungkin
Tabel 2. Validasi parameter untuk tugas-tugas tertentu

Percobaan validasi harus dilakukan oleh seorang analis yang berpengalaman

untuk menghindari kesalahan karena kurangnya pengalaman. Analis harus sangat
berpengalaman dalam teknik dan operasi dari instrumen. Sebelum instrumen
digunakan untuk memvalidasi metode, spesifikasi kinerjanya harus diverifikasi
menggunakan standar kimia generik. Memuaskan hasil untuk metode dapat diperoleh
hanya dengan peralatan yang berkinerja baik. Perhatian khusus harus diberikan
kepada mereka karakteristik peralatan yang penting untuk metode ini.Misalnya, jika
batas deteksi adalah penting untuk suatu metode khusus, instrumen yang spesifikasi
untuk kebisingan dasar dan, untuk detektor tertentu, respon terhadap senyawa tertentu
harus diverifikasi.

Setiap bahan kimia yang digunakan untuk menentukan parameter validasi yang
penting, seperti reagen standar referensi dan, harus
1. tersedia dalam jumlah yang cukup,
2. diidentifikasi secara akurat,
 3. cukup stabil dan
4. diperiksa untuk komposisi yang tepat dan kemurnian.
Setiap bahan lainnya dan bahan habis pakai, misalnya, kromatografi kolom,
harus baru dan memenuhi syarat untuk memenuhi kriteria performa kolom. Hal ini
memastikan bahwa satu set bahan baku dapat digunakan untuk eksperimen yang
paling dan menghindari kejutan yang tidak menyenangkan selama validasi metode.
Operator harus cukup akrab dengan teknik dan peralatan. Ini akan memungkinkan
mereka untuk mengidentifikasi dan mendiagnosa masalah tak terduga lebih mudah
dan untuk menjalankan seluruh proses secara lebih efisien.
Jika ada sedikit atau tidak ada informasi tentang karakteristik performa metode,
dianjurkan untuk membuktikan kesesuaian metode untuk digunakan dalam
eksperimen awal. Studi-studi ini harus mencakup perkiraan presisi, bekerja jangkauan
dan batas deteksi. Jika muncul validasi data awal tidak sesuai, metode itu sendiri,
peralatan, teknik analisis atau batas penerimaan harus diubah. Metode pengembangan
dan validasi Oleh karena itu, proses berulang-ulang. Sebagai contoh, pada
kromatografi cair, selektivitas dicapai melalui pemilihan komposisi fase gerak. Untuk
pengukuran kuantitatif, faktor resolusi antara dua puncak harus 2,5 atau lebih
tinggi. Jika nilai ini tidak tercapai, komposisi fase gerak membutuhkan optimasi lebih
lanjut. Pengaruh parameter operasi terhadap kinerja metode harus dinilai pada tahap
ini jika hal ini tidak dilakukan selama pengembangan dan optimasi metode ini.
Tidak ada panduan resmi pada urutan yang benar eksperimen validasi, dan
urutan yang optimal tergantung pada metode itu sendiri. Berdasarkan pengalaman
penulis, untuk metode kromatografi cair, urutan berikut telah terbukti sangat berguna:
1. Selektivitas standar (pemisahan mengoptimalkan dan deteksi selektivitas
campuran standar jika tidak mencukupi)
2. Linieritas, batas kuantisasi, batas deteksi, rentang
3. Pengulangan (presisi jangka pendek) dari waktu retensi dan daerah puncak
4. Intermediate presisi
5. Selektivitas dengan sampel nyata
6. Trueness / akurasi pada konsentrasi yang berbeda
 7. Ketidakrataan (studi interlaboratory)
Percobaan yang memakan waktu lebih, seperti akurasi dan kekerasan, termasuk
menuju akhir. Dapat diukur dalam eksperimen gabungan. Sebagai contoh, ketika
presisi kawasan puncak diukur selama rentang konsentrasi penuh, data dapat
digunakan untuk memvalidasi linieritas tersebut.
Selama validasi metode, parameter batas penerimaan, dan frekuensi uji
kesesuaian sistem yang sedang berlangsung atau cek QC harus didefinisikan.Kriteria
harus didefinisikan untuk menunjukkan bila metode dan sistem berada di luar kendali
statistik. Tujuannya adalah untuk mengoptimalkan eksperimen ini sehingga, dengan
jumlah minimum analisis kontrol, metode dan sistem analitis lengkap akan
memberikan hasil jangka panjang untuk memenuhi tujuan yang didefinisikan dalam
ruang lingkup metode ini.
Setelah metode ini telah dikembangkan dan divalidasi, laporan validasi yang
harus disiapkan adalah sebagai berikut:
a. Tujuan dan ruang lingkup metode (diterapkan, tipe).
b. Ringkasan metodologi.
c. Jenis senyawa dan matriks.
d. Semua bahan kimia, reagen, standar acuan, QC sampel
dengan kemurnian, kelas, sumber atau petunjuk rinci tentang persiapan mereka.
e. Prosedur pemeriksaan kualitas standar dan bahan kimia
yang digunakan.
f. Keamanan tindakan pencegahan.
g. Rencana dan prosedur untuk metoda pelaksanaan dari
laboratorium pengembangan metode untuk analisis rutin.
h. Metode parameter.
i. Parameter kritis diambil dari pengujian ketahanan.
j. Daftar peralatan dan fungsional dan kinerja, persyaratan
misalnya perusahaan, dimensi sel, kebisingan dan suhu rentang awal
kolom. Untuk peralatan yang kompleks, gambar atau diagram skematik dapat
berguna.
 k. Kondisi rinci tentang bagaimana percobaan dilakukan,
termasuk persiapan sampel. Laporan tersebut harus cukup rinci untuk
memastikan bahwa itu bisa direproduksi oleh teknisi kompeten dengan
peralatan yang sebanding.
l. Prosedur dan perhitungan statistik representatif.
m. Prosedur QC dalam analisis rutin, misalnya, sistem tes
kesesuaian.
n. Perwakilan plot, misalnya, kromatogram, spektra dan kurva
kalibrasi.
o. Metode batas kinerja penerimaan data.
p. Ketidakpastian yang diharapkan dari hasil pengukuran.
q. Kriteria untuk revalidation.
r. Orang (s) yang dikembangkan dan divalidasi metode ini.
s. Referensi (jika ada).
t. Ringkasan dan kesimpulan.
u. Persetujuan dengan nama, judul, tanggal dan tanda tangan
dari mereka yang bertanggung jawab untuk meninjau dan persetujuan dari
prosedur tes analitis.

