Professional Documents
Culture Documents
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari tentang makhluk hidup renik
(mikro atau kecil) dengan cara observasi. Untuk mengetahui makhluk hidup renik
dengan menggunakan alat (mikroskop, lup), media, teknik khusus misalnya biakan
murni maupun aseptic. Ruang lingkup mikrobiologi meliputi prion, virus, monera,
protista, dan fungi. Mikrobiologi perlu dipelajari karena:
a. Mikroba berada disekitar lingkungan kita dan kita selalu berinteraksi dengan
mikroba tersebut. Mikroba dapat dijadikan sebagai kawan atau lawan. Misalnya
interaksi sebagai lawan adalah dapat mengendalikan penyakit dan melawan
penyakit, sedangkan interaksi sebagai kawan dapat menghasilkan produk (dalam
pembuatan tape menggunakan bakteri Aspergillus sp) dan jasa (bioremidiasi,
biomining dan bioteknologi).
b. Mikroba merupakan obyek penelitian.
c. Rasa ingin tahu.
e. Vitamin
f. Air
Dalam mengisolasi mikrona pada media agar miring, media agar tegak,
maupun media cair dilakukan secara aseptic. Hal ini bertujuan untuk menghindari
terjadinya kontaminasi bakteri lain. Setelah bakteri biaka murni diinkubasi dengan
waktu tertentu maka dapat dilakukan pengamatan tentang sifat-sifat koloni yang
tumbuh antara lain mengenai jumlah, macam, warna, tekstur, ukuran, dan permukaan
koloni. Untuk mengamati sifat-sifat bakteri dilakukan dengan metode pewarnaan,
antara lain pewarnaan sederhana yamg bertujuan untuk mengetahui bentuk bakteri,
pewarnaan gram untuk mengetahui ketahanan bakteri terhadap keasaman. Uji
motilitas untuk menetahui daya gerak bakteri. Dari beberapa jenis pewarnaan diatas
kemudian melakukan pengamatan dengan menggunakan mikroskop maka kita dapat
melakukan identifikasi bakteri yang berada pada kultur murni. Untuk mengetahui
kepadatan mikroba dapat menggunakan enumerasi. Sedangkan uji resistensi
dilakukan untuk mengetahui resistensi suatu mikroba terhadap antibiotik
Virus berbeda dengan mikroba lainnya karena hanya dapat hidup dan
memperbanyak diri di dalam tubuh makhluk hidup. Sehingga virus disebut sebagai
2
parasit interselluler obligat. Untuk mengendalikan virus dapat dilakukan dengan cara
diinaktifkan dengan merendam virus menggunakan larutan misalnya dengan
disenfektan (chlorin) dengan perbandingan 1:10 atau dilarutkan pada eter (ditergen).
B. Rumusan Masalah
Dari latar belakang diatas dapat diperoleh rumusan masalah sebagai berikut:
1. Apakah tujuan dari pembuatan medium TA (Tauge Agar) dan PSA (Potato
Sukrosa Agar)?
2. Apakah tujuan dari penagkapan dan pengisolasian dari mikroorganisme?
3. Apakah tujuan pewarnaan bakteri dan badaimanakah cara melakukan masing-
masing pewarnaan bakteri?
4. Apakah tujuan dari enumerasi dan bagaimanakah hubungan antara pengenceran
dengan kepadatan jumlah bakteri?
5. Apakah tujuan dari uji resistensi bakteri dan bagaimanakah pengaruh pemberian
antibiotik dengan pengenceran yang berbeda pada medium terhadap tumbuhnya
bakteri?
6. Apakah tujuan dilakukannya praktikum virus?
C. Tujuan Percobaan
Dari latar belakang dan rumusan masalah di atas dapat diperoleh tujuan
percobaan sebagai berikut:
1. Tujuan pembuatan medium TA (Tauge Agar) dan PSA (Potato Sukrosa Agar)
adalah:
a. Mengetahui bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan medium TA
(Tauge Agar) dan PSA (Potato Sukrosa Agar) yang akan dipakai.
b. Mengetahui cara pembuatan medium TA (Tauge Agar) dan PSA (Potato
Sukrosa Agar).
c. Mengetahui manfaat medium agar TA (Tauge Agar) dan PSA (Potato
Sukrosa Agar) dalam praktikum mikrobiologi dasar.
2. Tujuan penagkapan dan pengisolasian mikroorganisme adalah:
3
a. Menangkap mikroorganisme dari sayur yang sudah basi (sayur lodeh dan
sayur sop) dan jamur yang terdapat pada makanan (roti dan teh).
b. Menumbuhkan mikrorganisme dalam medium TA (Tauge Agar) dan PSA
(Potato Sukrosa Agar) dalam cawan petri.
c. Mengetahui dan memilih mikroorganisme yang sudah ditangkap untuk diteliti
lebih lanjut.
d. Mengisolasi mikroorganisme yang sudah ditangkap pada pada medium TA
(Tauge Agar) dan PSA (Potato Sukrosa Agar) miring dalam tabung reaksi.
3. Tujuan dari pewarnaan bakteri adalah:
a. Mengetahui tentang bahan kimia dan teori dasar dalam pewarnaan bakteri.
b. Mengetahui teknik pembuatan olesan preparat.
c. Mengetahui prosedur pewarnaan sederhana dan pewarnaan negative.
d. Mengerjakan prosedur pewarnaan diferensial seperti pewarnaan gram’s, acid
fast, dan endospora pada bakteri.
Cara pewarnaan sederhana adalah:
Melakukan prosedur pewarnaan sederhana untuk membandingkan bentuk
morfologi sel-sel penyusun bakteri.
Cara pewarnaan negatif adalah:
Melakukan prosedur pewarnaan negatif untuk mengetahui morfologi
mikroorganisme yang akan kelihatan transparan dan tampak jelas diantara
medan yang gelap.
Cara pewarnaan gram’s adalah:
Mengetahui dasar kimiawi pewarnaan gram’s dan hasil dari teknik ini
digunakan untuk membedakan bakteri dalam dua kelompok utama yaitu
gram positif dan gram negatif.
Cara pewarnaan Acid Fast adalah:
Melakukan prosedur pewarnaan acid fast untuk mengetahui kandungan
lemak yang banyak pada bakteri yang tidak dapat diwarnai dengan
pewarnaan sederhata atau pewarnaan gram.
Cara uji katalase adalah:
4
Melakukan prosedur uji katalase untuk mengetahui adanya enzim katalase
yang dihasilkan oleh bakteri yang diamati.
D. Manfaat
Dari praktikum mikrobiologi ini dapat diambil manfaat yaitu pengetahuan
lebih tentang makhluk mikro (kecil) yang keberadaanya ada di sekeliling kita dan
jumlahnya tak terhingga melebihi jumlah manusia serta kekurangan dan kelebihan
suatu mikroorganisme.
5
BAB II
KAJIAN TEORI
A. PEMBUATAN MEDIUM
Media adalah pembenihan atau subtract atau dasar makanan untuk
menumbuhkan dan mengembangbiakkan organisme. Media yang baik bagi
pemeliharaan mikroorganisme adalah yang mengandung unsure-unsur makanan yang
diperlukan, dapat berupa garam-garam organic dan senyawa-ssenyawa organic seperti
protein, pepton, asam-asam amino dan vitamin-vitamin.
Mikroorganisme dalam suatu biakan murni memerlukan nutrisi atau makanan
untuk dapat tumbuh. Nutrisi yang diperlukan tersebut antara lain:
1. Sumber karbon
Sumber karbon dapat diperoleh berupa monosakarida seperti glukosa atau
fruktosa, sukrosa (gula pasir) dan laktosa. Pemilihan suatu sumber carbon dalam
suatu medium bergantung pada jenis mikrobia yang akan dikembangkan dan
ditumbuhkan karena setiap mikroba membutuhkan sumber karbon yang berbeda.
Sukrosa adalah yang umum digunakan apabila kita ingin menumbuhkan berbagai
macam bakteri dan jamur. Sukrosa dapat diambil dari gula pasir jika tidak
mendapatkan sukrosa yang murni. Konsentrasi sumber karbon yang digunakan
dalam medium berkisar antara 1%-20%.
2. Sumber nitrogen
Sumber nitrogen yang biasanya digunakan adalah peptone tetapi untuk beberapa
mikroba lain yang spesifik biasanya memerlukan sumber nitrogen lain yang
berupa nitrogen atau asam amino.
6
Sumber nitrogen yang digunakan dalam medium penumbuhan mikrobia biasanya
adalah pepton, tetapi untuk mikrobia yang spesifik biasanya juga memerlukan
sumber nitrogen yang berupa protein atau asam amino yang tertentu.
3. Ion-ion organic tertentu baik berupa unsure mikro dan makro, misalnya: Mg, Ca,
K, dan lain sebagainya.
4. Metabolit penting, misalnya vitamin.
5. Air
Air digunakan mikrobia untuk membentuk bahan sel dan untuk melarutkan
bahan-bahan makanan mikrobia yang nantinya digunakan dalam pembentukan
energi.
Bahan-bahan nutrien yang disediakan mikrobia untuk tumbuh dalam
laboratorium disebut kultur media. Nutrient yang paling baik untuk menumbuhkan
suat mikrobia dalam medium adaah mengandung zat-zat organic dan beberapa unsure
yang telah disebutkan diatas. Untuk membuat suatu media yang baik, pertama media
tersebut harus mengandung nutrient atau makanan yang cocok untuk mikrobia yang
ditumbuhkan. Media yang digunakan harus memiliki kelembapan yang cukup dan PH
yang sesuai. Media tersebut juga harus bebas dari mikrobia lain atau harus steril
sebelum digunakan. Kedua media yang baik memerlukan komponen mikro dan
makro, komponen makro dapat berupa: C, H, O, N, S, P, K, Ca, Mg, Fe. Sedangkan
komponen mikro dapat berupa: Mangan, Seng, Tembaga, Kobalt, Nikel, Boron, Klor,
Silika dan lain sebagainya yang tidak begitu diperlukan oleh mikrobia.
Ada beberapa jenis media yang dapat dibuat untuk menumbuhkan mikrobia,
yaitu:
1. Medium universal
2. Medim selektif: dapat berupa PSA dan PDA
3. Medium diferensial, memiliki penampakan yang berbeda dan merupakan medium
yang selektif untuk bakteri E.Coli misalnya EMB (Eosi Metilen Blue Agar)
4. Medium diperkaya
7
5. Medium cair
Umumnya media cair digunakan untuk menambah biomassa sel. Kalau ke dalam
media tidak ditambahkan zat pemadat. Media cair digunakan untuk pertumbuhan
bakteri, ragi, dan mikroalga.
6. Medium padat
Medium akan padat jika ditambahkan agar, jumlah agar yang ditambahkan
tergantung pada jenis atau kelompok mikroba yang akan ditumbuhkan. Pada
umumnya digunakan untuk menumbuhkan bakteri, jamur, dan kadang-kadang
mikroalga.
7. Medium setengah padat
Jika penambahan zat pemadat hanya setengah atau kurang dari seharusnya. Ini
umumnya digunakan untuk pertumbuhan mikroba yang banyak memerlukan
kandungan air dan hidup anaerob dan hidup fakultatif untuk menambahkan
biomassa sel.
B. PENANGKAPAN MIKROORGANISME
Penangkapan suatu mikroorganisme adalah suatu proses pemindahan
mikroorganisme ke medium yang belum berisi mikrooganisme atau suatu proses
pengembangbiakan mikroorganisme pada medium yang belum ditumbuhi
mikroorganisme. Penangkapan mikroorganisme ini merupakan penangkapan bakteri
dan jamur. Proses ini dilakukan secara aseptic. Sebelum melakukan penanaman, baik
tempat maupun alat-alatnya harus disterilkan terlebih dahulu dengan alcohol yang
bertujuan untuk menghindari kontaminasi.
Penangkapan bakteri dilakukan dengan cara mengambil sedikit sumber bakteri
(sayur sop yang sudah basi) menggunakan jarum inokulasi atau bisa juga
menggunakan cotton bud dan menggoreskannya pada medium agar di dalam cawan
petri secara aseptic. Kemudian diinkubasi selama 48 jam. Demikian juga dengan
pengkapan jamur kami melakukan hal yang sama seperti penagkapan bakteri hanya
saja sumbernya berasal dari teh dan roti. Kemudian diinkubasi selama 72 jam dengan
suhu 37oC. untuk mempermudah mengidentifkasi jenis mikroba yang tumbuh pada
8
medium agar di dalam cawan petri ini dalam melakukan penanaman kami
menyetrikkan sayur sop yang sudah basi dan jamur yang berasal dari teh dan roti
secara zigzag, sehingga setiap jenis mikroba akan tumbuh secara berkoloni dan ada
jarak antara koloni satu dengan yang lain. Cara ini akan mempermudah dalam
mengisolasi bakteri dan jamur atau membuat biakan murni dari bakteri dan jamur.
Kedua kegiatan penangkapan baik bakteri maupun jamur ini dilakukan untuk
mengetahui bakteri jenis apa yang tumbuh pada sayur basi dan jamur yang terdapat
pada teh dan roti berdasarkan pemunculan koloni bakteri maupun koloni jamur pada
medium agar dalam cawan petri.
Setelah berhasil menangkap bakteri dan jamur maka kegiatan selanjutnya
adalah membuat biakan murni atau mengisolasi bakteri dan jamur dengan
menggunakan medium agar miring dalam tabung reaksi. Pengisolasian ini juga harus
dibersihkan dengan alcohol agar terhindar dari kontaminasi. Kegiatan pengisolasian
bakteri digunakan untuk membiakkan satu jenis bakteri saja pada medium agar
miring atau memisahkan satu jenis bakteri dari beberapa koloni bakteri yang tumbuh
dalam cawan Petri tadi, demikian pula pengisolasian jamur dilakukan untuk
membiakkan satu jenis jamur saja pada medium agar miring atau memisahkan satu
jenis jamur dari beberapa koloni jamur yang tumbuh pada cawan Petri tadi.
C. IDENTIFIKASI MIKROORGANISME
Pewarnaan sederhana
Sel-sel yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus pandang
(transparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa sehingga sukar dilihat
karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan
indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar
belakangnya dapat dipertajam dengan mewarnai sel-sel tersebut dengan zat-zat
warna.
Pewarnaan yang paling umum digunakan adalah pewarnaan sederhana;
disebut demikian karena hanya digunakan satu jenis zat warna yang digunakan
untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan
9
pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan
basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya
bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif).
Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan
bermacam-macam tipe morfologi (kokus, basilus, vibrio, spirilum, dan
sebagainya) dari bahan-bahan lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai.
Disamping itu dapat pula diamati struktur-struktur tertentu seperti endospora.
Pewarnaan negative
Metode ini digunakan bukan untuk mewarnai bakteri melainkan mewarnai
latar belakangnya sehingga menjadi hitam gelap. Metode ini meliputi
pencampuran mikroorganisme di dalam setetes tinta nigrosin lalu
menyebarkannya diatas kaca obyek yang bersih. Pada pewarnaan ini bakteri
terlihat transparan (tembus pandang) dan tampak jelas diantara medan yang jelas
diantara medan yang gelap karena pewarna-pewarna tersebut tidak menembus
miroorganisme. Teknik ini digunakan untuk menentukan morfologi dan ukuran
sel. Berbeda dengan metode-metode pewarnaan yang lain , pada pewarnaan
negative olesan tidak mengalami pemanasan ataupun perlakuan keras dengan
dengan bahan-bahan kimia; maka terjadinya penyusutan sel dan salah agak
kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Akan tetapi,
harus dipehatikan bahwa selama mengeringnya pewarna, sel-sel tersebut dapat
saja mengalami penyusutan atau salah bentuk. Metode ini juga berguna untuk
bakteri-bakteri tertentu, seperti spiroteka yang sukar diwarnai.
Pewarnaan Gram
Pewarnaan diferensial yang terpenting untuk bakteri adalah pewarnaan
gram, nama ini diperoleh berdasarkan nama penemunya yaitu Dr. Christian Gram.
Pewarnaan ini dapar membedakan bakteri menjadi 2 kelompok utama yaitu gram
positif dan gram negative yang membuatnya sebagai alat yang esensial untuk
10
mengklasifikasikan dan membedakan mikroorganisme. Pewarnaan gram
menggunakan 4 macam regen yang berbeda.