Verifikasi Metode Standar

Sebuah laboratorium menerapkan metode spesifik harus telah mendokumen-
tasikan bukti bahwa metode tersebut telah tepat divalidasi. Ini berlaku untuk metode
yang dikembangkan di-rumah, serta untuk metode standar, misalnya, yang
dikembangkan oleh organisasi-organisasi seperti EPA, American Society for Testing
dan Material (ASTM), ISO atau USP.
Sejumlah pertanyaan biasanya timbul tentang validasi metode standar: Pertama,
metode ini harus menjadi pengguna revalidated di laboratorium dan, jika demikian,
harus revalidation metode mencakup semua percobaan, seperti yang dilakukan
selama validasi awal? Kedua, yang dokumentasi harus tersedia atau dikembangkan
in-house untuk metode standar? pedoman peraturan resmi dan tidak eksplisit tentang
validasi metode standar. Hanya CITAC / Pedoman EURACHEM (19) termasuk
sebuah ayat pendek yang berbunyi sebagai berikut:
Validasi atau bersama-sama diuji metode standar tidak boleh diambil begitu
saja, tak peduli betapa sempurna metode's silsilah - laboratorium harus memenuhi
persyaratan bahwa tingkat validasi metode tertentu adalah cukup untuk tujuan yang
diperlukan, dan bahwa laboratorium itu sendiri dapat mencocokkan data kinerja lain.
Ada dua persyaratan penting dalam kutipan ini:
1. Metode standar's validasi data yang memadai dan cukup untuk memenuhi
persyaratan's metode laboratorium.
2. laboratorium harus dapat mencocokkan data performa seperti yang dijelaskan
dalam standar.
Hasil harus didokumentasikan dalam protokol validasi. Kedua dokumen akan
menjadi sumber utama untuk laporan validasi.
Revalidation
Kemungkinan besar beberapa parameter metode harus diubah atau disesuaikan
selama hidup metode jika metode kriteria kinerja berada di luar kriteria penerimaan
mereka.  Revalidation juga diperlukan jika ruang lingkup metode telah berubah atau
diperpanjang, misalnya, jika sampel perubahan operasi matriks atau jika kondisi
berubah. Selanjutnya, revalidation diperlukan jika dimaksudkan untuk menggunakan
instrumen dengan karakteristik yang berbeda, dan karakteristik baru ini belum
tercakup dalam validasi awal. Sebagai contoh, metode KCKT mungkin telah
dikembangkan dan divalidasi pada pompa dengan volume delay 5 mL, tetapi pompa
baru memiliki volume keterlambatan hanya 0,5 mL.