Pewarna primer (kristal violet), pewarna violet ini digunakan pertama kali
dan sel yang terwarnai akan berwarna biru-keunguan. Pewarna selanjutnya yaitu
Gram’s Iodine, reagen ini dikenal dengan mordant. Pewarna ini merupakan
campuran larutan yang komplek, untuk memperkuat ikatan pewarna primer. Hasil
dari ikatan komplek Crystal violet-Iodine (CV-I) akan mewarnai sel secara
intensive. Semua sel nampak biru-keunguan. Pada sel gram positif komplek CV-I
berikatan dengan Mg-RNA yang merupakan komponen dinding sel. Gabungan
antara Mg-RNA-CV-I lebih susah dicuci dibandingkan dengan komplek CV-I
Pewarnaan diferensial sedikitnya menggunakan 3 reagen kimia yang
diaplikasikan pada preparat mikroskopis. Reagen pertama disebut pewarnaan
dasar atau primer, yang fungsinya untuk mewarnai semua sel. Untuk
mendapatkan warna yang kontras, reagen kedua yang digunakan adalah agen
dekolorisasi. Berdasarkan komposisi kimia dari komponen sel, agen dekolorisasi
akan melarutkan pewarna primer dari sel secara keseluruhan atau hanya pada
struktur sel tertentu. Reagen terakhir yaitu pewarna penutup yang merupakan
pewarna kontras dari pewarna primer. Pada waktu dekolorisasi, apabila pewarna
primer tidak tercuci, warna penutup tidak dapat diserap dan sel beserta
komponennya akan diwarnai oleh pewarna primer. Jika pewarna primer tercuci,
maka komponen sel menjadi tidak berwarna, dan akan terwarnai oleh pewarna
penutup. Dengan cara ini jenis sel atau struktur sel dapat dibedakan satu dengan
lainnya berdasarkan warna yang tertinggal (diserap).
Pewarnaan endospora
Pada jenis-jenis bakteri tertentu misalnya Clostridium, Desulfuculatum
(bakteri anaerob) dan basilus (bakteri aerob) mempunyai kemampuan untuk
membentuk suatu bentukan pada tempat-tempat yang khas di dalam sel yang
disebut Endospora. Endospora dibentuk oleh sel apabila kondisi lingkungan tidak
memungkinkan untuk kelangsungan hidup sel vegetatif bakteri, misalnya adalah
11
pada kondisi bahan makanan yang tersedia sedikit atau tidak ada. Berdasarkan
kenyataan tersebut maka kita dapat memaksa bakteri-bakteri tersebut untuk
membentuk endospora,misalnya adalah dengan jalan menumbuhkan bakteri
tersebut didalam medium dalam jangka waktu yang lama (membiarkan akan
menjadi tua). Selain kondisi kekurangan makanan, kondisi yang tidak
menguntungkan lainnya yaitu suhu yang terlalu panas dan dingin, adanya radiasi
dan terdapatnya bahan-bahan kimia yang mematikan bakteri.
1. Malakit hijau, yang berfungsi sebagai pewarna dasar yang akan mewarnai
spora melalui pemanasan. Baik dinding sel maupun endospora akan terwarnai
oleh malakit hijau. Larutan pencuci warna dasar menggunakan air. Pewarna
yang diikat oleh endospora akan tetap karena tidak tercuci oleh air. Setelah
pencucian,sel tidak berwarna dan endospora berwarna hijau.
2. Safranin sebagai zat warna (pewarna banding) yang akan mewarnai sel
vegetatif yang tidak berwarna merah, sedangkan endospora tetap berwarna
hijau.
12
Pewarnaan Acid Fast
Ziehl-Neelsen Acid Fast Stain adalah sebuh metode pewarnaan yang
dikembangkan oleh Paul Ehrlich pada tahun 1882. Ziehl-Neelsen Acid Fast Stain
dapat dipakai untuk mendeteksi organisme-organisme penyebab tuberculosis dan
leptosis. Slide organisme yang sudah diwarnai dengan carbolfuchshin dan
dipanaskan, dibilas dan dekolorisasi dengan 3% asam hidroklorida (HCl) dalam
95% etanol, dibilas, dan kemudian diwarnai dengan Loeffler’s methylen blue.
Sebagian besar generasi bakteri akan hilang warna merah dan carbolfuchsin
ketika dilakukan dekolorisasi. Namun demikian ada yang acid fast (tahan asan
mempertahankan warna merah terang). Komponen-komponen lipid yang terdapat
pada dinding-dinding sel bakteri tertentu yang bertanggung jawab memunculkan
sifat ini. Bakteri yang tidak tahan asam (acid-fast) kehilangan warna merahnya,
sehingga warna biru Loffler’s methylen blue kan meresap ke dalam dinding sel
ketika counterstain (pewarnaan yang kedua).
Pewarnaan jamur
Jamur adalah organisme eukariotik yang mempunyai dinding sel dan pada
umumnya tidak motil. Karakteristik ini menyerupai karakteristik tumbuhan.
Namun demikian jamur secara fundamental dapat dibedakan dari tumbuhan
karena mereka tidak mempunyai klorofil. Dengan demikian mereka tidak mampu
melakukan proses fotosintesis menghasilkan bahan organik dari karbondioksida
dan air, sehingga jamur disebut organisme yang heterotrof yang menyerupai sifat
sel hewan sehingga memerlukan bahan organik dari luar untuk keutuhan
nutrisinya.
Sebagai organisme saprofit jamur hidup dari benda-benda atau bahan-
bahan organik mati. Saprofit menghancurkan sisa-sisa bahan tumbuhan dan
hewan yang kompleks menjadi bahan yang lebih sederhana. Hasil penguraian ini
kemudian dikembalikan ke tanah sehingga dapat meningkatkan kesuburan tanah.
Disamping itu hasil penguraian dari jamur saprofit ini dapat menghancurkan atau
menguraikan sampah, kotoran hewan, bangkai hewan, dan bahan organik lainnya,
13
sehingga tidak terjadi penumpukan dari bahan organik mati tersebut. Dengan
demikian dapat mempertahankan berlangsungnya siklus materi terutama siklus
karbon, yang berperan bagi kelangsungan hidup seluruh organisme.
Untuk dapat membiakan fungi di laboratorium, teknik-teknik dasar
bakteriologis dapat diterapkan. Namun karena jamur mempunyai Generation
Time (waktu generasi) yang lebih panjang dari kebanyakan bakteri, maka
dibutuhkan kondisi kultur yang dapat memeliharanya lebih lama. Kondisi kultur
yang dibutuhkan misalnya dengan cara menghindarkan media dari kondisi
kekeringan. Disamping itu jumlah media yang disediakan dalam lempeng agar
lebih banyak daripada lempeng agar yang disediakan untuk bakteri. Melapisi
tempat media dengan paraffin untuk mencegah kekeringan dan menginkubasinya
dalam kamar/chamber yang lebih lembab.
Pewarnaan jamur bertujuan untuk mengamati morfologi jamur secara
mikroskopis. Pewarnaan ini menggunakan zat warna Lactofenol Cotton Blue
sehingga hifa jamur akan terwarnai biru dan hifa jamur tidak mengkerut. Dan
pada saat diamati di mikroskop akan tampak morfologi jamur yang meliputi :
hifa, sel kaki, tangkai spora dan sporanya.
Uji katalase
Mikroorganisme mampu merombak lingkungannya dan menggunakan
bahan kimia sebagai sumber energi dan faktor pertumbuhan serta reproduksinya.
Semua aktivitas sel dibantu oleh enzim, bahkan di dalam pemecahan bahan kimia
kompleks menjadi bahan yang lebih sederhana melibatkan banyak enzim yang
bekerja saling bertautan. Hal itu juga karena kerja enzim adaalah sangat spesifik,
satu jenis enzim umumnya hanya mampu bereaksi dengan satu jenis bahan. Hasil
dari reaksi enzimatik dapat diukur atau hilangnya suatu bahan pada media dapat
dideteksi. Sati seri uji enzimatik dapat dipakai untuk identifikasi dan
membedakan mikroba dari spesies yang satu dengan yang lain.
14
Prosedur kerja enzim katalase:
Katalase adalah enzim yang terdapat hampir semua bakteri. Enzim itu bertindak
sebagai katalisator dalam pemecahan hydrogen peroksida dan menghasilkan
oksigen:
2H2O2 katalase 2H2O + O2
Hidrogen peroksida adalah zat racun bagi bakteri. Zat ini dapat hilang dari piaraan
apabila mikroba dari piaraan itu menghasilkan katalase. Enzim katalase paling
banyak dihasilkan oleh bakteri obligant anaerob. Adanya enzim katalase dapat
ditunjukkan dengan menambahkan larutan hidrogen peroksida ke dalam piaraan
bakteri dan mengamati timbulnya oksigen.
Uji motilitas
Pergerakan suatu mikroba misalnya bakteri dapat diamati dengan
menggunakan metode yang disebut “ preparat basah tetes gantung”, yaitu suatu
metode yang dibuat dengan cara memberi setetes cairan yang yang mengandung
mikroba (akuades + mikroba) pada gelas penutup, kemudian gelas tersebut
diletakkan pada gelas benda yang cekung dengan permukaan yang ditetesi bakteri
menghadap kebagian cekung dari gelas benda. Gerakan mikroba akan tampak
pada preparat dan tidak berhamburan kemana-mana. Selain menggunakan metode
ini pergerakan mikroba juga dapat diamati dengan menggunakan medium khusus
yang disebut motility tes medium. Medium ini setengah padat sehingga arah
pertumbuhan bakteri pada medium akan membentuk pola yang khas. Dari pola
pertumbuhan ini akan diketahui bakteri yang ditanam itu dapat bergerak atau
tidak.
D. ENUMERASI
HITUNGAN LANGSUNG
Ada berbagai cara yang digunakan untuk menghitung jumlah bakteri dengan
metode ini. Untuk menghitung bakteri/spora jamur digunakan alat yang disebut
Haemositometer. Menyiapkan suspensi khamir dengan jalan melarutkan 0,01 gr
fermipan kedalam 10 ml aquades steril. Mengaduk campuran tersebut hingga
homogen. Campuran yang homogen diteteskan diatas homositometer dan ditutup
dengan kaca penutupnya lalu diamati di bawah mikroskop. Apabila terlalu pekat
suspensi dapat diencerkan secara seri (dilution metod).
1. Menentukan plot (5 kotak yang bergaris tebal dan terdiri atas kotak kecil-kecil)
2. Menghitung bakteri yang ada dalam masing-masing kotak yang besar (bakteri
yang tepat pada garis tepi dihitung satu kali)
3. Menjumlah bakteri dari seluruh kotak yang besar kemudian di rata-rata.
4. Menghitung konsentrasi bakteri/ml dengan cara memasukkan ke rumus volume:
Volume kotak = luas kotak × kedalaman kotak (rms matematika)
= 0,0625 mm2 × 0,1mm
= 0.00625 mm2
V = 0,00625 ml
16
Apabila dilakukan pengenceran dapat menggunakan rumus :
Jumlah sel/ml =
Keterangan:
P adalah faktor pengenceran
Untuk mendapatkan jumlah rata-rata sel/petak anda harus menghitung jumlah
sel minimal 25 petak, lalu rata-rata.
E. UJI RESITENSI
Pada percobaan uji resistensi, kelompok kami menggunakan cara Paper disk. Cara
ini dilakukan dengan menyiapkan lempeng media KNA dalam cawan Petri yang steril
kemudian mengoleskan biakan bakteri yang akan diuji pada lempeng agar secara
merata dengan menggunakan jarum inokulasi/cotton buds steril. Menggunting kertas
hisap berbentuk lingkaran dengan garis tengah kurang lebih 1 cm, kemudian
merendam dalam desinfektan atau antibiotik (kelompok kami menggunakan
tetrasilin) dengan konsentrasi tertentu. Tiap konsentrasi 3 potong kertas hisap. Setelah
itu meletakkan kertas hisap yang telah direndam dalam desinfektan/antibiotik
(tetrasilin) diatas gores dan bakteri pada lempeng agar yang akan diuji,memberi tanda
untuk setiap konsentrasi pada bagian luar cawan supaya tidak tertukar. Lalu
diinkubasi selama 24 jam. Untuk antibiotik menggoreskan bakteri yang akan diuji
pada lempeng agar secara merata, kemudian meletakkan disk antibiotik (tetrasilin)
diatas goresan bakteri tersebut lalu menginkubasi selama 24-48 jam. Setelah itu kami
17
kami melakukan pengamatan ternyata daerah disekitar paper disk tidak ditumbuhi
oleh bakteri dan terbentuk zona hambatan. Pada pengenceran 250 mg tetrasilin
dengan 4ml aquades diperoleh luas zona hambatan total sebesar 10,42 cm2. Pada
pengenceran 250 mg tetrasilin dengan 8 ml aquades zona hambatan totalnya 2,75
cm2. Sedangkan pada pengenceran 250 mg tetrasilin dengan 12 ml aquades diperoleh
luas zona hambatan total sebesar 4,11 cm2.
F. VIRUS
Virus adalah mikroorganisme yang sangat kecil dan tidak dapat dibiakkan
dalam media buatan. Sampai sekarang virus masih banyak menimbulkan pertanyaan
diantaranya apakah merupakan organisme yang hidup? Karena hidup diartikan
sebagai proses yang dihasilkan oleh aktivitas protein khusus yaitu asam nukleat.
Asam nukleat sel hidup bereaksi setiap saat namun pada virus tidak demikian virus
tidak dapat melakukan kegiatan diluar sel inang yang hidup sehingga virus tidak
dimasukkan dalam makhluk hidup tetapi jika virus tersebut masuk dalam sel inang
yang hidup dalam asam nukleat yang dimiliki virus menjadi aktif dan virus tersebut
dapat memperbanyak diri. Berdasarkan hal tersebut maka virus juga digolongkan
sebagai makhluk hidup. Virus pada mulanya dapat dibedakan dari agen infeksi lain
karena mereka sangat kecil (dapat lolos dari saringan bakteri) dan bersifat parasit
18
obligant intraseluler karena itu virus mambutuhkan sel inang yang hidup untuk
memperbanyak diri.
Virus yang telah menginfeksi inang di dalam saluran pencernaan. Virus akan
menyebar dan menyerang sel-sel saluran pencernaan, menghancurkan inti selnya
sehingga seluruh selnya akan hancur/lisis. Bukan hanya saluran pencernaan saja
tetapi dimungkinkan seluruh tubuh sel inang juga hancur, karena virus tersebut akan
melekat ada dinding sel inang dan envelope virus akan melebur dengan permukaan
membrane sel inang dan menyebabkan terbebasnya bahan nukleokapsit virus ke
dalam sitoplasma sel inang kemudian akan terjadi pelepasan selubung virion, diikuti
dengan replikasi asam nukleat dan sintesis protein virus, replikasi asam nukleat virus
terjadi di sitoplasma.
19
• Memiliki inang spesifik dalam genus/famili yang sama, sehingga aman terhadap
organisme bukan sasaran.
• Tidak mempengaruhi parasitoid, predator dan serangga berguna lainnya.
• Dapat mengatasi masalah resistensi ulat grayak terhadap insektisida kimia.
• Kompatibel dengan insektisida kimiawi yang tidak bersifat basa kuat.
Melihat besarnya manfaat SLNPV dan SLNPV sebagai agensia hayati pada ulat
grayak yang biasanya menyerang tanaman kacang-kacangan, tembakau dan sayuran,
maka NPV berpeluang besar untuk dikembangkan sebagai bio-pestisida yang
memiliki prospek komersial, tidak berdampak negatif bagi penggunanya.
Proses infeksi SLNPV dimulai dari tertelannya polihedra (berisi virus) bersama
pakan. Di dalam saluran pencernaan yang bersuasana alkalis, polihedra larut
sehingga membebaskan virus (virion). Selanjutnya virus menginfeksi sel-sel yang
rentan. Dalam waktu 1 sampai dengan 2 hari setelah polihedra tertelan, ulat yang
terinfeksi akan mengalami gejala abnormal secara morfologis, fisiologis dan
perilakunya.