Gambar 3. Flow diagram untuk revalidation

 Bagian atau revalidation lengkap juga dapat dipertimbangkan jika tes
kesesuaian sistem, atau hasil analisis sampel QC, terletak di luar kriteria penerimaan
preset dan di mana sumber kesalahan tidak bisa dilacak kembali ke instrumen atau
penyebab lainnya.
Setiap kali ada perubahan yang mungkin memerlukan revalidation sebagian
atau penuh, perubahan itu harus mengikuti perubahan sistem kontrol
didokumentasikan. Diagram aliran proses tersebut didokumentasikan dalam Gambar
3. Perubahan ini harus didefinisikan, berwenang untuk implementasi dan
didokumentasikan. Kemungkinan perubahan mungkin termasuk
a. sampel baru dengan senyawa baru atau matriks baru,
b. analis baru dengan keahlian yang berbeda,
c. instrumen baru dengan karakteristik yang berbeda,
d. Lokasi baru dengan kondisi lingkungan yang berbeda,
e. baru bahan kimia dan / atau referensi standar dan
f. modifikasi parameter analitik.
Sebuah evaluasi harus menentukan apakah perubahan tersebut adalah dalam
lingkup metode ini. Jika demikian, revalidation tidak diperlukan. Jika perubahan yang
terletak di luar ruang lingkup, parameter untuk revalidation harus
didefinisikan. Setelah percobaan validasi, uji kesesuaian parameter sistem harus
diselidiki dan merumuskan kembali, jika perlu.

Parameter untuk Validasi Metode

Parameter untuk validasi metode telah ditetapkan dalam kelompok kerja yang
berbeda dari komite nasional dan internasional dan dijelaskan dalam
literatur.Sayangnya, beberapa definisi bervariasi antara organisasi yang
berbeda. Sebuah upaya harmonisasi dibuat untuk aplikasi farmasi melalui ICH, di
mana perwakilan dari industri dan lembaga regulator dari Amerika Serikat, Eropa dan
Jepang batasan tertentu, persyaratan dan, sampai taraf tertentu, metodologi untuk
validasi metode analisis. Parameter, seperti yang didefinisikan oleh ICH dan dengan
organisasi lain dan penulis, diringkas dalam Tabel 3 dan dijelaskan secara singkat
dalam paragraf berikut.

Selektivitas / Spesifisitas
Istilah selektivitas dan spesifisitas sering digunakan secara bergantian. Sebuah
diskusi rinci tentang istilah ini, sebagaimana didefinisikan oleh organisasi yang
berbeda, telah disajikan oleh Vessmann. Ia terutama menunjukkan perbedaan antara
definisi kekhususan yang diberikan oleh IUPAC / WELAC dan ICH.
Meskipun tidak konsisten dengan ICH, istilah yang spesifik umumnya mengacu
pada metode yang menghasilkan respons untuk analit hanya satu, sedangkan istilah
selektif merujuk pada metode yang memberikan tanggapan untuk sejumlah entitas
kimia yang mungkin atau mungkin tidak dibedakan satu sama lain. Jika respon
dibedakan dari semua tanggapan lainnya, metode ini dikatakan selektif.Karena
terdapat beberapa metode yang sangat yang menanggapi hanya satu analit, istilah
selektivitas biasanya lebih tepat. USP monografi mendefinisikan selektivitas suatu
metode analisis sebagai kemampuan untuk mengukur secara akurat suatu analit dalam
kehadiran gangguan, seperti prekursor sintetik, eksipien, enantiomer dan dikenal
(atau mungkin) degradasi produk yang dapat diharapkan untuk hadir dalam matrik
sampel. Selektivitas dalam kromatografi cair diperoleh dengan memilih kolom
optimal dan pengaturan kondisi kromatografi, seperti komposisi fase gerak, kolom
suhu dan panjang gelombang detektor. Selain pemisahan kromatografi, langkah
persiapan sampel juga dapat dioptimalkan untuk terbaik selektivitas.
Ini adalah tugas yang sulit dalam kromatografi untuk memastikan apakah
puncak dalam kromatogram sampel murni atau terdiri dari lebih dari satu
senyawa. Oleh karena itu, analis harus mengetahui berapa banyak senyawa dalam
sampel atau apakah prosedur untuk mendeteksi puncak murni harus digunakan.
Sedangkan pada parameter kromatografi masa lalu seperti komposisi fase gerak
atau kolom yang telah diubah, sekarang aplikasi detektor spektroskopi digabungkan
on-line untuk kromatograf sedang digunakan. UV / terlihat dioda-array detektor dan
spektrometer massa memperoleh spektrum on-line sepanjang seluruh
kromatogram. Spektrum diperoleh pada saat puncak elusi dinormalisasi dan disalut
untuk presentasi grafis. Jika spektrum normal berbeda, puncak terdiri dari paling
sedikit dua senyawa.
Prinsip-array deteksi dioda dalam HPLC dan aplikasi mereka dan batasan yang
berkaitan dengan puncak kemurnian dijelaskan dalam literature. Contoh murni HPLC
puncak dan murni diperlihatkan pada Gambar 4. Sementara sinyal kromatografi
menunjukkan tidak ada kotoran di puncak baik, evaluasi spektral mengidentifikasi
puncak di sebelah kiri sebagai murni. Tingkat kotoran yang dapat dideteksi dengan
metode ini tergantung pada perbedaan spektral, pada detektor performa dan pada
algoritma perangkat lunak. Dalam kondisi ideal, puncak pengotor sebesar 0.05 0,1
persen dapat dideteksi.
Studi Selektivitas juga harus menilai gangguan yang mungkin disebabkan oleh
matriks, misalnya, urin, darah, tanah, air atau persiapan makanan. sampel Optimized
dapat menghilangkan sebagian besar komponen matriks. Tidak adanya gangguan
matriks untuk metode kuantitatif harus dibuktikan oleh analisis setidaknya lima
sumber independen kontrol matriks.