Secara morfologis, hemolimfa ulat yang semula jernih berubah keruh dan secara
fisiologis, ulat tampak berminyak dan perubahan warna tubuh menjadi pucat
kemerahan, terutama bagian perut. Sedangkan secara perilaku, ulat cenderung
merayap ke pucuk tanaman, yang kemudian mati dalam keadaan menggantung
dengan kaki semunya pada bagian tanaman.
Permukaan kulit ulat akan mengalami perubahan warna dari pucat
mengkilap pada awal terinfeksi kemudian akan menghitam dan
hancur. Apabila tersentuh, tubuh ulat akan mengeluarkan cairan
kental berbau seperti nanah yang berisi partikel virus. Ulat mati
dalam waktu 3 sampai dengan 7 hari setelah polihedra VIR (berisi
virus) tertelan. Sebelum mati ulat masih dapat merusak tanaman, namun kerusakan
yang diakibatkan ulat yang sudah terinfeksi sangat rendah, karena terjadi penurunan
kemampuan makan dari ulat grayak sampai 84 %.
Gejala infeksi SLNPV pada larva S. litura akan terlihat setelah 1 – 3 hari
SLNPV tertelan, Gejala pada larva instar-3 dan instar-4 yang terinfeksi SLNPV akan
20
terlihat berwarna putih kecoklatan pada bagian perutnya, sedangkan pada bagian
punggung berwarna coklat susu kehitaman, apabila larva instar-5 dan instar-6
terinfeksi SLNPV dan jika tidak mati, maka pada saat stadia pupa akan membusuk
dan seandainya sampai pada stadia imago maka bentuk sayap menjadi keriting. Larva
yang terinfeksi NPV pada umumnya ditandai dengan berkurangnya kemampuan
makan, gerakan yang lambat, dan tubuh membengkak akibat replikasi atau
perbanyakan partikel-partikel virus NPV. Integumen larva biasanya menjadi lunak,
rapuh, dan mudah robek. Apabila tubuh larva tersebut pecah maka akan
mengeluarkan cairan kental berwarna coklat susu yang merupakan cairan NPV
dengan bau yang sangat menyengat.
Di lapang kematian larva S. litura akibat terinfeksi SLNPV ditunjukkan dengan
gejala tubuh larva menggantung dengan kedua kaki semu bagian abdomen menempel
pada daun atau ranting tanaman membentuk huruf “V” terbalik . Akan tetapi ada juga
larva mati yang posisinya tidak seperti huruf “V” terbalik melainkan terkulai pada
helaian daun.
21
BAB III
METODE PERCOBAAN
A. PEMBUATAN MEDIUM
a. Alat-alat :
b. Bahan-bahan :
5. Gula pasir 60 gr
22
c. Prosedur kerja :
1. Membuat ekstrak taoge dengan mendidihkan 250 gram taoge dalam 1000 ml
selama 15 menit. Kemudian mengambil filtratnya dengan cara menyaring.
2. Menambahkan filtrat tersebut dengan 60 gr gula pasir, agar-agar batangan
yang sudah dipotong kecil-kecil 12 gr atau agar-agar powder 15 gr dan
memanaskan sampai agar-agar larut dan air sampai volume akhir setelah
penambahan gula dan agar agar adalah 1000 ml.
3. Memasukkan taoge agar (TA) kedalam 2 cawan petri masing-masing 20 ml
untuk media menangkap bakteri.
4. Membuat media tauge agar miring untuk isolasi bakteri dengan
memasukkan 5 ml TA ke dalam tabung reaksi (masing-masing mahasiswa 1
tabung reaksi).
5. Memasukkan tauge agar ke dalam 3 cawan petri masing-masing 20 ml dan
10 ml tauge cair (TC) ke dalam tabung reaksi untuk media uji resistensi.
6. Memasukkan tauge agar (TA) ke dalam 3 tabung reaksi masing- masing 9
ml untuk media enumerasi.
7. Menutup mulut tabung reaksi dengan kapas sebaik mungkin dan ditutup
kembali dengan aluminium foil, kemudian mensterilisasi semua tabung
reaksi yang telah diberi medium dengan autoklaf selama 15-20 menit pada
suhu1210C.
8. Setelah mensterilisasi agar, menegakkan tabung reaksi untuk agar yang
berdiri dan memiringkan tabung reaksi untuk agar yang miring kemudian
membiarkan sampai dingin.
23
2. Pembuatan Media untuk Jamur
a. Alat-alat :
b. Bahan-bahan :
5. Gula pasir 60 gr
c. Prosedur kerja :
24
3. Memasukkan potato sukrosa agar (PSA) kedalam 2 cawan petri masing-
masing 20 ml untuk media menangkap jamur.
4. Membuat media potato sukrosa agar (PSA) miring untuk isolasi jamur
dengan memasukkan 5 ml PSA ke dalam tabung reaksi (masing-masing
mahasiswa 1 tabung reaksi).
5. Menutup mulut tabung reaksi dengan kapas sebaik mungkin dan ditutup
kembali dengan aluminium foil, kemudian mensterilisasi semua tabung
reaksi yang telah diberi medium dengan autoklaf selama 15-20 menit pada
suhu1210C.
6. Setelah mensterilisasi agar, memiringkan tabung reaksi untuk agar yang
miring kemudian membiarkan sampai dingin.
1. Menangkap Bakteri
a. Alat – alat
1. Jarum ose
2. Inkubator
3. Bunsen
b. Bahan-bahan
25
c. Prosedur
1. Mengambil sayur sop yang sudah basi secara aseptik dengan menggunakan
botol sampel.
2. Menyiapkan medium tauge agar dalam cawan petri steril dan jarum ose
atau cotton bud steril.
3. Secara aseptik mengambil sayur sop yang sudah basi dengan ose atau
cotton bud steril dan dengan teknik streak, menginokulasikan mikroba pada
ose atau cotton bud steril pada medium taoge agar.
4. Selanjutnya membungkus cawan petri dan menginkubasikannya pada
inkubator dengan posisi terbalik pada inkubator dengan suhu 24-270C
selama 24 jam.
5. Setelah diinkubasi kemudian mengamati pertumbuhan koloni yang khas
dan menentukan sifat-sifat koloninya, yaitu jumlah, ukuran/ diameter,
macam koloni, bentuk dan warna koloni, kenaikan permukaan koloni,
tekstur koloni dan kepekatan koloni.
2. Menangkap Jamur
a. Alat – alat
1. Jarum ose
2. Inkubator
3. Bunsen
b. Bahan-bahan
26
c. Prosedur
C. ISOLASI MIKROORGANISME
1. Isolasi Bakteri
a. Alat-alat
1. Lampu spiritus
2. Jarum inokulasi (neddle)
3. Inkubator
4. Tisu gulung
b. Bahan-bahan
c. Prosedur Kerja
2. Isolasi Jamur
a. Alat-alat
1. Lampu spiritus
2. Jarum inokulasi (neddle)
3. Inkubator
b. Bahan-bahan
c. Prosedur Kerja
D. Identifikasi Mikrobia
1. Pewarnaan Sederhana
a. Alat-alat :
b. Bahan-bahan :
29
d. Prosedur kerja
30
2. Pewarnaan Negatif
a. Alat-alat
b. Bahan-bahan
c. Prosedur kerja
31
8. Memilih bagian olesan yang dengan jelas memperlihatkan sel-sel yang
transparan dengan latar belakang yang gelap.
9. Mencatat dan menggambar hasil pengamatan dari segi jenis
mikroorganisme, bentuk sel, rangkaian sel dan warna sel.
3. Pewarnaan Gram
a. Alat-alat
b. Bahan-bahan
►Safranin
c. Prosedur kerja
32
3. Melewatan usapan bakteri tersebut diatas api (difiksasi) dan mengering
anginkannya menjadi preparat mikroskopis.
4. Menetesi preparat mikroskopis tersebut dengan larutan kristal violet dan
membiarkan selama satu menit.
5. Mencucinya dengan air mengalir.
6. Menetesi preparat tersebut dengan Gram’s-Iodine Mordant dan
membiarkan selama satu menit.
7. Mencucinya dengan air mengalir.
8. Melakukan dekolorisasi dengan Ethyl Alkohol 95% dengan
menambahkan reagen setetes demi setetes sampai cristal violet tercuci
dari preparat dan memperhatikan jangan sampai dekolorisasi secara
berlebihan.