Gambar 4. Contoh murni HPLC puncak dan murni. Sinyal kromatografi tidak

menunjukkan adanya kotoran dalam puncak baik. evaluasi spektral Namun,
mengidentifikasi puncak di sebelah kiri sebagai murni.
Precision dan Reprodusibilitas
Ketepatan metode (Tabel 4) adalah sejauh mana hasil uji individu suntikan
beberapa dari serangkaian standar setuju. Standar deviasi diukur dapat dibagi menjadi
3 kategori: pengulangan, presisi intermediate dan reproduksibilitas. Pengulangan
didapat bila analisis dilakukan di laboratorium oleh seorang operator dengan
menggunakan suatu peralatan dalam waktu yang relatif jangka pendek.Setidaknya 6
penentuan dari 3 matriks yang berbeda pada 3 konsentrasi yang berbeda atau 2 harus
dilakukan, dan RSD dihitung.
The ICH membutuhkan presisi dari setidaknya 6 ulangan yang akan diukur pada
100 persen dari target konsentrasi tes atau dari minimal 9 ulangan meliputi kisaran
tertentu lengkap. Contohnya, hasilnya dapat diperoleh di 3 konsentrasi dengan 3
suntikan pada konsentrasi masing-masing.
kriteria penerimaan ini untuk presisi sangat tergantung pada jenis
analisis. Farmasi presisi QC yang lebih besar dari 1 persen RSD mudah dicapai untuk
analisis senyawa, tapi presisi untuk cuplikan biologi lebih seperti 15 persen di batas
konsentrasi dan 10 persen pada tingkat konsentrasi yang lain. Untuk lingkungan dan
sampel makanan, presisi sebagian besar tergantung pada sampel matriks, konsentrasi
analit, kinerja alat dan teknik analisis. 
Intermediate presisi adalah istilah yang telah didefinisikan oleh ICH sebagai
variabilitas jangka panjang dari proses pengukuran. Hal ini ditentukan dengan
membandingkan hasil dari metode dijalankan dalam sebuah laboratorium tunggal
selama beberapa minggu. yang presisi antara metode A mungkin mencerminkan
perbedaan dalam hasil yang diperoleh
a. dari operator yang berbeda,
b. dari praktek kerja yang tidak konsisten (ketelitian) dari
operator yang sama,
c. dari instrumen yang berbeda,
d. dengan standar dan reagen dari pemasok yang berbeda,
e. dengan kolom dari batch yang berbeda atau
 f. kombinasi ini.

Analit% Rasio analit Satuan RSD%

100 1 100% 1,3
10 10 -1 10% 2,8
10-2
1 1% 2,7
10-3
0,1 0,1% 3,7
10-4
0,01 100 ppm 5,3
10-5
0,001 10 ppm 7,3
10-6
0,0001 1 ppm 11
10-7
0,00001 100 ppb 15
10-8
0.000001 10 ppb 21
10-9
0.0000001 1 ppb 30
Tabel 4. Versus konsentrasi analit presisi (Ref. 15)

Tujuan validasi presisi menengah adalah untuk memastikan bahwa di

laboratorium metode yang sama akan memberikan hasil yang sama sekali tahap
pengembangan selesai.
Reproducibility (Tabel 5), seperti yang didefinisikan oleh ICH, merupakan
presisi diperoleh antara laboratorium yang berbeda. Tujuannya adalah untuk
memastikan bahwa metode ini akan memberikan hasil yang sama di laboratorium
yang berbeda. Reproducibility dari metode analisis ditentukan dengan menganalisis
aliquots dari banyak homogen di laboratorium yang berbeda dengan analis berbeda,
dan dengan menggunakan dan lingkungan kondisi operasional yang mungkin berbeda
dari, tapi masih dalam, parameter tertentu dari metode (tes interlaboratory). Validasi
reproduksibilitas adalah penting jika metode ini untuk digunakan di laboratorium
yang berbeda.
a. Perbedaan pada suhu kamar dan kelembaban
b. Operator dengan pengalaman yang berbeda dan ketelitian
 c. Peralatan dengan karakteristik yang berbeda, misalnya
volume penundaan sistem HPLC
d. Variasi material dan kondisi instrumen, misalnya dalam
HPLC, mobile komposisi fase, pH, laju alir fasa gerak
e. Variasi rincian eksperimental tidak ditentukan oleh metode
f. Peralatan dan bahan habis pakai dari usia yang berbeda
g. Kolom dari pemasok yang berbeda atau berbeda batch
h. Pelarut, reagen dan bahan lain dengan berbagai kualitas

Akurasi
Keakuratan suatu metode analisis adalah sejauh mana hasil tes yang dihasilkan
oleh metode dan nilai yang benar setuju. Keakuratan juga dapat digambarkan sebagai
kedekatan perjanjian antara nilai yang diadopsi, baik sebagai atau, diterima referensi
nilai sebenarnya konvensional, dan nilai ditemukan.
Nilai yang benar untuk penilaian akurasi dapat diperoleh dengan beberapa
cara.Salah satu alternatifnya adalah untuk membandingkan hasil metode dengan hasil
dari metode referensi ditetapkan. Pendekatan ini mengasumsikan bahwa
ketidakpastian metode referensi diketahui. Kedua, akurasi dapat dinilai dengan
menganalisis sampel dengan konsentrasi yang dikenal (misalnya, sebuah sampel
kontrol atau bahan referensi bersertifikat) dan membandingkan nilai yang diukur
dengan nilai yang benar sebagai yang disertakan dengan bahan tersebut. Jika bahan
referensi bersertifikat atau sampel kontrol tidak tersedia, sampel kosong matriks dapat
bunga berduri dengan konsentrasi dikenal dengan berat atau volume. Setelah
ekstraksi dari analit dari matriks dan injeksi ke dalam instrumen analitis, pemulihan
nya dapat ditentukan dengan cara membandingkan respon ekstrak dengan tanggapan
mengenai materi referensi dilarutkan dalam pelarut yang murni. Karena penilaian ini
akurasi mengukur efektivitas persiapan sampel, perawatan harus dilakukan untuk
meniru persiapan sampel aktual sedekat mungkin. Jika divalidasi dengan benar,
faktor pemulihan dihitung untuk konsentrasi yang berbeda dapat digunakan untuk
memperbaiki hasil akhir.
 Konsentrasi harus mencakup rentang perhatian dan harus mencakup konsentrasi
mendekati batas kuantisasi, satu di tengah jangkauan dan satu di akhir yang tinggi
dari kurva kalibrasi. Pendekatan lain adalah dengan menggunakan nilai keputusan
penting sebagai titik konsentrasi yang harus menjadi titik akurasi terbesar.
Dokumen ICH pada metodologi merekomendasikan akurasi validasi akan
dinilai menggunakan minimal sembilan penentuan selama minimal tiga tingkat
konsentrasi yang mencakup kisaran tertentu (misalnya, tiga konsentrasi / masing-
masing diulang tiga kali). Akurasi harus dilaporkan sebagai pemulihan persen pada
uji jumlah ditambahkan dikenal analit dalam sampel atau sebagai perbedaan antara
mean dan nilai sebenarnya diterima, bersama-sama dengan interval keyakinan.

Linieritas dan Kurva Kalibrasi

Linieritas suatu metode analisis adalah kemampuannya untuk memperoleh hasil
tes yang secara langsung proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel
dalam jarak tertentu atau proporsional dengan cara transformasi matematika
didefinisikan-baik. Linieritas bisa ditunjukkan secara langsung pada substansi uji
(dengan pengenceran dari larutan stok standar) dan / atau dengan menggunakan
penimbangan terpisah dari campuran sintetis produk komponen pengujian,
menggunakan prosedur yang diusulkan.
Linearitas ditentukan oleh serangkaian 3 sampai 6 suntikan dari 5 atau lebih
standar yang konsentrasi span 80-120 persen dari rentang konsentrasi yang
diharapkan. Tanggapan harus berbanding lurus dengan konsentrasi dari analit atau
proporsional dengan cara perhitungan matematika yang ditetapkan-baik.Sebuah
persamaan regresi linier diterapkan pada hasil harus memiliki sebuah mencegat tidak
berbeda dari 0. Jika mencegat nol signifikan diperoleh, harus menunjukkan bahwa hal
ini tidak berpengaruh pada keakuratan metode ini.
Pendekatan lain adalah data sinyal bagi dengan konsentrasi masing-masing,
menghasilkan respon relatif. grafik adalah diplot dengan tanggapan relatif pada
sumbu y dan konsentrasi yang sesuai pada sumbu x-, pada skala log. Garis horizontal
yang diperoleh harus selama rentang linier penuh. Pada konsentrasi yang lebih tinggi,
biasanya akan ada deviasi negatif dari linieritas. garis horisontal paralel ditarik pada
grafik yang berhubungan dengan, misalnya, 95 persen dan 105 persen dari garis
horizontal. Metode ini linier sampai ke titik di mana garis merencanakan respon
relatif memotong garis 95 persen HPLC. Gambar 5 menunjukkan perbandingan grafis
dua evaluasi pada sampel menggunakan kafein.
ICH merekomendasikan, untuk pelaporan akurasi, linieritas kurva koefisien
korelasi, y-intercept, kemiringan garis regresi dan jumlah kuadrat sisa. Selain itu,
analisis deviasi titik data aktual dari garis regresi juga dapat membantu untuk
mengevaluasi linearitas. Beberapa prosedur analitis, seperti immunoassays, tidak
menunjukkan linieritas setelah transformasi ada). Ini Dalam kasus ini, analitis respon
harus dijelaskan dengan tepat fungsi dari konsentrasi (jumlah dari analit dalam
contoh. Dalam rangka membangun linieritas, minimal lima konsentrasi
dianjurkan. pendekatan lain harus dibenarkan.