9. Mencucinya dengan air mengalir.
10. Menetesi dengan pewarna penutup dan membiarkan selama 45 detik.
11. Mencucinya dengan air mengalir
12. Mengeringkan dengan kertas hisap atau dengan mengering anginkan
sampai kering dan kemudian mengamati di bawah mikrokop dengan
bantuan minyak imersi dan memperhatikan bentuk sel, rangkaian sel,
warna sel serta menentukan Gram dari biakan murni.
4. Pewarnaan Endospora
a. Alat- alat
b. Bahan-bahan
33
1. Biakan murni bakteri 5. Malakit hijau
umur 48-72 jam 6. Kertas saring minyak imersi
2. Safranin
3. Kertas lensa
4. Xilol
c. Prosedur kerja
34
b. Bahan-bahan
c. Prosedur kerja
6. Uji Katalase
a. Alat-alat
1. Mikroskop
2. Bunsen
3. Ose
4. Obyek glass
35
b. Bahan-bahan
c. Prosedur Kerja
7. Uji Motilitas
a. Alat-alat
b. Bahan-bahan
c. Prosedur Kerja
36
1. Membersihkan obyek glass cekung dan cover glass dengan alkohol 70%
sampai bersih.
2. Membuat preparat basah tetes gantung dengan cara meneteskan setetes air
pada cover glass(sangat sedikit) dan menambahkan bakteri yang akan
diamati pada tetesan tersebutdengan needle (juga sangat sedikit) dan
mengusahakan tetesan masih sangat kecil,( tidak melebar ).
3. Meletakkan cover glass tersebut diatas obyek glass cekung yang tepi
cekungannya sudak diolesi parafin dengan posisi cairan ada di bawah.
4. Mengamati pergerakan mikroba di bawah mikroskop.
8. Pewarnaan Jamur
a. Alat-alat
1. Mikroskop
2. Bunsen
3. Ose
4. Obyek glass dan cover glass
b. Bahan-bahan
c. Prosedur kerja
E. Enumerasi
a. Alat-alat :
b. Bahan-bahan :
1. Taoge agar
2. Aquades steril
c. Prosedur kerja
38
4. Mengambil larutan dari tabung ke-4, ke-5, ke-6 masing-masing 1 ml dengan
menggunakan pipet streril dan memasukkannya ke dalam cawan petri steril
yang sudah diberi tanda.
5. Menyiapkan taoge agar (TA) cair dengan suhu 400-500C sebanyak 3 tabung
masing-masing berisi 9 ml medium.
6. Memasukkan TA ke dalam cawan petri yang telah berisi air isi ulang, 1
tabung TA untuk 1 cawan petri. Menggoyangkan cawan petri hingga
homogen dengan cara memutar cawan petri searah jarum jam lalu
sebaliknya di atas meja, mendiamkannya hingga dingin dan mengeras.
7. Inkubasikan pada suhu 220-270C selama 24-48 jam di dalam inkubator.
8. Menghitung jumlah koloni yang tumbuh pada setiap pengenceran. Jumlah
bakteri yanga ada dalam setiap 1 ml air isi ulang adalah berbanding terbalik
dengan pengenceran. Misalnya hasil perhitungan dari pengenceran 10-6
terdapat 10 koloni, maka jumlah bakteri adalah 10 x 10-6 sel bakteri per 1 ml
air isi ulang.
9. Menuliskan hasil pengamatan ke tabel pengamatan.
F. Uji Resistensi
a. Alat-alat
5. Pipet tetes
b. Bahan-bahan
1. Antibiotik tetrasilin
39
2. Tauge Agar (TA)
4. Alkohol 70 %
c. Prosedur Kerja
40
G. Virus
1. Memperbanyak Virus
a. Alat-alat
b. Bahan-bahan
2. Baby corn
3. Virus HaNPV/SINPV
c. Prosedur kerja
41
tersebut dengan membersihkan kotoran disekitar ulat terlebih dahu;lu
dengan pinset, kemudian menjepit kepalanya dan mengangkat pelan-
pelan. Kemudian memasukkan ulat tersebut ke dalam tabung reaksi
yang telah berisi 1 ml aquades kemudian menyimpannya dalam
freezer. Apabila telah terkumpul banyak, ulat siap untuk dimurnikan.
2. Pemurnian virus
a. Alat-alat
3. gelas ukur
4. Mortal
5. Pengaduk
6. Tabung sentrifuse
7. Masker
42
b. Bahan-bahan
2. Aquades
c. Prosedur Kerja
43
BAB IV
DATA DAN ANALISA
A. PEMBUATAN MEDIA
Dalam percobaan yang kami lakukan, kami menggunakan 2 medium
yaitu Medium TA ( Tauge Agar ) untuk bakteri dan PSA ( Potato Sukrosa
Agar ) untuk jamur. Medium tersebut dibuat dengan 2 bentuk yaitu medium
dalam cawan petri dan medium dalam tabung reaksi. Pada masing-masing
cawan petri diisi larutan TA dan PSA, larutan harus dibuat rata dan halus
sehingga harus ditaruh ditempat yang datar selama proses pendinginan, hal
tersebut dilakukan untuk mempermudah area tumbuh bakteri dan
mempermudah identifikasi nantinya. Pada masing-masing tabung reaksi diisi
larutan TA dan PSA, larutan tersebut harus dibuat miring dengan kemiringan
45°, hal tsb dilakukan supaya area tumbuh atau luas permukaan tumbuh
mikroorganisme yang akan ditumbuhkan lebih besar.
TA PSA
TA PSA
44
B. ISOLASI MIKROORGANISME
Tabel pengamatan hasil penumbuhan mikrobia
Medium Bentuk Warna Tekstur Kenaikan
koloni dan tepi Permukaan
TA
Sayur Tidak Krem Rata, Cembung
lodeh teratur Putih mengkilat Cembung
Sayur sop Tidak Suram
teratur
PSA
Teh Putih Suram Cembung
dan
orange
Roti Abu- Suram Cembung
abu
Analisis:
Pada penangkapan dan pengisolasian mikroorganisme, dari medium TA
yang ditanami bakteri dari sayur lodeh yang sudah basi. Menghasilkan bakteri
dengan bentuk koloni tidak teratur, berwarna krem dengan tekstur rata dan
mengkilap kenaikan permukaannya cembung. Pada medium yang ditanami
bakteri dari sayur sop yang sudah basi memiliki ciri yang sama dengan bakteri
yang berasal dari sayur lodeh, yang berbeda hanyalah warnanya yaitu putih.
Pada medium PSA yang ditanami jamur dari teh, menghasilkan jamur yang
berwarna putih dan orange dan tekstur dan tepi yang suram dan kenaikan
permukaanya cembung. Pada medium yang ditanami jamur dari roti
menghasilkan jamur dengan ciri yang sama dengan jamur teh yang berbeda
hanya warna jamurnya yaitu abu-abu.
45
C. IDENTIFIKASI MIKROBIA
Berdasarkan hasil praktikum maka dapat dituliskan data dan analisis sebagai
berikut:
PEWARNAAN SEDERHANA
Analisis:
Pada pewarnaan sederhana, bakteri yang diperoleh dari masing-maing tabung
reaksi adalah bentuk selnya cocobacillus, susunan selnya monococobacillus
dan diplococobacillus dan warna selnya biru.
PEWARNAAN NEGATIF
Analisis:
Pada pewarnaan negatif, bakteri yang diperoleh dari masing-masing tabung
reaksi berbentuk coccus dengan rangkaian sel monococcus dan diplococus
dengan warna sel transparan dan latar belakangnya berwarna gelap atau hitam.
PEWARNAAN GRAM
46
Analisis:
Pada pewarnaan gram, bakteri yang diperoleh dari tabung reaksi 1 dan 2
memiliki bentuk sel coccus, rangkaian sel berkelompok (Streptococcus dan
stapylococcus),warna sel biru ungu dan termasuk bakteri gram’s positif (+).
Pada bakteri 3,4, dan 5 memiliki bentuk sel coccus, rangkaian sel
berkelompok (Stapylococcus),warna sel merah dan termasuk bakteri gram’s
negatif (-).
Analisis:
Pada pewarnaan acid fast, diperoleh bakteri dari tabung reaksi 1-5
memiliki bentuk sel coccus, rangkaian sel pada tabung reaksi 1,4,5:
monococcus, diploccus, stafilococcus; tabung reaksi 2: monococcus,
stafilococcus; tabung reaksi 3 :monococcus, diplococcus, streptococcus.