Gambar 5. Presentasi grafis plot linieritas sampel kafein menggunakan HPLC.

Jarak
 Kisaran suatu metode analisis adalah interval antara bagian atas dan tingkat
bawah (termasuk tingkat-tingkat) yang telah menunjukkan akan ditentukan dengan
presisi, akurasi dan linearitas menggunakan metode seperti yang tertulis. Rentang ini
biasanya dinyatakan dalam satuan yang sama dengan hasil uji (misalnya, persentase,
bagian per juta) yang diperoleh dengan metode analitik.
Untuk tes uji, yang ICH memerlukan rentang minimum spesifikasi untuk
menjadi 80-120 persen dari konsentrasi uji, dan untuk penentuan suatu kenajisan,
untuk memperluas jangkauan dari batas kuantisasi, atau dari 50 persen dari
spesifikasi setiap kenajisan, mana yang lebih besar, sampai 120 persen dari
spesifikasi.

Gambar 6. Definisi untuk linearitas, jangkauan, LOQ, LOD

Limit Deteksi
Batas deteksi adalah titik di mana suatu nilai yang terukur lebih besar dari
ketidakpastian yang terkait dengannya. Ini adalah konsentrasi terendah dari analit
dalam suatu sampel yang dapat dideteksi namun tidak selalu diukur. Batas deteksi
sering bingung dengan sensitivitas dari metode ini. Sensitivitas dari metode analisis
adalah kemampuan metode ini untuk membedakan perbedaan-perbedaan kecil
konsentrasi atau massa analit uji. Dalam istilah praktis, sensitivitas kemiringan kurva
kalibrasi yang diperoleh dengan merencanakan respons terhadap konsentrasi analit
atau massa.
Pada kromatografi, batas deteksi adalah jumlah injeksi yang menghasilkan puncak
dengan ketinggian minimal dua atau tiga kali lebih tinggi tingkat kebisingan
baseline. Selain itu sinyal / kebisingan metode, yang ICH menjelaskan tiga metode
lebih lanjut:
1. Inspeksi visual: Batas deteksi ditentukan oleh analisis sampel dengan
konsentrasi analit dan dikenal dengan penentuan tingkat minimum yang analit
dapat dipercaya terdeteksi.
2. Standar deviasi respon berdasarkan deviasi standar dari kosong: Pengukuran
besarnya respons latar belakang analitis dilakukan dengan menganalisis jumlah
sampel yang tepat kosong dan menghitung standar deviasi tanggapan ini.
3. Standar deviasi respon berdasarkan kemiringan kurva kalibrasi: Sebuah kurva
kalibrasi tertentu dipelajari dengan menggunakan sampel yang mengandung
analit dalam kisaran batas deteksi. Deviasi standar residu dari garis regresi, atau
standar deviasi dari y-perpotongan garis-garis regresi, dapat digunakan sebagai
standar deviasi.

Gambar 7. Batas deteksi dan batas kuantisasi melalui sinyal terhadap kebisingan

Batas Kadar
 Batas kuantisasi adalah jumlah minimum yang disuntikkan menghasilkan
pengukuran kuantitatif dalam matriks target dengan presisi diterima dalam
kromatografi, biasanya membutuhkan ketinggian puncak 1-20 kali lebih tinggi dari
dasar suara.
Jika diperlukan presisi metode di batas kuantisasi telah ditentukan,
EURACHEM (Gambar 8) pendekatan dapat digunakan. Sejumlah sampel dengan
penurunan jumlah analit adalah disuntikkan enam kali. RSD persen dihitung dari
ketepatan diplot terhadap jumlah analit. Jumlah yang sesuai dengan yang dibutuhkan
presisi didefinisikan sebelumnya adalah sama dengan batas kuantisasi.Adalah penting
untuk tidak hanya menggunakan standar murni untuk tes ini tetapi juga matriks
runcing yang erat merupakan sampel yang tidak diketahui.
Untuk batas deteksi, para ICH merekomendasikan, di samping prosedur seperti
yang dijelaskan di atas, inspeksi visual dan deviasi standar respon dan kemiringan
kurva kalibrasi.

Gambar 11. Batas kuantisasi dengan EURACHEM metode.

Setiap hasil deteksi dan batas kuantisasi pengukuran harus diverifikasi oleh tes
eksperimen dengan sampel yang mengandung analit pada tingkat di dua
daerah..Gambar 6 menggambarkan batas kuantisasi (bersama dengan batas deteksi,
kisaran dan linieritas). Gambar 7 mengilustrasikan kedua batas deteksi dan batas
kuantisasi.
Kekasaran
Ketidakrataan tidak dibahas dalam dokumen ICH telah digantikan oleh
reproduktibilitas, yang memiliki arti yang sama seperti kekasaran, ditetapkan oleh
USP sebagai tingkat reprodusibilitas hasil diperoleh berdasarkan berbagai kondisi,
seperti yang berbeda laboratorium, analis, instrumen, kondisi lingkungan, operator
dan bahan. Ketidakrataan adalah ukuran reprodusibilitas hasil tes di bawah normal,
kondisi operasional diharapkan dari laboratorium ke laboratorium dan dari analis ke
analis. Ketidakrataan ditentukan oleh analisis aliquots dari banyak homogen di
laboratorium yang berbeda.

Robustness
Robustness tes yang menguji pengaruh parameter operasional terhadap hasil
analisis. Untuk penentuan ketahanan metode, sejumlah parameter metode, misalnya,
pH, laju alir, suhu kolom, volume injeksi, panjang gelombang deteksi atau komposisi
fase gerak, bervariasi dalam kisaran yang realistis, dan pengaruh kuantitatif dari
variabel-variabel ini ditentukan. Jika pengaruh parameter adalah dalam toleransi yang
ditentukan sebelumnya, parameter dikatakan dalam rentang's ketahanan metode.
Memperoleh data tentang efek-efek ini membantu untuk menilai apakah suatu
metode perlu revalidated ketika satu atau lebih parameter yang berubah, misalnya,
untuk mengkompensasi kinerja kolom dari waktu ke waktu. Dalam dokumen ICH,
dianjurkan untuk mempertimbangkan metode evaluasi yang ketahanan selama tahap
pengembangan, dan hasil yang sangat penting untuk metode ini harus
didokumentasikan. Ini bukan, bagaimanapun, diperlukan sebagai bagian dari
registrasi.

Stabilitas
Banyak zat terlarut mudah terurai sebelum investigasi kromatografi, misalnya,
selama penyusunan solusi sampel, ekstraksi, pembersihan, transfer fase atau
penyimpanan botol disiapkan (dalam lemari pendingin atau di sampler
otomatis).Dalam keadaan ini, pengembangan metode harus menyelidiki stabilitas
analit dan standar.
Sistem stabilitas jangka telah didefinisikan sebagai stabilitas dari sampel yang
dianalisis dalam larutan sampel. Itu adalah ukuran dari bias dalam hasil uji yang
dihasilkan selama suatu selang waktu terpilih, misalnya, setiap jam sampai 46 jam,
menggunakan solusi tunggal (Gambar 9). Stabilitas sistem harus ditentukan oleh
mereplikasi solusi analisis sampel. Sistem stabilitas yang dianggap pantas ketika
RSD, dihitung berdasarkan hasil uji yang diperoleh pada interval waktu berbeda,
tidak melebihi lebih dari 20 persen dari nilai yang sesuai dari sistem presisi. Jika,
merencanakan hasil uji sebagai fungsi waktu, nilai lebih tinggi, durasi maksimum
kegunaan larutan sampel dapat dihitung.

Gambar 9. Schematics stabilitas pengujian

Pengaruh penyimpanan jangka panjang dan siklus beku-thaw dapat diselidiki

dengan menganalisis sampel berduri segera setelah persiapan dan pada hari-hari
berikutnya periode penyimpanan diantisipasi. A minimum dua siklus pada dua
konsentrasi harus dipelajari dalam rangkap dua. Jika integritas obat dipengaruhi oleh
pembekuan dan thawing, sampel berduri harus disimpan dalam kontainer individu,
dan hati-hati yang tepat harus digunakan untuk studi sampel.
Parameter yang Harus Ada dalam Validasi Metode
Untuk proses validasi efisien, sangat penting untuk menentukan parameter
validasi yang tepat dan kriteria penerimaan. Parameter lebih, semakin banyak waktu
yang diperlukan untuk memvalidasi. Semakin ketat spesifikasi atau batas penerimaan,
semakin sering peralatan harus dikalibrasi ulang, dan mungkin juga dikualifikasi
ulang, untuk memenuhi spesifikasi yang lebih tinggi pada satu waktu. Hal ini tidak
selalu penting untuk setiap memvalidasi parameter kinerja analitis, tetapi perlu untuk
menentukan mana yang dibutuhkan.