Warna sel dari semua tabung reaksi sama yaitu biru (bakteri tidak tahan asam).
PEWARNAAN ENDOSPORA
1. Choirunnisak +
2. Indra dwi S. +
5. Risma agustina +
47
Analisis:
PEWARNAAN JAMUR
Analisis:
Pada pewarnaan jamur, jamur yang kami peroleh dari tabung reaksi 1
sampai 4 adalah jamur Aspergillus sp. Jamur ini memiliki susunan tubuh yang
terdiri atas hifa yang bersekat, sel kaki, konidiofor vesikel dan spora berwarna
hitam menyebar pada lapang pandang mikroskop. Mempunyai kepala yang
membawa konidia (vesikel) yang besar dan tersusun dengan padat, bulat, dan
berwarna hitam kecoklatan. Konidianya kasar dan mengandung pigmen. Pada
species ini kebanyakan sklerotia yang berwarna abu-abu sampai hitam.
Hifanya bercabang-cabang dan konidiofor sporanya tumbuh secara radial pada
konidiofor. Sedangkan pada tabung reaksi ke 5 jamur yang diperoleh adalah
Basipetospora rubra. Jamur ini pada medium PDA koloni berwarna putih,
terdiri dari spora, kotak spora, tangkai spora, dan hifa. Kotak spora berbentuk
bulat, tangkai spora sederhana, hifanya tidak bersekat, biasanya jamur ini
tumbuh pada teh basi dan tumbuh baik pada suhu lingkungan antara 27ºC-
30ºC.
48
UJI KATALASE
Analisis:
Pada uji katalase, bakteri yang diperoleh dari tabung reaksi 1,2,3,4
dan 5 setelah diuji dengan meneteskan H2O2 dan diamati dengan mikroskop
pada sediaan timbul gelembung O2, yang berarti uji katalase positif. Hal ini
menandakan bakteri tersebut mengandung enzim katalase yang dapat
mengubah H2O2 menjadi O2 dan uap air dan termasuk bakteri aerob.
UJI MOTILITAS
Analisis:
Pada uji motilitas, bakteri yang diperoleh dari kelima tabung reaksi
setelah diuji motilitas dengan teknik preparat basah tetes gantung dan diamati
pada mikroskop tampak adanya gerakan atau motilitas bakteri yaitu
pergerakan ke atas – bawah di tempat.
49
D. ENUMERASI
Jumlah bakteri pada setiap pengenceran.
No Pengenceran Jumlah koloni Jumlah bakteri
Analisis
Pada pengenceran air isi ulang dengan aquadessebanyak 6 kali
diperoleh larutan dengan konsentrasi 10-4,10-5 , dan 10-6 dengan cara membuat
pengenceran dari air isi ulang mulai dari pengenceran 10-1 s.d 10-6 dengan
memasukkan 1 ml sampel ke dalam tabung reaksi pertama kemudian
mengocoknya,maka konsentrasi larutan menjadi 10-1. Kemudian mengambil 1
ml dengan pipet dari tabung kedua dan mengocok sampai homogen,
konsentrasi larutan menjadi 10-2, kemudian sampai tabung ke 6. Hasil yang
diperoleh untuk larutan
10-4,10-5 , dan 10-6 adalah tidak terdapat bakteri sama sekali.
E. RESISTENSI
Jenis antibiotik Waktu Pengenceran Gambar
Inkubasi
Tetrasilin 24 jam 250 mg
tetrasilin +
4ml aquades
50
Tetrasilin 24 jam 250 mg
tetrasilin +
8ml aquades
Analisis:
Dari data hasil pengamatan diatas maka dapat dianalisis bahwa :
Dari pengenceran antara Tetrasilin (antibiotik) 250 mg dengan
aquades 4 ml, diperoleh data :
Zona Hambatan :
I. d : 1,2 cm - 0,5 cm = 0,7 cm r = 0,35 cm
II. d : 3,4 cm - 0,5 cm = 2,9 cm r = 1,45 cm
III. d : 2,6 cm - 0,5 cm = 2,1 cm r = 1,05 cm
Luas Hambatan :
= 10,42 cm2
51
Luas cawan Petri = πr2
= 17,84 cm2
Luas hambatan :
= 2,75 cm2
= 25,51 cm2
52
Luas hambatan :
= 4,11 cm2
= 24,15 cm2
F. VIRUS
Mikroorganisme : Virus
Jenis inang : SLNPV
Bentuk virus : Polihedral
Warna virus : Hijau
Hasil virus : Sedikit, kotor,
kontaminasi bakteri
Analisis:
Berdasarkan data hasil pngamatan diatas maka dapat dianalisis bahwa dari
hasil praktikum memperbanyak dan memurnikan virus kelompok kami telah
berhasil memperoleh virus dari inang SLNPV (Spodoptera Litura Nucleat
Polihedral Virus) yang memiliki bentuk virus polihedral, virus tersebut
berwarna hijau dan hasil virus sedikit, kontaminasi oleh bakteri, kotor oleh
sisa-sisa kulit tubuh dan kepala dari ulat Spodoptera litura.
53
BAB V
PEMBAHASAN
A. PEMBUATAN MEDIUM
C. IDENTIFIKASI MIKROORGANISME
Berdasarkan data dan analisis dapat diketahui bahwa mikoorganisme
merupakan merupakan makhluk hidup yang sangat kecil. Untuk
mengamatinya selain diperlukan mikroskop juga memerlukan beberapa
metode pewarnaan sehingga sel bakteri dapat dilihat lebih jelas. Metode
pewarnaan yang kami gunakan adalah:
Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan sederhana digunakan untuk mengamati morfologi, baik bentuk
susunan sel mapun warna selnya. Pewarnaan sederhana hanya
menggunakan satu macam zat warna. Hal bertujuan untuk melihat ada
tidaknya bakteri yang tumbuh pada media tersebut. Biasanya pewarnaan
ini mengunakan zat warna basa seperti kristal violet, biru metilen, air
fuchsin, safranin atau hijau malakit. Pewarnaan basa bisa terjadi bila
55
senyawa pewarna bersifat positif, sehingga pewarna akan diikat oleh
dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna menjadi biru dan terlihat.
Sel-sel Mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir
tembus pandang bila diamati. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan
pewarna sederhana karena sitoplasma basofilik (suka akan basa).
Pewarnaan sederhana ini menghasilkan bakteri dengan morfologi dan
bentuk sel coccobacillus dengan susunan sel monococcus dan diplococcus.
Pewarnaan Negatif
56
Pewarnaan Gram
57
Pewarnaan Acid Fast
Pewarnaan endospora
Dari data dan analisis dapat di bahas bahwa bakteri yang dimiliki
oleh Choirunnisak, Indra, Fuji dan Risma dapat membentuk endospora
karena bakteri kehabisan makanan atau nutrisi yang terdapat pada
medium. Sedangkan, pada bakteri yang dimiliki oleh Zuan tidak
membentuk endospora. Hal ini disebabkan bakteri masih mendapat cukup
makanan atau nutrisi yang terdapat pada medium, dan mungkin waktu
inkubasi kurang lama.
58
Pewarnaan Jamur
Pada pewarnaan jamur ini kelompok kami menggunakan pewarna
Lactofenol Cotton Blue sehingga hifa jamur akan terwarnai birudan
hifanya tidak mengkerut. Dari hasil pengamatan mikroskop dengan
perbesaran 400 kali dari tabung reaksi 1 sampai 4 diperoleh jamur
Aspergillus sp, terlihat morfologi sebagai berikut : Jamur ini memiliki
susunan tubuh yang terdiri atas hifa yang bersekat, sel kaki, konidiofor
vesikel dan spora berwarna hitam menyebar pada lapang pandang
mikroskop. Mempunyai kepala yang membawa konidia (vesikel) yang
besar dan tersusun dengan padat, bulat, dan berwarna hitam kecoklatan.