Identi- Kenajisan Kenajisan Assay

Tugas Analitik
fikasi kuantitatif kualitatif Cate 3
Ketepatan tidak tidak ya Ya
Ketelitian
- Pengulangan tidak ya tidak Ya
- Interim presisi tidak ya tidak Ya
- Reproduksibilitas tidak tidak tidak Tidak
Spesifikasi ya ya ya Ya
Batas deteksi tidak tidak ya Tidak
Batas kuantisasi tidak ya tidak Tidak
Linieritas tidak ya tidak Ya
Jarak tidak ya tidak ya *
Tabel 8. ICH Karakteristik
* Mungkin diperlukan, tergantung pada sifat dari tes khusus

Assay Cat 2 Cat 3 Assay

Tugas Analitik
Kategori 1 kuantitatif kualitatif Cate 3
Ketepatan ya ya * *
Ketelitian ya ya tidak Ya
Spesifikasi ya ya ya *
Batas deteksi tidak tidak ya *
 Batas kuantisasi tidak ya tidak *
Linieritas ya ya tidak *
Jarak ya ya * *
Kekasaran ya ya ya *
Tabel 9. Karakteristik USP
* Mungkin diperlukan, tergantung pada sifat dari tes khusus
Parameter validasi bergantung pada analisis tugas dan lingkup metode
ini.Sebagai contoh, baik USP dan ICH berisi bab-bab tentang prosedur validasi untuk
tugas-tugas analitik yang berbeda, yang keduanya termasuk untuk memberikan
beberapa ide tentang apa jenis validasi yang diperlukan untuk tugas yang berbeda
(lihat tabel 8 dan 9 ). Misalnya, menurut ICH, akurasi, presisi semua jenis dan batas
deteksi dan kuantisasi tidak diperlukan jika tugas analisis adalah identifikasi. Untuk
pengujian dalam 1 USP, kategori komponen utama atau bahan aktif yang akan diukur
biasanya hadir pada konsentrasi tinggi, sehingga validasi batas deteksi dan kuantisasi
tidak diperlukan.
Karena jenis analisis dan informasi yang harus diperoleh dari sampel memiliki
banyak pengaruh sebagainya validasi, tujuan dan ruang lingkup metode harus selalu
didefinisikan sebagai langkah pertama dari setiap validasi metode.

Referensi
1. US FDA - Pedoman untuk Industri (draft) Prosedur Analitis dan Metode
Validasi: Kimia, Manufaktur, dan Kontrol dan Dokumentasi, 2000
2. Konferensi Internasional Harmonisasi (ICH) Persyaratan Teknis Pendaftaran
Farmasi Manusia Penggunaan, Validasi prosedur analitis, Jenewa (1996)
3. US EPA, Bimbingan untuk metode pengembangan dan validasi metode untuk
Konservasi Sumber Daya dan Recovery Act (RCRA) Program, Washington DC
(1995)., http://www.epa.gov/sw-846/pdfs/methdev.pdf
4. JM Hijau, Sebuah panduan praktis untuk validasi metode analitik,
Anal. Chem.Berita & Fitur, 1 Mei 1996, hlm. 305A-309A.
5.  AOAC rekan-Verified Metode Program, Manual kebijakan dan prosedur,
Arlington, Va., USA (1998). http://www.aoac.org/vmeth/PVM.pdf
6. 16. Winslow PA dan RF Meyer, Mendefinisikan rencana induk untuk validasi
metode analisis, J. Validasi Teknologi, hal). 361-367 (1997.
7. J. Vessman, Selektivitas atau spesifisitas? Validasi metode analisis dari
perspektif kimiawan analitis dalam industri farmasi, J. Pharm & BioMed Analisis
14:867-869 (1996).
8. L. Huber dan S. George, diode-array deteksi dalam kinerja tinggi
kromatografi cair, New York, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-4 (1993).

VALIDASI METODE ANALISIS

UNTUK MEMENUHI TUGAS AKHIR SEMESTER IV

FAKULTAS MIPA, PRODI FARMASI,
MATA KULIAH ANALISIS FISIKOKIMIA 2
 DISUSUN OLEH :
FARIDA ISKANATI (08613095)

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA

YOGYAKARTA

2009/2010