Konidianya kasar dan mengandung pigmen. Pada species ini kebanyakan
sklerotia yang berwarna abu-abu sampai hitam. Hifanya bercabang-cabang
dan konidiofor sporanya tumbuh secara radial pada konidiofor. Pada
tabung reaksi 1 sampai 4 awalnya kita mengambil jamur dari roti
kemudian kita biakan pada medium agar. Adapun klasifikasi jamur
Aspergillus sp. Adalah sebagai berikut :
Classis : Deutomicetes
Ordo : Moniliales
Familiy: Moniliaceae
Genus : Aspergillus
Species: Aspergillus sp
Uji Katalase
Pada uji katalase, bakteri yang kami peroleh pada tabung reaksi 1,2,3,4,
dan 5 masing-masing dibuat sediaan mikroskopis kemudian ditetesi
dengan H2O2, selanjutnya kami amati dibawah mikroskop dengan
perbesaran 400 kali. Berdasarkan hasil pengamatan uji katalase dari
kelima tabug reaksi terbentuk gelembung O2. Hal ini berarti bakteri
menghasilkan enzim katalase dan termasuk bakteri aerob yang dapat
merubah H2O2 (Hidrogen Peroksida) menjadi O2 dan uap air. Adapun
persamaan reaksinya adalah sebagai berikut :
2 H2O2 enzim katalase 2 H2O2 + O2
Uji Motilitas
Pada uji motilitas ini, bakteri yang diperoleh kelompok kami dari kelima
tabung reaksi dengan metode preparat basah tetes gantung yaitu dengan
cara memberi setetes cairan yang mengandung bakteri pada kaca penutup,
kemudian kaca penutup tersebut diletakkan pada benda cekung dimana
permukaan yang diberi olesanbakteri tadi menghadap ke bagian yang
60
cekung dari kaca benda (tampak seperti menggantung). Dari hasil
pengamatan dengan mikroskop perbesaran 400 kali dari kelima tabung
reaksi tampak adanya gerakan atau motilitas bakteri yaitu pergerakan ke
atas – bawah di tempat.
D. ENUMERASI
Menurut teori sebenarnya terdapat hubungan antara tingkat pangenceran
dengan jumlah bakteri yang tumbuh/hidup. Hubungannya adalah semakin
pekat sampel (pengenceran sampel rendah) maka semakin sedikit jumlah
bakteri yang tumbuh/hidup ,dan sebaliknya semakin encer sampel
(pengenceran tinggi) maka semakin banyak jumlah bakteri yang
tumbuh/hidup. Untuk menghitung jumlah bakteri yang tumbuh pada setiap
pengenceran adalah dengan mengalikan jumlah koloni bakteri dengan
1/pengenceran.
Namun hasil yang diperoleh adalah pada larutan 10-4,10-5 , dan
10-6 adalah tidak terdapat bakteri sama sekali. Hal ini disebabkan karena
medium yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri suhunya terlalu
panas sehingga pada saat bakteri ditanam pada medium, bakteri tersebut
mati karena suhu yang panas.
E. UJI RESISTENSI
61
dengan garis tengah kurang dari 1 cm, kemudian merendam dalam desinfektan
atau antibiotik (kelompok kami menggunakan tetrasilin) dengan konsentrasi
tertentu. Tiap konsentrasi 3 potong kertas hisap. Setelah itu meletakkan kertas
hisap yang telah direndam dalam desinfektan/antibiotik (tetrasilin) diatas
gores dan bakteri pada lempeng agar yang akan diuji,memberi tanda untuk
setiap konsentrasi pada bagian luar cawan supaya tidak tertukar. Lalu
diinkubasi selama 24 jam. Untuk antibiotik menggoreskan bakteri yang akan
diuji pada lempeng agar secara merata, kemudian meletakkan disk antibiotik
(tetrasilin) diatas goresan bakteri tersebut lalu menginkubasi selama 24-48
jam. Setelah itu kami kami melakukan pengamatan ternyata daerah disekitar
paper disk tidak ditumbuhi oleh bakteri dan terbentuk zona hambatan. Pada
pengenceran 250 mg tetrasilin dengan 4ml aquades diperoleh luas zona
hambatan total sebesar 10,42 cm2. Pada pengenceran 250 mg tetrasilin dengan
8 ml aquades zona hambatan totalnya 2,75 cm2. Sedangkan pada pengenceran
250 mg tetrasilin dengan 12 ml aquades diperoleh luas zona hambatan total
sebesar 4,11 cm2.
62
zona hambatannya lebih sempit daripada zona hambatan pada pengenceran
250 mg tetrasilin dengan 12 ml aquades. Hal ini mungkin disebabkan
kesalahan dalam pengukuran dan kekurangtelitian kami dalam praktikum ini.
F. VIRUS
Pada percobaan yang telah kami lakukan dalam memperbanyak virus.
Kami memperoleh ulat Spodoptera litura yang telah mati karena terinfeksi
virus SLNPV (Spodoptera Litura Nukleat Polyhidrosis Virus). Gejala infeksi
SLNPV pada larva S. litura akan terlihat setelah 1 – 3 hari SLNPV tertelan,
Gejala pada larva instar-3 dan instar-4 yang terinfeksi SLNPV akan terlihat
berwarna putih kecoklatan pada bagian perutnya, sedangkan pada bagian
punggung berwarna coklat susu kehitaman. Larva yang terinfeksi NPV pada
umumnya ditandai dengan berkurangnya kemampuan makan, gerakan yang
lambat, dan tubuh membengkak akibat replikasi atau perbanyakan partikel-
partikel virus NPV. Integumen larva biasanya menjadi lunak, rapuh, dan
mudah robek. Apabila tubuh larva tersebut pecah maka akan mengeluarkan
cairan kental berwarna coklat susu yang merupakan cairan NPV dengan bau
yang sangat menyengat. Kematian larva S. litura akibat terinfeksi SLNPV
ditunjukkan dengan gejala tubuh larva menggantung dengan kedua kaki semu
bagian abdomen menempel pada kain yang dijadikan penutup tabung
membentuk huruf “V” terbalik. Setelah diperoleh ulat yang mati karena
terinfeksi virus kami melakukan pemurnian virus dan setelah diamati dengan
mikroskop hasilnya virus berbentuk polihedral,berwarna hijau dan hasil virus
sedikit, serta terkontaminasi oleh bakteri, kotor oleh sisa-sisa kulit tubuh dan
kepala dari ulat Spodoptera litura.
63
BAB V
PENUTUP
A. SIMPULAN
64
Konsentrasi campuran antibiotik dan aquades mempengaruhi resistensi
suatu bakteri. Semakin rendah konsentrasi campuran , maka zona hambatan
semakin kecil / sempit. Hal ini berarti semakin resisten terhadap antibiotik.
Begitu pula sebaliknya, semakin tinggi konsentrasi campuran, maka zona
hambatan semakin besar / luas. Hal ini berarti bakteri sensitif terhadap
antibiotik. Tetapi pada hasil yang kami dapat kurang sesuai dengan teori
tersebut karena pada pengenceran 250 mg tetrasilin dengan 4ml aquades zona
hambatannya lebih sempit daripada zona hambatan pada pengenceran 250 mg
tetrasilin dengan 12 ml aquades. Hal ini mungkin disebabkan kesalahan dalam
pengukuran dan kekurangtelitian kami dalam praktikum ini.
Terbentuknya zona hambatan resistensi suatu bakteri ditentukan
oleh jarak zona hambatan yang tergantung oleh adanya perubahan-perubahan :
a. Kemampuan kecepatan difusi antibiotik terhadap medium dan
interaksinya.
b. Derajat sensitifitas organisme terhadap antibiotik.
c. Kecepatan pertumbuhan organisme.
d. Jumlah organisme yang diinokulasikan.
Ulat Spodoptera litura yang mati karena terinfeksi virus kami
dimurnian virus dan diamati dengan mikroskop hasilnya virus berbentuk
polihedral,berwarna hijau dan hasil virus sedikit, serta terkontaminasi oleh
bakteri, kotor oleh sisa-sisa kulit tubuh dan kepala dari ulat Spodoptera litura.
B. SARAN
Kami menyadari laporan mikrobiologi yang telah kami buat ini masih
belum sempurna untuk itu kami sangat mengharapkan kritik dan saran yang
membangun baik dari pengoreksi maupun dari pembaca demi kesempurnaan
pembuatan laporan di masa yang akan datang. Atas penilaian dan saran yang telah
diberikan kami mengucapkan terima kasih.
65
DAFTAR PUSTAKA
66